CN105518126B

CN105518126B - 根据细胞尺寸来培养间充质干细胞的方法

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Publication number: CN105518126B
Application number: CN201480049071.9A
Authority: CN
Inventors: 梁允瑄; 吴元一; 陈惠辰; 权纯载; 金美延
Original assignee: Medipost Co Ltd
Current assignee: Medipost Co Ltd
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: US20160222353A1; EP3041930A1; KR101548956B1; JP6348183B2; JP2016534736A; AU2014315919A1; EP3041930A4; KR20150028052A; EP3041930B1; ES2690071T3; AU2014315919B8; AU2014315919A8; CN105518126A; WO2015034212A1; CA2922394A1; US10150950B2; AU2014315919B2; CA2922394C

Abstract

本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的方法，包括分离尺寸小于等于8μm的间充质干细胞，并将它们在含钙和镁的培养基，以及在低氧条件下进行培养。本发明的方法可以显著提高间充质干细胞的细胞增殖能力和分化潜能。

Description

根据细胞尺寸来培养间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种根据细胞尺寸来培养间充质干细胞的方法。尤其涉及一种用于尺寸小于等于8μm的间充质干细胞的分离，以及将它们在特定条件下培养的方法。

背景技术

术语“干细胞”是在胚胎、胎儿和成人的组织中发现的一种未分化类型的体细胞的通称，它具有分化成多种特定细胞类型的潜能。

干细胞根据其潜能可以分类为：多潜能干细胞(pluripotent stem cells)，多能干细胞(multipotent stem cells)和专能干细胞(unipotent stem cells)，多潜能干细胞具有分化成任意类型细胞的多潜能性。胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotent stem，iPS)是多潜能干细胞的代表。成体干细胞表现出多能性和/或单能性。其中包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。

尽管在细胞治疗中利用人胚胎干细胞的多潜能性进行了许多尝试，但是仍然保持着肿瘤发生和免疫排斥反应的高可能性，并且这是难以克服的障碍。

至于iPS细胞，它们是通过重编程特意由已分化的成年体细胞回归到它们最初的胚胎干细胞阶段的一类干细胞。由于其是自体细胞，因此iPS细胞可避免免疫排斥反应的风险，但iPS细胞的肿瘤发生风险仍然是需要解决的问题。

间充质干细胞已被提作解决这些问题的一种替代选择，因为它们表现出免疫调节作用且没有表现出肿瘤发生风险。间充质干细胞是可以分化成多种细胞类型的多能干细胞，并且被熟知具有调节免疫应答的功能，所述多种细胞类型包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、成心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞等。

间充质干细胞可分离自多种组织(例如骨髓、脐带血、脂肪组织等)，但可能不能对其进行充分定义，这是因为根据间充质干细胞衍生的来源，彼此的细胞表面标记物具有一些差异。一般来说，如果它们可以分化成成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞，具有纺锤体形态，并且表达表面标记物CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)，则可将这种干细胞定位为间充质干细胞。在这种情况下，不同遗传来源和/或背景的间充质干细胞在标准定义下彼此不具有显著差异，但是彼此在体内活性方面具有显著差异。另外，当使用间充质干细胞作为外源细胞治疗剂时，有限的间充质干细胞的池(pool)并不允许进行其他可用选择，甚至不管低的体内活性。

此外，为了将间充质干细胞应用到临床实践，考虑到从组织中所获得的间充质干细胞的数量有限，在初始阶段获得大量细胞以及将细胞传代培养是非常重要的。然而，间充质干细胞会在传代中形成一个异质群体，这将影响到细胞的增殖、分化和老化，这使得间充质干细胞很难被发展为治疗试剂。

为了努力克服以上问题，Li J等,Cell Research,2008；Majore I等,CellCommunication and Signaling,2009，Rataiczak MZ等,Aging,2012等公开了许多用于培养间充质干细胞的方法。然而，这些方法具有一些缺点：异质细胞是通过这些方法获得，这使得很难获得用于大量生产的必要数目的细胞，而且细胞的增殖能力在每次传代之后降低，细胞的老化进展加快。此外，上述文献中所使用的设备并不适用于良好操作规范(GMP)，这使得将其应用于实际生产过程很困难。因此，需要一种低成本提取均匀细胞群和使细胞有效地大量增殖的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明因此，本发明的一个目的是提供一种有效培养间充质干细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供采用所述方法制得的间充质干细胞，所述间充质干细胞在增殖能力和分化潜能有改善。

本发明的另一个目的是提供包含所述间充质干细胞的细胞治疗剂。

根据本发明的一个方面，提供了一种培养间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)分离间充质干细胞，所述间充质干细胞的尺寸小于等于8μm；(2)将所述间充质干细胞在2-5％的氧气条件下于含有2.1-3.8mM的钙和1.0-3.0mM的镁的培养基中培养。

根据本发明的另一个方面，提供了通过上述方法制得的间充质干细胞，所述间充质干细胞在增殖能力和分化潜能有改善。

根据本发明的进一步方面，提供了包含所述间充质干细胞的一种细胞治疗剂。

本发明的一方法可以显著提高间充质干细胞的增殖能力和分化潜能，该方法是通过分离尺寸小于等于8μm的间充质干细胞，并将它们在含钙、镁的条件下以及在低氧条件(low oxygen)下进行培养，这允许获得的间充质干细胞用作细胞治疗剂。

附图说明

图1展示了在胰蛋白酶处理前的贴壁形式(图1a)和胰蛋白酶处理后的单细胞形式的间充质干细胞的图表。也展示了通过细胞计数器(Cellometer)测得的细胞尺寸分布的示意图(图1c)。

图2A和2B是展示在将间充质干细胞(MSCs#1至#4)培养后通过细胞计数器测得的细胞的尺寸分布的图表。

图3是展示了在将细胞传代培养后，具有小尺寸(MSCs#1和#2)的细胞组I和具有大尺寸(MSCs#3和#4)的细胞组II的累积群体倍增数(cumulative population doubling(CPD))的图表。

图4为依照本发明的一方法获得的尺寸少于等于8μm的间充质干细胞(小)的显微照片。

图5a提供了未分离的细胞组(原始的，左)、细胞尺寸超过8μm的细胞组(大，中)和细胞尺寸小于等于8μm的细胞组(小，右)的显微照片。图5b和5c为分别展示这3组的增殖能力和累积群体倍增数(cumulative population doubling(CPD))的图表。

图6为根据尺寸小于等于8μm的间充质干细胞的比值所示出的细胞增殖能力的图表，1-5组分别指的是以下组成的间充质干细胞(MSCs)：超过8μm(100％)的MSCs；超过8μm(75％)的MSCs+小于等于8μm(25％)的MSCs；超过8μm(50％)的MSCs+小于等于8μm(50％)的MSCs；超过8μm(25％)的MSCs+小于等于8μm(75％)的MSCs；小于等于(100％)的MSCs。相对于组1而言，每组的增殖能力呈现出成倍增加。

图7示出了尺寸小于等于8μm的细胞组(小)和未分离的细胞组(原始的)在常规培养条件(对照)、添加钙(包括镁)的条件(Ca²⁺(Mg²⁺))、低氧条件和CMH条件下培养后的细胞形状(a，b)和细胞增殖能力(c)的检测结果，其中，CMH条件指的是添加钙(包括镁)条件/低氧条件。

图8提供了展示未分离的细胞组(原始的)和从脐带血(MSCs#1至#4)的传代培养衍生出的4种类型的间充质干细胞的小细胞组，在常规培养条件和CMH条件下培养后的增殖能力(8A)和累计群体倍增数(8B)的测试结果的图表。

图9为一种脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1)在含有浓度为1.8-4.4mM的钙的介质中培养6天后的细胞数目的结果。

图10为一种脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1)在标准氧(常氧，normoxia)、3％氧和5％氧的条件下培养后的细胞数目的结果。

图11提供了在原始细胞组和小细胞组于常规培养条件和CMH条件下培养之后的蛋白质印迹(Western blot)的结果和展示p53和p21(增殖抑制标记物)的表达水平的一个定量图表。

图12A和12B提供了原始细胞组和小细胞组在常规培养条件和CMH培养条件下经几次传代培养和细胞衰老诱导之后，染色的老化细胞的图表以及展示染色的细胞数目与总细胞数目比值的图表。

图13提供了展示在原始细胞组和小细胞组于常规培养条件和CMH培养条件下培养之后的成骨诱导(a)和成脂诱导(b)的图表。

具体实施方式

本发明提供了一种培养间充质干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)分离间充质干细胞，所述间充质干细胞的尺寸小于等于8μm；(2)将所述间充质干细胞在2-5％氧气的条件下于含有2.1-3.8mM的钙和1.0-3.0mM的镁的培养基中培养。

本发明是基于发现尺寸小于等于8μm的间充质干细胞比其他尺寸的间充质干细胞具有更好的增殖能力，以及间充质干细胞的增殖能力和分化潜能可以通过将它们在低氧条件下于含有特定浓度的钙和镁的培养基中进行培养而进一步提高。

本发明的一种培养间充质干细胞的方法中，步骤(1)是分离尺寸小于等于8μm的间充质干细胞。

本发明的培养方法可能被应用于多种器官的间充质干细胞。可用于本发明的间充质干细胞的例子包括来源于脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊水、脐带或牙齿的那些间充质干细胞，但不限于此。在本发明的一优选实施例中，本发明的培养方法适用于脐带血衍生间充质干细胞。

此外，可应用本发明的培养方法的间充质干细胞可能来源于多种对象。例如，可用于本发明的间充质干细胞可获自哺乳动物(包括人)，但不限于此。在本发明的一优选实施例中，使用人类器官的间充质干细胞。

通常的间充质干细胞的尺寸范围为3.5-24μm，而本发明中所采用的间充质干细胞具有尺寸小于等于8μm(小)的特征。尺寸小于等于8μm的间充质干细胞具有比未分离的间充质干细胞(以下称“原始细胞”)或尺寸超过8μm的间充质干细胞更出众的增殖能力。

在本发明的一方法中，所述分离尺寸小于等于8μm的间充质干细胞，优选采用过滤器来实施，这并没有特别限制。考虑到破坏间充质干细胞的风险和使用安全性，举例来说，所述过滤器可选自孝感亚光(Xiaogan yaguang)的滤膜管。为了获得小细胞，所述采用过滤器的分离方法可在最佳条件下进行。例如，种群为2×10⁵个细胞的间充质干细胞可被装载在孔径尺寸为8μm的滤膜管上，并在1,200rpm下离心5分钟，以获得尺寸小于等于8μm的均匀间充质干细胞。

尺寸小于等于8μm的间充质干细胞，以下简称为“小细胞”。

本发明中培养间充质干细胞的方法的步骤(2)，为将尺寸小于等于8μm的间充质干细胞在2-5％氧气的低氧条件下于含有2.1-3.8mM的钙和1.0-3.0mM的镁的培养基中培养。

所述培养方法的主要特征是将所述间充质干细胞在含有钙和镁的培养基中进行培养。

可通过调节用于干细胞的常规培养基的钙和镁的浓度来制备所述培养基。常规培养基的实例包括Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、α-MEM、McCoys5A培养基、eagle基础培养基、康诺特医学研究实验室(Connaught Medical ResearchLaboratory(CMRL))培养基、格拉斯哥(Glasgow)MEM、Ham's F-12培养基、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、Leibovitz's L-15培养基、洛斯维帕克纪念研究所(Roswell ParkMemorial Institute(RPMI))1640培养基、培养基199和Hank培养基199，但不限于此。

可选地，所述培养基可以含有或可不含血清。此外，可在所述培养基中使用血清替代物，而不是血清。

在本发明的一实施例中，所述培养基含有5-30％的胎牛血清(FBS)。在另一实施例中，所述培养基含有血清替代物。除了市售产品外，可使用人血清或人血小板中的多种生长因子(包括PDGF、TGF、IGF)及其类似的细胞因子用作血清替代物。

在本发明的培养方法中，钙用于促进间充质干细胞的增殖、抑制免疫原性并刺激细胞因子分泌。在这点上，可以在培养基中使用2.1-3.8mM的浓度、优选3.3-3.8mM的浓度、并更优选浓度约3.6mM的钙。例如，当使用α-MEM作为培养基时，可添加0.3-2mM的浓度、优选1.5-2.0mM的浓度、并且更优选浓度约为1.8mM的钙，这是因为培养基已经含有1.8mM的钙。同样地，当采用另一培养基时，考虑到培养基自身的钙浓度，为获得实施本发明的培养方法所需的期望浓度，可容易地计算待添加的钙的浓度。

在本发明的一培养基中，使用镁来防止钙的沉淀。可以在培养基中使用1.0-3.0mM的浓度、并且优选约1.8mM的浓度的镁。当镁在培养基中以小于1.0mM的浓度存在时，镁很难阻止钙的沉淀。另一方面，培养基中高于3.0mM的镁浓度可能阻断胞外基质(ECM)的形成，干扰细胞在培养皿底部的附着，从而使得细胞易受剪切应力的影响，并且增加细胞内的矿化。例如，当使用α-MEM作为培养基时，可添加0.2-2.2mM的浓度、并且优选1.0mM浓度的镁，这是因为培养基已经含有0.8mM的镁。同样地，当采用另一培养基时，考虑到培养基自身的镁浓度，为获得实施本发明的培养方法所需的期望浓度，待添加的镁浓度可容易地计算。

因此，根据本发明一优选实施例的培养基，可基于补充有5-30％的胎牛血清(FBS)、0.3-2.0mM的钙和0.2-2.2mM的镁的α-MEM，以使钙和镁的最终浓度分别为2.1-3.8mM和1.0-3.0mM。

此外，本发明培养方法的另一特征是间充质干细胞的低氧培养条件。与通常的氧气条件(常氧)相比，所述低氧条件可促进间充质干细胞的增殖，并且抑制免疫原性并刺激细胞因子分泌。在此情况下，所述低氧条件是指氧气含量为2-5％的气氛。氧气浓度低于2％或5％时的相关问题是间充质干细胞的增殖显著降低。在本发明的一优选实施例中，将间充质干细胞培养在约3％水平的氧气中。可通过调节细胞孵育器的氧气浓度来达到低氧条件。例如，可用氮气(100％)或氮气/二氧化碳混合气体(95％/5％)来供给孵育器以将常氧气氛调节为低氧气氛。可通过安装在孵育器上的氧气传感器来监测孵育器中的氧气浓度。

除了本发明的前述条件外，可以以常规方式培养间充质干细胞。例如，可在三维生物反应器或旋转器或常规的贴壁培养容器中来培养间充质干细胞。

当用于钙和镁浓度控制的主要特征与低氧条件的次要特征组合时，可获得协同效应，即，与单独条件相比，特定浓度的钙和镁与低氧条件的组合允许间充质干细胞更加有效地增殖，同时进一步提高对免疫原性的抑制和对细胞因子分泌的刺激。用于本发明培养方法的组合条件被称为“CMH条件”(钙+镁+低氧条件)。

本发明的培养方法可应用于间充质干细胞的传代。换言之，使用本发明的一培养方法培养的间充质干细胞可以以相同的方式进行传代培养。通过使间充质干细胞更加有效地增殖，本发明的一培养方法具有即使进行更少传代也能产生较大数目的间充质干细胞的优点。例如，在接种相同数目的细胞并且每一代的持续时间统一的情况下进行5轮传代后，发现本发明的一培养方法产生的间充质干细胞的数目是常规方法的100-1000倍。

因此，本发明提供了通过上述方法制得的间充质干细胞，所述间充质干细胞在增殖能力和分化潜能有改善。

此外，本发明提供了包含采用上述培养方法所获得的间充质干细胞的细胞治疗剂。本发明的细胞治疗剂可用于治脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞或肺细胞的再生或保护。另外，本发明的细胞治疗剂可应用于选自以下情形中的一种：肺部疾病治疗；抑制或治疗肺病诱发的炎症；肺组织再生；以及抑制肺纤维化。特别地，它可以应用于抑制或改善肺病诱发的炎症和纤维化。另外，本发明的细胞治疗剂可用于心血管疾病的治疗或软骨再生。另外，本发明的细胞治疗剂可提高免疫调节功能；降低免疫应答、免疫细胞渗透或免疫原性；以及抑制炎症反应。

以下，采用实施例详细说明本发明，而这些实施例并不构成对本发明范围的限制。

实施例1：分析脐带血衍生间充质干细胞的细胞尺寸

将未分离的脐带血衍生间充质干细胞的细胞尺寸进行以下测试：

特别地，从4名捐赠者获得脐带血衍生间充质干细胞并冰冻保存。每次收集的间充质干细胞均要解冻并培养在具有用10％FBS补充的α-MEM培养基的孵育器中，于37℃、5％CO₂的条件下培养5天。

采用显微镜来观察细胞的形貌，并通过胰蛋白酶处理使其分离成单个细胞。采用ECLIPSE TE2000-U倒置显微镜在100X的放大率下来观察细胞，并拍摄细胞群体的多个区域。在被拍摄的区域中，采用Cellometer vision 5X(nexcelom biosceince)来分析活细胞的尺寸。

图1展示了显微镜获取的照片。图1a为展示从脐带血分离出的、所培养的间充质干细胞的照片，图1b为展示在胰蛋白酶处理后的单细胞形式的间充质干细胞的照片。图1c为展示细胞尺寸测量结果的图表。

从图1中可以看出，无法获得当细胞彼此吸附在一起时的细胞尺寸的信息(图1a)，但当细胞是单个细胞形式时，能检查其细胞尺寸(图1b)。根据细胞计数器(Cellometer)的分析，可以确认间充质干细胞由尺寸范围从4.84到18.52μm的一不均匀细胞群体组成。

实施例2：根据其尺寸分析脐带血衍生间充质干细胞的增殖能力

为了分析脐带血衍生间充质干细胞的细胞尺寸与增殖能力之间的关联，采用实施例1所述的方法对从4个捐赠者(MSCs#1至#4)获得的间充质干细胞进行培养，之后采用细胞计数器来分析其细胞尺寸。分析结果如图2A和2B所示。可以确认MSCs#1和#2的细胞尺寸是相对较小(可从图2A看出)，而MSCs#3和#4的细胞尺寸是相对较大(可从图2B看出)。

将具有小细胞尺寸的组I((MSCs#1和#2)和具有大细胞尺寸的组II(MSCs#3和#4)进行传代培养，并制备累积生长曲线。累积生长曲线表示为累积群体倍增数(cumulativepopulation doubling(CPD))，CPD为群体倍增数(PD)的累积值。

基于每代中细胞的总数目来计算PD，PD＝log(一特定代的增殖速率)/log 2。当一特定代的细胞达到50-60％的汇合时，将它们进行胰蛋白酶处理并分离，以获得单个细胞。一特定代的增殖速率是通过将获得的单个细胞的数目除以初始时提供给培养容器的细胞的数目来算得。重复以上过程直至该代的细胞增殖停止。细胞被允许从第一代、第二代开始增殖直到最后一代细胞停止增殖。每一代的培养周期为7天。图表中的P1到P10指的是传代的数目。该实验结果如图3所示。

从图3可以看出，具有小细胞尺寸的组I的增殖能力被证实比具有大细胞尺寸的组II的大，而且组I比组II的细胞增殖的持续时间更长。

实施例3：细胞尺寸的确定和小细胞的分离

<3-1>适用于分离的细胞尺寸的确定

根据细胞的尺寸，可选择孝感亚光(Xiaogan yaguang)的滤膜管作为用于分析细胞的过滤器。由于所述过滤器的内部安置有一50mL的管子，所述过滤器可在离心过程中免受来自外界的污染。同时，用于分离细胞的设备是已知的，例如分类设备，贝克曼高速离心机，BD's及其类似物。但是，该分类设备并不适用于治疗试剂的过程，这是因为在细胞的分离过程可能对细胞造成损害。贝克曼高速离心设备不适合用在GMP生产过程，因为它不能利用用于消耗品部分的一次性产品。至于它并非为一个密封系统，它不能在离心过程中保证无菌的细胞条件。考虑到本发明的间充质干细胞应当被用作治疗试剂，适合于实际GMP生产设施的孝感亚光滤膜管被确定为最合适的。

采用所述滤膜管来分离尺寸小于等于3μm(≤3μm)、尺寸小于等于5μm(≤5μm)、尺寸小于等于8μm(≤8μm)的脐带血衍生间充质干细胞。测量每组被分离的细胞的数目。结果，通过所述过滤器分离的尺寸≤3μm或≤5μm的细胞的数目，以及所述细胞在间充质干细胞群体中的百分比均太低。与此相反，获得足够数目的尺寸≤8μm的间充质干细胞。正因为如此，确定小于等于8μm为合适的细胞尺寸，该尺寸范围的细胞被称为“小细胞”或“小间充质干细胞”。

<3-2>建立用于获得小细胞的最优条件

为了建立用于获取尺寸小于或等于8μm的细胞的最优条件，根据离心的重复次数，研究离心条件(离心的速度和持续时间)、装载的细胞数目以及细胞获得率。

(1)根据离心速度的细胞获得率

采用一离心机((Hanil Science Industrial,combi514R)将实施例1的间充质干细胞(2×10⁵细胞/2mL)分别在800rpm、1,200rpm、1,500rpm和2,000rpm下离心5min。设置已装载在过滤器上的细胞的数目为100％，测量在离心之后通过所述过滤器的细胞比率(％)。结果在表1中示出。

<表1>

如表1所示，发现在1200rpm的离心速度可比其他速度获得更高的获得率。基于以上结果，在下面的实验中，离心是在1200rpm的速度下进行。

(2)根据离心的持续时间的细胞获得率

采用一离心机((Hanil Science Industrial,combi514R)将实施例1中所培养的间充质干细胞在1200rpm下分别离心2min、5min和10min，之后以如上述同样的方式测量通过过滤器的细胞比率(％)。结果在表2中示出。

<表2>

如表2所示，发现在1200rpm下离心5min可比其他持续时间获得更高的获得率。基于以上结果，在下面的实验中，离心是在1200rpm下进行5min。

(3)根据装载的细胞数的细胞获得率

将实施例1中所培养的间充质干细胞以5×10⁴,1×10⁵,2×10⁵或3×10⁵细胞/2mL的群体在1200rpm下离心5min。之后以如上述同样的方式测量通过过滤器的细胞比率(％)。结果在表3中示出。

<表3>

如表3所示，发现在2×10⁵细胞的群体装载间充质干细胞可比其他群体获得更高的获得率。基于以上结果，在下面的实验中，离心是以2×10⁵的群体在1200rpm下进行5min。

(4)确定离心次数

为了根据离心次数来检测细胞获得率，将细胞分成两组，分别为离心一次和离心两次。离心两次的组进一步分为两个小组。在后者的第二次离心中，第一小组中将新培养基添加到离心管中而无需更换任何过滤器，而第二小组在将过滤器更换之后将细胞悬浮在培养基中。

特别地，在第一小组中(两次(添加培养基))，如上所述的在将间充质干细胞离心之后，将2mL的新培养基加到使用过的过滤器上，并将细胞离心。然后，以如上述同样的方式测量通过过滤器的细胞的数目。在第二小组中(两次(更换过滤器))，如上所述的在将间充质干细胞离心之后，通过将停留在过滤器上的细胞进行悬浮而获得细胞。然后，放置一新的过滤器，并将细胞离心以测量通过过滤器的细胞的数目。结果在表4中示出。

<表4>

如表4所示，离心2次的两个小组与离心1次的组并没有显示显著的不同。正因为如此，离心的次数被最终确认为一次。

基于在最优条件下用显微镜观察获得的间充质干细胞，如图4所示，可以确认获得了尺寸小于等于8μm的不均匀的细胞群。

实施例4：比较尺寸小于等于8μm的间充质干细胞(小细胞)的增殖能力

为了检测依照本发明得到的小细胞的增殖能力，将所述间充质干细胞分成非分离组(原始)、细胞尺寸小于等于8μm的细胞组(小)、细胞尺寸超过8μm的细胞组(大)，并进行传代培养以比较增殖能力。将上述的这三类细胞组在补充有10％PBS的α-MEM培养基中培养，每代平均5天长以测试累积生长。

测试的结果如图5所示。图5a展示了三类细胞组的显微镜照片，暗示了相对于原始细胞组(左图)和细胞尺寸超过8μm的组(中图)而言，细胞尺寸小于等于8μm的组(右图)更均匀。图5b和5c展示了增殖能力和CPD，其中，细胞尺寸小于等于8μm的组比其他细胞组的增殖能力更强。特别地，细胞尺寸小于等于8μm的组至少比其他两组的CPD大2倍。

实施例5：根据尺寸小于等于8μm的间充质干细胞(小细胞)的百分比来分析增殖能力

为了证明尺寸小于等于8μm的间充质干细胞(小细胞)的增殖能力的优势，制备如下的带不同小细胞百分比的5种细胞组。

组1:超过8μm的MSCs(100％)

组2:超过8μm的MSCs(75％)+小于等于8μm的MSCs(25％)

组3:超过8μm的MSCs(50％)+小于等于8μm的MSCs(50％)

组4:超过8μm的MSCs(25％)+小于等于8μm的MSCs(75％)

组5:超过8μm的MSCs(100％)

以与实施例2相同的方法测量每个细胞组的增殖能力，并将增殖能力的量呈现在图6中，各组的增殖能力相比于组1成倍增加。

如图6所示，随着尺寸小于等于8μm的细胞的百分比的增加，可观察到较高的增殖能力的细胞。这些结果显示尺寸小于等于8μm的细胞具有高的增殖能力。

实施例6：根据CMH条件的小细胞的增殖能力分析

已知脐带血衍生间充质干细胞在常规的培养条件下(例如37℃和5％CO₂)传代培养时，其增殖能力随细胞尺寸的增加而降低。因此，非常有必要建立一培养条件，在该条件下，具有出众增殖能力的尺寸小于等于8μm的脐带血衍生间充质干细胞，可以保持它们的细胞尺寸和增殖能力。

因此，在本实施例中，尺寸小于等于8μm的脐带血衍生间充质干细胞是在不同条件下培养，然后比较在这些条件下的细胞尺寸和增殖能力。

特别地，将原始细胞组和细胞尺寸小于等于8μm的细胞组(小细胞组)的细胞解冻，并于含有用10％FBS补充的α-MEM培养基(Invitrogen,USA)的孵育器中(低氧/CO₂孵育器，Thermo Scientific#3131)在37℃、5％CO₂的条件下培养5天。当细胞达到80-90％的汇合时，用胰蛋白酶进行处理获得单个细胞。然后，将细胞以5000细胞/cm²的浓度接种到α-MEM培养基上，并在典型培养条件(对照组)、添加钙(包括镁)条件、低氧条件、添加钙(包括镁)/低氧条件(以下称作“CMH”)下进行培养。在一典型培养条件中，细胞是在37℃、5％CO₂、常氧(空气中氧气浓度为21％(v/v))的条件下于α-MEM培养基(含有10％FBS；含有1.8mM的钙和0.8mM的镁)中进行培养。在添加钙条件(包括镁)中，细胞是在37℃、5％CO₂、常氧的条件下于α-MEM培养基(通过添加1.8mM的钙和1mM的镁来调节培养基中钙和镁的总浓度分别为3.6mM和1.8mM)中进行培养。另外，低氧条件中，细胞是在37℃、5％CO₂、低氧(氧气浓度为3％(v/v))的条件下于α-MEM培养基中进行培养。在CMH条件中，细胞是在37℃、5％CO₂、3％(v/v)氧气的条件下于α-MEM培养基(通过添加1.8mM的钙和1mM的镁来调节培养基中钙和镁的总浓度分别为3.6mM和1.8mM)中进行培养。在4轮传代培养中观察每组细胞的形状和增殖能力。

细胞的形状(a，b)和增殖能力(c)如图7所示。如图7a和7b所示，在CMH条件下培养的原始细胞组和小细胞组的细胞密度显著高于在其他条件下培养的组。而且，当将原始细胞组和小细胞组的细胞的形状相比时，小细胞组的细胞粘附的形式完全相同，并具有较多数目的粘附细胞。

另一方面，从图7c可以看出，在CMH条件下的对照细胞组和小细胞组中，其增殖能力均显示是最强的。特别地，每代小细胞组的增殖能力至少比不含细胞的组大2倍。每代小细胞组的增殖能力的结果显示，在CMH条件下培养的细胞，其增殖能力比在其他通常条件下培养的细胞至少大2倍。

以上结果暗示了小细胞组比原始细胞组具有较强的增殖能力，且能保持其细胞尺寸，细胞的增殖能力可以通过将小细胞在CMH条件下进行培养来增强。

实施例7：在CMH条件下培养的小细胞的细胞尺寸和增殖能力的分析

为了分析在CMH条件下培养的小细胞组中脐带血衍生间充质干细胞的尺寸和增殖能力，将原始细胞组和细胞尺寸小于等于8μm的小细胞组在典型培养条件和CMH条件下进行培养。在将这些间充质干细胞在各自的条件下传代培养之前，将它们在通常条件下进行2轮传代培养(p2)。在每次传代之后将这些细胞培养7天。然后，测试细胞的增殖能力和累积增殖能力。结果如图8所示。

如图8所示，当小细胞组在CMH条件下培养时，细胞尺寸的维持和增殖能力大大增强，在持续的传代过程中也保持这种影响。在实际细胞治疗中用到的初始传代中(p3到p6)，观察到增殖能力是相当高。特别地，小细胞组和CMH培养条件的结合，显示出每代的增殖能力至少有2倍的差异(图8A)。至于累计群体倍增数(CPD)，尽管MSCs之间存在一些差异，发现在多次传代中至始至终都保持细胞的增殖能力(图8B)。

这些结果暗示了本发明中小细胞组和CMH培养条件的结合有助于提高脐带血衍生间充质干细胞的增殖。

实施例8：根据钙浓度的间充质干细胞的增殖能力

为了检查脐带血衍生间充质干细胞根据钙浓度的增殖能力，将细胞在不同钙浓度的培养基中进行培养。

特别地，将从分泌后的母体收集并且在冷冻状态下储存的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1)解冻，并在5％CO₂条件下于37℃培养在孵育器(低氧/CO₂孵育器,ThermoScientific#3131)中的补充有10％FBS的α-MEM培养基(Invitrogen,USA)中。当细胞达到50-96％的汇合时，通过胰蛋白酶处理使其分离成单个细胞。向α-MEM(补充有10％FBS；含有1.8mM钙和0.8mM的镁)中添加多种浓度(0mM,1.6mM,1.8mM,2.0mM,2.2mM,2.4mM and2.6mM)的钙以将培养基的钙浓度调节到如下：1.8mM,3.4mM,3.6mM,3.8mM,4.0mM,4.2mM和4.4mM。将细胞在上述培养基中培养6天，然后计数。为了防止钙诱导的沉淀，向每种培养基中添加1mM浓度的镁(总的镁浓度为1.8mM)。将细胞培养在21％(v/v)的常氧条件下，并在细胞生长至50-60％的程度时，将它们以同样的方式传代培养。检测的结果如图9所示。

从图9可以看出，随着添加的钙浓度从0到1.8mM(培养基中的总钙浓度为1.8或3.6mM)，增殖能力不断增加。由这些结果知，用于获得细胞的最大增殖的培养基的最优钙浓度为3.6mM。因此，为了相对于普通培养条件达到较高的增殖能力，在钙浓度为1.8-3.6mM的培养基中来培养细胞是有利的。

实施例9：脐带血衍生间充质干细胞根据氧气浓度的增殖能力

为了检查脐带血衍生间充质干细胞根据氧气浓度的增殖能力，将细胞在不同氧气浓度的条件下进行培养。

特别地，将脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1)以与实施例8相同的方式在补充有10％FBS的α-MEM中进行培养，只是不再额外添加钙或镁，并且所述细胞是在3％或5％氧气或在常氧条件(空气中的氧气水平，21％)下进行培养，并被计数。结果如图10所示。

如这些结果中所示，细胞在低氧条件的增殖能力比常氧条件下高。尤其是在3％的氧气浓度下的增殖能力最高。在较长时间的持续传代中都保持这样的结果。

实施例10：脐带血衍生间充质干细胞根据培养条件的增殖抑制蛋白和衰老分析

为了确认实施例6中脐带血衍生间充质干细胞的增殖提高的原因，测定干细胞中增殖抑制蛋白的表达水平及其衰老变化。

特别地，如实施例6所述，原始细胞组和小细胞组在典型培养条件和CMH条件下进行培养。当细胞达到50-60％的汇合时，用胰蛋白酶处理使细胞分离。随后将细胞培养溶液进行离心以除去培养基，之后用PBSA洗涤以获得细胞。接着，根据制造商协议采用裂解缓冲液(RIPA)分离蛋白质。采用牛血清白蛋白(BSA)为标准，对蛋白质进行量化，并制备15μg的蛋白质以完成Western blot(蛋白质印迹实验)。将蛋白质负载在12％的聚丙烯酰胺凝胶上，然后在130V下电泳2h。在电泳之后，采用Western Blotter在300mA的电流下3h将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜(Amersham Pharmacia,USA)。采用含5％脱脂牛奶的1X TBST(100mM Tris(pH 7.5),1.5M NaCl,0.5％Tween-20)溶液来封闭所述薄膜1h。然后，在制冷温度下将原发性抗体(p21,p53(Abcam,USA)和β-肌动蛋白)连接到封闭后的硝酸纤维素膜上过夜。之后，将形成的硝酸纤维素膜用1X的TBST洗涤，并加入第二抗体(抗兔或鼠IgG-HRP,Cell Signaling Technology,MA,USA)，并允许在室温下附加到其中1h。接着，根据制造商协议通过采用ECL Western印迹检测试剂盒(Amersham Pharmacia)将ECL prime溶液倒到所述薄膜上，并通过Chemidoc设备(Biorad,USA)来检查波段。

蛋白质印迹(Western blot)的结果如图11所示。如图11所示，可以发现已在CMH条件下培养过的小细胞组中的p53和p21(Abcam)、增殖抑制蛋白的表达水平相对较低。这个结果暗示通过下调增殖抑制蛋白的表达，CMH培养条件提高了间充质干细胞的增殖能力。

同时，将原始细胞组和小细胞组的细胞在典型培养条件和CMH条件下经过几次传代培养以诱导它们老化。移去每个培养皿的培养溶液，并用PBS洗涤细胞。然后，在向细胞中加入1mL的1X固定溶液(Cell Signaling Technology)之后，将细胞在室温下孵育10min。移走固定溶液之后，用2mL的PBS洗涤细胞2次。接着，在向细胞中加入1mL的β-半乳糖苷酶染色溶液(SAβgal,Cell Signaling Technology)之后，将细胞在孵育器中孵育24-48h。在从中移走染色溶液之后，将细胞用1mL的PBS洗涤。之后，采用倒置显微镜ECLIPSE TE2000-U(Nikon)在100X的放大率下对染色的细胞进行拍摄。照片用于检查染色细胞数目相对于总细胞数目的值。

检查的结果如图12A、12B所示。图12A、12B(左)提供了从已生过孩子的不同母亲所获得的MCSs(MSCs#1至#4)的原始细胞组和小细胞组的照片，所述原始细胞组和小细胞组是在典型培养条件和CMH条件下进行培养。照片展示了染色的老化细胞。图12A、12B(右)也提供了展示染色的细胞数目与总细胞数目的比值的图表。在该图表中，原始(original，O)指原始细胞组，OCMH指在CMH条件下培养的原始细胞组，S指在常规培养条件下培养的小细胞组，SCMH指在CMH条件下培养的小细胞组。

如图12A和12B所示，当小细胞在CMH条件下培养时，老化细胞的数目最少，正如图表所证实的一样。这些结果暗示通过将本发明中的小细胞在CMH条件下培养，可以增加增殖能力和抑制衰老。

实施例11：测定脐带血衍生间充质干细胞根据培养条件的分化潜能和标记物的变化

当依照本发明的小细胞是在CMH条件下培养时，为了检查脐带血衍生间充质干细胞在其基本特性方面的变化，将来自两种脐带血衍生间充质干细胞的原始细胞组和小细胞组在常规培养条件和CMH条件下培养。然后进行分析以检查间充质干细胞在成骨诱导(osteogenic induction)和成脂诱导(adipogenic induction)的分化潜能的变化，及其标记物的变化。

<11-1>成骨诱导和骨染色

为了诱导成骨分化，在6孔板的每个孔中放置500-1000个细胞，并在2-4天后提供成骨诱导培养基(1mM的磷酸甘油，50mM的L-抗坏血酸-2-磷酸盐，1μM的地塞米松/UVAB，补充有庆大霉素和10％FBS的α-MEM培养基)。每3天用新鲜的分化培养基来更换培养基以诱导细胞分化2-3周。将分化的细胞用PBS洗涤2次，接着在固定溶液(40％丙酮)中孵育30-45秒。在将细胞用蒸馏水洗涤2-3次后，向其中加入碱性染色溶液(Fast violet B盐)，将细胞在暗处于室温下孵育30min。然后将细胞用蒸馏水洗涤2次，并用Mayer苏木精溶液处理10-20秒。在移去溶液后，将细胞用自来水洗涤并干燥。将染色的组织用盖玻片覆盖而采用水溶性的封固溶液用于观察。由于细胞内碱性磷酸酶的活化将分化成成骨细胞的细胞被染成了深棕色，所以可以基于染色的程度对细胞的成骨诱导程度进行评估。

<11-2>成脂诱导和脂肪染色

为了成脂诱导，在6孔板的每个孔中放置500-1000个细胞，并在2-4天后提供成脂诱导培养基(0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.2mM的消炎痛，10μM的胰岛素，1μM的地塞米松/UVAB，补充有10％FBS和庆大霉素的DMEM培养基)。每3天用新鲜的分化培养基来更换培养基以诱导分化3-4周。将分化的细胞用PBS洗涤2次，接着在固定溶液(10％福尔马林)中孵育10min。在将细胞用蒸馏水洗涤2-3次后，向其中加入染色溶液(油红O)，将细胞在室温下放置30min。然后，将细胞用蒸馏水洗涤，并用Mayer苏木精溶液处理10-20秒。在移除溶液后，将细胞用自来水洗涤并干燥。观察染色的组织，并用盖玻片覆盖而采用水溶性的封固溶液。基于染色(红色)的程度，以及分化的脂质空泡的出现和形成的程度，可以对成脂诱导的程度进行评估。

实验结果如图13所示。图13a和图13b分别展示了成骨诱导和成脂诱导的结果。如图13所示，当小细胞组在CMH条件下培养时，获得了较优的成骨诱导和成脂诱导的结果。以上结果表明，小的细胞尺寸和CMH培养条件的结合可以提高脐带血衍生间充质干细胞的分化潜能。

<11-3>标记物分析

为了分析脐带血衍生间充质干细胞中细胞表面抗原的免疫表型，通过如下FACS分析来检查标记物蛋白质(CD14,CD29,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,CD105,HLAABC和HLADR)的表达。

将原始细胞组和小细胞组在常规培养条件和CMH条件下进行培养。然后，用胰蛋白酶处理细胞，并用PBS溶液洗涤2次。将洗涤后的细胞与CD14-FITC(异硫氰酸荧光素)、CD34-FITC、CD45-FITC和HLADR FITC、间充质干细胞中已知的阴性抗原进行反应，以及和CD73-PE(藻红蛋白)、CD90-PE、CD105-PE和HLAABC-PE、已知的在间充质干细胞中强烈表达的阳性抗原进行反应。通过采用FACS仪器检测第二抗体的信号，获得表达标记物的细胞与总细胞的比。在反应后，采用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)和CELLQUEST软件进行分析。

实验结果如表5所示。

<表5>

如表5所示，依照细胞尺寸或培养条件，间充质干细胞的标记物蛋白质的表达并没有差异。

这些结果揭露，本发明中小细胞和CMH培养条件并没有显著改变脐带血衍生间充质干细胞的基本特性。

Claims

1.一种培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离间充质干细胞，所述间充质干细胞的尺寸小于等于8μm；以及

(2)将所述间充质干细胞在含有3.3-3.8mM的钙和1.0-3.0mM的镁的培养基中进行培养，所述培养是在2-5％氧气的条件下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊水、脐带或牙齿。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述分离间充质干细胞是通过将所述间充质干细胞通过孔径为8μm的过滤膜而进行。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基选自Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、α-MEM、McCoys5A培养基、eagle基础培养基、康诺特医学研究实验室(Connaught Medical Research Laboratory(CMRL))培养基、Glasgow MEM、Ham'sF-12培养基、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、Leibovitz'sL-15培养基、洛斯维帕克纪念研究所(RPMI)1640培养基、培养基199和Hank培养基199。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基含有5-30％的胎牛血清。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基不含胎牛血清，但含有血清替代物。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基在α-MEM的基础上补充有5-30％的胎牛血清、0.3-2.0mM的钙和0.2-2.2mM的镁。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以与权利要求1相同的条件对所述间充质干细胞进行传代培养。

9.如权利要求1所述的方法获得的间充质干细胞。

10.一种包括如权利要求9所述的间充质干细胞的细胞治疗剂。

11.如权利要求10所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述细胞治疗剂应用于脂肪细胞、骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞或肺细胞的再生或保护。

12.如权利要求10所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述细胞治疗剂应用于选自以下情形中的一种：肺部疾病治疗；抑制或治疗肺病诱发的炎症；肺组织再生；以及抑制肺纤维化。

13.如权利要求10所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述细胞治疗剂应用于软骨再生。

14.如权利要求10所述的细胞治疗剂，其特征在于，所述细胞治疗剂应用于治疗自身免疫疾病或移植物抗宿主疾病。

15.一种提高间充质干细胞的增殖能力和分化潜能的方法，其特征在于，包括以下步骤：