KR102200555B1 - 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포 - Google Patents

인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포 Download PDF

Info

Publication number
KR102200555B1
KR102200555B1 KR1020190099361A KR20190099361A KR102200555B1 KR 102200555 B1 KR102200555 B1 KR 102200555B1 KR 1020190099361 A KR1020190099361 A KR 1020190099361A KR 20190099361 A KR20190099361 A KR 20190099361A KR 102200555 B1 KR102200555 B1 KR 102200555B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
differentiation
hypoxia
hepatocytes
cells
hascs
Prior art date
Application number
KR1020190099361A
Other languages
English (en)
Inventor
박인수
Original Assignee
아주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아주대학교산학협력단 filed Critical 아주대학교산학협력단
Priority to KR1020190099361A priority Critical patent/KR102200555B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102200555B1 publication Critical patent/KR102200555B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포에 관한 것으로, 구체적으로 저산소(hypoxia) 조건 하에서 배양하되 광조사(Photobiomodulation irradiation; PBM)하여 인간유래 지방줄기세포(hASCs)로부터 간세포의 분화를 유도하는 방법 및 이에 의해 제조된 간세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 분화 방법은 전세포사멸인자(pro-apoptotic factor)인 PARP, Caspase-3, BAX 단백질 발현을 감소시키고, 항세포사멸인자(anti-apoptotic factor)인 Bcl-2, pAKT 단백질 발현을 향상시켜 hASCs 세포의 세포사멸(Apoptosis)을 억제하고, 간세포 성장인자와 섬유아세포 성장인자의 생산을 향상시켰는바, 인간유래 지방줄기세포(hASCs)로부터 간세포로의 분화 효율을 향상시킨 것으로, 이를 이용하여 수득한 간세포는 간질환의 치료용 세포 치료제 및 이식체 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포{Method for differentiation of hepatocyte derived from human adipose-derived stem cells and Hepatocyte}
본 발명은 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포에 관한 것으로, 구체적으로 저산소(hypoxia) 조건 하에서 광조사(Photobiomodulation irradiation; PBM)하여 인간유래 지방줄기세포(hASCs)로부터 간세포의 분화를 유도하는 방법 및 이에 의해 제조된 간세포에 관한 것이다.
일반적으로 분화란 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 말하는데, 그 대표적인 예는 동물의 발생 과정에서 볼 수 있다. 즉, 정자와 난자가 결합하여 만들어진 수정란이라는 하나의 세포가 뼈, 심장, 피부 등의 다양한 조직 세포로 만들어지기 위해서는 '분화'가 일어나야 하는 것이다. 이러한 분화능력을 가지고 있는 줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하며 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 의미한다.
최근에, 인간 지방조직(adipose tissue)에 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화 세포군이 포함되어 있음이 보고되었다(B. Cousin 등, BBRC301: 1016, 2003; Miranville 등, Circulation 110: 349, 2004; S. Gronthos 등, J. Cell Physiol. 189: 54, 2001; M.J. Seo 등, BBRC 328: 258, 2005). 이러한 지방조직 유래 다분화능 줄기세포로서 지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)는 중간엽계 줄기세포와 비교하여 지방조직을 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 이점을 가지고 있어 다분화능 줄기세포의 새로운 공급원으로서 주목받고 있다.
한편, 간은 인간 체중의 3% 정도를 차지하며, 중요한 기능을 수행하는 장기이다. 간을 이루는 핵심세포인 간세포는 글리코겐, 단백질, 지질, 핵산, 비타민류 등의 생합성 및 분해의 기능과 독성이 있는 물질을 해독하는 기능을 나타낸다. 그러나 이런 정상적인 간 기능을 갖지 못하는 간질환 환자의 대부분은 간 조직 손상으로 인해 간세포의 재생 능력이 감소함에 따른다. 현재 국내 간질환 사망자는 10만 명당 1만 천명에 이른다는 보고가 있다. 간질환의 경우, 조직적합성을 갖는 간 조직 이식이 현재까지 가장 효과적인 치료방법으로 알려져 있으나, 공여자를 찾기에 어려움이 따른다는 중대한 단점이 있다. 이에 대한 대안으로 현재 줄기세포에 대한 연구가 활발해지면서 줄기세포를 이용한 세포 치료에 많은 관심이 집중되고 있다.
이러한 배경 하에 본 발명자는 저산소 조건 하에서 인간지방줄기세포를 배양하되 주기적으로 저출력 레이저로 광조사하여 배양하면 간세포의 분화에 효과적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제10-1624514호(2016.06.07. 공고)
The ScientificWorld Journal Volume 2013, Article ID 632972(2013.08.27. 공개)
본 발명자는 보다 효과적으로 간세포 분화 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 인간유래 지방줄기세포(hASCs)를 산소 함량이 낮은 저산소(hypoxia) 조건하에서 주기적으로 광조사(Photobiomodulation irradiation; PBM)하여 배양 시, 전세포사멸인자(pro-apoptotic factor)인 PARP(Poly-ADP-ribose-Polymerase), Caspase-3, BAX 단백질의 발현은 감소시키고, 항세포사멸인자(anti-apoptotic factor)인 Bcl-2, pAKT 단백질의 발현을 향상시켜 hASCs 세포의 세포사멸(Apoptosis)을 억제시키고, 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 및 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor; FGF2)의 발현을 향상시켜 간세포로의 분화를 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하게 되어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포에 관한 것이다.
따라서 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산소 함량이 낮은 저산소(hypoxia) 조건 하에서, 인체의 지방조직으로부터 분리된 인간유래 지방줄기세포(hASCs)를 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하되, 상기 간세포로의 분화를 유도하는 단계는 배양 시 적색 파장대의 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 인간 지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분화 방법으로 제조한 간세포를 제공한다.
본 발명에 따른 분화 방법은 전세포사멸인자인(pro-apoptotic factor)인 PARP, Caspase-3, BAX 단백질 발현을 감소시키고, 항세포사멸인자(anti-apoptotic factor)인 Bcl-2, pAKT 단백질 발현을 향상시켜 hASCs 세포의 세포사멸(Apoptosis)을 억제하고, 간세포 성장인자와 섬유아세포 성장인자의 생산을 향상시켰는바, 인간유래 지방줄기세포(hASCs)로부터 간세포로의 분화 효율을 향상시켰다. 따라서, 이를 이용하여 수득한 간세포는 간질환의 치료용 세포 치료제 및 이식체 등으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 hASCs 세포의 면역형광(Immunofluorescence) 염색 결과로서, 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 확인을 위해 CD29, CD90 및 CD105를 염색하였고, 내피 세포 계통 식별을 위해 KDR, CD31 및 CD34를 염색하였고, 평활근 세포 식별을 위한 SMA을 염색한 결과이다(Scale bar: 200μm).
도 2는 정상 조건(산소 농도; 21% O2) 또는 저산소 조건(1% O2) 하에서 hASCs 세포를 21 일 동안 배양하고 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)에 의한 hASCs 세포의 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과로서, 도 2(A)는 21일 되는 시점에 죽은 세포의 형광 현미경 이미지 사진으로, 죽은 세포는 호모다이머(ethidium homodimer, 적색)로 염색됨을 확인할 수 있었고, 도 2(B)는 hASCs 세포에서 전세포사멸인자(pro-apoptotic factor)로서 PARP, Caspase-3, BAX의 단백질 발현 감소와 항세포사멸인자(anti-apoptotic factor)로서 Bcl-2, pAKT의 단백질 발현 증가를 확인할 수 있다(Scale bar: 500μm).
도 3은 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)하여 배양한 hASCs 세포에서 성장인자의 생산을 확인한 결과로서, 도 3(A)는 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)한 hASCs에서 웨스턴 블롯 분석 및 HIF-1α의 정량 분석 결과를 나타낸 것이고(Scale bar: 100 μm), 도 3(B)는 간세포 관련 단백질을 면역형광(Immunofluorescence) 염색에 의해 모니터링한 결과로, hASCs 세포는 anti-human FGF, HGF 및 EGF antibodies와 함께 염색되었고, 도 3(c)는 PBM 처리에 의해 hASCs 세포에서 저산소에 의해 유도된 생존 인자(hypoxia-induced survival factors) 및 간세포 성장인자(hepatic growth factors)가 향상된 것을 확인할 수 있다. 이때 단일층의 hASCs를 21일 동안 배양하였고, 결과를 bFGF, HGF, 및 EGF의 상대적인 양(Relative amount, %)으로 나타내었다.
도 4는 시험관 내 분화(In vitro differentiation) 결과로서, 도 4(A)는 간세포 표적 마커(Hepatogenic cell surface markers)를 면역형광(Immunofluorescence) 염색하여 모니터링한 결과이고(Scale bar: 100μm), 도 4(B)는 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)된 hASCs 세포에서 초기 간 특이적 마커(AFP) 및 후기 간 특이적 마커(ALB)에 대한 웨스턴 블롯 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 "지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)"란, 지방조직(adipose tissue)에 존재하는 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화된 성체줄기세포를 의미한다. 상기 지방줄기세포는 중간엽 줄기세포와 비교하여 지방조직을 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 장점이 있다. 본 발명에서는 인간유래의 지방줄기세포(Human adipose-derived stem cells; hASCs)를 대상으로 한다.
이에 본 발명은 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 산소 함량이 낮은 저산소(hypoxia) 조건 하에서, 인체의 지방조직으로부터 분리된 인간유래 지방줄기세포(hASCs)를 성장인자가 포함된 배지에서 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 상기 배지는 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor2, FGF2), 및 니코틴 아미드(Nicotinamide)를 포함할 수 있으나, 당업계에서 간세포 분화를 위해 사용되는 배지 조성물이라면 제한되지 않는다.
이때 상기 간세포로의 분화를 유도하는 단계는 배양 시 600 내지 700 nm 파장의 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하여 분화를 유도한다. 본 발명에서의 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)는 빛을 이용하여 살아있는 조직에 변화를 야기하는 것으로, LED(light emitting diode)로부터 발생된 빛을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 저산소(hypoxia) 조건은 정상 산소인 21 % 농도의 산소보다 낮은 산소 상태를 의미하며, 보다 구체적으로는 1 내지 10 % O2 농도를 포함하는 것으로, 30 내지 40℃, 바람직하게는 37℃에서 12 내지 48시간, 바람직하게는 24시간 동안 저산소 챔버에서 실시하는 것을 의미한다. 여기서, 산소의 % 농도는 부피%를 의미한다.
상기 배양 기간은 14 내지 28일일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 적색파장대의 빛은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 LED(light emitting diode)로부터 발생된 빛을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 LED로부터 발생되어 600 내지 700nm의 파장 및 5 내지 30 mW/㎠의 전력의 전력를 나타내는 빛을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 LED로부터 발생되어 660nm의 파장 및 10 mW/㎠의 전력을 나타내는 빛을 사용할 수 있다.
아울러, 상기 빛의 조사 조건 역시 지방줄기세포를 간세포로 분화시키는 것을 촉진시키는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 배지로부터 1 내지 5cm의 간격을 두고 위치한 LED 광원을 이용하여 1일 10 내지 20분 동안 조사하는 방법을 사용할 수 있다.
상기 저산소(hypoxia) 조건 하에서 광조사하여 배양하는 경우, PARP 또는 Caspase-3, 또는 BAX의 발현은 감소시키고, Bcl-2, 또는 pAKT의 발현은 향상시켜 인간유래 지방줄기세포의 세포사멸(Apoptosis)을 억제할 수 있다.
또한, 상기 저산소(hypoxia) 조건 하에서 광조사하여 배양하는 경우, 저산소인자(HIF-1α), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 및 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 발현을 향상시킬 수 있다. 이는 인간유래 지방줄기세포에서 간세포로의 분화를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명에 따라 제조된 간세포는 간 질환의 치료용 세포 치료제 및 이식체 등으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험 방법>
1) 인간유래 지방줄기세포 배양(Culture of hASCs)
CEFO(서울, 대한민국)로부터 공급받은 인간유래 지방줄기세포(hASCs)를 10% 소 태아 혈청(FBS, Welgene), 100units/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium F-12(DMEM / F-12, Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 37.0℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다(표 1 참조).
2) In vitro 간세포 분화(hepatic differentiation)
인간유래 지방줄기세포(hASCs)는 4×104 cells/cm2의 농도로 콜라겐 I 형 코팅 접시에 도말되었다. hASCs 세포가 Confluency에 도달하면, 간세포 유도(hepatogenic induction)는 21일 기간 동안 수행되었다. 먼저, hASCs 세포를 EGF 및 bFGF(PeproTech EC, London, UK)를 보충된 hepatogenic differentiation basal medium(HDBM) 무 혈청 배지에서 7일 동안 배양하였다. 그 후 HGF, FGF, Nicotinamide를 함유한 HDBM에서 14 일간 배양하였다(표 1 참조).
[표 1]
Figure 112019083388217-pat00001
3) 광조사(Photobiomodulation irradiation; PBM)
발광다이오드(LED, WON Technology, Daejeon, Korea)를 매일 10분간 사용 하였다. 사용된 광원은 세포 배양을 위해 Standard multi-well plate(12.5×8.5 cm)에 맞도록 설계된 LED(발광 다이오드; WON Technology Co., Ltd., Korea)이다. LED는 660nm 피크의 방출 파장을 갖으며, 세포 단일층 표면에서의 조사는 Power meter(Orion, Ophir Optronics Ltd., UT)로 측정하였다.
6 J/cm2의 에너지 선량(energy dose)을 얻기 위해, LED 어레이의 노출 시간은 10mW/cm2(1 milliwatt X second = 0.001 joules)의 전력 밀도 하에서 10분 동안 수행하였다.
4) 세포 생존율 분석(Cells viability assay)
세포 생존력은 배양 10일 후 생존/사멸 생존 세포 독성 분석 키트 (Molecular probes, Carlsbad, CA)를 사용하여 분석하였다. 간단히 말하면, 2μl의 녹색의 SYTO 10 형광 핵산 염색 용액과 2μl의 적색 핵산 염색 용액(ethidium homodimer-2)을 함유한 HEPES-buffered saline solution(HBSS) 1ml를 플레이트에 첨가한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 15분간 배양하였다. 이때 음성 대조군은 -80℃에서 30분간 세포를 동결시켜 준비하였다. Image J 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD)를 사용하여 이미지를 정량화하였다. 살아있는 세포/죽은 세포의 비율은 이미지 당 픽셀 수를 세어 점수를 매겼다.
5) 형광활성 세포 분류기(Fluorescence-activated cell sorting; FACS)
세포를 0.5% 소 혈청 알부민(BSA; SigmaeAldrich, St. Louis, MO)을 함유하는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 세포는 60분 동안 이소타입(Isotype) 대조군 또는 항원 특이적 항체를 갖는 1% BSA를 함유하는 PBS에서 염색되었다. 사용되는 항체에는 human CD31(Beckman Coulter), CD45(Abcam, Cambridge, MA), CD90(BD Biosciences), CD105(Caltac Laboratories, Burlingham, CA) 및 CD29(Millipore, Waltham, MA)를 포함한다. 세포를 0.5% BSA를 함유하는 PBS로 3회 세척하고, Accuri 장치(BD Biosciences)를 사용하여 유동 세포 계측(flow cytometry)을 위해 PBS에 재현탁시켰다. 이소타입(Isotype) 대조군 IgG를 음성 대조군(negative control)으로 사용하였다.
6) 면역 형광 염색(Immunofluorescence staining)
간접 면역 형광 염색(Indirect immunofluorescence staining)은 표준 절차를 사용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 세포를 4% 파라포름알데히드( paraformaldehyde)로 고정시키고, 5% BSA/PBS(1시간, 24℃)로 블록킹(blocking) 시켰으며, PBS로 2회 세척하고, 0.1% Triton X-100/PBS로 1분간 처리하고, PBS로 씻어 내었다. M.O.M. Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하면서 섹션(sections)을 특이적인 1차 항체 및 형광 결합된 2차 항체로 염색하였다(표 2 참조).
세포를 DAPI(4,6-디아미노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드; Vector Laboratories)로 대비 염색하였다. mouse IgG(Dako, Carpinteria, CA) 및 rabbit IgG (Dako) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 염색된 섹션(sections)을 모델 DXM1200F 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 처리된 이미지를 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 형광 강도에 대해 분석하였다.
[표 2]
Figure 112019083388217-pat00002
7) 웨스턴 블롯(Western blot)
샘플을 용해 완충액[20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% sodium dodecyl sulfate(SDS), 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1μg/ml leupeptin, 2μg/ml aprotinin]으로 4℃에서 1시간 동안 처리하였다. 그 후 용해물을 4℃에서 30분 동안 15,000g에서 원심분리하여 정제하고, 2% SDS 및 5%(v/v) 2-mercaptoethanol을 함유한 Laemmli sample buffer로 희석하였고, 90℃에서 5분간 가열하였다. 단백질은 10% 또는 15% 분해겔(resolving gels)을 사용하여 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 멤브레인을 1차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 검출을 위해, 퍼옥시다아제 결합된 anti-mouse IgG 또는 anti-rabbit IgG 및 화학 발광(enhanced chemiluminescence, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 설명서에 기재된 대로 사용하였다. 멤브레인을 스캔하여 화학 발광 이미지(chemiluminescent images)를 만들고, 이미지 분석기(Kodak, Rochester, NY)로 정량화하였다.
8) 통계분석(Statistical analyses)
모든 정량 결과는 삼중 샘플(triplicate samples)로부터 얻어졌으며, 데이터는 평균 ± 표준 편차(mean ± SD)로 나타내었다. 통계 분석은 두 그룹의 샘플을 비교하기 위한 two-sample t 검정과 3 그룹에 대한 일원 분산 분석 (One-way Analysis of Variance, ANOVA)을 사용하여 수행되었다. p <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
<실시예 1> 인간유래 지방줄기세포(hASCs) 특징 확인
인간 지방 조직으로부터 수득한 부착 세포를 시험 관내에서 옮겼다. 세포는 인간 MSC 마커인 CD29(b1 integrin), CD90(Thy-1) 및 CD105(endoglin)에 대해 양성을 나타냈다. 그러나, 세포는 유세포 분석(flow cytometry analyses)에서 인간 내피 세포 마커(human endothelial cell markers)인 CD34, CD31, KDR (VEGF 수용체) 및 조혈 세포 마커 CD45에 대해 음성을 나타냈다(도 1).
이러한 결과는 분주한 세포가 많은 hASCs 집단을 포함하고, 내피 세포(endothelial cell)로 오염되지 않았음을 의미한다.
<실시예 2> 인간유래 지방줄기세포 사멸 억제(Inhibition of hASCs apoptosis) 확인
hASCs 세포의 세포 생존력을 확인하기 위해, 형광 염료로 죽은 세포를 분석하였다. 죽은 세포는 적색으로 염색되었고, 죽은 세포는 저산소 배양한 hASCs 세포와 비교하여 저산소 및 PBM 처리한 hASCs 세포에서 현저히 적었다(p<0.05)(도 2A). 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)하여 배양된 hASCs 세포에서는 세포-기질 상호 작용의 결핍 즉, 아노이키스(anoikis)으로 유발되는 세포사멸(Apoptosis)이 억제되었음을 확인할 수 있었다.
또한 hASCs 세포에서 단백질 발현 수준 확인 결과, 전세포사멸인자(pro-apoptotic factor)로서 PARP, Caspase-3, BAX 단백질의 발현은 감소하였는데 반해, 항세포사멸인자(anti-apoptotic factor)로서 Bcl-2, pAKT 단백질의 발현을 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 2B).
이는 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)하여 배양된 hASCs 세포가 정상 산소 조건에서 배양한 hASCs 세포에 비해 세포사멸억제인자(anti-apoptotic factor)의 분비량이 더 높다는 것을 의미한다.
따라서, 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)에서 배양된 hASCs 세포는 정상적인 세포 배양 조건에서 배양된 hASCs 세포에 비해 저산소증(Hypoxia)에 보다 적응력이 있고 내성이 있다는 것으로 판단할 수 있다.
<실시예 3> 저산소 및 PBM 처리하여 배양(Hypoxia+PBM Culture)된 세포의 성장인자 생산 확인
5% 산소 조건 하의 저산소 상태에서 저산소증 유도인자(hypoxia-inducible factors; HIFs)의 증가된 발현이 확인되었다(도 3A). 또한, 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)하여 배양한 hASCs 세포는 정상적인 세포 배양 조건의 hASCs 세포와 비교하여 HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α)과 같은 저산소 유도된 생존 인자(hypoxia-induced survival factors)의 발현이 유의적으로 증가됨을 확인할 수 있었다(도 3A).
아울러, PBM의 처리는 성장인자의 발현을 증가시키고, 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)는 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 및 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor; FGF2)의 발현을 향상시킴을 확인할 수 있었다(도 3B). 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)하여 배양된 세포에서 성장인자의 발현은 PBM 단독 처리하여 배양된 hASCs 세포 또는 저산소 단독 처리하여 배양된 hASCs 세포에서의 성장인자의 발현보다 훨씬 컸음을 확인할 수 있었다(도 3C).
따라서, 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)에서 배양된 hASCs 세포는 정상적인 세포 배양 조건에서 배양된 hASCs 세포에 비해 간세포 성장인자(HGF)와 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)의 발현이 향상되었는바, 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)가 간세포 분화 효율을 향상시킬 수 있음을 의미한다.
<실시예 4> 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM Culture)의 시너지(Synergy) 효과 확인
hASCs 세포가 간세포로의 분화에 있어서 PBM 처리가 미치는 영향을 연구하기 위해, 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM) 조건에서 hASCs 세포를 각각 21일 동안 배양하였다.
면역형광(Immunofluorescence) 염색법 결과, 정상 조건(21% O2 농도)과 대비하여, 저산소(5% O2) 조건에서 초기 간 특이성 마커(early liver specific markers)인 AFP 또는 후기 간 특이성 마커(late liver specific markers)인 ALB에서 양성 세포가 더 많이 관찰되었다. 또한, 알파태아단백(alpha-fetoprotein; AFP)과 알부민(ALB)은 21일이 되는 시점에 PBM 처리에 의해 증가되었음을 관찰하였다(도 4A).
이러한 결과는 PBM이 일반적으로 중간엽 줄기세포(MSC)에서 간세포 분화를 증가시킨다는 것을 확인시켜 준다. 특히, 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM) 조건에서 배양된 hASCs 세포에서의 AFP 및 ALB의 발현은 PBM 단독 처리하여 배양된 hASCs 세포 또는 저산소 단독 처리하여 배양된 hASCs 세포에서의 발현보다 훨씬 컸다(도 4B). 아울러, AFP 단백질(초기 간 특이성 마커)의 발현은 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM) 배양에 의해 14일 동안 증가하였다. 그러나, ALB 단백질(후기 간 특이성 마커)의 발현은 21일 동안 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM) 배양에 의해 증가하였다(도 4B).
이러한 결과는 저산소 및 PBM 처리(Hypoxia+PBM)가 간 분화(hepatic differentiation) 및 메타볼리즘(metabolism)에 관여하는 유전자의 상향 조절(upregulation)을 유도함을 시사한다.
저산소(hypoxia) 조건은 많은 조직에서 세포 분화를 촉진시키는 것으로 알려져 있지만, 저산소 조건이 hASCs 세포의 간 분화에 미치는 영향은 이전에 분명하지 않았다. 본 발명에서는 저산소 조건이 hASCs 세포의 간 분화에 미치는 영향을 밝혀낸 것으로, 특히 저산소 조건 하에서 PBM를 조사하여 hASCs 세포를 배양하는 경우 간세포 마커인 ALB의 발현 증가와 AFP-양성 세포 및 CK8/18-양성 세포의 증가를 밝혔는바, 저산소 조건 및 PBM 조사가 간엽성 전구세포(mesenchymal cell progenitors)를 간세포(hepatic cells)로의 분화를 유도한다는 것을 밝혀냈다는 점에서 기술의 우수성이 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1 내지 10% O2 농도의 산소 함량이 낮은 저산소(hypoxia) 조건 하에서, 인체의 지방조직으로부터 분리된 인간유래 지방줄기세포(hASCs)를 30 내지 40℃에서 12 내지 48시간 동안 배양하여 간세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하되,
상기 간세포로의 분화를 유도하는 단계는 배양 시 적색 파장대의 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하여 배양하고,
상기 광조사는 배양 배지로부터 1 내지 5cm의 간격을 두고 600 내지 700nm의 파장 및 5 내지 30 mW/㎠의 전력을 나타내는 적색 파장대의 빛을 하루 10 내지 20분간 조사하는 것을 특징으로 하는, 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 분화 방법은 PARP 또는 Caspase-3 또는 BAX 단백질의 발현은 감소시키고, Bcl-2 또는 pAKT 단백질의 발현은 향상시키는 것을 특징으로 하는, 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 분화 방법은 저산소인자(HIF-1α), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 및 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 발현이 향상되는 것을 특징으로 하는, 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법.
삭제
KR1020190099361A 2019-08-14 2019-08-14 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포 KR102200555B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190099361A KR102200555B1 (ko) 2019-08-14 2019-08-14 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190099361A KR102200555B1 (ko) 2019-08-14 2019-08-14 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102200555B1 true KR102200555B1 (ko) 2021-01-08

Family

ID=74127592

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190099361A KR102200555B1 (ko) 2019-08-14 2019-08-14 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102200555B1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150028052A (ko) * 2013-09-05 2015-03-13 메디포스트(주) 세포 크기에 따른 간엽줄기세포 배양방법
KR101624514B1 (ko) 2013-10-29 2016-06-07 주식회사 엔바이오텍 지방유래 줄기세포 배양방법
KR20180038227A (ko) * 2016-10-06 2018-04-16 (주) 넥셀 인간 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 간세포

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150028052A (ko) * 2013-09-05 2015-03-13 메디포스트(주) 세포 크기에 따른 간엽줄기세포 배양방법
KR101624514B1 (ko) 2013-10-29 2016-06-07 주식회사 엔바이오텍 지방유래 줄기세포 배양방법
KR20180038227A (ko) * 2016-10-06 2018-04-16 (주) 넥셀 인간 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 간세포

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The ScientificWorld Journal Volume 2013, Article ID 632972(2013.08.27. 공개)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Drela et al. Experimental strategies of mesenchymal stem cell propagation: adverse events and potential risk of functional changes
Park et al. Enhancement of ischemic wound healing by spheroid grafting of human adipose-derived stem cells treated with low-level light irradiation
Ladurner et al. Spatial distribution and differentiation potential of stem cells in hatchlings and adults in the marine platyhelminth Macrostomum sp.: a bromodeoxyuridine analysis
Yu et al. Stemness and transdifferentiation of adipose-derived stem cells using L-ascorbic acid 2-phosphate-induced cell sheet formation
RU2528250C2 (ru) Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом
Kim et al. Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro
Zhang et al. Differentiation and neurological benefit of the mesenchymal stem cells transplanted into the rat brain following intracerebral hemorrhage
US20220090008A1 (en) Colony forming medium and use thereof
Jiang et al. Improvement of the survival of human autologous fat transplantation by adipose‐derived stem‐cells‐assisted lipotransfer combined with bFGF
JP2024001179A (ja) 間葉系幹細胞の細胞培養法
Gugjoo et al. Mesenchymal stem cell: basic research and potential applications in cattle and buffalo
US20070116674A1 (en) Use of adipose tisue cells for initiating the formation of a fuctional vascular network
Doğan et al. In vitro differentiation of human tooth germ stem cells into endothelial‐and epithelial‐like cells
Apdik et al. Dose-dependent effect of boric acid on myogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (hADSCs)
Park et al. Prevention of skin flap necrosis by use of adipose-derived stromal cells with light-emitting diode phototherapy
Park et al. Vascular regeneration effect of adipose-derived stem cells with light-emitting diode phototherapy in ischemic tissue
Gao et al. Experimental research Different methods for inducing adipose-derived stem cells to differentiate into Schwann-like cells
JP2017500860A (ja) 哺乳類筋肉由来の幹細胞
KR101753557B1 (ko) 줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법
KR20190060716A (ko) 무혈청 배지 조성물
KR102200555B1 (ko) 인간지방줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 이에 의해 제조된 간세포
KR20130090512A (ko) 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법
Wu et al. COX-2/PGE2/VEGF signaling promotes ERK-mediated BMSCs osteogenic differentiation under hypoxia by the paracrine action of ECs
Ma et al. Isolation and biological characterization of a novel type of pulmonary mesenchymal stem cells derived from Wuzhishan miniature pig embryo
Wang et al. Optimizing proliferation and characterization of multipotent stem cells from porcine adipose tissue

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant