CN105503903A

CN105503903A - 苯并恶唑并恶嗪酮类化合物的制备方法及其中间体和晶型

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Publication number: CN105503903A
Application number: CN201410503772.7A
Authority: CN
Inventors: 陈曙辉; 丁照中; 龚刚立; 颜小兵; 黄巍; 郭峰; 段宝玲; 高任龙; 周平凡; 路新华; 董桂敏
Original assignee: NANJING MINGDE NEW DRUG RESEARCH AND DEVELOPMENT Co Ltd; NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Current assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2034-09-26
Also published as: JP6568221B2; KR20170055551A; EP3199536A4; JP2017532375A; EP3199536B1; AU2015320137A1; US10106557B2; US20170275299A1; CA2962474C; AU2015320137B2; EP3199536A1; CA2962474A1; TWI679204B; WO2016045586A1; CN105503903B; TW201619167A; KR102485412B1

Abstract

本发明公开了一种高纯度苯并恶唑并恶嗪酮类化合物的制备方法及其晶型，本发明还公开了制备式(Ⅰ)化合物的中间体化合物及其制备方法。

Description

苯并恶唑并恶嗪酮类化合物的制备方法及其中间体和晶型

技术领域

本发明涉及一种高纯度苯并恶唑并恶嗪酮类化合物的制备方法及晶型，本发明还涉及制备式(Ⅰ)化合物的中间体化合物及其制备方法。

背景技术

CN21310456006.5记载了一类全新的口服Xa因子抑制剂，用于预防术后深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)，预防在心房颤动时的中风，治疗急性冠脉综合征(ACS)。其结构如式(B-1)所示：

发明内容

本发明提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法，

其包含如下步骤：

其中，R为氨基保护基；

X为F、Cl、Br或I；

R²选自任选被取代的5或6元环氨基或杂环氨基，“杂”代表O、N、C(＝O)、C(＝O)NH，取代基独立地选自C_1-4烷基或杂烷基。

本发明的一些方案中，上述R选自烷氧羰基类氨基保护基。

本发明的一些方案中，上述R选自Cbz、Boc、Fmoc、Alloc、Teco、甲氧羰基或乙氧羰基。

本发明的一些方案中，上述R2选自：或

本发明的一些方案中，上述碱选自碱金属碱、碱土金属碱或有机金属碱。

本发明的一些方案中，上述碱金属碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠和/或碳酸氢钾。

本发明的一些方案中，上述碱土金属碱选自氢化钠、氢化钾和/或氢化钙。

本发明的一些方案中，上述有机金属碱选自甲醇钠、叔丁醇锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾、乙醇钠和/或异丙醇铝。

本发明的一些方案中，上述化合物(Ⅳ)与上述碱的摩尔用量比为1:1～5,具体为1:2～3。

本发明的一些方案中，上述化合物(Ⅲ)和化合物(Ⅳ)的摩尔用量比为1:1～2。

本发明的一些方案中，上述反应的反应温度为-10～50℃。

本发明的一些方案中，上述反应的反应温度为0～30℃。

本发明的一些方案中，上述反应的反应时间为5～200小时。

本发明的一些方案中，上述反应的反应时间为10～100小时。

本发明的一些方案中，上述反应的反应时间为16～48小时。

本发明的一些方案中，上述反应在反应溶剂中进行，上述反应溶剂选自酰胺类溶剂、醚类溶剂或其任意混合物。

本发明的一些方案中，上述反应溶剂用量为化合物(Ⅳ)重量的10～50倍。

本发明的一些方案中，上述反应溶剂用量为化合物(Ⅳ)重量的15～20倍。

本发明的一些方案中，上述酰胺类溶剂选自DMF或DMAC。

本发明的一些方案中，上述醚类溶剂选自四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二氧六环或甲基叔丁基醚。

本发明的一些方案中，上述式(Ⅰ)化合物的制备方法还包含如下反应：

本发明的一些方案中，上述HA选自选自有机或无机酸。

本发明的一些方案中，上述HA选自盐酸、硫酸、草酸、柠檬酸、马来酸或富马酸。

本发明的一些方案中，上述化合物(i)可由化合物(Ⅱ)与还原剂反应制得，其中：

所述还原剂优选为碱金属氢化物；

所述碱金属氢化物优选为硼氢化钠、三乙酰基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、红铝和/或四氢锂铝；

所述化合物(Ⅱ)与还原剂的摩尔用量比优选为1:1～5；

所述反应在反应溶剂中进行，所述溶剂优选为单一有机溶剂或混合有机溶剂；

所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇、四氢呋喃和/或二氯甲烷；

所述溶剂用量为所述化合物(Ⅱ)重量的5～20倍；

所述反应的反应温度为-10～50℃；

所述反应的反应温度为0～30℃；

所述反应的反应时间为2～30小时；

所述反应的反应时间为8～16小时。

本发明的一些方案中，上述化合物(j)可由上述化合物(i)在碱存在下与甲磺酰氯反应制得，其中：

所述碱优选为碱金属碱、碱土金属碱、有机金属碱和/或有机碱；

所述碱金属碱优选为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠和/或碳酸氢钾；

所述碱土金属碱优选为氢化钠、氢化钾和/或氢化钙；

所述有机金属碱优选为甲醇钠、叔丁醇锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾、乙醇钠和/或异丙醇铝；

所述有机碱优选为二乙胺、三乙胺、DIEA、吡啶、DMAP和/或DBU；

所述化合物(i)与所述碱的摩尔用量比优选为1:1～5；

所述化合物(i)与所述甲磺酰氯的摩尔用量比优选为1:1～2；

所述反应在反应溶剂中进行，所述溶剂优选为非质子性有机溶剂；

所述有机溶剂优选为苯、甲苯、二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃和/或甲基四氢呋喃；

所述溶剂用量为所述化合物(i)重量的5～20倍；

所述反应的反应温度为-20～50℃；

所述反应的反应温度优选为-5～15℃；

所述反应的反应时间为2～30小时；

所述反应的反应时间为8～16小时。

本发明的一些方案中，上述化合物(k)可由上述化合物(j)与邻苯二甲酰亚胺钾盐反应制得，或由上述化合物(j)与邻苯二甲酰亚胺在碱作用下制得，

其中：

所述碱优选为碱金属碱、碱土金属碱、有机金属碱及有机碱；

所述碱金属碱为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠和/或碳酸氢钾；

所述碱土金属碱为氢化钠、氢化钾和/或氢化钙；

所述有机金属碱为甲醇钠、叔丁醇锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾、乙醇钠和/或异丙醇铝；

所述化合物(j)与所述碱的摩尔用量比优选为1:1～5；

所述有机溶剂为苯、甲苯、二氧六环、四氢呋喃、DMF、DMSO和/或NMP；

所述溶剂用量为上述化合物(i)重量的5～20倍；

所述反应的反应温度为0～100℃；

所述反应的反应温度为20～80℃；

所述反应的反应时间为2～30小时；

所述反应的反应时间为8～16小时。

本发明的一些方案中，上述化合物(Ⅱ)可用于制备化合物(Ⅴ)，

其中：

上述化合物(Ⅴ)可由上述化合物(j)与碱作用，然后加入酸成盐析出制得；

所述碱优选为碱金属碱或有机碱；

所述有机碱优选为水合肼、氨水、甲胺水溶液和/或甲胺醇溶液；

所述酸优选为无机酸或有机酸；

所述无机酸优选为盐酸或硫酸；

所述有机酸优选为草酸、柠檬酸、马来酸和/或富马酸；

所述化合物(j)与所述碱的摩尔用量比优选为1:2～10；

所述化合物(j)与所述酸的摩尔用量比优选为1:2～10；

所述反应在反应溶剂中进行，所述溶剂优选为水或质子性有机溶剂；

所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇和/或异丙醇；

所述溶剂用量为上述化合物(i)重量的5～20倍；

所述反应的反应温度为0～100℃；

所述反应的反应温度为20～80℃；

所述反应的反应时间为2～30小时。

本发明的一些方案中，上述化合物1可由上述化合物(Ⅴ)在碱存在下与5-氯噻吩-2-甲酰氯反应制得，其中：

所述化合物(Ⅴ)与碱的摩尔用量比优选为1:1～3；

所述化合物(Ⅴ)与5-氯噻吩-2-甲酰氯的摩尔用量比优选为1:1～2；

所述反应在反应溶剂中进行，所述溶剂优选为水与有机溶剂的混合溶剂；

所述有机溶剂优选为醚类或芳烃类溶剂；

所述醚类溶剂优选为四氢呋喃或甲基四氢呋喃；

所述芳烃类溶剂优选为苯、甲苯、氯苯或溴苯；

所述水与有机溶剂的体积比为1:1～2；

所述溶剂用量为上述化合物(Ⅴ)的重量5～20倍；

所述反应的反应温度为0～40℃,优选为10～30℃；

所述反应的反应时间为5～30小时。

5-氯噻吩-2-甲酰氯可参考印度拜耳医药保健公司(BayerHealthcareAG)申请的美国专利US2007149522实施例1中公布的方法制备，具体为：80℃条件下向5-氯噻吩-2-甲酸的甲苯溶液中加入氯化亚砜，搅拌2～3小时，浓缩即得到上述的5-氯噻吩-2-甲酰氯。

化合物(Ⅲ’)可以按照如下的合成路线制备

化合物(Ⅲ’)也可按Synthesis,(1),178-183；1999文章上的方法由上述化合物(g)制备得到。

化合物(g)可按印度专利文献2006MU00055中的方法由上述化合物(f)或上述化合物(h)制备得到，或者，化合物(g)也可以按照如下合成路线制备。

化合物(f)可按OrganicProcessResearch&Development,16(5),1003-1012；2012文章中的方法由天然产物异抗坏血酸制备得到。

化合物(h)可按专利WO2001002020中的方法由天然产物D-阿拉伯糖制备。

本发明还提供了制备化合物(Ⅰ)的中间体，其结构如下：

其中，

所述R为氨基保护基；

所述R选自烷氧羰基类氨基保护基；

所述R选自Cbz、Boc、Fmoc、Alloc、Teco、甲氧羰基或乙氧羰基；

所述R²选自任选被取代的5或6元环氨基或杂环氨基，“杂”代表O、N、C(＝O)或C(＝O)NH，取代基独立地选自C_1-4烷基或杂烷基；

所述R²选自或

所述HA选自有机或无机酸；

所述HA选自盐酸、硫酸、草酸、柠檬酸、马来酸或富马酸。本发明还提供了中间体(Ⅳ)的制备方法，其包含如下反应：

本发明的一些方案中，上述中间体(Ⅳ)的制备方法还包含如下反应：

本发明的一些方案中，上述中间体(Ⅳ)的制备方法中，化合物(a)可由2,4-二氟硝基苯与叔丁醇钾反应制得，其中：

所述2,4-二氟硝基苯与叔丁醇钾的摩尔用量比优选为1:1～3；

所述反应在反应溶剂中进行，所述溶剂为有机溶剂；

所述有机溶剂优选为醚类溶剂或芳烃类溶剂；

所述醚类溶剂优选为四氢呋喃或甲基四氢呋喃；

所述芳烃类溶剂优选为苯、甲苯、氯苯或溴苯；

所述溶剂用量为上述2,4-二氟硝基苯重量的5～20倍；

所述反应的反应温度为0～40℃；

所述反应的反应温度为10～30℃；

所述反应的反应时间为1～30小时；

所述反应的反应时间为3～8小时。

本发明的一些方案中，上述化合物(b)可由上述化合物(a)在碱存在下与R²-H反应制得，其中：

所述碱选自碱金属碱、碱土金属碱或有机金属碱；

所述碱金属碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠和/或碳酸氢钾；

所述碱土金属碱选自氢化钠、氢化钾和/或氢化钙；

所述有机金属碱选自甲醇钠、叔丁醇锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾、乙醇钠和/或异丙醇铝；

所述化合物(a)与所述碱的摩尔比为1:1～3；

所述化合物(a)与R²-H的摩尔比为1:1～2；

所述反应在反应溶剂中进行，反应溶剂选自非极性溶剂和极性溶剂的混合溶剂；

所述非极性溶剂选自苯、甲苯、二甲苯氯苯和/或溴苯；

所述极性溶剂选自DMF、DMSO或NMP；

所述非极性溶剂与极性溶剂的体积比为1:0.5～2；

所述溶剂用量为化合物(a)重量的5～20倍。

在本发明的一些技术方案中，上述化合物(c)可由上述化合物(b)与酸反应制得，其中：

所述酸优选为无机酸或有机酸；

所述无机酸优选为盐酸、硫酸和/或硝酸；

所述有机酸优选为三氟乙酸、甲磺酸和/或对甲苯磺酸；

所述化合物(b)与酸的摩尔用量比为1:5～30；

所述反应在反应溶剂中进行，所述溶剂优选为水或有机溶剂；

所述有机溶剂优选为乙酸乙酯、甲醇和/或二氧六环；

所述溶剂用量为化合物(b)的重量5～20倍；

所述反应的反应温度为0～50℃，优选为10～30℃；

所述反应的反应时间为2～30小时，优选为2～8小时。

在本发明的一些技术方案中，上述化合物(d)可由上述化合物(c)与氢化还原试剂/体系反应制得，其中：

所述氢化还原体试剂/体系优选为重金属催化氢化体系及还原性金属；

所述重金属催化氢化体系优选为以干钯碳、湿钯碳、雷尼镍或氢氧化钯为催化剂，氢气为还原剂；

所述还原性金属优选为铁粉或锌粉；

所述化合物(c)与所述重金属的重量用量比优选为100:(2～30)；

所述有机溶剂优选为乙酸乙酯、甲醇、乙醇、四氢呋喃和/或DMF；

所述溶剂用量为化合物(d)重量的5～200倍；

所述反应的反应温度为0～50℃，优选为20～40℃；

所述反应的反应时间为2～30小时，优选为8～16小时。

本发明的一些技术方案中，化合物(Ⅳ)可由化合物(d)在碱存在下与常见氨基保护试剂反应制备；

所述氨基保护试剂优选自烷氧羰基类氨基保护试剂；

所述氨基保护试剂选自CbzCl、(Boc)₂O、2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙腈、氯甲酸乙酯、氯甲酸甲酯、芴甲氧羰酰氯、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺、氯甲酸烯丙酯、N-[2-(三甲基硅基)乙氧羰氧基]琥珀酰亚胺等。

所述碱优选为碱金属碱、碱土金属碱及有机金属碱；

所述碱土金属碱优选为氢化钠、氢化钾和/或氢化钙；

所述有机金属碱优选为甲醇钠、叔丁醇锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾、乙醇钠和/或异丙醇铝。

所述化合物(d)与碱的摩尔用量比优选为1:1～3；

所述化合物(d)与氨基保护试剂的摩尔用量比优选为1:1～2；

所述有机溶剂优选为苯、甲苯、二氧六环、四氢呋喃和/或甲基四氢呋喃；

所述水与有机溶剂的体积比为1:0.5～2；

所述溶剂用量为化合物(d)重量的5～20倍；

所述反应的反应温度为-20～50℃，优选为-5～15℃；

所述反应的反应时间为2～30小时。

本发明的一些技术方案中还提供了化合物(Ⅳ)的另一制备方法，其包括如下路线：

本发明的一些方案中，化合物(e)可由上述化合物(b)与氢化还原剂/体系反应制得，其中：

所述氢化还原试剂/体系优选为重金属催化氢化体系和/或还原性金属；

所述重金属催化氢化体系优选为以干钯碳、湿钯碳、雷尼镍和/或氢氧化钯为催化剂，氢气为还原剂；

所述还原性金属优选为铁粉和/或锌粉；

所述化合物(b)与重金属的重量用量比优选为100:2～30；

所述溶剂用量为化合物(b)重量的5～200倍；

所述反应的反应温度为0～50℃,优选为20～40℃；

所述反应的反应时间为2～30小时，优选为4～8小时。

本发明的一些技术方案中，由化合物(e)和氨基保护试剂反应制备化合物(Ⅳ)的方法可参照由化合物(d)制备化合物(Ⅳ)的方法。

本发明还提供了化合物1的两个稳定且具有良好药用前景的晶型，A晶型和B晶型，其结构如图1和图2所示。

本发明还提供了化合物1的A晶型和B晶型的制备方法，包括将任意一种形式的化合物1加入到溶剂结晶，并制得不同形式的晶型，其中：

所述溶剂优选为有机溶剂或含有醇类溶剂或水的混合溶剂；

所述有机溶剂优选为醇类或酮类；

所述醇类优选为甲醇、乙醇、异丙醇和/或正丁醇；

所述酮类优选为丙酮和/或甲基乙基酮；

所述混合溶剂优选为DMSO与乙醇或DMSO与水的混合溶剂；

所述DMSO与乙醇或水的体积比为1:0.5～5；

所述溶剂用量为化合物1重量的3～50倍。

定义和说明：

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。

本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

本领域任何合成路线规划中的一个重要考量因素是为反应性官能团(如本发明中的氨基)选择合适的保护基。对于经过训练的从业者来说，GreeneandWuts的(ProtectiveGroupsInOrganicSynthesis,WileyandSons,1991)是这方面的权威。本发明引用的所有参考文献整体上并入本发明。

下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。

本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。反应一般是在惰性氮气下、无水溶剂中进行的。质子核磁共振数据记录在BrukerAvanceIII400(400MHz)分光仪上，化学位移以四甲基硅烷低场处的(ppm)表示。质谱是在安捷伦1200系列加6110(&1956A)上测定。LC/MS或ShimadzuMS包含一个DAD：SPD-M20A(LC)和ShimadzuMicromass2020检测器。质谱仪配备有一个正或负模式下操作的电喷雾离子源(ESI)。

本发明采用下述缩略词：DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；EA代表乙酸乙酯；Pd/C代表钯碳；DMF代表N,N-二甲基甲酰胺；DMAC代表N,N-二甲基乙酰胺；DMSO代表二甲亚砜；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；Cbz代表苄氧羰基，是一种胺保护基团；Boc代表叔丁基羰基是一种胺保护基团；Fmoc代表笏甲氧羰基，是一种胺保护基团；Alloc代表烯丙氧羰基，是一种胺保护基团；Teoc代表三甲基硅乙氧羰基，是一种胺保护基团；HOAc代表乙酸；r.t.代表室温；O/N代表过夜；THF代表四氢呋喃；Boc₂O代表二-叔丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIPEA代表二异丙基乙基胺；DIEA代表二异丙基乙基胺；DMAP代表4-二甲氨基吡啶；DBU代表1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；tol代表甲苯；NH₄Cl代表氯化铵；THF代表四氢呋喃；i-PrOH代表2-丙醇；mp代表熔点；NMP代表N-甲基吡咯烷酮；t-BuOK代表叔丁醇钾；AcOH代表冰醋酸；rf代表回流；MeNH₂代表甲胺；Et₃N代表三乙胺；H₂O₂代表过氧化氢；Con.HCl(aq)代表浓盐酸水溶液。

化合物经手工或者软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。

本发明给出的合成式(Ⅰ)化合物及其中间体的工艺，有益效果为：克服现有技术中起始原料价格昂贵，所用试剂毒害大，反应条件苛刻，分离纯化困难，不易工业化等缺点。

具体地：

1)本发明制备式(Ⅰ)化合物方法原料为常规或常见试剂，在市场上容易获得且价格低廉；

2)中间体化合物(Ⅱ)可由新中间体化合物(Ⅳ)与已知中间体化合物(Ⅲ)经一步反应即得到，有效的提高了反应收率；

3)采用手性天然产物为原料引入手性中心，得到的式(Ⅰ)化合物具有高的光学纯度；

4)各步骤反应中所使用试剂均为小分子，易于纯化。

因此，本发明在制备式(Ⅰ)化合物及其中间体方面，具有很高的工业应用价值和经济价值。

附图说明

图1为化合物1的A晶型Cu-Kα辐射的XRPD谱图，其中A晶型由化合物1在乙醇中结晶析出制得。

图2为化合物1的B晶型Cu-Kα辐射的XRPD谱图，其中B晶型由化合物1在DMSO/EtOH体系结晶析出制得。

图3为化合物1的A晶型的DSC谱图。

图4为化合物1的B晶型的DSC谱图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。

实施例1：化合物1的制备

流程1:

步骤1：2-(叔丁氧基)-4-氟-1-硝基苯的合成

冰水浴条件下，叔丁醇钾(387克，3.46摩尔)分批缓慢加入到2,4-二氟硝基苯(500克，3.14摩尔)的甲苯(2升)溶液中，保持温度不超过20℃。加毕，将反应液降到0℃保持温度搅拌2小时。TLC(石油醚)板检测反应完全，把反应液倾倒入冷的饱和氯化铵溶液(3升)中，乙酸乙酯萃取(1升x3)。合并有机相旋干得到2-(叔丁氧基)-4-氟-1-硝基苯(670克，粗品，深红色油状物，HPLC纯度90％)，未进一步纯化，直接用于下一步反应。¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ7.82(dd,J＝9.2,6.0Hz,1H),6.93(dd,J＝10.4,2.8Hz,1H),6.84(m,1H),1.48(s,9H).

步骤2：4-(3-(叔丁氧基)-4-硝基苯基)吗啡啉-3-酮的合成

冰水浴条件下，叔丁醇钾(315克，2.81摩尔)分批缓慢加入到2-(叔丁氧基)-4-氟-1-硝基苯(600克，2.81摩尔)与吗啉-3-酮(284克，2.81摩尔)的甲苯和二甲基亚砜(1：1，1升)混合溶剂中，同时保持温度不超过20℃。加毕，将反应液加热到90℃，在这个温度下搅拌2小时。TLC(PE)板检测反应完全，把反应液倾倒入冷的饱和氯化铵溶液(4升)中，乙酸乙酯萃取(1升x2)。合并的有机相用水(2升)洗，有机相旋干得到4-(3-(叔丁氧基)-4-硝基苯基)吗啡啉-3-酮(828克，粗品，深红色油状物，HPLC纯度80％)，未进一步纯化，直接用于下一步反应。¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ7.79(d,J＝9.2Hz,1H),7.42(d,J＝2.0Hz,1H),7.10(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),4.36(s,2H),4.06(t,J＝2.0Hz,2H),3.82(t,J＝2.0Hz,2H),1.45(s,9H).

步骤3：4-(4-氨基-3-(叔丁氧基)苯基)吗啡啉-3-酮的合成

铁粉(106克，1.90摩尔)加入到剧烈搅拌的4-(3-(叔丁氧基)-4-硝基苯基)吗啡啉-3-酮(140克，0.475摩尔)与氯化铵(101克，1.90摩尔)的乙醇和水(3:1，1.2L)的混合溶液中。加毕，反应搅拌大约半小时后开始剧烈放热，冰水冷却至不在剧烈放热，升至室温过夜，TLC(PE：EA＝1:1)板检测反应完全，过滤，甲醇洗残渣，TLC(PE：EA＝1:1)板检测洗涤完全，合并滤液旋干，水(500毫升)洗，二氯甲烷(300毫升x3)萃取。合并有机相旋干得到4-(4-氨基-3-(叔丁氧基)苯基)吗啡啉-3-酮(125克，粗品，黑色油状物，HPLC纯度70％)，未进一步纯化，直接用于下一步反应。¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ6.84(d,J＝2.0Hz,1H),6.75(m,1H),6.65(m,1H),4.76(brs,2H),4.14(s,2H),3.91(t,J＝2.0Hz,2H),3.62(t,J＝2.0Hz,2H),1.33(s,9H).

步骤4：(2-羟基-4-(3-吗啡啉酮)苯基)氨基甲酸苄酯的合成

4-(4-氨基-3-(叔丁氧基)苯基)吗啡啉-3-酮(400克，1.51摩尔)用4N盐酸溶液(1升)溶解搅拌反应过夜。反应液用冰水冷却，用12N的氢氧化钠溶液将反应液PH调至7左右，然后加入碳酸氢钠固体(190克，2.23摩尔)和四氢呋喃(600毫升)。冷却至0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯(258克，1.51摩尔)的四氢呋喃(500毫升)溶液，保持温度低于10℃。加毕，TLC(PE：EA1:3)板检测反应完全。将二氯甲烷(2升)和水(1升)加入到反应液中，静置分液，水相用二氯甲烷(1升x2)萃取。合并有机相旋干后加入乙醇(1升)搅拌打浆过滤，滤饼用乙醇(200毫升)洗两次，然后取出滤饼干燥得到(2-羟基-4-(3-吗啡啉酮)苯基)氨基甲酸苄酯(225克，HPLC纯度98％)，褐色固体。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ9.95(brs,1H),8.52(s,1H),7.56(d,J＝9.2Hz,1H),7.45～7.33(m,5H),6.91(d,J＝2.4Hz,1H),6.79(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.15(s,2H),4.18(s,2H),3.95(t,J＝4.8Hz,2H),3.66(t,J＝4.8Hz,2H),1.33(s,9H).

流程2:

步骤5：4-(3-(羟基)-4-硝基苯基)吗啡啉-3-酮的合成

10毫升的Con.HCl(aq)缓慢加入到4-(3-(叔丁氧基)-4-硝基苯基)吗啡啉-3-酮(10.0克，34.0毫摩尔)的乙酸乙酯(30毫升)溶液中。室温搅拌过夜，加入水(50毫升)，乙酸乙酯(30毫升x2)萃取。合并有机相旋干得到粗品，乙醇(100毫升)打浆过滤旋干得到4-(3-(羟基)-4-硝基苯基)吗啡啉-3-酮(4.12克，HPLC纯度98％，收率51％)。¹HNMR(DMSO-d₆,400MHz)δ11.1(brs,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.31(d,J＝2.4Hz,1H),7.11(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),4.25(s,2H),3.98(t,J＝4.8Hz,2H),3.79(t,J＝4.8Hz,2H),1.33(s,9H).

步骤6：4-(4-氨基-3-(羟基)苯基)吗啡啉-3-酮的合成

在250毫升的氢化瓶中，氮气保护下，干钯碳(200毫克)加入到4-(3-(羟基)-4-硝基苯基)吗啡啉-3-酮(3.5克，14.7毫摩尔)的甲醇(100毫升)溶液中。反应液在30psi的氢气压力下，30℃下搅拌反应16小时。TLC(PE:EA＝1:1)板检测反应完全,过滤，用热的甲醇(200毫升)洗涤滤饼。合并有机相旋干得4-(4-氨基-3-(羟基)苯基)吗啡啉-3-酮(2.7克，HPLC纯度91％，收率88％)。¹HNMR(DMSO-d₆,400MHz)δ9.22(brs,1H),6.63(s,1H),6.57(d,J＝8.4Hz,1H),6.51(d,J＝8.4Hz,1H),4.59(brs,2H),4.13(s,2H),3.91(t,J＝4.4Hz,2H),3.57(t,J＝4.4Hz,2H).

步骤7：(2-羟基-4-(3-吗啡啉酮)苯基)氨基甲酸苄酯的合成

冰水浴下，碳酸氢钠固体(1.63克，19.4毫摩尔)加入到4-(4-氨基-3-(羟基)苯基)吗啡啉-3-酮(2.7克，12.9毫摩尔)的四氢呋喃(10毫升)和水(15毫升)的混合溶液中。冷却至0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯(1.63克，19.4毫摩尔)的四氢呋喃(5毫升)溶液，保持温度不超过5℃。加毕，TLC(PE:EA＝1:3)板检测反应完全。水(30毫升)加入到反应液中搅拌五分钟过滤，滤饼水(10毫升)洗，收集滤饼旋干，乙醇打浆得到(2-羟基-4-(3-吗啡啉酮)苯基)氨基甲酸苄酯(3.66克，白色固体，HPLC纯度96％，收率82％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ9.95(brs,1H),8.52(s,1H),7.56(d,J＝9.2Hz,1H),7.45～7.33(m,5H),6.91(d,J＝2.4Hz,1H),6.79(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),5.15(s,2H),4.18(s,2H),3.95(t,J＝4.8Hz,2H),3.66(t,J＝4.8Hz,2H),1.33(s,9H).

流程3:

步骤8：(2R,3R)-2,3,4-三羟基丁酸钾的合成

冰水浴条件下，将氢氧化钾(1.12千克，19.98摩尔)缓慢加入到甲醇(10升)和水(2.4升)的混合溶剂中，控制温度不超过45℃。加毕，通入氧气到反应液中，待反应液降到35℃，滴加D-(-)-阿拉伯糖(1千克，6.66摩尔，溶在2.4升水中)的水溶液，滴加超过6小时(整个过程保持通入氧气)并保持反应温度在35度。滴完后继续通入氧气2小时，再通入空气60小时。将反应液减压浓缩至2.4升油状物，再把油状物慢慢滴入快速搅拌的甲醇(10升)中，有大量白色固体析出。滴完后，过滤，并真空干燥后得白色固体(560克，收率48％)。¹HNMR(D₂O，400MHz)δ4.09(d,J＝4.0Hz,1H),3.97～3.92(m,1H),3.65(d,J＝5.6Hz,1H).

步骤9：(2S,3R)-2,4-二溴-3-羟基丁酸甲酯的合成

将溴化氢/乙酸溶液(33％，2升)加入到盛有(2R,3R)-2,3,4-三羟基丁酸钾(560克，3.21摩尔)的反应器中。室温搅拌24小时，将反应液倒入无水甲醇(14升)中，再室温搅拌18小时，之后反应液加热到65℃回流4小时。反应液减压浓缩，加入水(1升)和乙酸乙酯(1.5升)萃取，分离出有机相，硫酸钠干燥，浓缩，得到(2S,3R)-2,4-二溴-3-羟基丁酸和(2S,3R)-2,4-二溴-3-羟基丁酸甲酯的油状混合物706克。硫酸(60毫升)缓慢加入到该混合物(680克)的甲醇(3.5升)溶液中，加热回流6小时，TLC(PE:EA＝10:1)板检测反应完全，将反应液浓缩，残留物溶在乙酸乙酯(800毫升)中，用水(500毫升)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩得产物为灰白色固体(650克，收率74％)。¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ4.71(d,J＝3.6Hz,1H),4.20～4.15(m,1H),3.83(s,3H),3.55～3.48(m,2H).

步骤10：(2R,3S)-3-溴甲基环氧乙烷-2-羧酸甲酯的合成

将碳酸钾(503克，3.65摩尔)加入到(2S,3R)-2,4-二溴-3-羟基丁酸甲酯(200克，0.729摩尔)的丙酮(2.5升)溶液中，室温反应4小时，TLC(PE:EA＝10:1)板检测原料消失，将反应液过滤，减压浓缩得产物为淡黄色油状物，再用减压蒸馏装置将产物蒸出为无色透明液体(126克，90％)。

¹HNMR(CDCl₃，400MHz)δ3.83(s,3H),3.67～3.62(m,2H),3.57～3.52(m,1H),3.46～3.43(m,1H).

流程4:

步骤11：(3R,4R)-3,4-二羟基二氢呋喃-2(3H)-酮的合成

将异抗坏血酸(17.6g，0.1mol)溶于250ml水中，并降温至0～6℃。将无水碳酸钠粉末(21.2g，0.2mol)分批加入反应瓶中。加料结束后，继续搅拌同时加入30％双氧水(22mL)，内部温度从6℃升高至19℃，继续在冰浴下搅拌5分钟，内部温度升至27℃。反应液被加热到42℃搅拌30分钟。将锌粉(1.0g，0.015mol)加入到反应液中淬灭过量的双氧水，淀粉碘化钾试纸检测显示阴性。将反应液用6N的盐酸调节pH值至1.0。在50℃下减压浓缩至少量白色固体析出。用乙酸乙酯(150mlx3)萃取。将有机相浓缩至200ml(10～15vol)；降温至15～25℃，搅拌5～8小时；(大量白色固体析出)过滤，烘干，得到8.26g(3R,4R)-3,4-二羟基二氢呋喃-2(3H)-酮，收率70％。

¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ5.78(brs,1H),5.37(brs,1H),4.39(d,J＝4.4Hz,1H),4.30～4.22(m,2H),4.05(d,J＝10.0Hz,1H).

步骤12：(2S,3R)-2,4-二溴-3-羟基丁酸甲酯的合成

1L烧瓶中加入(3R,4R)-3,4-二羟基二氢呋喃-2(3H)-酮(26.0g，221mmol)，和182.0mL33％氢溴酸乙酸溶液。混合物在室温下搅拌24小时后，加入959.0mL甲醇，继续搅拌36小时。所得反应液加热到65～75℃，回流4小时。反应液减压浓缩后，加入水(70.0mL)和乙酸乙酯(105.0mL)萃取，分离出有机相，硫酸钠干燥，浓缩，得到的粗品油状混合物51g。硫酸(4.1mL)缓慢加入到该混合物(51.0g)的甲醇(239.0mL)溶液中，加热回流6小时(60～70℃)。将反应液浓缩，残留物溶在乙酸乙酯(60.0mL)中，用水(30mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩得产物为灰白色固体(51g，收率：83％)。¹HNMR(D₂O，400MHz)δ3.98(d,J＝4.0Hz,1H),3.86～3.81(m,2H),3.54～3.51(m,2H).

流程5

步骤13：(3R,3aS)-甲基-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-羧酸的合成

在0℃搅拌下，向(2-羟基-4-(3-吗啡啉酮)苯基)氨基甲酸苄酯(68.5g,0.20mol)的DMF(700mL)溶液中，依次一次性加入(2S,3R)-2,4-二溴-3-羟基丁酸甲酯(46.8g,0.24mol)，碳酸铯(130.3g,0.40mol)。该反应液在0℃下，搅拌反应10小时。待检测(2-羟基-4-(3-吗啡啉酮)苯基)氨基甲酸苄酯完全消失后，在0℃下，继续加入碳酸铯(65.2g,0.20mol)。反应液逐渐升温至室温，搅拌反应12小时。反应混合液降温到0℃，加入甲醇(700mL)，用4NHCl/甲醇溶液调节pH＝1。在0℃下，缓慢滴加二氯亚砜(58mL,0.80mol),约1小时滴加完。在0℃下，继续搅拌反应1小时后，再逐渐升温至室温反应16小时。待检测反应完全后，反应液在40℃下，减压浓缩除去甲醇。剩下的反应混合物降温后，加入到pH为2的冷的盐酸水溶液中。过滤收集固体得到粗品，粗品用冷的盐酸水溶液(40mL,pH＝2)洗两次，甲醇(40mL)洗两次，真空干燥得到目标产物为白色固体(38g,收率:54％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ7.81(d,J＝8.4Hz,1H),7.08～7.02(m,2H),5.15(d,J＝6.8Hz,1H),4.58(d,J＝9.2,3.2Hz,1H),4.40(m,1H),4.18(s,2H),4.15(m,1H),3.95(t,J＝4.4Hz,1H),3.80(s,2H),3.69(t,J＝4.4Hz,1H).

步骤14：(3R,3aS)-3-(羟甲基)-7-(3-酮吗啡啉)-3a,4-二氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-1(3H)-酮的合成

在0℃搅拌下，向(3R,3aS)-甲基-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-羧酸(38.3g,0.11mol)的混合甲醇/二氯甲烷(660mL,2:1)悬浊液中，分批加入硼氢化钠(5.0g,0.13mol)，约40分钟加完。在0℃下，搅拌反应20分钟。反应液升温至室温，在40℃下，减压浓缩除去溶剂，得到粗品。该粗品在水(40mL)中打浆10分钟，过滤，水(20mL)洗一次，真空干燥得到目标产物28g。水相用甲醇/二氯甲烷(1:10)萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得到目标产物5g，总收率为90％。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ7.84(d,J＝8.8Hz,1H),7.05～6.99(m,2H),5.34(brs,1H),4.54(d,J＝7.2Hz,1H),4.45(m,1H),4.18(s,2H),4.02(t,J＝4.4Hz,1H),3.95(s,2H),3.77～3.68(m,4H).

步骤15：((3R,3aS)-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-基)甲磺酸甲酯的合成

在0℃搅拌下，向(3R,3aS)-3-(羟甲基)-7-(3-酮吗啡啉)-3a,4-二氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-1(3H)-酮(19.2g,60mmol)的二氯甲烷(600mL)悬浊液中，一次性加入三乙胺(25mL,180mmol)，滴加甲烷磺酰氯(9mL,120mmol)，约20分钟加完。在0℃下，搅拌反应1小时，再逐渐升温至室温反应16小时。待检测反应基本完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液(200mL)。混合液过滤，滤液分液，水相用二氯甲烷(100mLx2)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(200mL)洗两次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后与固体合并得到目标产物(21g,收率:87％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.07～7.01(m,2H),4.79(m,1H),4.64～4.58(m,3H),4.18(s,2H),4.07(d,J＝5.6Hz,2H),3.95(t,J＝4.8Hz,1H),3.69(t,J＝4.8Hz,1H),3.28(s,2H).

步骤16：2-(((3S,3aS)-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-基)甲基)异吲哚-1,3-二酮的合成

将((3R,3aS)-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-基)甲磺酸甲酯(5.4g,13.5mmol)溶于DMF(55mL)中。在25℃搅拌下，一次性加入邻苯二甲酰亚胺钾盐(3.75g,20.3mmol)，搅拌10分钟后升温至70℃，反应16小时。待检测反应基本完全后，冷却至室温，加入到冰水(180mL)中。过滤收集固体得到粗品，粗品用冰水(20mL)洗两次，干燥得到目标产物为白色固体(5.4g,收率:90％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ7.95～7.85(m,4H),7.80(d,J＝8.8Hz,1H),7.04(d,J＝2.4Hz,1H),7.00(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),4.73(m,1H),4.72(m,1H),4.18～4.03(m,6H),3.94(t,J＝4.8Hz,1H),3.68(t,J＝4.8Hz,1H).

步骤17：(3S,3aS)-3-(氨甲基)-7-(3-酮吗啡啉))-3a,4-二氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-1(3H)-酮的合成

向250毫升反应瓶中，加入MeOH(100mL)，随后加入化合物2-(((3S,3aS)-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-基)甲基)异吲哚-1,3-二酮(10.11g,22.5mmol)，充分搅拌均匀后，一次性加入40％甲胺水溶液(10.5mL,135mmol)，搅拌10分钟后升温至65℃，继续搅拌4小时，检测原料反应完全。然后将反应液冷却至室温，用HCl-MeOH溶液(12mL,12M)调节反应液pH＝1，搅拌1小时，充分成盐。在40℃下，反应液浓缩除去部分甲醇(约50mL)得到浆状液。随后加入甲醇/二氯甲烷(60mL，1:5)，打浆16小时，过过滤，滤饼用MeOH(10mL)洗两次，干燥得到目标产的盐酸盐(白色固体，7.0g，收率为87％，纯度98％)。¹HNMR(DMSO-d₆，400MHz)δ7.85(d,J＝8.4Hz,1H),6.98～6.95(m,2H),4.82(m,1H),4.59(d,J＝10.4Hz,1H),4.29(s,2H),4.12～4.01(m,4H),3.71(t,J＝5.6Hz,1H),3.52～3.47(m,2H),3.28(s,1H).

步骤18：5-氯-N-(((3S,3aS)-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺的合成

向250毫升反应瓶中，加入水(30mL)，丙酮(54mL)，随后加入碳酸钠(2.48g,23.4mmol)，充分搅拌完全溶解后，降温至0-5℃，加入(3S,3aS)-3-(氨甲基)-7-(3-酮吗啡啉))-3a,4-二氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-1(3H)-酮盐酸盐(6.40g,18.0mmol)，约10分钟加完。在0-5℃下，搅拌至完全溶解(约30分钟)。随后，在0-5℃下，滴加5-氯噻吩-2-酰氯(3.90g,21.6mmol)的甲苯(11mL)溶液,大约20分钟滴加完。滴加完后，继续在0-5℃下搅拌反应0.5小时，再逐渐升温至20度反应1小时。反应过程中逐渐有固体析出。TLC(DCM：MeOH＝20:1)板检测反应至反应完全，向反应液中加入水(100mL)，搅拌20分钟。随后在45℃下浓缩除去有机溶剂，过滤，收集固体，固体用水(50ml)洗，干燥得到目标产物(白色固体，8.40g,收率99％，HPLC纯度94％，手性纯度99％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.00(t,J＝5.6Hz,1H),7.85(d,J＝8.8Hz,1H),7.71(d,J＝4.0Hz,1H),7.21(d,J＝4.0Hz,1H),7.05(d,J＝2.0Hz,1H),7.05(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),4.62-4.51(m,2H),4.18(s,2H),4.11-4.01(m,2H),3.95(t,J＝5.2Hz,2H),3.73(t,J＝5.2Hz,2H),3.68(t,J＝5.2Hz,2H).

步骤19：5-氯-N-(((3S,3aS)-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺的重结晶(A晶型)

将2.8g步骤18中粗品固体用90mL乙醇加热到70℃搅拌30分钟，然后降温至室温搅拌16小时，过滤收集固体为2.4g，HPLC纯度为98.3％，收率86％。

步骤20：5-氯-N-(((3S,3aS)-1-酮-7-(3-酮吗啡啉)-1,3,3a,4-四氢苯并[b]恶唑并[3,4-d][1,4]恶嗪-3-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺的重结晶(B晶型)

从步骤18中粗品固体中取出500mg固体，加入0.65mLDMSO搅拌溶解，随后加入1.3mLEtOH加热到80℃全部溶解，随后自然降温至0-10℃，有大量固体析出，过滤收集固体得到400mg，HPLC纯度为99.3％，收率80％。

实施例2：化合物2的制备

化合物2的制备方法参照实施例1，其中，将步骤2中的吗啉-3-酮替换为哌啶-2-酮。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.01(t,J＝5.6Hz,1H),7.83(d,J＝8.8Hz,1H),7.72(d,J＝4.0Hz,1H),7.22(d,J＝4.0Hz,1H),6.87-6.93(m,2H),4.50-4.64(m,2H),3.99-4.13(m,2H),3.73(t,J＝5.6Hz,2H),3.52-3.60(m,2H),2.37(t,J＝6.0Hz,2H),1.77-1.90(m,4H)；LCMS(ESI)m/z:462.1(M+1).

实施例3：化合物7的制备

化合物7的制备方法参照实施例1，其中，将步骤2中的吗啉-3-酮替换为四氢嘧啶-2(1H)-酮。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.00(t,J＝6.0Hz,1H),7.69-7.75(m,2H),7.20(d,J＝4.0Hz,1H),6.85-6.95(m,2H),6.55(s,1H),4.47-4.62(m,2H),3.94-4.10(m,2H),3.71(t,J＝5.6Hz,2H),3.56(t,J＝5.6Hz,2H),3.20(td,J＝5.2,2.0Hz,2H),1.91(t,J＝6.0Hz,2H)；LCMS(ESI)m/z:463.0(M+1).

实施例4：化合物8的制备

化合物8的制备方法参照实施例1，其中，将步骤2中的吗啉-3-酮替换为吡啶-2(1H)-酮。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.01(t,J＝5.6Hz,1H),7.95(d,J＝8.8Hz,1H),7.72(d,J＝4.0Hz,1H),7.59(dd,J＝6.8,1.6Hz,1H),7.49(ddd,J＝9.2,6.8,2.0Hz,1H),7.21(d,J＝4.0Hz,1H),7.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.01(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.45(d,J＝9.2Hz,1H),6.29(td,J＝6.8,1.2Hz,1H),4.56-4.69(m,2H),4.03-4.16(m,2H),3.75(t,J＝5.6Hz,2H)；LCMS(ESI)m/z:458.1(M+1).

实施例5：化合物30的制备

化合物30的制备方法参照实施例1，其中，将步骤2中的吗啉-3-酮替换为(R)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.00(t,J＝5.4Hz,1H),7.71(d,J＝4.0Hz,1H),7.57(d,J＝9.2Hz,1H),7.21(d,J＝4.0Hz,1H),6.27(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),6.16(d,J＝2.8Hz,1H),4.53-4.46(m,2H),3.97-3.95(m,2H),3.78-3.73(m,1H),3.70(t,J＝5.6Hz,2H),3.33-3.31(m,2H),3.27(s,3H),3.21-3.17(m,1H),3.01-2.95(m,1H),1.99-1.87(m,4H)；LCMS(ESI)m/z:478.1(M+1).

实施例6：化合物34的制备

化合物34的制备方法参照实施例1，其中，将步骤2中的吗啉-3-酮替换为1H-1,2,4-三唑。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.27(s,1H),9.05(t,J＝5.6Hz,1H),8.22(s,1H),8.02(d,J＝8.4Hz,1H),7.75(d,J＝4.0Hz,3H),7.52(m,2H),7.22(d,J＝4.0Hz,1H),4.64(m,2H),4.14(m,2H),3.75(t,J＝5.6Hz,2H)；LCMS(ESI)m/z:432(M+1).

体外活性评价

通过测定IC₅₀值来评价受试化合物对人或大鼠的Ⅹa因子或其他酶如凝血酶或胰蛋白酶的抑制能力，其中IC₅₀值与抑制常数K_i相关联。在显色测定中使用纯化的酶。使用FlexStationIII(美国分子仪器公司)测定37℃下时间进程中线性部分(通常是加入底物2～10分钟后)在405nm处的吸光度的变化来测量发色底物水解的初始速度。通过绘制水解的相对速度(与未受抑制的对照组相比)对受试化合物浓度的对数曲线后，通过线性回归计算，测定导致底物水解的速率降低50％的抑制剂的浓度。根据Cheng-Prusoffequation:K_i＝IC₅₀/(1+[S]/K_m)计算酶抑制常数(K_i)，其中[S]为底物浓度，K_m为通过双倒数作图法确定的米-曼二氏常数。通过GraphPadPrism软件得到受试化合物的IC₅₀值。使用“形剂量效应(可变斜率)”拟合曲线。

人/大鼠凝血因子Xa试验：

采用Tris-HCl缓冲液(50mM,pH8.3,150mMNaCl)测定人或大鼠的凝血因子Xa活性抑制作用。通过将50μL人凝血因子Xa(EnzymeResearchLaboratories,Inc；终浓度为8.36nM)或50μL大鼠凝血因子Xa(EnzymeResearchLaboratories,Inc；终浓度为57.5nM)的缓冲液滴加到Greiner384微量滴定板的合适孔中的方法测定IC₅₀。含2μL2％(V/V)DMSO的测定缓冲液(未受抑制的对照组)或各种浓度的待测化合物稀释在含有2％(V/V)DMSO的测定缓冲液中，并添加48μL衬底S-2222(Chromogenix；化学式：Bz-IIe-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNA·HClR＝H(50％)，其中R＝CH₃(50％))的测定缓冲液，终浓度为0.172mM。该试验中将受试化合物与酶预培养10分钟，然后加入底物S-2222得到100μL终体积以开始试验。

K_i<10μM的受试化合物被认为是积极的，本发明优选K_i<1μM的化合物，更优选K_i<0.1μM的化合物，更优选K_i<0.01μM的化合物，进一步优选K_i<0.001μM的化合物。经上述试验方法测定，本发明的一些化合物K_i<0.1μM，因此本发明的化合物可作为有效的Ⅹa因子抑制剂。

人凝血酶试验：

采用缓冲液(10mM的HEPES缓冲液，pH7.4,2mMCaCl₂)测定人凝血酶活性抑制作用。选择Greiner384微量滴定板中合适的孔测定IC₅₀，含有50μL人凝血酶(Sigma公司；T8885)的缓冲液，终浓度为0.05NIH单位/mL，含2μL2％(V/V)DMSO的测定缓冲液(未受抑制的对照组)或各种浓度的待测化合物稀释在含有2％(V/V)DMSO的测定缓冲液中；加入含有48μL底物S-2238(Chromogenix；化学式：H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)的缓冲液，终浓度为30μM。该试验中将受试化合物与酶预培养10分钟，然后加入底物得到100μL终体积以开始试验。

人胰蛋白酶试验：

采用缓冲液(50mMTris,pH8.2,and20mMCaCl₂)测定人胰蛋白酶活性抑制作用。选择Greiner384微量滴定板中合适的孔测定IC₅₀，含有50μL人胰蛋白酶(Sigma公司；T6424)的缓冲液，终浓度为0.39BAEE单位/mL，含2μL2％(V/V)DMSO的测定缓冲液(未受抑制的对照组)或各种浓度的待测化合物稀释在含有2％(V/V)DMSO的测定缓冲液中；含有底物S-2222(Chromogenix)的缓冲液，终浓度为30μM。该试验中将受试化合物与酶预培养10分钟，然后加入底物48μL，得到终体积100μL以开始试验。

凝血酶原试验：

通过凝血酶的生成测量受试化合物对凝血酶原酶的活性。简单地说，在10mMHEPES缓冲液和pH7.4,2mMCaCl₂中温育12.5μL人因子Xa，终浓度为0.5nM，并在37℃加入12.5μL人血小板(1×10⁷mL^-1)10分钟。加入25μL凝血酶原以开始反应，终浓度为0.5μM，含2μL2％(V/V)DMSO的测定缓冲液(未受抑制的对照组)或各种浓度的待测化合物稀释在含有2％(V/V)DMSO的测定缓冲液中。20分钟后，加入48μL底物S-2238(Chromogenix)至终浓度为50μM以测定凝血酶活性。

表1：本发明化合物体外筛选试验结果

结论：本发明化合物通过其特定的抗凝血因子Xa活性表现出很强的抗凝血活性。

Claims

1.式(Ⅰ)化合物的制备方法，

其包含如下步骤：

其中，

R为氨基保护基，优选自烷氧羰基类氨基保护基，更优选自Cbz、Boc、Fmoc、Alloc、Teco、甲氧羰基或乙氧羰基；

X为F、Cl、Br或I；

R²选自任选被取代的5或6元环氨基或杂环氨基，“杂”代表O、N、C(＝O)或C(＝O)NH，取代基独立地选自C_1-4烷基或杂烷基；

优选地，R²选自或

2.根据权利要求1所述制备方法，其中，所述碱选自碱金属碱、碱土金属碱或有机金属碱；

优选地，所述碱金属碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠和/或碳酸氢钾；

优选地，碱土金属碱选自氢化钠、氢化钾和/或氢化钙；

优选地，有机金属碱选自甲醇钠、叔丁醇锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾、乙醇钠和/或异丙醇铝。

3.根据权利要求1所述制备方法，其中，化合物(Ⅳ)与所述碱的摩尔用量比为1:1～5,具体为1:2～3；

化合物(Ⅲ)和化合物(Ⅳ)的摩尔用量比为1:1～2；

反应温度为-10～50℃，具体为0～30℃；和/或

反应时间为5～200小时，具体为10～100小时，更具体为16～48小时。

4.根据权利要求1所述制备方法，该反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自酰胺类溶剂、醚类溶剂或其任意混合物；

优选地，所述反应溶剂用量为化合物(Ⅳ)重量的10～50倍，更优选为15～20倍；

优选地，酰胺类溶剂选自DMF或DMAC；和/或

优选地，醚类溶剂选自四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二氧六环或甲基叔丁基醚。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其包含如下反应路线：

或

其中，HA选自有机或无机酸，优选地，HA选自盐酸、硫酸、草酸、柠檬酸、马来酸或富马酸。

6.作为制备式(Ⅰ)化合物中间体的下式化合物：

其中，

优选地，R²选自或HA选自有机或无机酸，优选地，HA选自盐酸、硫酸、草酸、柠檬酸、马来酸或富马酸。

7.根据权利要求6所述化合物(Ⅳ)的制备方法，包含如下步骤：

8.根据权利要求7所述制备方法，其中，所述碱选自碱金属碱、碱土金属碱或有机金属碱；

优选地，化合物(a)与碱的摩尔比为1:1～3；

优选地，化合物(a)与R²-H的摩尔比为1:1～2；

优选地，碱土金属碱选自氢化钠、氢化钾和/或氢化钙；

优选地，有机金属碱选自甲醇钠、叔丁醇锂、叔丁醇钠、叔丁醇钾、乙醇钠和/或异丙醇铝；

优选地，该反应在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自非极性溶剂和极性溶剂的混合溶剂；

优选地，非极性溶剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯或溴苯；

优选地，极性溶剂选自DMF、DMSO或NMP；

优选地，非极性溶剂与极性溶剂的体积比为1:0.5～2；和/或

优选地，溶剂用量为化合物(a)重量的5～20倍。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其包含如下反应路线：

10.下式化合物1的晶型，其结构如图1或图2所示。

11.根据权利要求10所述晶型的制备方法，包括将任意一种形式的化合物1加入到溶剂中结晶制得，其中，

优选地，溶剂用量为化合物1重量的3～50倍；

优选地，所述溶剂选自醇类溶剂或者含有醇类溶剂或水的混合溶剂；

优选地，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和/或正丁醇；

优选地，所述混合溶剂选自DMSO与乙醇或水的混合溶剂；或

优选地，所述DMSO与乙醇或水的体积比为1:0.5～5。