CN105524287B - 发酵‑淋溶联合从杜仲果壳中提取杜仲胶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从杜仲果壳中提取杜仲胶的方法，通过发酵、淋溶和纯化等步骤，得到杜仲精胶，所得精胶的纯度达到99.9％，胶提取率达到20％。相对于现有技术，该方法具有提取率高、提取周期短、成本低、环境污染少等优势。

Description

发酵-淋溶联合从杜仲果壳中提取杜仲胶的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用发酵、淋溶的方法从杜仲果壳中提取杜仲胶的方法，其中所提取得到的杜仲粗胶纯度能达到95％，具有分解速率增快，生产周期短等特点。
背景技术
杜肿胶是我国特有的资源，具有自身独特的性能，具有广泛的用途，是天然橡胶的最佳替代品，具有巨大的开发前景。杜仲胶可主要用于航天、航海、国防和医药等行业，且能够开发的领域和产品很多。我国是橡胶消费大国，天然胶资源的匮乏将严重制约我国橡胶工业的发展，寻找其他可代替橡胶的资源迫在眉睫。国家对天然胶资源的需求目前已提高至战略层次上，杜仲胶的产业化要求也越来越迫切，因此杜仲胶的产业化将是一个中长期的发展目标。
杜仲胶的提取方法目前分为化学法和生物法。化学法主要是通过酸碱对植物组织产生的水解破坏作用,使组织结构变得疏松,便于胶体从结构中提取出来。化学法主要有溶剂法(有机溶剂法、苯-甲醇法、溶剂-沉淀法、石油醚-乙醇法)、碱液浸提法、综合法等。化学方法存在许多缺点：溶剂法是利用有机溶剂将原料中的胶浸提出来，原料处理不够充分，胶不能完全浸出，且有机溶剂易燃、毒性大，安全性较差；碱液浸提法主要依赖碱洗除去杂质，需大量的NaOH，成本高且环境污染严重，多次冲洗胶丝流失大，产率低。生物法有微生物发酵法和酶解法，两者作用原理相同，都是通过纤维素木质素降解菌作用于原材料，经发酵或者纤维素菌产生纤维素酶破坏纤维素组分。但是生物方法在单独使用时存在一定的缺陷，即微生物发酵法存在发酵周期长等缺点，酶解法虽具有高效性、专一性等特点，但此法成本较高。而且酶解法目前只有纤维素酶酶解成本相对较低，而木质素酶成本极高，几乎无法应用。生物法在处理杜仲果壳(木质素含量高)时，分解木质纤维素结构产生比较细密的有机碎屑附着在木质纤维素结构的表面，从而阻碍了微生物接解到新鲜的木质纤维基质，而出现微生物老化现象不利于快速分解木质纤维素结构。
发明内容
根据目前的研发现状，本发明中采用发酵-淋溶的方法从杜仲果壳中提取杜仲胶，该方法先通过发酵分解果壳中的木质纤维，然后模拟降水进行淋溶以去除发酵分解得到有机碎屑，减少有机碎屑附着带来的影响，从而加速了分解速率，大大缩短了生产周期。本发明采用淋溶的方法，避免现有技术中高压水枪水洗过程中洗坏杜仲胶而带来的损失。再者，发酵-淋溶过程中明显缩短生产周期，所得粗胶的纯度高，得到的精胶的提取率也相应大大提升。
本发明提供一种从杜仲果壳中提取杜仲胶的方法，其具体步骤为：
步骤(1)接种球的制备：直径为1～5cm、孔径为0.5～2mm、多孔的玻璃陶瓷球置于盛有特制的琼脂培养基的高压灭菌锅(120℃，1.2大气压)中灭菌，冷却后将球体表面的琼脂用70摄氏度的热蒸馏水清洗，清洗后将球体在1L的白腐真菌发酵液中振荡培养7天，待用；
步骤(2)发酵：盛有10公斤杜仲果壳、孔径为3mm、体积为1m3的网箱置于已加入2L白腐真菌发酵液的发酵池中浸没发酵，发酵温度为20～30℃，发酵周期为7～16天，发酵pH值为4-7；
步骤(3)淋溶阶段：将步骤(2)所述的装有发酵剩余物的网箱从发酵池中取出，加入步骤(1)制备的接种球，细水流模拟降雨淋溶果壳8～16小时，直至清洗液为澄清状，每隔30min将网箱翻转10次；
步骤(4)：将步骤(3)清洗完成后剩余的材料重复发酵—淋溶过程3次，每次淋溶结束后，将其中的接种球取出，重复接种后再次利用，所得杜仲粗胶的纯度达到95％；
其中，所述的白腐真菌发酵液是指白腐真菌的土豆葡萄糖液体；
土豆葡萄糖液体具体制备过程为200g土豆煮沸30min后进行过滤，滤液冷却后与20g葡萄糖混匀的液体；
所述的特制的琼脂培养基是指由土豆葡萄糖液体与20g琼脂制备的。
一些实施例中，步骤(4)所得的杜仲粗胶与石油醚按重量比1:2在75℃水浴锅中提取2小时，趁热过滤，提取次数为3次，合并滤液，-20℃冷冻放置至有白色丝状沉淀，过滤，再用甲醇冲洗，即得杜仲精胶，纯度达到99.9％，提取率为20％。一些实施例中，甲醇的用量根据具体情况决定。
一些实施例中，步骤(1)所述的接种球的直径为3cm。
一些实施例中，步骤(2)发酵阶段的发酵温度为25℃，发酵周期为10天。
一些实施例中，步骤(3)所述淋溶阶段的淋溶时间为12小时。
在步骤(1)中，接种球清洗后，保证球体表面无多余的残留培养基，而孔隙内的培养基又保存完整，易于后期发酵菌的着床。玻璃陶瓷球的孔径，范围不能过大，过大接种菌不能附着，优选0.5～2mm。接种球的直径优选1-5cm，在4～5cm接种后，菌种的负重不牢靠，易脱落，优选在1～3cm。但直径在1、2cm时，由于球体过小，导致后续的淋溶阶段效果较差，粗胶纯度较低。清洗后的球体冷却后在已加入白腐真菌发酵液的1L锥形瓶中振荡培养。
在步骤(2)中所述的发酵，除了白腐真菌，能够用于发酵的菌类均可适用。本发明中白腐真菌在发酵中所使用的培养液为土豆葡萄糖液。土豆葡萄糖液具体制备过程为200g土豆煮沸30min后进行过滤，滤液冷却后与20g葡萄糖混匀后得到的液体。另外，本发明所用到的菌类均为白腐真菌，菌类的培养基均为土豆葡萄糖液的培养基。
在步骤(3)所述的淋溶阶段，相对于现有技术中的高压水泵或高压水枪冲洗，细水模拟降雨淋溶能有效的减少杜仲胶的流失，大大提高杜仲胶的提取率。网箱中添加的接种球，一方面可以增加摩擦力将有机碎屑更快去除；另一方面可以弥补因淋溶而损失的活性发酵菌。一些实施例中，添加的接种球为30个。淋溶时间在8～16小时。一些实施例的淋溶时间为12小时。具体时间参考淋溶的洗出液情况，洗出液为澄清状即可。淋溶过程中材料的混匀，通过将网箱进行翻转实现。本发明中的淋溶作用是指一种通过细水模拟降雨，雨水下渗，发酵剩余物上脱离的碎屑随细水流走的作用。细水模拟降雨的量及强度在小雨至中雨的降雨量及强度之间。
获得的杜仲胶的纯度采用天然生橡胶杂质含量测定的方法测定。将试样剪成条状，放入容器中，加入含0.5g硫醇基苯并噻唑的橡胶溶剂150mL，加热至溶解。然后趁热用已恒重的孔径为45μm的滤筛过滤，滤筛使用前要先用洁净溶剂润湿。将残留有杂质的滤筛浸泡在石油醚中，滤筛上缘要保持高于石油醚溶液约2mm，20min后取出沥干，于烘箱中烘制恒重。杂质含量计算：杂质含量(％)＝(试样重-滤筛重)/(滤筛和杂质总重)×100％。
杜仲果壳的中杜仲胶的含量与来源地有关，本发明申请所使用的杜仲果壳运用现有技术的方法提取率为10-11％，运用本发明的方法提取率升至18-20％。
本发明提供的方法所获得的杜仲粗胶纯度最高达到95％，在杜仲粗胶纯化过程中，粗胶与石油醚的重量比用量相对于现有技术有明显的降低，最优为1:2，大大的减少了石油醚的用量，降低成本，获得的精胶的纯度达到99.9％。
本发明使用的发酵-淋溶方法，提取杜仲胶的周期时间短，成本低，提取率高，污染少。与单纯的发酵技术相比，生产周期大大缩短，由原来的2个月缩短至1个月左右，杜仲胶的纯度大大提高，提取率也大大提高。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。
实施例1～3发酵温度的筛选
从杜仲果壳中提取杜仲胶的方法，实施例操作步骤为：
步骤(1)接种球的制备：直径为3cm、孔径为0.5～2mm、多孔的玻璃陶瓷球置于盛有特制的琼脂培养基的高压灭菌锅(120℃，1.2大气压)中灭菌，冷却后将球体表面的琼脂用70℃的热蒸馏水清洗，清洗后将球体在1L的白腐真菌发酵液中振荡培养7天，待用；
步骤(2)发酵：盛有10公斤杜仲果壳、孔径为3mm、体积为1m3的网箱置于已加入2L白腐真菌发酵液的发酵池中浸没发酵，发酵温度进行参数改变，发酵周期为10天，发酵pH值为4-7；
步骤(3)淋溶阶段：将步骤(2)所述的装有发酵剩余物的网箱从发酵池中取出，加入步骤(1)制备的接种球，细水流模拟降雨淋溶果壳12小时，直至清洗液为澄清状，每隔30min将网箱翻转10次；
步骤(4)：将步骤(3)清洗完成后剩余的材料重复发酵—淋溶过程3次，每次淋溶结束后，将其中的接种球取出，重复接种后再次利用，得杜仲粗胶。
步骤(5)：采用成熟的石油醚-冷冻循环技术进行纯化，具体为：将实施例所得的杜仲粗胶与石油醚按重量比1:2在75℃水浴锅中提取2h，趁热过滤，提取3次，合并滤液，滤液于-20℃下冷冻放置至有白色丝状沉淀，过滤，再用甲醇冲洗，即得精胶。
具体情况如下表1：
表1发酵温度的筛选结果：
实施例编号 温度 粗胶纯度 精胶得率
1 20℃ 88％ 16％
2 25℃ 94％ 20％
3 30℃ 89％ 15％
从表1的实施例1～3的结果分析，可知，25℃为最佳发酵温度。
实施例4～7发酵周期的筛选
参照实施例1～3的合成方法，控制发酵温度为25℃，将发酵周期进行改变，其他参数不变的情况下，所得结果如下表2：
表2发酵周期筛选的结果：
实施例编号 天数 粗胶纯度 精胶得率
4 7天 88％ 17％
5 10天 95％ 20％
6 13天 95％ 15％
7 16天 95％ 13％
从表2的实施例4～7的结果分析，可知，10天为最佳发酵周期。
实施例8～12接种球的直径筛选
参照实施例1～3的合成方法，控制发酵温度为25℃，将接种球的直径进行改变，其他参数不变的情况下，所得结果如下表3：
表3接种球的直径筛选的结果：
实施例编号 接种球直径 粗胶纯度 精胶得率
8 1cm 89％ 16％
9 2cm 90％ 17％
10 3cm 95％ 20％
11 4cm 88％ 14％
12 5cm 85％ 15％
从表3的实施例8～12的结果分析，可知，接种球的直径范围可控制在1～3cm，最佳直径为3cm。
实施例13～17淋溶时间的筛选
参照实施例1～3的合成方法，控制发酵温度为25℃，将淋溶时间进行改变，其他参数不变的情况下，所得结果如下表4：
表4淋溶时间筛选的结果：
实施例编号 淋溶时间 粗胶纯度 提取率
13 8小时 90％ 19％
14 10小时 91％ 19％
15 12小时 95％ 20％
16 14小时 95％ 15％
17 16小时 95％ 14％
从表4的实施例13～17的结果分析，可知，淋溶过程大约持续12小时即可。

Claims (5)

1.一种从杜仲果壳中提取杜仲胶的方法，其具体步骤如下：
步骤(1)接种球的制备：直径为1～5cm、孔径为0.5～2mm、多孔的玻璃陶瓷球置于盛有特制的琼脂培养基的高压灭菌锅中120℃，1.2大气压灭菌，冷却后将球体表面的琼脂用70摄氏度的热蒸馏水清洗，清洗后将球体在1L的白腐真菌发酵液中振荡培养7天，待用；
步骤(2)发酵：盛有10公斤杜仲果壳、孔径为3mm、体积为1m3的网箱置于已加入2L白腐真菌发酵液的发酵池中浸没发酵，发酵温度为20～30℃，发酵周期为7～16天，发酵pH值为4-7；
步骤(3)淋溶阶段：将步骤(2)所述的装有发酵剩余物的网箱从发酵池中取出，加入步骤(1)制备的接种球，细水流模拟降雨淋溶果壳8～16小时，直至清洗液为澄清状，每隔30min将网箱翻转10次；
步骤(4)：将步骤(3)清洗完成后剩余的材料重复发酵—淋溶过程3次，每次淋溶结束后，将其中的接种球取出，重复接种后再次利用，所得杜仲粗胶的纯度达到95％；
其中，所述的白腐真菌发酵液是指白腐真菌的土豆葡萄糖液体；
土豆葡萄糖液体具体制备过程为200g土豆煮沸30min后进行过滤，滤液冷却后与20g葡萄糖混匀的液体；
所述的特制的琼脂培养基是指由土豆葡萄糖液体与20g琼脂制备的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)所得的杜仲粗胶与石油醚按重量比1:2在75℃水浴锅中提取2小时，趁热过滤，提取次数为3次，合并滤液，-20℃冷冻放置至有白色丝状沉淀，过滤，再用甲醇冲洗，即得杜仲精胶，纯度达到99.9％，提取率为20％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)所述的接种球的直径为3cm。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)发酵阶段的发酵温度为25℃，发酵周期为10天。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)所述淋溶阶段的淋溶时间为12小时。
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