CN105543198A - 水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵制备普鲁兰酶技术领域，具体涉及水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用的专利申请。具体为：利用克雷伯氏菌发酵制备普鲁兰酶的过程中，将水杨酸钠添加于产酶培养基中；产酶培养基中水杨酸钠浓度大于0，但不超过100？μM。水杨酸钠能够抑制克雷伯氏菌荚膜多糖的合成，因而可以提高发酵液中的普鲁兰酶的酶活。实际检测结果表明，在普鲁兰酶产酶培养基中加入适量的水杨酸钠，显著提高了所制备的普鲁兰酶的酶活，表现出了较好的应用效果，因而具有较好地推广应用前景。

Description

水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用
技术领域
本发明属于发酵制备普鲁兰酶技术领域，具体涉及水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用的专利申请。
背景技术
普鲁兰酶(EC3.2.1.41)专一性地水解支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键，由于其能将最小单位的支链分解，最大限度的利用淀粉原料，因此在以淀粉为原料的食品发酵加工业中有着重要的用途，广泛应用于高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、啤酒及改性淀粉等的生产中。
克雷伯氏菌是目前普鲁兰酶的主要产生菌，然而，克雷伯氏菌在生长过程中合成的荚膜多糖则不利于普鲁兰酶发酵生产，既消耗了培养基中的营养物质，增加了培养基的粘度，降低了发酵液的溶氧速率，影响发酵产酶，也给酶的提取纯化带来困难。因此，减少克雷伯氏菌荚膜多糖的合成，将有利于提高普鲁兰酶的发酵生产。然而如何抑制克雷伯氏菌荚膜多糖的生成，及抑制荚膜多糖合成后普鲁兰酶的酶活等特性的改变情况尚未见到较为详细的研究报道。
发明内容
本发明目的在于提供水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的新应用，从而能够较好提高普鲁兰酶的酶活。
本发明所采取的详细技术方案如下所述。
水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用，利用克雷伯氏菌发酵制备普鲁兰酶的过程中，将水杨酸钠添加于产酶培养基中，可提高所制备的普鲁兰酶的酶活；产酶培养基中水杨酸钠浓度为大于0，但不超过100μM；水杨酸钠浓度具体例如为大于0并不超过50μM、10μM、20μM、30μM、40μM、60μM、70μM、80μM、90μM、10μM~50μM、30μM~50μM、50μM~100μM等等。
所述克雷伯氏菌具体例如为中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京）保藏编号为：CGMCCNO.10357的克雷伯氏菌菌株。
所述产酶培养基，以w/v表示，配方为：糯米粉0.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O0.01%，pH自然。
利用克雷伯氏菌发酵制备普鲁兰酶的过程中，发明人认为，水杨酸钠能够抑制克雷伯氏菌荚膜多糖的合成，因而可以提高发酵液中的普鲁兰酶的酶活。实际检测结果表明，在普鲁兰酶产酶培养基中加入适量的水杨酸钠，显著提高了所制备的普鲁兰酶的酶活，表现出了较好的应用效果，因而具有较好地推广应用前景。
附图说明
图1为产酶培养基中不同水杨酸钠终浓度的发酵液酶活，其中1、2、3、4、5、6分别表示水杨酸钠的终浓度为0μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM，“*”表示与对照组有显著差异（p<0.05）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对下述实施例中所涉及部分物料情况简要说明如下。
菌株：下述实施例中所用克雷伯氏菌菌株，目前保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京），保藏编号为：CGMCCNO.10357，该菌株的原始菌株由发明人筛选获得，因此发明人保藏有该菌株的备份。
试剂：
水杨酸钠母液（16.01mg/mL，即1mol/L）：1.601g水杨酸钠溶于100毫升灭过菌的蒸馏水中；使用时根据需要将水杨酸钠母液稀释成相应浓度即可；
0.5%普鲁兰糖溶液：称取0.5g普鲁兰糖加入到100ml蒸馏水中；
3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将3.15gDNS（3,5-二硝基水杨酸，化学纯）溶于131mL、2MNaOH热溶液中（10.48gNaOH溶于131mL蒸馏水中），加入250mL酒石酸钾钠热溶液（91g酒石酸钾钠溶于250mL蒸馏水中），再加2.5mL苯酚（固体加热）和2.5gNa2SO3，溶解后定容到500毫升的棕色瓶中，放置7天后使用。
培养基：
斜面培养基采用LB(Luria-Bertani)培养基（w/v）：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl1%（固体培养基含2.0%琼脂粉）；
种子培养基（w/v）：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，pH6.0；
产酶培养基（w/v）：糯米粉0.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O0.01%，pH自然；
上述培养基均采用高压蒸汽121℃灭菌20min。
实施例
本实施例以发酵制备普鲁兰酶的过程为例，对水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用效果进行了具体检验，相关实验过程介绍如下。
发酵制备普鲁兰酶的过程，具体如下。
第一，制备发酵用种子液，具体为：用接种环从保存的斜面培养基上挑取少量保存的克雷伯氏菌菌株（CGMCCNO.10357），接种于100mL的种子培养基中；34℃、220r/min培养大约16h；
第二，液体发酵产酶，具体为：在250mL的锥形瓶中置入产酶培养基100mL，灭菌后，按8%的体积比例接入第一步骤中所制备的种子液，然后加入适量水杨酸钠母液；为获得最适的水杨酸钠溶液浓度，发酵产酶时将发酵液分为6组，每组中水杨酸钠浓度分别为0μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM；将各组发酵液置于200r/min、30℃的摇床中发酵培养2天，以进行产酶；
第三，提取粗酶液，具体为：收集第二步骤中的发酵液，8000r/min、4℃离心20min，取上清，即为粗酶液。
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法对粗酶液中普鲁兰酶的酶活进行测定，具体的测定过程为：
（1）绘制葡萄糖标准曲线，具体为：
配制1mg/mL的葡萄糖标准液，取8支干净的试管，分别标记为1、2、3、4、5、6、7、8，依次加入0.0mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.3mL、0.35mL、0.4mL的葡萄糖标准液，然后用蒸馏水将每支试管定容到3mL，再分别加入1.5mL的DNS试剂，充分混合后在沸水中煮沸10min；
冷却后在540nm下测吸光值，以1号管为对照；
以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作葡萄糖标准曲线；
（2）测定普鲁兰酶活力，具体为：
首先取两支试管，分别加入所制备的普鲁兰酶粗酶液1mL和1mL的去离子水，将其中的一只试管置于沸水浴中加热10min，灭酶活作为对照；
然后，在上述两只试管中分别加入1mL、0.5%的普鲁兰多糖溶液；再后，同时将两只试管置于45℃恒温水浴锅中保温30min；
最后，在每只试管中再分别加入1.5mLDNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，然后置于沸水浴中10min显色；显色后将试管冷却，540nm波长下进行比色（以灭活酶液对照）；
根据测定的吸光度值查上述所绘制的葡萄糖标准曲线得到反应体系中的葡萄糖含量，然后代入下述公式计算普鲁兰酶酶活，
普鲁兰酶酶活=。
酶活定义：在45℃条件下，每分钟产生相当于1μmol萄萄糖还原力的酶活定义为1个酶活单位。
对含有不同浓度水杨酸钠的发酵液中的普鲁兰酶的酶活测定结果如下表所示（表中数据仅为平均值），同时依据测定数据绘制柱状图如图1所示；
。
从上表数据及图1可以看出，当产酶培养基中水杨酸浓度不超过100μM时，均能较为明显的提高普鲁兰酶的酶活，尤其是当产酶培养基中水杨酸浓度为50μM时，普鲁兰酶的发酵活力较不采用水杨酸钠的发酵液中的普鲁兰酶酶活提高159%，表现出了较好地应用效果。

Claims (4)

1.水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用，其特征在于，利用克雷伯氏菌发酵制备普鲁兰酶的过程中，将水杨酸钠添加于产酶培养基中；产酶培养基中水杨酸钠浓度大于0，但不超过100μM。
2.如权利要求1所述水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用，其特征在于，产酶培养基中水杨酸钠浓度为50μM。
3.如权利要求1所述水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用，其特征在于，所述克雷伯氏菌采用中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号为：CGMCCNO.10357的克雷伯氏菌菌株。
4.如权利要求1所述水杨酸钠在发酵制备普鲁兰酶过程中的应用，其特征在于，所述产酶培养基，以w/v表示，配方为：糯米粉0.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O0.01%，pH自然。
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