CN105579028B - 抗真菌局部组合物及治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗真菌感染的包含能形成纳米微粒的聚合物和抗真菌剂的局部组合物(以及生产这样的组合物的方法)。本发明还涉及聚六亚甲基双胍的新用途。

Description

抗真菌局部组合物及治疗方法
技术领域
本发明涉及用于治疗真菌感染的包含能形成纳米微粒的聚合物和抗真菌剂的局部组合物(以及生产这样的组合物的方法)。
背景技术
真菌感染在人类和动物中越来越常见，但由于抗真菌组合物的毒性、这些组合物的溶解性差以及可证明使用传统药物制剂难以到达一些感染的远端位置，因此这类感染的治疗仍是存在问题的。
20世纪60年代发现了广谱抗真菌剂例如两性霉素B、哈霉素、菲律宾菌素(filipin)和制霉菌素。但由于毒性，只有哈霉素和制霉菌素得到局部使用，两性霉素B得到全身性使用。抗真菌治疗的突破是引入唑类，特别是酮康唑。目前使用的抗真菌剂的主要类型是多烯、唑烯丙基胺(azoles allyl amine)、脂肽和嘧啶。然而，多烯对哺乳动物细胞是有毒的。唑类有很好的局部耐受性，但当全身性给药时具有副作用，并且已有一些对唑类有耐药性的报道。氟胞嘧啶是最常用的嘧啶。虽然其具有优良的组织渗透性，但对氟胞嘧啶的耐药性能快速发展并产生胃肠副作用。脂肽显示低毒性，检测疗效的一些试验仍在进行。
因为真菌是真核的，且如果靶细胞被破坏也可损害宿主细胞，所以新抗真菌剂的发展受到限制。真菌感染的增加和抗真菌剂使用的增加已导致出现对真菌的耐药性(resistance among fungi)。因为真菌疾病造成免疫功能不全患者的发病率和死亡率增加，所以抗真菌耐药性具有高临床影响。
由于因水溶解性问题而缺少适当的递送，因此据估计大约40％的新发现药物都失败了。在局部递送药物的情况下，皮肤的屏障性能经常需要渗透促进剂以达到药物的所需剂量。
甲癣(更普遍地已知为指甲真菌感染)引起指甲变厚、变色、变丑和分裂。如果不治疗，指甲可能变得非常厚以致于指甲压迫鞋子内部，引起压力、刺激和疼痛。特别是在糖尿病患者、患有外周性血管疾病的那些患者和免疫功能不全的患者中存在其他并发症的风险。指甲真菌感染可能引起心理问题和社会问题。指甲真菌感染的发病率随年龄增加，在欧洲有显著的发病率，60岁以上的人中患病率约为30％，而在亚洲发病率水平甚至更高。指甲真菌感染可感染一个或多个脚趾甲和/或手指甲，如果不进行治疗可完全毁坏指甲。
目前用于指甲真菌感染的治疗是每周1-2次、持续6-12个月的局部指甲油(lacquer)/漆(paint)(例如阿莫罗芬)和/或口服抗真菌剂(例如特比萘芬或伊曲康唑)。口服抗真菌剂具有严重的副作用例如胃肠不适，甚至可能引起肝功能衰竭。据报道通常25-50％的病例会复发，由于预期的副作用和治疗时间的长度，许多患者不愿意接受疗程，且经常只有当疾病变得加剧(aggressive)时才会开始治疗。目前口服或局部治疗可能需要6-12个月才会起作用。口服治疗必须使体循环充满(saturate)以到达脚趾，且增加的剂量加大了胃肠并发症和肝脏并发症的风险。局部治疗对变厚指甲的渗透是无效的，而且还需要高剂量。
足癣(Athlete’s Foot)(也被称为脚的癣菌病(ringworm of the foot)、脚癣(Tinea pedis)或平底靴足癣(moccasin foot))是通常由毛癣菌属(Trichophyton)真菌(最常见红色毛癣菌(T.rubrum)或须癣毛癣菌(T.mentagrophytes))引起的皮肤真菌感染。引起足癣的各种寄生菌也可能引起其他皮肤感染例如甲癣和股癣。虽然与指甲真菌感染不同，但足癣也有依从性(compliance)和治疗时间的问题。
曲霉病由曲霉属(Aspergillus)真菌导致的肺部感染引起。这种感染与许多病症例如肺结核和慢性阻塞性肺部疾病相关。即使在使用联合治疗方法时，这种感染也常常是难以治疗的。越来越多的曲霉属真菌感染对三唑有耐药性。
真菌性角膜炎是由真菌感染引起的角膜炎症。纳他霉素眼用混悬液(Natamycinophthalmic suspension)经常用于丝状真菌感染，而建议将氟康唑眼用溶液用于念珠菌感染(Candida infection)。两性霉素B滴眼剂用于难以治疗的病例，然而，这些滴眼剂在个体中可能是有毒性的。
口腔念珠菌病是由念珠菌属(Candida)物种引起的口腔粘膜真菌感染。口腔念珠菌病在免疫缺陷患者中特别成问题，因为常常难以成功治疗。
本发明的目的是解决与目前抗真菌治疗相关的一个或多个上述问题。本发明的又一个目的是提供局部抗真菌治疗。本发明的另一个目的是提供可使抗真菌剂穿过许多机体组织例如指甲和/或真皮、粘膜以及角膜和/或巩膜的更好地渗透的治疗。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供用于治疗真菌感染的包含能形成纳米微粒的聚合物和抗真菌剂的局部组合物。
通过由聚合物和抗真菌剂形成纳米微粒，本发明人有利地发现，抗真菌剂能更有效地被细胞吸收，因此可配制成局部药物，其不仅具有较慢的释放曲线，而且具有可局部递送而非全身递送的减少的治疗剂量，从而消除一些经口施用的抗真菌剂的危险。通过使安全的纳米聚合物递送系统与有效的抗真菌剂组合，可提供能提高疗效并潜在地使目前感染的治疗时间线从6个月减少至6周的局部治疗。
术语“局部组合物”意指应用于(或能够应用于)体表的外表面，例如皮肤、指甲、眼睛、细支气管、粘膜、口和胃肠道的组合物。
术语“纳米微粒”意指平均直径的范围大致为0.5-200nm的结构。优选地，纳米微粒的范围为1-150nm，更优选地范围为2-120nm，最优选地为5-120nm。在某些情况中，优选地纳米微粒的上限范围为约100-120nm，更优选地范围为50-175nm，甚至更优选地范围为75-150nm，最优选地范围为110-140nm。在其他情况中，优选地纳米微粒的下限范围为0.5-10nm，更优选地范围为0.5-8nm，甚至更优选地为1-7nm，最优选地为约7nm或更低。术语“抗真菌剂”意在涵盖能抑制引起真菌感染的真菌的生长和/或存活的一系列化合物和分子。
优选地，所述聚合物包含直链和/或支链或环状聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物。所述直链和/或支链或环状聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物可以是根据下面的式1a或式1b的化合物，下面的表A和表B中提供了实例：
式1a
Figure BDA0000947750870000041
式1b
Figure BDA0000947750870000042
其中：
“n”是指聚合物中重复单元的数目，n可从2至1000例如从2或5至10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900变化；
G1和G2独立地表示包含双胍或胍的阳离子基团，其中L1和L2直接连接胍的氮原子。因此，双胍或胍基团是聚合物骨架不可或缺的部分。式1a中双胍或胍基团不是侧链部分。
阳离子基团的实例：
双胍
Figure BDA0000947750870000043
(如PHMB中)
或者
胍
Figure BDA0000947750870000051
(如PHMG中)
本发明中，L1和L2是聚合物中G1和G2阳离子基团之间的连接基团。L1和L2可独立地表示含有C1-C140碳原子的脂肪族基团，例如烷基诸如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140烷基；或者L1和L2可(独立地)为C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)的脂环族基、杂环基、芳香族基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基；或者L1和L2可(独立地)为可选地被一个或多个优选一个氧原子、氮原子或硫原子、官能团以及饱和或不饱和环部分(cyclic moiety)中断的聚亚烷基。适合的L1和L2的实例是列于表A中的基团。
L1、L2、G1和G2可以使用脂肪族基、脂环族基、杂环基、芳基、烷基芳基和氧化烯基进行修饰。
N和G3优选是末端基团。通常，本发明中使用的聚合物具有端基氨基(N)和氰基胍(G3)或胍(G3)末端基团。这样的末端基团可以通过连接脂肪族基、脂环族杂环基、杂环基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基来修饰(例如使用1,6-二氨基己烷、1,6-二(氰基胍基)己烷、1,6-二胍基己烷、4-胍基丁酸)。此外，末端基团可以通过连接受体配体、右旋糖酐、环糊精、脂肪酸或脂肪酸衍生物、胆固醇或胆固醇衍生物或聚乙二醇(PEG)来修饰。可选地，聚合物可以以胍或双胍或氰基胺或胺或氰基胍的N和G3位置作为末端，或者以氰基胺的N和氰基胍的G3位置作为末端，或者以胍的N和氰基胍的G3位置作为末端，或者以L1-胺的G3和氰基胍的N位置作为末端。G3可以是L1-胺、L2-氰基胍或L2-胍。根据聚合的数目(n)或聚合物链的断裂和合成期间的副反应，末端基团的不均匀(heterogeneous)混合物可能如上所述作为实例出现。因此，如上所示，N和G3基团可相互交换/以不均匀混合物形式存在。或者，N和G3可以不存在且聚合物可为环状，在这种情况下各自的末端L1和G2基团可彼此直接连接。
式1b中，X可以存在或者不存在。L3、L4和X是如上针对“L1或L2”所提到的。因此，L3和L4和X是聚合物中G4和G5阳离子基团之间的连接基团。L3、L4和X可独立地表示含有C1-C140碳原子的脂肪族基团，例如烷基诸如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140烷基；或者L3、L4和X可独立地为C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10，C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)的脂环族基、杂环基、芳香族基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基；或者L3、L4和X可独立地为可选地被一个或多个优选一个氧原子、氮原子或硫原子、官能团以及饱和或不饱和环部分中断的聚亚烷基。适合的L3、L4和X的实例是列于表B中的基团。
“G4”和“G5”是阳离子部分且可以是相同或不同的。它们中至少一个是双胍部分或氨基甲酰基胍，另一部分可以是如上所述(双胍或氨基甲酰基胍)或胺。为避免歧义，式1b中，阳离子部分G4和G5不含仅为单个胍的基团。例如，G4和G5通常不含单个胍的基团。这样的化合物的实例如表B所列出的聚烯丙基双胍、聚(烯丙基双胍基-共-烯丙基胺)、聚(烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙基胺)、聚乙烯基双胍。
聚烯丙基双胍的实例如下所示：
Figure BDA0000947750870000061
在聚烯丙基双胍的情况中，L3和L4是相同的，G4和G5是相似的，因此聚烯丙基双胍可以简化为如下：
Figure BDA0000947750870000071
聚(烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙基胺)的实例如下所示：
Figure BDA0000947750870000072
用于本发明的聚合物通常具有与它们相关联的反离子(counter ion)。适合的反离子包括但不限于以下：卤化物(例如氯化物)、磷酸盐、乳酸盐、膦酸盐、磺酸盐、氨基羧酸盐、羧酸盐、羟基羧酸盐、有机磷酸盐、有机膦酸盐、有机磺酸盐和有机硫酸盐。
用于本发明的聚合物可以是不同“n”数值聚合物的不均匀混合物或包含特定“n”数值的由标准纯化方法纯化的均匀片段。如上所示，聚合物也可以是环状的，且另外可以是支链的。
“n”的优选数值包含2-250、2-100、2-80和2-50。
表A.源于式1a的聚合物类似物的实例。
Figure BDA0000947750870000073
Figure BDA0000947750870000081
源于式1a的示例性化合物的CAS编号
Figure BDA0000947750870000082
表B.源于式1b的聚合物类似物的实例。
Figure BDA0000947750870000083
本发明的方法中使用的聚合物可包含直链和/或支链或树枝状(dendrimeric)分子。所述聚合物可包含直链和/或支链或树枝状分子的组合。例如如上所述，所述聚合物可包含式1a或式1b分子的一种或任何组合。
例如，所述聚合物可包含以下中的一种或多种：聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)或聚亚乙基六亚甲基双胍(PEHMB)。一些实例在表A和表B中列出。
因此，所述聚合物可包含以下中的一种或多种的均匀或不均匀混合物：聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)、聚亚乙基六亚甲基双胍(PEHMB)、聚亚甲基双胍(PMB)、聚(烯丙基双胍基-共-烯丙基胺)、聚(N-乙烯基双胍)、聚烯丙基双胍。
最优选的聚合物包含聚六亚甲基双胍(PHMB)。
所述纳米微粒可与抗真菌剂一起形成或在抗真菌剂的存在下形成。可使用不同的方法形成纳米微粒，并可以想到所述纳米微粒作为聚合物和抗真菌剂的复合物来形成。然而，聚合物纳米微粒可独立地形成，然后用抗真菌剂孵育，以便所述抗真菌剂被吸收或附于纳米微粒上，从而以这样的方式保持其对抗真菌的疗效。
在本发明的一个实施方案中，通常全身性施用的抗真菌剂在所述组合物中以少于抗真菌剂的治疗有效全身剂量的剂量存在。由于局部组合物可以更有效地向感染部位施用所述抗真菌剂，因此可减少剂量，且这可以减少与一些药剂相关的潜在毒性问题。
对本领域技术人员显而易见的是，所述组合物可进一步包含一种或多种以下组分：缓冲剂、赋形剂、粘结剂、油、水、乳化剂、甘油、抗氧化剂、防腐剂和芳香剂，或局部乳膏或软膏中常见的任何其他成分。此外，所述组合物可以是许多形式例如膏剂或用于喷雾装置使用的混悬剂或配制为与微针阵列递送系统结合使用。如果应用微针阵列，那么可将其并入粘合贴片(adhesive patch)中。
对于某些应用，所述组合物可另外包含渗透剂，从而将抗真菌剂递送到感染区。例如，可使用尿素以使纳米微粒攻破(breach)患有指甲真菌感染的个体的指甲，这种情况中所述感染在指甲下面或在指甲本身。
本发明的组合物也可经鼻内或通过吸入施用，并且可方便地以干粉吸入剂形式递送或借助于适合的推进剂从高压容器、泵、喷雾器(spray)或雾化器(nebuliser)中以呈现为气溶胶喷雾(aerosol spray)的形式递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他适合的气体。在高压气溶胶的情况中，可通过提供阀门以递送计量的量(metered amount)来确定剂量单位。所述高压容器、泵、喷雾器或雾化器可含有所述组合物的溶液或混悬液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，例如山梨醇酐三油酸酯(sorbitan trioleate)。用于吸入器或吹入器(insufflator)中的胶囊和盒(cartridge)(例如，由明胶制成)可配制为含有本发明的组合物和适合的粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
优选地将气溶胶或干粉制剂设置为使得每个计量的剂量或“喷(puff)”含有至少1μg的递送给患者的组合物。可以理解，气溶胶的总日剂量会因患者而异，全天可以以单次剂量或更通常地以分次剂量施用。
或者，本发明的组合物可以以栓剂或阴道栓(pessary)的形式施用，或者其可以以洗液、溶液、乳膏、软膏或扑粉(dusting powder)的形式局部应用。本发明的组合物也可经皮施用，例如通过使用皮肤贴片。它们也可以通过眼睛途径施用，特别是用于治疗眼睛的疾病。
对于眼睛的使用，本发明的组合物可使用纳米微粒系统配制或在等渗、pH调节的无菌生理盐水中配制为微粒化的混悬液，或优选地在等渗、pH调节的无菌生理盐水中配制为溶液，可选地与防腐剂例如苯扎氯铵组合。或者，它们可在软膏例如凡士林中配制。
对于对皮肤的局部应用，本发明的组合物可配制为含有活性化合物的适合的软膏，所述活性化合物混悬于或溶解于例如一种或多种以下的混合物中：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，它们可以配制为混悬于或溶解于例如一种或多种以下的混合物中的适合的洗液或乳膏：矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
如本文上述的局部组合物可用于治疗多种真菌感染。然而，其特别适用于治疗指甲真菌感染、足癣或其他类型的皮肤真菌感染/皮肤癣菌感染(例如腹股沟癣(股癣)、身体之癣(体癣)、头皮之癣(头癣)、其他“癣”型感染)。本发明也适用于治疗酵母感染例如但不限于擦烂(intertrigo)、花斑癣和鹅口疮(白色念珠菌(Candida albicans))。
当然，所应用的抗真菌剂主要受其对引起感染的真菌的疗效支配。抗真菌剂可包含一种或多种选自下组的药剂：制霉菌素、特比萘芬、酮康唑、两性霉素B、伊曲康唑或黄连素。
所述真菌感染可包括皮肤癣菌感染。然而，本发明也可用于治疗酵母感染和/或定殖(colonisation)。
在本发明的其他方面，提供用于治疗真菌感染的包含聚六亚甲基双胍和抗真菌剂的纳米微粒组合的局部药物。
根据本发明的其他方面，提供与抗真菌剂一起或者联合抗真菌剂形成一种或多种纳米微粒的聚六亚甲基双胍(PHMB)在制备局部药物中的用途。所述纳米微粒用作将抗真菌剂向感染区递送的递送载体，并且在治疗真菌感染时也形成协同效应。参考本发明的第一个方面，对本领域技术人员显而易见的是可使用PHMB形成本文上述的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供生产用于治疗真菌感染的局部组合物的方法，包括将能形成纳米微粒的聚合物与抗真菌剂在适于允许纳米微粒形成的条件下混合。此外，应用所述方法生产本文上述的组合物将是显而易见的。
在本发明的另外方面中，提供包含能形成纳米微粒的聚合物和抗真菌剂的组合物与微针阵列的组合，其用于治疗指甲真菌感染。所述微针阵列可并入粘合贴片中。所述微针阵列的长度小于2mm。更优选地，所述微针阵列的长度小于1.5mm。最优选地，所述微针阵列的长度小于1mm。优选地，插入皮肤中的微针小于500μm。更优选地，插入皮肤中的微针小于400μm。最优选地，插入皮肤中的微针为约200-300μm。优选地，所述微针将所述组合物施用于真皮和/或表皮。
附图说明
现在仅通过实施例，参考以下实验和附图来描述本发明的实施方案，其中：
图1是显示当与PHMB组合时抗真菌剂对抗酿酒酵母EBY100(Saccharomycescerevisiae EBY100)的最小抑制浓度(MIC)减少的图。实心正方形表示单用药物的MIC，实心圆形表示当与PHMB组合时药物的MIC。每种药物的MIC的减少倍数为：制霉菌素-2倍，两性霉素B-4倍，黄连素-2倍，酮康唑-4倍和特比萘芬-8倍；
图2是显示当与PHMB组合时抗真菌剂对抗酿酒酵母NOD 24(Saccharomycescerevisiae NOD 24)的MIC的图。实心正方形表示单用药物的MIC，实心圆形表示当与PHMB组合时药物的MIC。每种药物的MIC的减少倍数为：制霉菌素-4倍，两性霉素B-16倍，黄连素-16倍，酮康唑-4倍和特比萘芬-16倍；
图3是显示当与PHMB组合时抗真菌剂对抗白色念珠菌的MIC减少的图。实心正方形表示单用药物的MIC，实心圆形表示当与PHMB组合时药物的MIC。每种药物的MIC的减少倍数为：制霉菌素-2倍，两性霉素B-2倍，黄连素-2倍，酮康唑-4倍和特比萘芬-4倍；
图4A-4E是显示当与PHMB组合时抗真菌剂的荧光性/吸光度变化的图。在存在和不存在PHMB的情况下检测荧光化合物的荧光发射强度的变化。酮康唑(图4A)、两性霉素B(图4B)、黄连素(图4C)和制霉菌素(图4D)的荧光降低(荧光猝灭)。在存在和不存在PHMB的情况下检测特比萘芬的吸光度的变化，发现吸光度增加(增色效应)(图4E)；
图5(a)和(b)是显示使用动态光散射检测的所形成的微粒的尺寸分布的图。图5(a)显示当黄连素与PHMB以1:3的比例组合时所形成的微粒的尺寸分布(平均尺寸＝22.22±1.591nm)，而图5(b)显示当酮康唑与PHMB以1:3的比例组合时所形成的微粒的尺寸分布：峰1的平均尺寸＝1.15±0.017，峰2的平均尺寸＝5.88±0.71，峰3的平均尺寸＝498.9±65.2；
图6显示白色念珠菌的荧光显微镜图像，表明当与PHMB组合时，黄连素的递送增强。A＝用DAPI染色的未处理的白色念珠菌，因此核是蓝色的。B＝单用1μg/ml黄连素处理的白色念珠菌，由于黄连素的递送量小，因此细胞质内显示绿色荧光。C＝用1μg/ml黄连素和1.25μg/mlPHMB处理的白色念珠菌，显示细胞质的绿色荧光增强，表明黄连素的递送增加。条(bar)＝5μm；
图7显示当单用黄连素处理和用黄连素和PHMB的组合处理时，黄连素阳性白色念珠菌细胞的流式细胞仪分析的图。细胞的％表示为一式三份的平均值±SD。该图表明，随着PHMB的浓度从1.25μg/ml增加至5μg/ml，向细胞的递送增加。对于每个黄连素的浓度，柱表示如下：单用黄连素、1.25μg/ml的PHMB、2.5μg/ml的PHMB和5μg/ml的PHMB；
图8是显示所生产的包含特比萘芬和PHMB的纳米微粒的纳米微粒尺寸/浓度的图；
图9是显示所生产的包含特比萘芬和PHMB的纳米微粒的纳米微粒尺寸/相对强度的图；
图10是显示所生产的包含特比萘芬和PHMB的纳米微粒的纳米微粒尺寸/相对强度3D图的图；
图11是带指甲的手指的俯视图，其使用用于递送本发明的组合物的微针贴片处理；
图12是图11所示的手指的横截面图；以及
图13是微针贴片的横截面图。
具体实施方式
以下实验的目的是研究使用基于纳米技术的递送系统和阳离子聚合物聚六亚甲基双胍(PHMB)是否能增强抗真菌剂的细胞递送。实验还探索了抗真菌剂和可与小分子形成纳米微粒的PHMB组合的新策略。PHMB是敷料(dressing)、游泳池和隐形眼镜液中常用的便宜的、容易获得的消毒剂和抗菌剂。认为其抗菌作用是通过破坏生物体的细胞膜从而引起细胞内容物渗漏来起作用。实验还评估了抗真菌剂和PHMB的组合是否能减少药物的剂量从而减少毒性和/或增加药物内化，以及是否存在任何的协同效应。
实验关注具有抗真菌作用的细胞内靶点的抗真菌剂，但由于溶解度问题、毒性和耐药性，目前次优选用于诊所。与临床使用的抗真菌剂一起，还研究了证明具有体外抗真菌活性的新候选者(candidate)黄连素(Zhao et al.,(2010)J.Therm.Analysis andCalorimetry,102,49-55)。选择的候选者示于下面表1中。
表1
Figure BDA0000947750870000141
使用棋盘试验(chequerboard assay)评估白色念珠菌、酿酒酵母NOD 24和酿酒酵母EBY 100的临床分离株对抗真菌剂和PHMB的组合的体外敏感性。还评估了药物和PHMB之间、纳米微粒的形成和细胞摄取之间的相互作用。
抗真菌剂
从Sigma-Aldrich,UK(英国)得到粉末形式的制霉菌素、特比萘芬、酮康唑和黄连素。从Sigma得到去离子水中溶液形式的两性霉素B。二甲亚砜(DMSO)也来自Sigma。在DMSO中制备制霉菌素储备液(5mg/ml)、特比萘芬储备液(15mg/ml)、酮康唑储备液(5mg/ml)和两性霉素B储备液(0.2mg/ml)。将黄连素溶解于水中从而制得10mg/ml的储备液。也在水中制得PHMB储备液(5mg/ml)。将所有的储备液制成500μl的不同等份，在-20℃下并避光保存。
菌株
研究酿酒酵母的两个菌株和白色念珠菌的一个临床分离株。从Royal VeterinaryCollege(皇家兽医学院)得到酿酒酵母NOD 24，从英国Allinson
Figure BDA0000947750870000151
得到酿酒酵母EBY 100。还从Royal Veterinary College得到白色念珠菌的临床分离株。
培养基
得到粉末形式的RPMI 1640培养基，将其溶解于蒸馏水中，根据标准程序用0.165M的吗啉代丙烷磺酸(MOPS)缓冲。使用1M氢氧化钠溶液调节pH为7。得到粉末形式的沙氏葡萄糖琼脂(SGA)。所有的培养基和化学品均来自英国Sigma-Aldrich。
接种体制备
通过从24小时生长的SGA培养中取5个菌落并在含有MOPS的RPMI 1640中混合来制备酵母接种体。通过分光光度测定，将混合物的光密度调节至1，其相当于每毫升3×107个酵母的菌落形成单位。在含有MOPS的RPMI 1640中进一步稀释该混悬液，得到终接种量为0.5×104CFU/ml。
棋盘滴定试验
根据CLSI建议的标准程序，在无菌96-孔板中进行棋盘滴定试验，以检测单用药物和与PHMB组合的抗真菌效果。将MOPS缓冲的RPMI1640培养基用作试验培养基。如果在DMSO中制备储备液，则在试验培养基中制备药物稀释液，在水中制备储备液的情况中，则用水本身制备药物的进一步稀释液。检测的浓度为：制霉菌素0.000039mg/ml-0.02mg/ml，两性霉素B 0.032mg/ml-0.0000625mg/ml，黄连素0.01mg/ml-0.00002mg/ml，酮康唑0.032mg/ml-0.0000625mg/ml，以及特比萘芬0.16mg/ml-0.00031mg/ml。在所有的板上都有生长对照和无菌对照。一式三份制备所有的板。
孵育以及最小抑制浓度(MIC)和部分抑制浓度指数(FICI)的计算
用石蜡箔将板密封以防止蒸发，白色念珠菌保持在37℃，酿酒酵母保持在30℃。视觉记录MIC，24小时后对白色念珠菌和酿酒酵母NOD 24辅助使用Powerwave 340通用微孔板分光光度计(Biotek)。但由于在生长对照孔内甚至24小时后也没有生长，因此在48小时后记录酿酒酵母EBY100的MIC。MIC定义为最低浓度，在该浓度下没有可见的生长。FICI用于分析体外药物的相互作用，并使用以下给出的等式计算：
Figure BDA0000947750870000161
根据推荐的标准解释FICI值(FICI≤0.5是“协同效应”，>0.5但≤4是“无相互作用”，>4是“拮抗效应”)。
荧光性和吸光度研究
通过荧光检测荧光抗真菌剂与PHMB的相互作用。使特定浓度的每种药物与不同浓度的PHMB相互作用，研究荧光强度的变化。在96孔平底石英板中进行实验。以1:0-1:10的w/w比将150μg/ml黄连素、5μg/ml酮康唑和5μg/ml两性霉素B与PHMB混合。以1:0-1:4的w/w比将50μg/ml制霉菌素与PHMB混合。在不具有荧光的特比萘芬的情况中，研究吸光度的变化。以1:0-1:5的w/w比将10μg/ml特比萘芬与PHMB混合。在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中从储备液制备除黄连素之外的所有药物的溶液，因为该浓度下黄连素在PBS中沉淀，所以用水制备黄连素溶液。通过移液管吸移(pipeting)使混合物完全混合，在室温下保持20分钟，然后检测其荧光性/吸光度变化。在Infinite M200Pro荧光计(Tecan)中检测荧光性。为了检测荧光强度，激发波长和发射波长分别为：制霉菌素：320nm和410nm，两性霉素B：340nm和480nm，黄连素：350nm和550nm，酮康唑：260nm和375nm。在特比萘芬的情况中，使用ND1000分光光度计(纳米微滴(Nanodrop))研究吸光度变化。特比萘芬的吸收峰在272nm。绘制272nm处最大吸光度相对PHMB浓度的变化。
微粒形成和粒径测定
用动态光散射(DLS)估计所形成的复合物的尺寸。其基于以下原理，即可通过测量运动中的微粒的散射光来测定它们的尺寸。以1:3的w/w比将抗真菌剂(100μg/ml)和PHMB在PBS中完全混合，并在室温下保持20分钟。使用Zetasizer S(Malvern instruments，英国)测定粒径。
显微镜检查
由于化合物的荧光足以由显微镜检查(microscopy)检测到，因此可视觉检测黄连素的细胞递送。单用黄连素以及还使用黄连素与PHMB的组合处理白色念珠菌细胞。通过移液管吸移3-4次将50μl的1μg/ml、2μg/ml和3μg/ml的黄连素溶液与50μl的1μg/ml和2.5μg/ml的PHMB在无菌96孔板中适当地混合，并在室温下保持20分钟。将RPMI 1640中100μl白色念珠菌细胞加入到这些孔中、100μl单用黄连素的溶液中和100μl的PBS中，并在37℃下保持1小时。将每个孔的内容物转移至微量离心管(eppendorf tube)中，并在5000rpm下离心10分钟。除去上清液后，向每个管中加入100μl 2.5μg/ml的4’,6’二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，以使真菌核染色。在琼脂糖床(agarose bed)中制备载玻片，使用油浸镜(oil immersionlens)在DM4000直立式荧光显微镜(莱卡微系统)下观察。
流式细胞术
当与PHMB组合时，使用流式细胞仪定量检测黄连素向白色念珠菌的细胞递送。在96孔板中，用1μg/ml-5μg/ml的单用的黄连素和这些浓度与1.25、2.5、5μg/ml的PHMB组合来处理酵母细胞。该程序与显微镜检查的程序完全相同。离心后，除去100μl上清液，加入400μl PBS，使用FITC(异硫氰酸荧光素)过滤器在FACS CantoTMII流式细胞仪(BD Biosciences)中检测黄连素的递送。使用FACS Diva软件获取数据并用Flowjo 5.6.5软件分析数据。
统计学分析
用威氏符号轶次检验(Wilcoxon signed rank test)统计分析当与PHMB组合时抗真菌剂的MIC变化。认为P值小于0.05是有显著性的。使用2.0版的SPPSS软件进行统计学分析。
棋盘试验
通过评估抗真菌剂的MIC变化来测量真菌对选择的抗真菌剂及其与PHMB的组合的棋盘试验的敏感性，从而了解当PHMB和药物共同起作用时是否存在任何的减少。当与PHMB组合时，所有的药物均表现出MIC显著性降低(p值＝0.043)。抗真菌剂的MIC和FICI值总结于下面表2中。
表2
Figure BDA0000947750870000181
图1-3显示了MIC的下降。与小于0.00005mg/ml的PHMB组合的所有药物均表现出对所有生物体的MIC下降。当与下面表3所示的抗真菌剂组合时，PHMB的MIC也存在显著性降低(p值＝0.045)。
表3
Figure BDA0000947750870000191
在棋盘试验期间，我们遇到了特比萘芬在培养基中的溶解度问题。
但该问题通过将特比萘芬在37℃下保持10分钟而得到解决。一些抗真菌剂表现出协同作用。不出所料，不同药物针对不同生物体的MIC存在差异。观察到抗真菌剂针对酿酒酵母NOD 24的MIC有巨大下降。在特比萘芬和酮康唑情况中发现了与PHMB的强协同作用。在两性霉素B的情况中，当针对酿酒酵母EBY 100进行检测时，也观察到协同作用。棋盘试验的结果表明PHMB可增强这些抗真菌剂的作用。
荧光性和吸光度研究
通过研究PHMB和抗真菌剂的荧光强度变化来检测它们之间的相互作用。结果描述于图4中。所有化合物的荧光性均有降低。在酮康唑和PHMB的比例为1:6时，其荧光性下降至接近50％。制霉菌素的荧光性显示仅有小的降低。研究期间，发现黄连素在PBS中沉淀，因此使用水作为溶剂。黄连素的荧光性有下降，但之后开始略微增加，但不会超过单用黄连素的样品。两性霉素B中也观察到相似的情况。样品荧光性的这种下降称为荧光淬灭。在特比萘芬的情况中，发现吸光度略微增加。这称为增色效应。荧光淬灭和增色效应表明PHMB与抗真菌剂相互作用。
所形成的微粒的尺寸
使用DLS测定PHMB和抗真菌剂之间形成的复合物的尺寸。在酮康唑和黄连素的情况中观察到纳米微粒(图5)。但在酮康唑的情况中，也存在一些较大尺寸的微粒。在黄连素(图5(a))的情况中，64.5％的微粒为22.2±1.5nm左右。但对于酮康唑(图5(b))而言，仅有小于10％的微粒的尺寸小于10nm。多分散指数大于1，意味着更宽的粒径分布。在其他药物的情况中，观察到微粒为50至≤1000nm。结果表明，PHMB与所有抗真菌剂形成微粒，其中与特比萘芬、酮康唑和黄连素形成纳米微粒。
显微镜检查
使用荧光显微镜检查检测黄连素向白色念珠菌的细胞递送。与图6描述的单用黄连素相比，当黄连素与PHMB组合时，细胞的荧光性有相当大的增加。当PHMB的浓度增加时，也观察到相同浓度的黄连素的荧光性增加。图6显示仅有一个黄连素浓度，但对于所有研究的浓度均观察到相似的结果。结果表明，与单用黄连素相比，加入PHMB时，进入细胞的黄连素增加。这定性地证明PHMB可增强黄连素向真菌的递送。
流式细胞术
使用流式细胞术量化黄连素向白色念珠菌的递送的增加。因为黄连素的发射峰在FITC的吸收光谱内，所以使用FITC过滤器。如图7所示，当黄连素与PHMB组合时，许多黄连素阳性的细胞中存在明显增加。该观察类似于显微镜检查，即在黄连素阳性细胞中随PHMB浓度的增加而增加。在单用黄连素的更高浓度中也观察到略微增加。这些结果表明，PHMB增加黄连素向白色念珠菌的细胞递送。
结果
PHMB是低毒、临床上安全的抗菌剂，实验表明通过使抗真菌剂与该阳离子聚合物组合能增强抗真菌剂的递送。当药物与PHMB组合时，检测药物针对白色念珠菌和酿酒酵母的抗真菌活性的变化。使用荧光性/吸光度研究和动态光散射检测聚合物和药物之间的相互作用。使用流式细胞术和荧光显微镜检查研究黄连素的细胞递送。
实验表明，当与PHMB组合时，所有药物的MIC存在显著性降低(p值＝0.043)。在PHMB的存在下，所有研究药物的荧光强度和吸光度也改变，表明了相互作用。通过动态光散射确认了药物-PHMB的相互作用。在黄连素、特比萘芬和酮康唑的情况中观察到纳米微粒。通过使用显微镜检查可见黄连素向白色念珠菌的细胞递送增加，并通过流式细胞术量化。
PHMB可增强抗真菌剂的作用，形成纳米微粒，并提高黄连素的细胞递送，并可以想到在PHMB与抗真菌剂的组合中使用纳米微粒会将改善体外抗真菌活性。
因为如表2所示，所有药物的MIC都降低，所以PHMB可增强所有研究药物的抗真菌作用。对酮康唑、特比萘芬和两性霉素B观察到协同作用。
假定PHMB与选择的抗真菌剂形成纳米微粒。当制霉菌素、特比萘芬和两性霉素B与PHMB以1:3的比例组合时，没有检测到纳米微粒。检测到在500-1000nm尺寸范围内的更大尺寸的微粒。这可能是由于聚合(aggregation)或沉淀。然而，认为以不同的比例组合药物和PHMB时，除改变形成微粒的温度、改变培养基/反应溶剂和调节pH之外，还会引起纳米微粒形成。
该研究探索的另一种药物递送技术在细胞内和局部真菌感染以及高度真菌耐药的感染中有潜在应用。由于穿过细胞膜运输困难和在细胞内活性降低，因此由细胞内真菌如荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)和新隐球菌(Cryptococcus neoformans)引起的感染难以治疗。与现有技术相比，基于药物递送系统的PHMB可提供比较便宜的溶液，并允许使用更低剂量的抗真菌剂。
可以想到PHMB(或能形成纳米微粒的实际上类似的聚合物)可与抗真菌剂组合，以靶向下面表4所列出的真菌。
表4
属 物种
毛癣菌属(Trichophyton) 须癣毛癣菌(mentagrophytes)
毛癣菌属(Trichophyton) 红色毛癣菌(rubrum)
表皮癣菌属(Epidermophyton) 絮状表皮癣菌(floccosum)
用特比萘芬和PHMB形成纳米微粒
进行用特比萘芬和PHMB形成纳米微粒的实验。
将特比萘芬溶解于DMSO中，储备液浓度为10mg/ml。然后将其在超纯水中进一步稀释至1mg/ml的浓度(将20μl 10mg/ml的特比萘芬加入到180μl的H2O中，通过涡流(vortexing)充分混合)。
在60℃下将PHMB(水中1mg/ml)加热20分钟，然后在使用前将其冷却至室温。
将PHMB:特比萘芬的比例保持在3:1不变，因为这样提供了检测条件中至今最优的纳米微粒尺寸和数目。
配制PHMB/特比萘芬纳米微粒：
用10倍的30:10(μg/ml PHMB:特比萘芬)纳米微粒制剂制成300μl。向1.5ml的无菌管中加入288μl的PBS。加入9μl的1mg/ml PHMB并通过移液管上下吸移5次来混合。然后加入3μl的1mg/ml特比萘芬并通过移液管上下吸移5次来混合。然后在PHMB的存在下在室温下孵育1小时，以形成纳米微粒。
然后用PBS将溶液进一步稀释10倍，用于在Nanosight LM10纳米粒子筛选机上测量(得到最终浓度为3μg/ml的PHMB和1μg/ml的特比萘芬)。
在Nanosight LM10机器(从Nanosight Limited，威尔特郡，英国得到)上读取在20℃、相机水平9、屏幕增益10和检测阈6时测量1分钟的值。
Nanosigh结果示于图8-10中，并总结于下表5中。
表5
粒径分布：平均:119nm，众数(Mode):126nm，SD:18nm
累计数据(nm)：D10:90，D50:121，D90:141，D70:130
用户线(User Lines):0nm，0nm
总浓度：1.27粒子/框，0.14E8粒子/ml
选择的浓度：0.00粒子/框，0.00E8粒子/ml
拟合曲线：平均:0nm，SD:0
完成的追踪：27
漂移速度：1331nm/s
如图8-10所示，生产包含PHMB和特比萘芬的纳米微粒，然后将其用于制备随后治疗一系列潜在真菌感染的局部药物。
微针贴片
经皮贴片长期用于可通过皮肤容易吸收的小分子亲脂性药物的施用。因为该非侵入性的递送途径可使得直接吸收药物进入体循环，绕过(by-passing)也可能大幅减少许多药物生物利用度的消化系统和肝门静脉系统，所以其有利于施用与口腔递送不相容的许多药物。通过大大减少患者不适、针刺焦虑、意外针刺损伤的风险，经皮递送也克服了与皮下注射相关的对施用者的许多挑战和关于锐器处置的问题。
尽管有这么多优点，药物的经皮递送限于与通过皮肤的吸收相容的那类分子。使用传统经皮递送来递送小分子盐和治疗性蛋白通常是不可行的，因为即使在吸收增强赋形剂的存在下，皮肤也会提供针对这些分子的有效保护屏障。然而，微针技术可用于将含有抗真菌剂的纳米微粒直接递送至表皮、真皮和指甲基质(nail matrix)(在那里，指甲和皮肤在指甲上皮处接触)。通过用这种方法递送本发明的组合物，纳米微粒会进入指甲基质和毛细管系统，并向硬指甲盖下的甲床递送抗真菌纳米微粒组合物，并到达真菌中。用这种方法可直接将有效的抗真菌剂递送至作用位点，从而减少治疗时间并增强效果。
图11和12显示手指10的图形，可向虚线所示的手指的治疗区12内应用微针贴片(如图13所示)。治疗区12由指甲14后面的真皮组成，也在指甲和皮肤接触的指甲基质(指甲上皮)16处。指甲根18位于指甲后真皮下的区域，因此可通过应用递送本发明组合物的微针贴片得到有效治疗。当然，除用于手指甲外，微针贴片还可用于脚趾甲。
图13显示可将本发明的组合物应用于患有指甲真菌感染的个体的微针贴片的图。微针贴片20由柔性网材料22形成，柔性网材料22的下面应用有粘合剂24。具有多个点30并向下延伸的微针26的阵列集中位于柔性网的下面。这些点可作为具有导管的针形成，所述导管与含有组合物的储层28连接，或者简单地使它们的点在组合物中得到覆盖。在另一个实施方案中，储层28可通过位于微针阵列附近的孔排出组合物，以便组合物在预定的时间框架内可连续覆盖阵列的点。显然对本领域技术人员而言，目前可用许多不同的微针贴片，本发明的组合物可适用于其一系列的使用。
可插入皮肤中的微针长度可小于2mm，优选为约250μm，具有最低的患者不适，考虑到产生的小孔，具有最小的注射后感染、出血风险，或真皮内施用的无意静脉注射(inadvertent IV injection)的风险。此外，因为在这些小突起(projection)下皮肤意外穿刺几乎不可能，所以微针减少了对注射施用者的风险。
可以想到微针贴片可用于单次治疗，所有患者需要做的是从包装纸除去贴片并将其应用于手指或脚趾的适当部分持续给定的时间段。在另一种情况中，微针贴片可与组合物组合出售，患者会在微针的表面覆盖一定量的组合物并以规定的方式将贴片应用于身体。贴片可在其外部具有标记，以便协助患者或医师正确地在待治疗的手指或脚趾上的正确位置排列微针。
气溶胶
可将本发明的组合物配制成气溶胶制剂。在该工作例中，用卡泊芬净(脂肽抗真菌剂)形成PHMB纳米微粒，并干燥。然后将干燥的纳米微粒加入到推进剂中。推进剂提供产生气溶胶云雾的力量，并且推进剂也是其中可混悬或溶解卡泊芬净纳米微粒活性组分的介质。
可使用一些推进剂，但一般而言必须具有：
·沸点范围为-100℃至+30℃
·密度约为1.2-1.5g cm-3(可混悬或溶解药物的大约密度)
·蒸汽压为40-80psig
·对患者没有毒性
·不易燃
·能溶解常用添加剂。活性成分应完全可溶或完全不溶。
用于哮喘吸入器的推进剂将是特别适用的，如氢氟烷烃(HFA)：HFA 134a(1,1,1,2,-四氟乙烷)或HFA 227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)或其组合。此外，或另一方面，可使用增加渗透和生物利用度的磷脂质。
当加入水分时，例如当制剂喷至肺部的湿润环境时，纳米微粒会被重构。优选该制剂包含在铝合金容器中，所述容器内部用含氟聚合物覆盖并用计量阀密封以便可分配计量的剂量。如果需要，也可安装雾化喷嘴和防尘帽。
以上实施方案并不旨在限制由权利要求书提供的保护范围，而在于描述如何使本发明付诸实践的实施例。

Claims (17)

1.用于治疗指甲或皮肤真菌感染的局部组合物，其包含聚合物和抗真菌剂，其中所述聚合物包含聚六亚甲基双胍，所述抗真菌剂包含一种或多种选自下组的药剂：特比萘芬、酮康唑和两性霉素B。
2.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述抗真菌剂在所述组合物中以少于所述抗真菌剂的治疗有效全身剂量的剂量存在。
3.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述组合物进一步包含赋形剂。
4.根据权利要求3所述的局部组合物，其中所述赋形剂为选自以下的一种或多种：缓冲剂、粘结剂、油、水、乳化剂、甘油、抗氧化剂、防腐剂和芳香剂。
5.根据权利要求3所述的局部组合物，其中所述组合物进一步包含尿素。
6.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述皮肤真菌感染包括足癣。
7.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述真菌感染包括皮肤癣菌感染和/或酵母感染。
8.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述组合物为乳膏、软膏、喷雾或粉末形式。
9.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述组合物通过微针阵列施用。
10.根据权利要求9所述的局部组合物，其中所述微针阵列并入粘合贴片中。
11.与或者联合抗真菌剂形成一种或多种纳米微粒的聚六亚甲基双胍在制备用于治疗指甲或皮肤真菌感染的局部药物中的用途，其中所述抗真菌剂包含一种或多种选自下组的药剂：特比萘芬、酮康唑和两性霉素B。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述纳米微粒用作将所述抗真菌剂向感染区递送的递送载体。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述聚六亚甲基双胍与所述抗真菌剂形成协同效应。
14.生产用于治疗指甲或皮肤真菌感染的局部组合物的方法，其包括将能形成纳米微粒的聚合物与抗真菌剂在适于允许纳米微粒形成的条件下混合，其中所述聚合物包含聚六亚甲基双胍，所述抗真菌剂包含一种或多种选自下组的药剂：特比萘芬、酮康唑和两性霉素B。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法用于生产权利要求1所述的组合物。
16.包含能形成纳米微粒的聚合物和抗真菌剂的组合物与微针阵列的组合，其用于治疗指甲真菌感染，其中所述聚合物包含聚六亚甲基双胍，所述抗真菌剂包含一种或多种选自下组的药剂：特比萘芬、酮康唑和两性霉素B。
17.根据权利要求16所述的组合，其中所述微针阵列并入粘合贴片中。
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