CN107574146A - 由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方法产生的间充质干细胞 - Google Patents

由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方法产生的间充质干细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方法产生的间充质干细胞。具体而言，该方法包含：a)由人类多能干细胞形成胚胎体；b)使所述胚胎体附着到培养皿以诱导所述胚胎体自然分化为间充质干细胞；以及c)连续增殖性培养间充质干细胞同时维持其一致性。此外，本发明涉及用于诱导间充质干细胞分化的标准化方法，不管其遗传背景差异如何，都可广泛应用于所有人类多能干细胞。本发明还可通过使用人类多能干细胞以连续方式大规模生产再生医学和干细胞治疗所必需的间充质干细胞。因此，可实现细胞治疗产品的实际用途，且本发明预计大大有助于对例如心血管病和神经障碍等不易治疗病症的治疗。

Description

由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方 法产生的间充质干细胞
本申请是申请号为200980163164.3，申请日为2009年10月28日，发明名称为“由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方法产生的间充质干细胞”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种由人类多能干细胞诱导间充质干细胞的方法、通过所述方法产生的间充质干细胞以及包含间充质干细胞的细胞治疗产品。
背景技术
干细胞是能够分化为构成有机体组织的多种细胞的细胞，且一般指分化之前的未分化细胞，其可获自胚胎、胎儿和成人身体的各个组织。干细胞通过分化刺激(环境)分化为特定细胞；与因分化完成而引起其细胞分裂已停止的细胞不同，干细胞允许通过经由细胞分裂(自我更新)产生与其本身相同的细胞来进行增殖(扩增)；且由于在不同环境下或通过不同的分化刺激，干细胞可分化为其它细胞，因此干细胞在分化过程中具有可塑性。
干细胞根据其分化能力可分为多能(pluripotent)、多效(multipotent)和单能(unipotent)干细胞。多能干细胞为具备全能性以分化为所有细胞的多能细胞，且这些多能干细胞包含胚胎干细胞(ES细胞)以及诱导性多能干细胞(iPS细胞)等。成体干细胞可为多效和/或单能干细胞的实例。
胚胎干细胞由早期胚胎发育中胚细胞的内细胞团形成；具备全能性以分化为所有细胞从而使得其能够分化为任何种类的组织细胞；可以永生和未分化状态的形式培养；与成体干细胞不同，可通过生殖细胞的制备遗传到下一代(汤姆逊(Thomson)等人，科学(Science)，282，1145-1147，1998；瑞比诺夫(Reubinoff)等人，自然生物技术(Nat，Biotechnol.)，18；399-404，2000)。
通过在人类胚胎形成的时候仅分离并培养内细胞团来制备人类胚胎干细胞，且当前，已从灭菌操作后剩余的冷冻胚胎中获得全局制备的人类胚胎干细胞。为使用能够分化为所有细胞的多能人类胚胎干细胞作为细胞治疗产品，已进行了各种尝试；然而，这些尝试尚未完全克服例如致癌和免疫排斥风险高等障碍。
作为对这些尝试的一种补充，最近已对诱导性多能干(iPS)细胞进行了报道。包含在多能干细胞概念中的iPS细胞为通过去分化成体细胞获得的细胞，所述成体细胞的分化以若干方式结束，因而在分化的早期阶段恢复为胚胎样状态。到目前为止，已有报道称鉴于基因表达和分化能力，去分化的细胞呈现出与胚胎干细胞(其为多能干细胞)几乎相同的特性。这些iPS细胞还可使用自体细胞，因而排除了免疫排斥的风险，然而肿瘤发生的风险仍然是需要解决的问题。
近来，已提供了具有免疫调节功能并且无肿瘤发生风险的间充质干细胞作为用于解决这些问题的替代方法。间充质干细胞为能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞等的多效细胞，且已报道具有调节免疫反应的功能。间充质干细胞可从各种组织分离出来并培养，但它们的能力和细胞表面标记依据其来源而互不相同。因此，并不容易清楚地界定间充质干细胞。然而，间充质干细胞通常由可分化为骨细胞、软骨细胞和肌细胞的细胞界定；具有螺旋形式；并且表达CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)，这些是基本的细胞表面标记。
同时，为使间充质干细胞用作细胞治疗产品，再生医学和/或细胞治疗领域所需的约1×109最少数量的细胞需得到满足。然而，在考虑用于设定条件和标准的实验时，实际需要的细胞数量进一步增加。因此，体外实验中需要至少10次传代以由获自各种来源的现有间充质干细胞提供所述量的细胞。在这种情况下，细胞变得老化并经修饰，因此，它们可能不会再适于用作细胞治疗产品。虽然已通过使用这些细胞来设定条件和标准，但可能会出现一些问题：这些细胞可能在实际用于治疗中之前就已变得枯竭，从而需要使用来自他人的间充质干细胞，且在这种情况下，由于使用不同的细胞而需要进行额外的实验。
解决现有间充质干细胞培养系统的上述问题的最理想替代方法是使用人类多能干细胞来产生间充质干细胞。然而，到目前为止，诱导人类多能干细胞分化为间充质干细胞已需要由特定细胞因子(例如，BMP、bFGF)进行诱导程序(这成本很高且需要控制浓度)或对具有异种病原体风险的异种饲养细胞(OP9小鼠细胞株)进行诱导程序以及其后通过特定标记(例如CD73)进行分选。
此外，就通过这些方法产生的间充质干细胞来说，很难维持其基本状态且生产效率不高。此外，具有不同遗传背景的人类多能干细胞具有不同的生理机制，从而无法使用用于诱导间充质干细胞分化的现有方法(这些方法先前是在特定系中建立)。因此，为从具有不同遗传起源的人类多能干细胞诱导间充质干细胞具有一定的难度，需要开发和应用其它的分化诱导方法。鉴于这些原因，在再生医学和细胞治疗领域中，间充质干细胞在用作理想细胞治疗产品时具有局限性。
发明内容
本发明提供间充质干细胞的高效率大规模生产方法，其通常适用于具有各种遗传背景的人类多能干细胞。此外，本发明还提供通过所述方法产生的间充质干细胞、包含间充质干细胞的细胞治疗产品以及用于由人类多能干细胞产生间充质干细胞的标准化培养系统。
为解决上述问题，本发明提供由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法，所述方法包含：a)由人类多能干细胞形成胚胎体；b)使胚胎体附着到组织培养皿，然后诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞；以及c)执行间充质干细胞的连续增殖性培养，同时维持间充质干细胞的一致性。具体来说，分化诱导可包含通过自体细胞因子回路的形成诱导自发分化以及具有使用培养基的特性，所述培养基包括人表皮生长因子(hEGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-B)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、氢化可的松(hydrocortisone)、抗坏血酸等，可使用类似物以维持并以增殖性方式培养经分化诱导的间充质干细胞。
本发明提供用于诱导间充质干细胞分化和增殖性培养间充质干细胞的标准化方法，不管其遗传背景的差异如何，都能够广泛应用于所有的人类多能干细胞。进一步来说，本发明可以连续方式大规模生产间充质干细
胞，作为用于细胞治疗产品的最佳资源，同时仍维持间充质干细胞的一致性。进一步来说，本发明能够克服因异种饲养细胞的诱导而引起的异种病原体的风险以及可能由于荧光激活细胞分选器(FACS)进行的分选而造成的细胞损伤，且允许以低成本得到间充质干细胞的高效率生产。最终，本发明可通过使用人类多能干细胞，很容易地大规模生产间充质干细胞(其可理想地用于再生医学和细胞治疗中)，从而实现细胞治疗产品的实际用途。此外，本发明预计大大有助于对例如心血管病和神经障碍等不治之症的治疗。
附图说明
图1a显示诱导人类多能干细胞分化为间充质干细胞以及间充质干细胞的增殖性培养。
图1b显示通过利用聚合酶链反应，与7天胚胎体(embryonic bodies on day 7ofculture)和14天胚胎体(embryonic bodies on day 14of culture)的间充质分化相关的基因表达差异的定量结果。
图1c显示通过对14天胚胎体染色，在间充质分化的早期阶段基因蛋白质表达的验证结果。
图2a显示在胚胎体附着时对14天胚胎体的分选。
图2b显示在通用培养基中培养胚胎体时起始诱导分化为间充质干细胞，通用培养基中不会添加外部细胞因子。
图2c和图2d分别显示在以不利用以及利用诺金(Noggin)(其为BMP拮抗剂)处理过的群组中分化为间充质干细胞的诱导过程。
图3显示EGM-2MV培养基与á-MEM培养基(其为用于培养间充质干细胞的现有培养基)之间的效率差异，这通过与细胞衰老相关的β-gal染色证实。
图4a显示在EGM-2MV培养基中培养140天或更长时间的间充质干细胞的生长模式。
图4b是本发明的间充质干细胞的生长曲线，表明间充质干细胞在体外培养时生长，同时维持长期活性。
图5a和图5b显示通过本发明的方法获得的间充质干细胞表达间充质特有的标记。
图6显示在长期体外培养后，本发明的间充质干细胞的染色体分析结果。
图7a和图7b显示通过本发明的方法获得的间充质干细胞的分化能力的分析结果。
图8a和图8b显示通过本发明的方法获得的间充质干细胞是否形成畸胎瘤以及是否表达与免疫诱导相关的因子。
图9a至图9d显示通过利用缺血性心血管病小鼠模型观测功能以便估计通过本发明的方法获得的间充质干细胞的功能性而获得的结果。
图10显示关于通过本发明的方法获得的间充质干细胞作为自体饲养细胞的可能性的实验结果。
图11a至图11f显示对通过利用车医院的3号人类胚胎干细胞株(CHA3-hESC)以及H9人类胚胎干细胞株(其具有与首尔国立大学医院(Seoul National UniversityHospital)的人类胚胎干细胞不同的遗传背景和培养环境)对本发明再现性的验证结果。
具体实施方式
本发明针对通过利用人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法，所述方法包含：a)由人类多能干细胞形成胚胎体；b)使胚胎体附着到组织培养皿，然后诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞；以及c)维持并以增殖性方式培养经分化诱导的间充质干细胞。具体来说，本发明可包含由人类多能干细胞形成胚胎体，且此可通过所属技术领域中已知的一般方法实施。举例来说，人类多能干细胞可用蛋白酶处理，随后在不含碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)的胚胎干细胞培养基中以悬浮状态培养。
如本文使用的术语“干细胞”指代能够以无限方式使细胞再生以便形成组织和器官的专一细胞的主细胞。干细胞是可发展的多效或多能细胞。干细胞可细胞分裂成两个子干细胞，或一个子干细胞和一个转化细胞，且随后增殖为成熟和完整的组织细胞类型。这些干细胞可通过各种方法分类。最常用的方法之一取决于干细胞的分化能力。根据所述方法，干细胞可分为能够分化为三胚层细胞的多能干细胞、能够以有限方式分化为特定胚层或更多的多效干细胞以及仅能够分化成特定胚层的单能干细胞。
如本文使用的术语“多能干细胞”指代具有多能性的干细胞，所述多能干细胞能够分化为构成活体的所有三胚层，且其实例包含胚胎干细胞和诱导性多能干(iPS)细胞。成体干细胞可为多效或单能干细胞。
如本文使用的术语“分化”指代一种过程，通过这一过程细胞在分裂期间的结构或功能、细胞的增殖和生长变得专一化，即细胞的形态或功能变化，使得有机体的细胞、组织等执行其既定工作。一般来说，这是相对简单的系统被分成两个或两个以上性质上不同的分系统的过程。分化指代一种状态，在此状态下，某种生物系统(其起初已经是均质的)的各部分在性质上变得互不相同，或者由于上述原因而分裂为在性质上明显不同的部分或分系统，例如就卵(其起初是均质的(homogeneous))个体发育而言，被分成头、身体等，或细胞被分成肌细胞、神经细胞等，变得互不相同。
本文使用的术语“胚胎体(EB)”指代通过诱导多能干细胞的分化而形成的聚集物。当在不含碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)的胚胎干细胞培养基中不存在饲养细胞的情況下以悬浮状态培养多能干细胞时，可产生胚胎体。通过上述方法制备的胚胎体已报道能够分化为来自内胚层、中胚层和外胚层的个体形成所必需的所有细胞，且此对应于证明多能干细胞的多能性的体外方法之一。
本发明可包含选择培养14天的胚胎体以及诱导胚胎体分化为间充质干细胞。具体来说，可选择培养14天的胚胎体(其通过在不含bFGF的胚胎干细胞培养基中以悬浮状态培养人类多能干细胞而形成)，然后用于产生间充质干细胞。培养7天的胚胎体通常用于从人类多能干细胞(通常为人类胚胎干细胞)诱导分化为间充质干细胞的现有方法。然而，本发明人发现，鉴于间充质干细胞由人类多能干细胞产生，选择培养14天的胚胎体而不是培养7天的胚胎体可提高分化诱导效率。具体来说，由于对培养7天和14天的胚胎体的基因表达的研究，已证实与早期间充质分化相关的基因(短尾基因(brachyury)、BMPR等)和Sox 17(其为早期心脏间充质细胞中的重要基因)在培养14天的胚胎体中与培养7天的现有胚胎体相比，得到显著高的表达(见图1b)。根据以上结果可以看出，选择培养14天的胚胎体可诱导优先分化为间充质干细胞。
另外，本发明还可包含使培养14天的胚胎体附着到组织培养皿，然后诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞。当诱导人类多能干细胞分化为间充质干细胞时，通常通过外部添加骨形态发生蛋白((BMP)-2)等来起始分化诱导。本发明人发现，在不外部添加BMP-2等的情况下，当通过使用例如杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)培养基等通用细胞培养基培养胚胎体时，诱导自发分化为间充质干细胞(见图2b)。关于此机制，本发明人考虑到相关技术所已知BMP自动回路形成的可能性(其为间充质干细胞诱导因子)，然后为证明此，通过利用诺金(其为BMP拮抗剂)进行的处理观测间充质干细胞分化的诱导过程(见图2c和图2d)。在未用诺金处理的群组中诱导分化为间充质干细胞(见图2c)。然而，观测到间充质祖细胞并不出现于经诺金处理的群组中(见图2d)，而且在传代培养时，由于细胞无法重新附着，因此细胞培养是不可能的。根据上述结果可以看出，当培养14天的胚胎体在其附着后在通用培养基中培养时，即使不存在外部添加细胞因子的情况，也会诱导自发分化为间充质干细胞，且这是由于BMP回路系统的自我调节。
另外，本发明可包含通过使用含有细胞因子的培养基维持并以增殖性方式培养经分化诱导的间充质干细胞。在本发明中，含有人表皮生长因子(hEGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-B)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、氢化可的松以及抗坏血酸等的微脉管内皮细胞2型培养基(EGM-2MV，瑞士巴塞尔龙沙(Lonza；Basel,Switzerland))培养基用作间充质干细胞的培养基。本发明人发现当使用EGM-2MV培养基替代广泛用作现有间充质干细胞培养基的α-MEM培养基时，间充质干细胞的活性在其体外培养中维持得相对较长。
为使用间充质干细胞作为细胞治疗产品，如上所述提供足量的细胞必须放在首位，且为了此目的，需要对间充质干细胞传代培养。然而，重复的传代培养可能会导致间充质干细胞衰老，引起其分裂能力降低，因而可能会失去其活性(分化能力)。在这点上，已证实与已用作现有间充质干细胞培养基的α-MEM培养基相比，本发明的EGM-2MV培养基具有优越的活性保留能力(见图3)。具体来说，由于通过实施β-gal染色来在细胞衰老时为其染色，已看到更多细胞的β-gal染色得以完成，且与通过使用EGM-2MV培养基培养的间充质干细胞相比，在通过使用α-MEM培养基培养的间充质干细胞中细胞的尺寸变得非常大。一般来说已知的是，在干细胞体外培养时，由于细胞衰老引起的细胞非生长与细胞的增大相关。这意味着，当通过使用α-MEM培养基培养间充质干细胞时，间充质干细胞的衰老加速，因而间充质干细胞失去分化能力。
另外，本发明提供通过本发明的方法产生的间充质干细胞。间充质干细胞可分化为骨细胞、软骨细胞和肌细胞等，且由螺旋形式和基本细胞表面标记(SH2(+)、SH3(+)、CD34(-)和CD45(-))的表达程度界定。通过本发明的方法获得的来源于首尔国立大学医院人类胚胎干细胞(亚洲1号，男性，STO饲养细胞)的间充质干细胞在三次不同试验的情况下得出相同的结果，这通过荧光激活细胞分选器以及通过功能分化证实。
本发明提供用于诱导分化和增殖培养的标准化方法，这通常可用于由具有各种遗传起源的人类多能干细胞产生间充质干细胞。在这点上，对车医院的人类胚胎干细胞(亚洲2号，男性，MEF饲养细胞)以及H9人类胚胎干细胞(西方人，女性，MEF饲养细胞)执行本发明的方法，这些干细胞具有与首尔国立大学医院的人类胚胎干细胞不同的遗传起源，且从那里获得相同的结果。也就是说，为诱导由具有各种遗传背景和/或培养环境的人类多能干细胞分化间充质干细胞，通常可使用本发明的标准化方法。
另外，本发明提供包含通过本发明的方法获得的间充质干细胞的细胞治疗产品。具体来说，细胞治疗产品可用于形成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞，且根据环境分化为各种细胞。
如本文使用的术语“细胞治疗产品”指代用于治疗、诊断以及预防的药物，包括通过分离、培养和专业化操作(美国FDA指导)而由人类制备的细胞或组织，且更具体来说指代用于治疗、诊断以及预防的药物，其通过包含对自体、同源或异源体外活细胞进行增殖或分选或通过其它方法修饰细胞生物特性的任何过程制备，以便恢复细胞或组织的功能。细胞治疗产品根据细胞分化的程度主要分为体细胞治疗产品和干细胞治疗产品，且本发明特别针对干细胞治疗产品。
另外，本发明提供用于由具有各种遗传起源的人类多能干细胞产生间充质干细胞的系统。所述系统包含：a)培养人类多能干细胞以及选择培养14天的胚胎体；b)使胚胎体附着到组织培养皿且通过利用DMEM+FBS培养基诱导来培养胚胎体，从而诱导胚胎体的分化；c)以及通过使用含有人表皮生长因子(hEGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-B)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、氢化可的松以及抗坏血酸的培养基来维持并以增殖性方式培养间充质干细胞。
另外，本发明提供用于培养人类多能干细胞的饲养细胞。培养时，需要饲养细胞来以连续方式维持人类多能干细胞的未分化状态。来源于小鼠胚胎的成纤维细胞已优选用作用于人类多能干细胞的现有饲养细胞。然而，由于当多能干细胞将用于临床时，各种病原体的种间渗透已被视为是一个问题，因此来源于人类的若干细胞已经报道可能用作饲养细胞作为替代方法。然而，这仍无法克服不足：不可能完全排除异源病原体；本质上需要外来因子来维持未分化状态(例如，bFGF、IGF和ACTIVIN等)；以及不可能连续提供细胞用于长期培养。相反，来源于人类多能干细胞的间充质干细胞(其根据本发明产生)可以连续方式提供具有同一背景的细胞，且作为自体饲养细胞，还可排除其它病原体的免疫排斥和/或渗透。此外，本发明人发现以下优点：当来源于人类多能干细胞的间充质干细胞(其根据本发明产生)用作饲养细胞时，不需要外来未分化的状态维持因子。换句话说，已证实即使30或30次以上传代期间不添加未分化的状态维持因子，未分化的状态也得以维持(见图10)，且即使在为了维持未分化状态而添加过量因子的情况下使用来源于人类的现有若干饲养细胞时，也无法获得此显著效应“维持未分化状态较长时间”。
在下文中，将参考以下实例详细描述本发明。然而，以下实例仅用于例示本发明，因而本发明的范围并不限于以下实例。很显然，由所属领域的技术人员作出的各种修改均包含在本发明的技术范围内。
[实例]
实例1：由首尔国立大学医院的人类胚胎干细胞产生间充质干细胞
(1)胚胎体的形成
用分散酶(2mg/ml)对首尔国立大学医院的人类胚胎干细胞(亚洲1号，男性，STO饲养细胞)(其维持未分化状态)进行处理，接着通过精细操作分离，然后在不含bFGF的胚胎干细胞培养基中以悬浮状态培养14天。
对培养7天和14天的胚胎体执行基因分析，且通过利用聚合酶链反应(PCR)定量与用于各胚胎体的间充质分化相关的基因表达差异。已证实，短尾基因和BMPR(其为与早期间充质分化相关的基因)以及Sox 17(其为早期心脏间充质细胞中的重要基因)在培养14天的胚胎体中与培养7天的胚胎体相比，得到显著高的表达(见图1b)。另外，通过对培养14天的胚胎体进行染色确定短尾基因的蛋白质表达及其位置(见图1c)。
(2)诱导分化为间充质干细胞
将通过14天悬浮培养制备的胚胎体附着到组织培养皿，然后诱导自然分化为间充质干细胞。在图2a中显示在附着时对14天胚胎体的分选。附着后，一些胚胎体生长得很好(图2a左图)，而另一些胚胎体生长得不好(图2a右图)。观测到诱导分化为间充质干细胞，同时胚胎体在包括杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS，10％v/v(体积比上体积))的培养基中培养16天。在图2b中显示胚胎体附着后第3天和第7天的观测结果。
如从图2b所见，已证实，当在无细胞因子的通用培养基(DMEM+FBS)中培养胚胎体时，起始诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞。为了揭开分化诱导的机制，比较并观测经由利用诺金(其为BMP拮抗剂)处理诱导分化为间充质干细胞的过程(见图2c和图2d)。已证实，在未用诺金处理的群组中诱导分化为间充质干细胞(见图2c)，而在以诺金处理的群组中未观测到间充质祖细胞(见图2d)。从上述结果可以看出，在并未外部添加细胞因子的通用培养基中培养胚胎体时，诱导自发分化为间充质干细胞是由BMP自动反馈回路系统引起。
(3)经分化诱导的间充质干细胞的维持和增殖性培养
间充质干细胞(其在实例1的(2)中在附着后通过培养胚胎体16天而经分化诱导)利用酶(胰蛋白酶-EDTA，含EDTA 4Na的0.25％胰蛋白酶)进行处理，且分离成单细胞，随后单细胞再附着到组织培养皿。随后，通过使用500ml的培养基，在37℃下维持并以增殖性方式培养细胞，所述培养基包括0.5ml的人表皮生长因子(hEGF)、0.5ml的血管内皮生长因子(VEGF)、2ml的人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-B)、0.5ml的胰岛素样生长因子(IGF-1)、0.2ml的氢化可的松以及0.5ml的抗坏血酸，再加上470ml的基础培养基。
关于间充质干细胞的活性在增殖性培养期间是否得到维持，通过实验相互比较本发明使用的EGM-2MV培养基与α-MEM培养基(其为现有的间充质干细胞培养基)的活性维持能力。具体来说，对通过使用各培养基培养的细胞群组执行与衰老相关的β-gal染色，且在图3中显示这些结果(培养和比较进行一个月，且使用第7次培养传代的细胞)。
图3中显示，在通过使用α-MEM培养基培养的间充质干细胞中相比于通过使用EGM-2MV培养基培养的间充质干细胞中，更多细胞经β-gal染色。这意味着，在通过使用α-MEM培养基培养间充质干细胞时，间充质干细胞的衰老加速，因而间充质干细胞失去分化能力，最终间充质干细胞无法充当细胞治疗产品。然而，尽管传代培养是连续的，但本发明EGM-2MV培养基的使用也能够维持间充质干细胞的活性较长时间，因而与α-MEM培养基的使用相比，可相对改进作为细胞治疗产品的实用性。
另外，研究当通过使用EGM-2MV培养基培养间充质干细胞较长时间时，是否能够连续维持间充质干细胞的一致性和活性，且其结果显示在图4a和图4b中。图4a显示通过使用EGM-2MV培养基培养140天或更长时间后的细胞，且其显示细胞的生长形态仍具有指纹图案(这是间充质干细胞的典型图案)。图4b显示直到培养140天才出现连续且强烈的细胞分裂，且这表明间充质干细胞的活性可以连续方式维持。综上所述，可清楚地看出，当经分化诱导的间充质干细胞在本发明的EGM-2MV培养基中维持并以增殖性方式培养时，间充质干细胞的一致性和活性可维持较长时间。
实例2：间充质干细胞的表征
(1)细胞表面标记的分析
已分析实例1中获得的间充质干细胞特有的细胞表面标记是否得到表达。在抗原-抗体反应后通过使用荧光激活的细胞分选器获得的结果显示在图5a和图5b中。IgG用作对照。
根据图5a已证实，在培养95天(D95)和培养129天(D129)的细胞中，间充质干细胞所特有的标记CD73和CD105仍大量表达。另外，对培养129天的间充质干细胞执行细胞表面标记分析，且这些结果显示在图5b中。根据图5b已证实，CD29、CD44和CD90(其为人类间充质干细胞(hMSC)标记)得到表达，但SSEA1、SSEA4、TRA-1-60和OCT-4(其为人类胚胎干细胞(hESC)标记)与内胚层和外胚层标记(其它谱系标记)均未得到表达。
最终，根据本发明的方法，可清楚地显示可选择性诱导人类多能干细胞仅分化间充质干细胞，且进一步来说，可在细胞的长期增殖性培养时维持间充质干细胞的一致性。
(2)核型分析
通过利用G显带法(萨科内(Saccone)等人,美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89:4913-4917,1992)分析实例1中获得的间充质干细胞(培养160天)的核型，且这些结果显示在图6中。根据图6已证实，间充质干细胞具有XY+44的正常核型。
(3)间充质干细胞的功能(分化能力)的验证
为验证实例1中获得的间充质干细胞(培养129天)的分化能力，通过利用先前报道的方法(蒂齐亚诺·巴尔贝里(Tiziano Barberi)等人,公共科学图书馆·医学(PLoSMedicine),2:0554-0560,2005年6月；以及凯斯·J·佩尼克(Kitsie J.Penick)等人,生物技术(Biotechniques),39:687-691,2005)进行分析。具体来说，诱导间充质干细胞分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞，随后通过免疫染色反应研究各细胞所特有的基因表达。细胞分化结果显示在图7a中。
通过利用抗原-抗体反应，用油红O(Oil Red O)(其对脂肪细胞小滴染色)对脂肪细胞染色，且利用聚集蛋白聚糖和胶原蛋白II(这是软骨细胞所特有的表达蛋白)对软骨细胞染色。此外，利用抗原-抗体反应，通过能够证实矿物质形成的冯科萨染色(Von Kossastaining)来证实骨细胞的分化，以及利用MYF 5(这是肌细胞所特有的表达蛋白)来证实肌细胞的分化。
另外，当间充质干细胞分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞时，利用PCR定量各细胞所特有的各基因表达，且这些结果显示在图7b中。根据图7b已证实，脂肪细胞中的Serbf和PPARγ，骨细胞中的ALP、骨钙蛋白(Osteocalcin)和骨桥蛋白(Osteopontin)，软骨细胞中的聚集蛋白聚糖以及肌细胞中的MyoD分别得到表达。上述结果清楚表明，根据本发明的方法获得的间充质干细胞保留多能性以分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞。
(4)利用免疫缺陷小鼠验证肿瘤发生
已证实通过利用实例1中的免疫缺陷小鼠获得的本发明的间充质干细胞是否会肿瘤发生。人类胚胎干细胞用于对照实验。具体来说，将首尔国立大学医院1×107的间充质干细胞和3×106的人类胚胎干细胞注入免疫缺陷小鼠，且在图8a中显示12周后的尸检结果。根据图8a已证实，在注入有首尔国立大学医院人类胚胎干细胞的小鼠中产生畸胎瘤，且在注入有本发明的间充质干细胞的小鼠中不会产生畸胎瘤。另外，已由FACS证实，与免疫诱导相关的因子并未得到表达，且这些结果显示在图8b中。IgG用作对照。根据图8b已证实，HLA-DR和HLA-DQ(其为因免疫原性的存在而表达的MHC II分子)不被表达为表面因子，且B7-2和B7-1(其为与免疫诱导相关的共模拟子(co-simulator))并未得到表达。
综上所述，已证实，即使在本发明的间充质干细胞以胚胎干细胞(对照)大约三倍或三倍以上数量移植到小鼠中时，也不会诱发肿瘤，且即使在12周的长期培养期间，与免疫诱导相关的因子也不会得到表达。因此，这清楚地表明，本发明的间充质干细胞无肿瘤发生的风险。
(5)利用缺血性心血管病模型进行的功能性评估
为评估从实例1获得的本发明的间充质干细胞对于缺血性心血管病的功能性，使用缺血性心血管病小鼠模型。在将每只小鼠5×104的间充质干细胞(培养129天)移植到具有上述疾病的小鼠中后，评估间充质干细胞的功能性持续8周，并且在图9a至图9d中显示这些结果。
图9a和图9b显示移植有间充质干细胞的心脏以及未移植有间充质干细胞的心脏。经由MT染色观测纤维化，且图中的蓝色部分表示纤维化。图9a和图9b显示，与未移植有细胞的心脏组织(图9b)相比，在移植有细胞的心脏组织(图9a)中因心壁的纤维化而引起的变薄要更少。也就是说，缺血性心脏病中存在心壁的纤维化，因而壁变薄。然而，当本发明的间充质干细胞被移植时，可阻止因纤维化而引起的心壁变薄。另外，图9c显示损伤诱发区域中的心壁的纤维化部分用数字表示并量化的结果，且这清楚地表明，与不存在细胞移植的对照相比，细胞移植群组中的纤维化部分进一步减少。图9d显示8周追踪中的回波心电图测量结果。第4周和第8周的两个心电图测量记录可证实细胞移植群组中的心壁运动优于对照组。LVEDD表示心脏舒张，以及LVFS表示心脏收缩，且由于LVEDD值较小以及LVFS值较大，因此心脏功能较好。
根据结果已证实，当本发明的间充质干细胞移植到缺血性心血管病模型中时，心壁并不会变薄，且间充质干细胞替代死亡组织，因而导致心脏功能障碍的纤维化区域减少，从而最终改进缺血性心血管病。
(6)作为自体饲养细胞的功能性的实验
对实例1中获得的本发明的间充质干细胞可用作用于维持人类多能干细胞呈未分化状态的饲养细胞的可能性进行研究。在本实验中，在无bFGF(其为人类多能干细胞的未分化状态维持因子)的情况下进行培养。
具体来说，通过使用根据本发明通过诱导首尔国立大学医院3号人类胚胎干细胞株(SNUhES3)分化而获得的间充质干细胞(SNU3MSC-1)作为饲养细胞来培养首尔国立大学医院3号人类胚胎干细胞株(SNUhES3)。已证实，当在不存在未分化状态维持因子(bFGF)的情况下培养人类胚胎干细胞时，尽管经30或30次以上传代培养，但人类胚胎干细胞的未分化状态得到维持(见图10)。从图10可以看出，OCT-4、SSEA-4和TRA-1-60(其为人类多能干细胞标记)甚至在30次传代培养后仍得到表达，且这证明其未分化能力得到了完整维持。综上所述，已证实，当在培养人类多能干细胞时本发明的间充质干细胞用作自体饲养细胞时，即使在不添加bFGF的情况下，多能干细胞的未分化能力也可连续维持，所述bFGF为在其现有培养期间维持多能干细胞的未分化能力所必需。
实例3：由车医院的人类胚胎干细胞和H9人类胚胎干细胞产生间充质干细胞以及其表征
为确定本发明的间充质干细胞的产生方法通常是否能够应用于具有不同遗传背景和/或培养环境的人类多能干细胞(即其再现性)，进行实验。通过与本发明的实例1相同的方法进行所述实验，其中例外为使用车医院的3号人类胚胎干细胞株(CHA3-hESC)和H9人类胚胎干细胞，其具有与首尔国立大学医院的人类胚胎干细胞不同的遗传背景和/或培养环境。具体来说，在培养14天的胚胎体附着后，在不外部添加细胞因子的通用培养基中诱导自发分化为间充质干细胞，随后通过使用EGM-2MV培养基进行维持和增殖性培养来获得间充质干细胞。
图11a至图11f显示通过使用车医院的3号人类胚胎干细胞株(CHA3-hESC)和H9人类胚胎干细胞(其具有与首尔国立大学医院的人类胚胎干细胞不同的遗传背景和/或培养环境)，对本发明间充质干细胞产生方法的再现性的验证结果。
如从图11a和图11b可见，来源于车医院的间充质干细胞(培养90天)以及来源于H9细胞的间充质干细胞(培养90天)均呈现出间充质干细胞的典型表型。另外，通过使用荧光激活细胞分选器进行的蛋白质表达的分析结果证实CD105、CD73、CD29、CD44和CD90(其为间充质干细胞所特有的蛋白质)被视为阳性，而SSEA-1、SSEA-4和TRA-1-60(其为胚胎干细胞的特有标记)以及CD45、CD34(其为来源于其它胚层的标记)被视为阴性[见图11c(D90，来源于车医院的细胞的间充质干细胞)以及图11d(D90，来源于H9细胞的间充质干细胞)]。
另外，通过利用G显带法(萨科内(Saccone)等人,美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89:4913-4917,1992)，作为来源于车医院的细胞的间充质干细胞(培养90天)以及来源于H9细胞的间充质干细胞(培养90天)的核型的分析结果，已证实它们均具有XY+44的正常核型(分别见图11e和图11f)。
根据上述结果，根据本发明由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法被证明是培养间充质干细胞的标准化方法，其通常可应用于具有不同遗传背景和/或培养环境的人类多能干细胞。
根据本发明，间充质干细胞可以低成本大规模生产作为用于细胞治疗产品的最佳资源，同时仍维持其一致性。最终，本发明可通过使用人类多能干细胞，很容易地大规模生产间充质干细胞(其可理想地用于生殖医学和细胞治疗中)，从而实现细胞治疗剂的实际用途。此外，本发明可大大有助于对例如心血管病和神经障碍等不治之症的治疗。

Claims (13)

1.一种由维持未分化状态的成熟且商业化的人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法，所述方法包括：
a)通过在不含bFGF的培养基中以悬浮状态培养维持未分化状态的成熟且商业化的人类多能干细胞14天以形成聚集物；
b)使所述聚集物附着到培养皿以诱导所述聚集物自发分化为间充质干细胞；以及
c)以增殖性方式培养所述间充质干细胞，同时维持所述间充质干细胞的一致性，
其中成熟且商业化的人类多能干细胞不包含直接分离自人类胚胎或胚泡的人类多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在含有胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基的碱性组分中培养步骤b)的所述聚集物，从而诱导其分化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过在不添加外部细胞因子的情况下形成自体细胞因子回路而出现步骤b)的所述自发分化的诱导。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述自体细胞因子为骨形态发生蛋白(BMP)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过使用含有人表皮生长因子、血管内皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、氢化可的松以及抗坏血酸的培养基来培养步骤c)的所述间充质干细胞。
6.一种间充质干细胞，其由根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法产生。
7.一种细胞治疗产品，其包括根据权利要求6所述的间充质干细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞治疗产品，其中所述细胞治疗产品形成选自由脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞组成的群组中的细胞。
9.一种使用由根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法产生的间充质干细胞的方法，其作为用于培养成熟且商业化的人类多能干细胞的饲养细胞，其中成熟且商业化的人类多能干细胞在没有添加bFGF的情况下维持在未分化状态。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述维持未分化状态的成熟且商业化的人类多能干细胞经受30次传代培养。
11.一种用于培养成熟且商业化的人类多能干细胞的饲养细胞，其包括由根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法产生的间充质干细胞，其中成熟且商业化的人类多能干细胞在没有添加bFGF的情况下维持在未分化状态。
12.一种用于由通过培养在未添加bFGF的情况下维持未分化状态的成熟且商业化的人类多能干细胞形成的聚集物产生间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)胚胎干细胞培养基，其不含碱性成纤维细胞生长因子；
b)杜尔伯科改良伊格尔培养基，其含有体积比上体积为10％的胎牛血清；以及
c)培养基，其含有人表皮生长因子、血管内皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、氢化可的松以及抗坏血酸，
其中成熟且商业化的人类多能干细胞不包含直接分离自人类胚胎或胚泡的人类多能干细胞。
13.一种用于由维持未分化状态的成熟且商业化的人类多能干细胞产生间充质干细胞的培养系统，所述培养系统包含：
a)在不含bFGF的培养基中以悬浮状态培养维持未分化状态的成熟且商业化的人类多能干细胞并选择培养14天的聚集物；
b)使所述聚集物附着到组织培养皿并通过使用含有胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基培养基培养所述聚集物，从而诱导所述聚集物分化为间充质干细胞；以及
c)通过使用含有人表皮生长因子、血管内皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、氢化可的松以及抗坏血酸的培养基维持并以增殖性方式培养所述间充质干细胞，
其中成熟且商业化的人类多能干细胞不含有直接分离自人类胚胎或胚泡的人类多能干细胞。
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