CN105492630A - 使用靶基因表达的数学建模评价pi3k细胞信号传导途径活性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，所述方法包括至少基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平推断医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性。本发明还涉及一种装置，所述装置包含经配置以执行此方法的数字处理器、存储可由数字处理设备执行以执行此方法的指令的非临时性存储介质和包含用于引起数字处理设备以执行此方法的程序代码装置的计算机程序。

Description

使用靶基因表达的数学建模评价PI3K细胞信号传导途径活性
发明领域
本发明总体涉及生物信息学、基因组加工、蛋白质组加工和相关技术的领域。更具体地，本发明涉及一种方法，所述方法包括至少基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平推断医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性。本发明还涉及一种装置，所述装置包含经配置以执行此方法的数字处理器、存储可由数字处理设备执行以执行此方法的指令的非临时性存储介质和包含用于引起数字处理设备执行此方法的程序代码装置的计算机程序。
发明背景
基因组和蛋白质组分析已经基本上实现了医疗领域诸如肿瘤学中的临床应用，并且是其潜在希望，其中已知多种癌症与基因组突变/变异和/或特定基因的高或低表达水平的特定组合相关，其在癌症的生长和进化（例如，细胞增殖和转移）中起作用。
例如，筛选乳腺癌样品中的细胞膜上的HER2受体的过表达目前是经执行用于鉴定适用HER2抑制剂诸如曲妥珠单抗（Trastuzumab）的患者的标准测试。ERBB2基因的过表达（其导致细胞膜上的HER2受体的过表达）存在于约25％至30％的所有乳腺癌中，并且与增加的疾病复发和不良预后相关。然而，HER2受体的表达决不是用于驱动肿瘤生长的决定性指标，因为HER2受体引发的信号传导可以例如受下游细胞信号传导途径抑制。这也似乎反映于用曲妥珠单抗治疗的HER2阳性乳腺癌患者中的26%的初始响应率(Charles L. Vogel,等人, “Efficacy and Safety of Trastuzumab as a Single Agent in First-LineTreatment of HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer”, Journal ofClinical Oncology, Vol. 20, No. 3, February 2002, 第719至726页)。除此之外，HER2受体下游的细胞信号传导途径也可被HER2受体下游的蛋白的突变/过表达活化，导致无法通过测量HER2表达水平来检测的相对侵袭性肿瘤类型。因此，期望能够提高表征具有肿瘤（例如，乳腺癌）的患者的可能性，所述肿瘤至少部分由HER2受体下游的细胞信号传导途径中存在的作用驱动。
发明概述
本发明提供了如本文公开的新且改进的方法和装置。
根据本发明的主要方面，以上问题通过使用靶基因表达的数学建模来推断PI3K细胞信号传导途径的活性的方法来解决，即包括以下的方法：
- 至少基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平推断所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性，其中所述推断包括：
- 测定医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中的FOXO转录因子（TF）元件的水平，所述FOXO TF元件控制PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的转录，所述测定至少部分基于评估将PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平与FOXO TF元件的水平关联的数学模型；
- 基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中的FOXO TF元件的测定水平推断所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性，
其中所述推断通过使用所述数学模型的数字处理设备来执行。
本发明基于本发明人的以下认识：鉴定HER2受体下游的细胞信号传导途径（本文中，PI3K细胞信号传导途径）中存在的作用的合适方式可以基于细胞信号传导途径的信号传导输出值的测量，这是 - 除其它 - 转录因子（TF）（本文中，FOXO TF元件）对靶基因的转录，其由细胞信号传导途径控制。本文靶向的PI3K细胞信号传导途径不仅与乳腺癌关联，而且已知在许多类型的癌症中被不当活化(Jeffrey A. Engelman, “Targeting PI3Ksignalling in cancer: opportunities, challenges and limitations”, NatureReviews Cancer, No. 9, August 2009, 第550至562页)。它被认为由RTK受体家族（其还包括HER家族）调节。随后，PI3K细胞信号传导途径经由多个过程传递其接受的信号，所述多个过程中的两个主要分支是mTOR复合物的活化和通常被称为FOXO的转录因子的家族的失活（参见来自Jeffrey A. Engelman的上述文章中显示PI3K细胞信号传导途径的图）。本发明集中于PI3K细胞信号传导途径和FOXO TF家族，其活性实质上与PI3K细胞信号传导途径的活性负相关，即，FOXO的活性实质上与PI3K细胞信号传导途径的无活性相关，而FOXO的无活性实质上与PI3K细胞信号传导途径的活性相关。本发明使得可能通过以下测定医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性：（i）测定医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中的FOXO TF元件的水平，其中所述测定至少部分基于评估将PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平（其转录受FOXO TF元件控制）与FOXO TF元件的水平关联的数学模型，和（ii）基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中的FOXO TF元件的测量水平推断医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性。这优选允许提高表征具有肿瘤（例如，乳腺癌）的患者的可能性，所述肿瘤至少部分地由失调的PI3K细胞信号传导途径驱动，且因此可能响应于PI3K细胞信号传导途径的抑制剂。
本文中，FOXO转录因子（TF）元件被定义为含有FOXO TF家族成员中的至少一个（即，FOXO1、FOXO3A、FOXO4和FOXO6）的蛋白复合物，其能够结合至特定DNA序列，从而控制靶基因的转录。
数学模型可以是概率模型，优选贝叶斯网络模型（Bayesian network model），其至少部分基于将FOXO TF元件和医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平关联的条件概率，或者数学模型可以至少部分基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平的一种或多种线性组合。具体而言，PI3K细胞信号传导途径的活性的推断可以如公开的国际专利申请WO 2013/011479 A2 （“Assessmentof cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of targetgene expression”）中所公开或如公开的国际专利申请WO 2014/102668 A2 （“Assessmentof cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of targetgene expressions”）中所描述进行，所述申请的内容在此以其整体并入。
所述医学主体可以是人或动物。此外，医学主体的组织和/或细胞和/或体液可以来自源自医学主体的细胞系和/或组织培养物，且，如果适用，在实验室中体外培养（例如，用于再生的目的）。此外，“靶基因”可以是“直接的靶基因”和/或“间接的靶基因”（如本文所述）。
具体合适的靶基因描述于以下文本段落以及下文实施例中（例如参见表1至3）。
因此，根据优选的实施方案，所述靶基因选自表3中列举的靶基因。
特别优选的是一种方法，其中所述推断包括：
- 至少基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种，优选至少三种靶基因的表达水平推断医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性，所述靶基因选自：AGRP、BCL2L11、BCL6、BNIP3、BTG1、CAT、CAV1、CCND1、CCND2、CCNG2、CDKN1A、CDKN1B、ESR1、FASLG、FBXO32、GADD45A、INSR、MXI1、NOS3、PCK1、POMC、PPARGC1A、PRDX3、RBL2、SOD2 和TNFSF10。
进一步优选的一种方法，其中所述推断还基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的至少一种靶基因的表达水平，所述靶基因选自：ATP8A1、C10orf10、CBLB、DDB1、DYRK2、ERBB3、EREG、EXT1、FGFR2、IGF1R、IGFBP1、IGFBP3、LGMN、PPM1D、SEMA3C、SEPP1、SESN1、SLC5A3、SMAD4 和TLE4。
进一步优选的一种方法，其中所述推断还基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的至少一种靶基因的表达水平，所述靶基因选自：ATG14、BIRC5、IGFBP1、KLF2、KLF4、MYOD1、PDK4、RAG1、RAG2、SESN1、SIRT1、STK11 和TXNIP。
如果所述推断还基于选自前述段落中指定的组群的至少一种靶基因的表达水平和选自前述段落之前段落中指定的组群的至少一种靶基因的表达水平两者，上述关于两个组群提到的靶基因IGFBP1和SESN1可以仅包含于所述组群之一中。
本发明的另一个方面涉及一种方法（如本文所述），其还包括：
- 基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性确定PI3K细胞信号传导途径在医学主体的组织和/或细胞和/或体液中是否异常运行。
本发明还涉及一种方法（如本文所述），其还包括：
- 为医学主体推荐开药，所述药物校正PI3K细胞信号传导途径的异常运行；
其中只有当基于PI3K细胞信号传导途径的推断活性确定PI3K细胞信号传导途径在医学主体的组织和/或细胞和/或体液中异常运行时才进行所述推荐。
本发明还涉及一种方法（如本文所述），其中所述推断包括：
- 至少基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的靶基因组中的两种、三种或更多种靶基因的表达水平推断医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性。
优选地，
所述PI3K细胞信号传导途径的靶基因组包括选自以下的至少九种、优选所有靶基因：AGRP、BCL2L11、BCL6、BNIP3、BTG1、CAT、CAV1、CCND1、CCND2、CCNG2、CDKN1A、CDKN1B、ESR1、FASLG、FBXO32、GADD45A、INSR、MXI1、NOS3、PCK1、POMC、PPARGC1A、PRDX3、RBL2、SOD2 和TNFSF10。
特别优选一种方法，其中
所述PI3K细胞信号传导途径的靶基因组还包括选自以下的至少一种靶基因：ATP8A1、C10orf10、CBLB、DDB1、DYRK2、ERBB3、EREG、EXT1、FGFR2、IGF1R、IGFBP1、IGFBP3、LGMN、PPM1D、SEMA3C、SEPP1、SESN1、SLC5A3、SMAD4 和TLE4。
还特别优选一种方法，其中
所述PI3K细胞信号传导途径的靶基因组还包括选自以下的至少一种靶基因：ATG14、BIRC5、IGFBP1、KLF2、KLF4、MYOD1、PDK4、RAG1、RAG2、SESN1、SIRT1、STK11 和TXNIP。
如果所述靶基因组还包括选自前述段落中指定的组群的至少一种靶基因和选自前述段落之前段落中指定的组群的至少一种靶基因两者，上述关于两个组群提到的靶基因IGFBP1和SESN1可以仅包含于所述组群之一中。
待根据本发明使用的样品可以是，例如，从癌症病灶、或从怀疑为癌症的病灶、或从转移性肿瘤、或从存在被癌细胞污染的体液的体腔（例如，胸腔或腹腔或膀胱腔）、或从含有癌细胞的其它体液等等、优选经由活检程序或其它样品提取程序获得的样品。提取样品的细胞还可以是来自血液系统恶性肿瘤（诸如白血病或淋巴瘤）的肿瘤细胞。在一些情况下，细胞样品还可以是循环肿瘤细胞，即已进入血流且可以使用合适的分离技术（例如血浆分离置换法或常规静脉采血）提取的肿瘤细胞。除了血液，提取样品的体液可以是尿、胃肠内容物或渗出物。如本文所使用，术语“提取样品”还涵盖这样的情况，其中主体的组织和/或细胞和/或体液已取自主体并且例如已经置于显微镜载片上，并且其中为了执行请求保护的方法，例如借助于激光捕获显微切割（LCM）或通过从载玻片上刮取目的细胞或通过荧光活化的细胞分选技术来提取该样品的一部分。
根据另一个公开的方面，装置包含经配置以执行根据如本文所述的本发明的方法的数字处理器。
根据另一个公开的方面，非临时性存储介质存储可由数字处理设备执行以执行根据如本文所述的本发明的方法的指令。所述非临时性存储介质可以是计算机可读取的存储介质，诸如硬盘驱动器或其它磁性存储介质、光盘或其它光存储介质、随机存取存储器（RAM）、只读存储器（ROM）、闪速存储器、或其它电子存储介质、网络服务器等等。数字处理设备可以是手提式设备（例如，个人数据助手或智能电话）、笔记本计算机、台式计算机、平板计算机或设备、遥控网络服务器等等。
根据另一个公开的方面，计算机程序包含用于引起数字处理设备执行根据如本文所述的本发明的方法的程序代码装置。数字处理设备可以是手提式设备（例如，个人数据助手或智能电话）、笔记本计算机、台式计算机、平板计算机或设备、遥控网络服务器等等。
如本文所述的本发明还可以例如有利地与以下关联使用：
基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性诊断；
基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性预后；
基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性的药物处方；
- 基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性预测药效；
基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性预测副作用；
药效的监测；
药物开发；
测定开发；
途径研究；
癌分期；
基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性在临床试验中登记医学主体；
待进行的后续测试的选择；和
伴随诊断测试的选择。
在阅读和理解所附的附图、以下描述和具体在阅读本文以下提供的更详尽的实施例之后，进一步的优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
应当理解，权利要求1的方法、权利要求13的装置、权利要求15的非临时性存储介质和权利要求15的计算机程序具有类似和/或相同的优选实施方案，具体而言，如从属权利要求中所定义。
应当理解，本发明的优选实施方案还可以是从属权利要求或上述实施方案与相应的独立权利要求的任何组合。
本发明的这些和其它方面从下文描述的实施方案将是显而易见的，且参考下文描述的实施方案进行阐明。
附图简述
图1示意性和示例性显示用于对PI3K细胞信号传导途径的转录程序建模的数学模型，本文中，贝叶斯网络模型。
图2显示基于(A.) PI3K细胞信号传导途径的靶基因的证据组织的列表（参见表1）、(B.) PI3K细胞信号传导途径的靶基因的基于数据库的列表（参见表2）和(C.) PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的训练结果。
图3显示基于GSE17907的乳腺（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。
图4显示基于作为GSE8671数据集公开的许多健康结肠样品（第1组）和腺瘤性息肉（第2组）的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。
图5显示基于GSE20916的结肠（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。
图6显示基于GSE17951数据集中公开的前列腺（癌症）细胞的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。
图7说明Kaplan-Meier图中描述的ER+ 乳腺癌患者（GSE6532 & GSE9195）的预后。
图8显示基于PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性线性模型的训练结果。
图9显示基于GSE17907的乳腺（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性线性模型的测试结果。
图10显示基于GSE17951的前列腺（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性线性模型的测试结果。
实施方案的详述
以下实施例仅仅说明具体优选的方法和与其相关的所选方面。其中提供的教导可用于构建几种测试和/或试剂盒，例如用于检测、预测和/或诊断一种或多种细胞信号传导途径的异常活性。此外，使用如本文所述的方法之后，可以有利地指导药物处方，可以进行药物预测和药效（和/或副作用）的监测，可以预测和监测药物抗性，例如选择后续待进行的测试（如伴随诊断测试）。以下实施例不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：数学模型构建
如公开的国际专利申请WO 2013/011479 A2 (“Assessment of cellular signalingpathway activity using probabilistic modeling of target gene expression”)中所详述，通过构建概率模型，例如，贝叶斯网络模型，且引入细胞信号传导途径（本文中，PI3K细胞信号传导途径）的一种或多种靶基因的表达水平和转录因子（TF）元件（本文中，FOXOTF元件，控制细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的转录的TF元件）的水平之间的条件概率关系，此模型可以用于以高精确度测定细胞信号传导途径的活性。此外，通过调节条件概率和/或向模型中添加新的节点来代表额外的信息源，可以容易地升级概率模型来并入通过后期临床研究获得的额外知识。以这种方式，可以适当地升级概率模型来包括最近的医学知识。
在公开的国际专利申请WO 2014/102668 A2 (“Assessment of cellularsignaling pathway activity using linear combination(s) of target geneexpressions”)中所详述的另一个容易理解和解释的方法中，细胞信号传导途径（本文中，PI3K细胞信号传导途径）的活性可以通过构建和评估线性或（假-）线性模型来测定，所述模型引入细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平和转录因子（TF）元件（本文中，FOXO TF元件，控制细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的转录的TF元件）的水平之间的关系，所述模型至少部分基于一种或多种靶基因的表达水平的一种或多种线性组合。
在两种方法中，一种或多种靶基因的表达水平可以优选是mRNA水平的测量，其可以是例如使用与靶基因的mRNA序列相关的探针的（RT）-PCR和微阵列技术以及RNA测序的结果。在另一个实施方案中，一种或多种靶基因的表达水平可以通过蛋白水平，例如由靶基因编码的蛋白的浓度进行测量。
上述表达水平可以任选以可能适合或不适合更好应用的许多方式进行转换。例如，表达水平的四种不同转化，例如，基于微阵列的mRNA水平，可以是：
- “连续数据”，即如使用众所周知的算法诸如MAS5.0和fRMA在微阵列预处理之后获得的表达水平，
- “z得分”，即连续表达水平这样换算，使得跨越所有样品的平均值为0并且标准偏差为1，
- “离散的”，即高于特定阈值的每一个表达设为1，并且低于特定阈值的每一个表达设为0（例如探针组的阈值可以选择为在许多阳性临床样品和相同数目的阴性临床样品的组中的其值的中值），
- “模糊的”，即使用下述形式的S型函数，将连续表达水平转换为0和1之间的值：1/(1+exp((thr–expr)/se))，其中expr是连续表达水平，thr是如先前提及的阈值，并且se是影响0和1之间的差异的软化参数。
可以构建的最简单的线性模型之一是在第一层中具有代表转录因子（TF）元件（本文中，FOXO TF元件）的节点和在第二层中具有代表靶基因表达强度水平的直接测量（例如，通过例如在微阵列或(q)PCR实验中，与特定靶基因特别高度关联的一个探针组）的加权节点的模型。权重可以基于来自训练数据集的计算或基于专业知识。在其中每种靶基因可能测量多重表达水平的情况下（例如在微阵列实验的情况下，其中一种靶基因可以用多重探针组进行测量），使用仅一种表达水平/靶基因的该方法是特别简单的。选择用于特定靶基因的一种表达水平的一种特定方法是使用来自探针组的表达水平，所述探针组能够最佳分开训练数据集的活性和消极样品。测定该探针组的一种方法是执行统计检验，例如t检验，并且选择具有最低p值的探针组。具有最低p值的探针的训练数据集的表达水平通过限定具有（已知）活性和消极样品的表达水平重叠的可能性最小概率的探针。另一种选择方法是基于优势比（odds-ratios）。在此类模型中，对于一种或多种靶基因各自提供一种或多种表达水平，并且一种或多种线性组合包含对于一种或多种靶基因各自包括加权项的线性组合，每个加权项基于对于相应的靶基因提供的一种或多种表达水平的仅一种表达水平。如果如上所述每种靶基因选择仅一种表达水平，则该模型可以被称为“最具判别性的探针组”模型。
作为“最具判别性的探针组”模型的替代物，在其中每种靶基因可能测量多重表达水平的情况下，能够利用每种靶基因提供的所有表达水平。在此类模型中，对于一种或多种靶基因各自提供一种或多种表达水平，并且其中一种或多种线性组合包含对于一种或多种靶基因提供的一种或多种表达水平的所有表达水平的线性组合。换言之，对于一种或多种靶基因各自，对于相应的靶基因提供的一种或多种表达水平各自可以在线性组合中通过其自身（个别）权重进行加权。该变体可以被称为“所有探针组”模型。它具有相对简单同时利用所有提供的表达水平的优点。
如上所述的两个模型的共同之处在于它们可以视为“单层”模型，其中TF元件的水平基于表达水平的线性组合进行计算。
在TF元件（本文中，FOXO TF元件）的水平已通过评估分别模型进行测定之后，测定的TF元件水平可以是有阈值的，以便推断细胞信号传导途径（本文中，PI3K细胞信号传导途径）的活性。计算此类适当阈值的方法是通过比较已知具有消极途径的训练样品和具有活性途径的训练样品的测定的TF元件水平wlc。这样做且还考虑到这些组中的方差的方法通过使用阈值获得
　　　　　　　　　　(1)
其中σ和μ是训练样品的标准偏差和平均值。在仅少数样品在活性和/或消极训练样品中可获得的情况下，可以将假计数加入基于两组方差的平均值计算的方差中：
　　　　　　　　　　（2）
其中v是组方差，并且x是阳性假计数。标准偏差σ接下来可以通过获得方差v的平方根来获得。
为了便于解释，阈值可以从TF元件wlc的测定水平中扣除，导致细胞信号传导途径的活性得分，使得负值对应于阴性细胞信号传导途径，并且正值对应于活性细胞信号传导途径。
作为上述“单层”模型的替代物，在一个实例中也可以使用“双层模型”。在此模型中，对于各靶基因，基于其相关探针组的测量强度，使用线性组合计算概括值（“第一（底）层”）。计算的概括值随后与使用进一步线性组合的细胞信号传导途径的其它靶基因的概括值组合（“第二（顶）层”）。再次，权重可以由训练数据集学习或基于专业知识或其组合。换种说法，在“双层”模型中，对于一种或多种靶基因各自提供一种或多种表达水平，并且一种或多种线性组合对于一种或多种靶基因各自包含对于相应的靶基因提供的一种或多种表达水平的所有表达水平的第一线性组合（“第一（底）层”）。该模型进一步至少部分基于对于一种或多种靶基因各自包括加权项的进一步线性组合，各加权项基于对于相应的靶基因的第一线性组合（“第二（顶）层”）。
在优选形式的“双层”模型中，概括值的计算可以包括使用训练数据对于各靶基因限定阈值，并且从计算的线性组合中减除阈值，获得靶基因概括。此处，可以选择阈值，使得负靶基因概括值对应于下调的靶基因，并且正靶基因概括值对应于上调的靶基因。另外，靶基因概括值在它们合并到“第二（上层）”之前，使用例如上述转化（模糊、离散等）之一进行转化是可能的。接下来，将测定的靶基因概括值求和以得到TF概括水平。
在TF元件的水平已通过评估“双层”模型进行测定之后，测定的TF元件水平可以是有阈值的，以便推断细胞信号传导途径的活性，如上所述。
在下文中，上述模型统称为“（假-）线性模型”。概率模型（例如，贝叶斯网络模型）和（假-）线性模型的训练和使用的更详细描述提供于以下实施例3中。
实施例2：靶基因的选择
转录因子（TF）是蛋白复合物（即，以特定结构结合在一起的蛋白的组合）或蛋白，其能够通过结合特定DNA序列来调节来自靶基因的转录，由此控制从DNA至mRNA遗传信息的转录。由于转录复合物的这种作用直接产生的mRNA在本文中称为（转录因子的）“直接的靶基因”。细胞信号传导途径活化还可以产生更多二级基因转录，称为“间接的靶基因”。在下文中，优选包含直接的靶基因或者由其组成的贝叶斯网络模型（作为示例性数学模型）作为细胞信号传导途径活性和mRNA水平之间的直接联系，然而直接和间接靶基因之间的区别并不总是明显的。本文中，呈现使用基于可获得的科学文献数据的评分函数选择直接靶基因的方法。尽管如此，由于有限的信息以及生物学变异和不确定性，不能排除间接的靶基因的意外选择。为了选择靶基因，目前可用的科学文献的两个储库用于生成靶基因的两个列表。
基于得自美国国立卫生研究所的“www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed”可得且本文中进一步被称为“Pubmed”的MEDLINE数据库的科学文献生成靶基因的第一列表。通过在2013年的第一季度期间使用查询诸如（FOXO AND “靶基因”）搜索含有推测FOXO靶基因的出版物。进一步遵循下面更详细描述的方法手动分析所得出版物。
根据积累证据的科学实验的类型，通过使用其中对于特定靶基因的科学证据给予等级的排序系统，从科学文献中选择特定细胞信号传导途径mRNA靶基因。尽管一些实验证据仅仅暗示基因为靶基因，如例如在其中已知PI3K细胞信号传导轴是有活性的细胞系的微阵列上增加的mRNA，但其它证据可以是非常有力的，如鉴定的细胞信号传导途径TF结合位点和细胞中特定细胞信号传导途径的刺激后染色质免疫沉淀（ChIP）测定中该位点的取回以及细胞系中细胞信号传导途径的特定刺激后mRNA的增加的组合。
可以在科学文献中鉴定用于发现特定细胞信号传导途径靶基因的几种类型的实验：
1. ChIP实验，其中显示了细胞信号传导途径-TF与它在基因组上的结合位点的直接结合。实例：通过使用染色质免疫沉淀（ChIP）技术，随后将具有和不具有活性的PI3K细胞信号传导途径的诱导的细胞系的DNA中的假定的功能FOXO TF转录因子结合位点鉴定为仅基于核苷酸序列识别的结合位点的亚组。将假定的功能性鉴定为来源于ChIP的证据，其证明发现TF结合DNA结合位点。
2. 电泳迁移率变化（EMSA）测定，其显示了TF与含有结合序列的DNA片段的体外结合。相比于基于ChIP的证据，基于EMSA的证据更弱，因为它无法被翻译为体内情形。
3. 细胞信号传导途径的刺激和测量微阵列上的mRNA概况或使用RNA测序，使用细胞信号传导途径诱导的细胞系并测量在存在放线菌酮的情况下诱导后几个时间点测量的mRNA概况，其抑制翻译为蛋白，因此假定诱导的mRNA是直接的靶基因。
4. 与3类似，但使用定量PCR来测量mRNA的量。
5. 使用生物信息学方法鉴定基因组中的TF结合位点。对于FOXO TF元件的实例：使用保守的FOXO结合基序5'-TTGTTTAC-3'，在人基因组序列上运行软件方法，并鉴定基因启动子区中和其它基因组区中潜在的结合位点。
6. 与3类似，仅仅不存在放线菌酮。
7. 与4类似，仅仅不存在放线菌酮。
8. 特定组织或细胞样品的mRNA表达概况，其中已知细胞信号传导途径是有活性的，但在不存在合适的阴性对照条件的情况下。
以最简单的形式，技术人员可以对其中鉴定目标mRNA的这些实验方法的各自给予每一种潜在的目标mRNA 1分。
可选地，能够递增给予分，表示一种技术1分，第二种技术加第二分，等等。使用该相对排序策略，技术人员可以形成最可靠的靶基因的列表。
可选地，可以使用以另一种方式的排序来鉴定最可能是直接的靶基因的靶基因，通过给予提供体内直接靶基因最多证据的技术更高数目的分，在上文的列表中，这将表示对实验方法1）为8分，对2）为7分，并且降低至对实验方法8为1分。此类列表可以被称为“一般靶基因列表”。
尽管存在生物学变异和不确定性，但本发明人假定直接的靶基因最可能以组织不依赖的形式来诱导。这些靶基因的列表可被称为“证据组织的靶基因的列表”。已经使用此类证据组织的靶基因的列表来构建PI3K细胞信号传导途径的计算模型，其可以应用于来自不同组织来源的样品。
以下将示例说明如何针对PI3K细胞信号传导途径具体构建证据组织（evidencecurated）的靶基因列表的选择。
为了选择用作“模型”的输入的PI3K靶基因的目的，使用以下三种标准：
1. 基因启动子/增强子区含有FOXO结合基序：
a. 应该证明FOXO结合响应于PI3K细胞信号传导途径的活性，例如通过其中特定FOXO基序连接报道基因的瞬时转染测定的手段，和
b. FOXO基序的存在应该通过例如基因启动子/增强子区的富含基序分析来证实。
2. 通过例如ChIP/CHIP实验或另一染色质免疫沉淀技术证明FOXO（差异地）体内结合所讨论的基因的启动子/增强子区：
a. 证实当PI3K细胞信号传导途径没有活性时FOXO结合基因的启动子/增强子区，和
b. 当PI3K细胞信号传导途径有活性时，则（优选）不结合（或弱结合）基因的基因启动子/增强子区。
3. 例如通过以下证实当PI3K细胞信号传导途径的活性改变时，该基因差异转录，
a. 通过实时PCR或微阵列实验的所讨论的基因的mRNA的倍数富集，或
b. 通过免疫沉淀测定证实RNA Pol II结合基因的启动子区。
通过将这样的基因定义为PI3K细胞信号传导途径的靶基因来进行选择，对于所述基因集合了足够且充分记载的证明均符合上述所有三个标准的实验证据。收集PI3K差异结合证据的合适实验是比较例如当暴露于或不暴露于他莫西芬时，响应于他莫西芬而表达PI3K细胞信号传导途径的活性的癌细胞系（例如，用他莫西芬可诱导的FOXO构建体（诸如FOXO.A3.ER）转染的细胞系）中的ChIP/CHIP实验的结果。其同样适用于收集mRNA转录的证据。
上文讨论了靶基因选择程序的一般方法和更具体的实例，其已用于基于使用上述方法发现的证据来选择许多靶基因。在对PI3K细胞信号传导途径的贝叶斯网络模型中使用的靶基因列表显示于表1中。
表 1：贝叶斯网络模型中使用的PI3K细胞信号传导途径的靶基因和用于测量靶基因的mRNA表达水平的相关探针组的证据组织的列表。
使用Thomson-Reuters的Metacore（最后访问：2013年5月14日）中提供的科学出版物的手动组织的数据库生成靶基因的第二个列表。针对人FOXO转录因子（即FOXO1、FOXO3A、FOXO4和FOXO6）的家族直接下游转录调节的基因查询数据库。该查询产生336种假定FOXO靶基因，其如下进一步分析。首先删除只有一个支持出版物的所有假定FOXO靶基因。接下来，引入评分函数，其对于出版物中报道的每种类型的实验证据（诸如ChIP、EMSA、差异表达、敲低/敲除、荧光素酶基因报道测定、序列分析）给出分。相同的实验证据有时在多个出版物中提到，其产生相应数量的分，例如，两个出版物提到ChIP发现导致针对单一ChIP发现的两倍的得分。进行进一步分析以仅允许具有不同类型的实验证据、而不仅仅一种类型的实验证据（例如，差异表达）的基因。最后，针对所有推定FOXO靶基因计算证据得分，并且选择具有6或更多的证据得分的所有推定FOXO靶基因（表2中显示）。启发性地选择6的截止水平，因为先前显示约30种靶基因在很大程度上足以测定途径活性。
这些靶基因的列表可以被称为“靶基因的基于数据库的列表”。此类组织的靶基因列表已被用于构建计算模型，所述计算模型可以应用于来自不同的组织来源的样品。
表 2：贝叶斯网络模型中使用的PI3K细胞信号传导途径的靶基因和用于测量靶基因的mRNA表达水平的相关探针组的基于数据库的列表。
基于上述两个列表（即，证据组织的列表（参见表1）和基于数据库的列表（参见表2））生成靶基因的第三个列表。三个标准已用于从这两个列表进一步选择基因。第一个标准与归因于靶基因的功能相关。归因于基因的功能可以在科学文献中找到，但经常可得于公共数据库，诸如NIH的OMIM数据库（经由“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim”可得）。在第三个列表中选择来自表1中的证据组织的列表和表2中的基于数据库的列表的靶基因，发现所述靶基因归因于参与对于癌症必不可少的过程，诸如细胞凋亡、细胞周期、抑制肿瘤/进展、DNA修复、分化。最后，选择被发现在细胞系实验中具有高差异表达的靶基因，其与已知的低PI3K/高FOXO活性相比具有已知的高PI3K/低FOXO活性。本文中，第三个列表中包括在经多个样品平均的FOXO转录的“开”和“关”状态之间具有20.5的最小表达差异（本文中：关于探针组水平）的靶基因。第三个标准专门目的在于选择最具判别性的靶基因。基于用具有已知高PI3K/低FOXO活性的多个样品和具有已知低PI3K/高FOXO活性的多个样品的细胞系实验中的表达水平，计算优势比（odds ratio，OR）。本文中，在测量中使用中值作为截止值和代表不确定性的软边界计算每种探针的优势比。根据“软”优势比将来自证据组织的列表和基于数据库的列表的靶基因进行排序，且对于靶基因的第三个列表选择排序最高（OR > 2）和排序最低（OR < 1/2，即，阴性调节的靶基因）。
考虑基因的功能、“开(on)”相比于“关(off)”信号传导的差异表达和更高的优势比，发现靶基因组（表3中显示），所述靶基因组被认为在测定PI3K信号传导途径的活性中更有证明性。靶基因的此类列表也可以被称为“靶基因的短列表”。因此，根据本发明特别优选表3中报道的靶基因。尽管如此，鉴于用获取技术诸如微阵列可以获得大量组基因的表达水平的相对容易，考虑利用表3的靶基因的一些或全部，并且任选额外使用表1和表2的剩余靶基因的一个、两个、一些或全部。
表 3：基于靶基因的证据组织的列表和靶基因的基于数据库的列表的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表。
实施例3：训练和使用数学模型
数学模型可用于推断细胞信号传导途径（本文中，医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径）的活性之前，必须适当训练该模型。
如果所述数学模型是概率模型，例如，贝叶斯网络模型，其至少部分基于将FOXOTF元件和医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平关联的条件概率，所述训练可优选如公开的国际专利申请WO 2013/011479 A2 (“Assessment of cellular signaling pathway activity usingprobabilistic modeling of target gene expression”)中详细描述进行。
如果所述数学模型至少部分基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平的一种或多种线性组合，所述训练可优选如公开的国际专利申请WO 2014/102668 A2 （“Assessment ofcellular signaling pathway activity using linear combination（s） of targetgene expressions”）中详细描述进行。
a）示例性贝叶斯网络模型
本文中，如图1中所示的示例性贝叶斯网络模型首先用于以简单的方式对PI3K细胞信号传导途径的转录程序建模。所述模型由三种类型的节点组成：（a） 第一层1中的转录因子（TF）元件；（b） 第二层2和第三层3中的靶基因TG1、TG2、TGn；（c） 与靶基因的表达水平连接的测量节点。这些可以是微阵列探针组PS1a、PS1b、PS1c、PS2a、PSna、PSnb，如本文优选使用，但也可以是其它基因表达测量，诸如RNAseq或RT-qPCR。
数学模型（本文中，示例性贝叶斯网络模型）的合适实施基于微阵列数据。该模型描述（i）靶基因的表达水平如何取决于TF元件的活化，和（ii）探针组强度进而如何取决于相应靶基因的表达水平。对于后者，探针组强度可以取自fRMA加工前的Affymetrix HG-U133Plus2.0微阵列，这广泛可得自Gene Expression Omnibus (GEO,www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)和ArrayExpress (www. ebi.ac.uk/arrayexpress)。
由于示例性贝叶斯网络模型是细胞信号传导途径（本文中，PI3K细胞信号传导途径）的生物学的简化，且由于生物学测量通常有噪音，选择概率方法，即，以概率术语描述（i）TF元件和靶基因和（ii）靶基因和它们各自的探针组之间的关系。此外，假设驱动肿瘤生长的致癌细胞信号传导途径的活性没有瞬时和动态改变，但长期或甚至不可逆改变。因此，开发示例性贝叶斯网络模型用于解释静态细胞状态。由于该原因，没有将复杂动态细胞信号传导途径特征并入模型。
一旦建立和校准示例性贝叶斯网络模型（参见下文），该模型可以通过输入探针组测量值作为第三层3中的观察值且在模型中回推对于TF元件必须“存在”何种概率而用于新样品的微阵列数据上。此处，“存在”被认为是TF元件结合至DNA且控制细胞信号传导途径的靶基因的转录的现象，且“不存在”被认为是TF元件不控制转录的情况。该后者可能性因此是可用于指示细胞信号传导途径（本文中，PI3K细胞信号传导途径）的活性的初始读出值，其接下来可以通过取有活性相比于无活性的概率的比率而转化为细胞信号传导途径有活性的几率（即，如果p是细胞信号传导途径有活性的预测概率，几率以p/(1-p)给出）。
在示例性贝叶斯网络模型中，已经使概率关系为定量的，以允许定量概率推理。为了改善组织类型间的概况行为，已经小心精选描述（i）TF元件和靶基因之间的概率关系的参数。如果TF元件为“不存在”，最可能靶基因是“下”，因此对此选择0.95的概率，并且对为“上”的靶基因选择0.05的概率。后者（非零）概率解释靶基因受其它因子调节或意外地观察为“上”（例如由于测量噪音）的（罕见）概率。如果TF元件“存在”，则靶基因以0.70的概率被认为“上”，并且靶基因以0.30的概率被认为“下”。以这种方式选择后者值，因为可以存在即使TF元件存在靶基因也并未高度表达（例如因为基因启动子区被甲基化）的几种原因。在靶基因并未由TF元件上调但却下调的情况下，以相似的方式选择概率，但反映存在TF元件的情况下的下调。已经对实验数据校准描述（ii）靶基因和它们各自的探针组之间的关系的参数。对于后者，在本实施例中，使用来自具有定义的活性和无活性的途径设置的细胞系实验的微阵列数据，但这也可以使用已知的细胞信号传导途径活性状态的患者样品来进行。
本文中，关于具有FOXO构建体的稳定转染的HUVEC细胞系的表达的公开可得的数据用作实例，所述FOXO构建体在用4OHT （得自Gene Expression Omnibus的GSE16573）刺激之后可诱导。用4OHT刺激12小时的具有可诱导的FOXO构建体的细胞系被认为是FOXO活性样品（n = 3），而消极FOXO样品是具有所述构建体且无4OHT刺激的细胞系（n = 3）。
图2显示基于(A.) PI3K细胞信号传导途径的靶基因的证据组织的列表（参见表1）、(B.) PI3K细胞信号传导途径的靶基因的基于数据库的列表（参见表2）和(C.) PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的训练结果。在该图中，纵轴表明FOXO TF元件是“存在”或“不存在”的可能性，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性，其中横轴以上的值对应于FOXO TF元件更可能“存在”/有活性，且横轴以下的值表明FOXO TF元件“不存在”/无活性的可能性大于其“存在”/有活性的可能性。
涵盖没有用他莫昔芬刺激且因此FOXO无活性的细胞系的三个样品的第三组3被指定为消极FOXO标记，而涵盖用4OHT刺激、因此FOXO无活性的样品的第四组4被指定为活性标记。在相同数据集中，第一、第二和第五组1、2、5被正确地预测具有消极PI3K细胞信号传导途径。最后一组6由用预期针对4OHT刺激不敏感的FOXO的突变变体转染的细胞系组成。然而，在第二模型（B.）和第三模型（C.）中发现一些活性。基于PI3K细胞信号传导途径的靶基因的证据组织的列表的模型正确地预测PI3K细胞信号传导途径在最后一组6中是消极的，而其它两个列表以相对低的概率预测其有活性。（图注：1 –用空载体感染的原代HUVEC；2 –用空载体 + 用OHT刺激12h的原代HUVEC；3 –用FOXO.A3.ER载体感染的原代HUVEC；4 –用FOXO.A3.ER载体 + 用OHT刺激12h的原代HUVEC；5 –用FOXO.A3.ER. H212R载体感染的原代HUVEC，6 –用FOXO.A3.ER.H212R载体+ 用OHT刺激12h的原代HUVEC）。
在下文中，图3至6中显示示例性贝叶斯网络模型的测试结果。
图3显示基于GSE17907的乳腺（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。在该图中，纵轴表明FOXO TF元件是“存在”或“不存在”的可能性，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性，其中横轴以上的值对应于FOXO TF元件更可能“存在”/有活性，且横轴以下的值表明FOXO TF元件“不存在”/无活性的可能性大于其“存在”/有活性的可能性。该模型正确地预测正常乳腺样品（第5组）中的活性FOXO TF元件，如从文献已知。预测具有消极FOXO TF元件的大多数样品发现于ERBB2/HER2亚组（第3组），这不是出乎意料的，因为编码HER2的ERBB2基因的过度扩增与PI3K细胞信号传导途径的活性在科学上关联，因此，FOXO易位出核，导致FOXO-调节的转录的抑制。具有分子亚型基础的乳腺癌样品（第2组），如预期，预测具有无活性的FOXO TF元件，因为已知基底乳腺癌通常缺乏HER2表达，因此不可能具有活性的PI3K细胞信号传导途径。（图注：1 –未知的，2 –基底，3 – ERBB2/HER2，4 –管腔A，5 –正常乳腺，6 –正常类似物）。
图4显示基于作为GSE8671数据集公开的许多健康结肠样品（第1组）和腺瘤性息肉（第2组）的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。在该图中，纵轴表明FOXO TF元件是“存在”或“不存在”的可能性，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性，其中横轴以上的值对应于FOXO TF元件更可能“存在”/有活性，且横轴以下的值表明FOXO TF元件“不存在”/无活性的可能性大于其“存在”/有活性的可能性。该模型正确地预测正常样品（第1组）中的活性PI3K细胞信号传导途径，其中预期所述PI3K细胞信号传导途径正常工作。关于腺瘤性息肉（第2组），从文献已知它们由于其中的突变而表达PI3K细胞信号传导途径的增加活性。Philips和同事已经显示，在他们的研究中，多达86％的结肠直肠肿瘤具有PI3K细胞信号传导途径的增加活性（WayneA. Philips, 等人, “Increased levels of phosphatidylinositol 3-kinase activityin colorectal tumors”, Cancer, Vol. 83, No. 1, July 1998, 第41至47页）。除了三个以外的所有腺瘤样品被该模型预测为是FOXO消极的，因此，是PI3K活性的，这很好地与文献中发现的数量相关。（图注：1 –正常，2 –腺瘤）。
图5显示基于GSE20916的结肠（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。在该图中，纵轴表明FOXO TF元件是“存在”或“不存在”的可能性，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性，其中横轴以上的值对应于FOXO TF元件更可能“存在”/有活性，且横轴以下的值表明FOXO TF元件“不存在”/无活性的可能性大于其“存在”/有活性的可能性。该模型再次正确地预测正常样品具有活性的FOXO TF元件（第1和3组），除了隐窝上皮细胞的显微切割样品（第2组），这可能由于其连续的增殖和更干细胞样的行为而具有活性的PI3K细胞信号传导途径和消极的FOXO TF元件（Patrick Laprise, 等人, “Phosphatidylinositol 3-kinase controlshuman intestinal epithelial cell differentiation by promoting adherensjunction assembly and p38 MAPK activation”, Journal of Biological Chemistry,Vol. 277, No. 10, March 2002, 第8226至8234页）。不令人惊讶地，在癌组织（腺瘤和癌；第8至11组）中发现其它FOXO消极样品。（图注：1 –正常结肠（粘膜），2 –正常结肠（隐窝），3–正常结肠（手术），4 –远端正常结肠（粘膜），5 –远端正常结肠（隐窝），6 –腺瘤（粘膜），7 –腺瘤（隐窝），8 –腺癌（手术），9 –癌（粘膜），10 –癌（隐窝），11 –癌（手术））。
图6显示基于GSE17951数据集中公开的前列腺（癌）细胞的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性贝叶斯网络模型的测试结果。在该图中，纵轴表明FOXO TF元件是“存在”或“不存在”的可能性，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性，其中横轴以上的值对应于FOXO TF元件更可能“存在”/有活性，且横轴以下的值表明FOXO TF元件“不存在”/无活性的可能性大于其“存在”/有活性的可能性。对照组（第2组）的所有正常细胞被预测为具有活性的FOXO TF元件，而肿瘤组（第3组）和活检组（第1组）中的小部分样品被预测为具有沉默的FOXO转录。在文献中，报道了前列腺癌中的PI3K细胞信号传导途径的活性（例如，Mari Kaarbø, 等人, “PI3K-AKT-mTOR pathway is dominantover androgen receptor signaling in prostate cancer cells”, CellularOncology, Vol. 32, No. 1-2, 2010, 第11至27页）。（图注：1 –活检，2 –对照，3 –肿瘤）。
图7说明Kaplan-Meier图中描述的ER+ 乳腺癌患者（GSE6532 & GSE9195）的预后。在该图中，纵轴表明作为患者组的分数的无复发存活率，横轴表明以年计的时间。该图表明活性的FOXO TF元件（由与在该图的右侧上的其它曲线上方终止的曲线相比不那么陡的曲线的斜率所示）（其与消极的PI3K细胞信号传导途径相关）对于复发是保护性的，而具有消极的FOXO TF元件，因此，异常活性的PI3K细胞信号传导途径与复发的高风险相关。（具有预测的活性的FOXO TF元件的患者组由114个患者组成，而具有预测的消极的FOXO TF元件的患者组由50个患者组成）。FOXO转录活性的预测概率的风险比中也证明了该结果（使用基于PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的FOXO活性的概率作为预测物）：0.45（95% CI：0.20 – 1.0，p < 0.03）。
b）示例性（假-）线性模型
在如本文示例性描述的（假-）线性模型可以用于推断测试样品中的途径活性之前，需要测定指示结点和调用结点“不存在”或“存在”的阈值之间的关联的符号和量级的权重。可以使用专业知识先验地填充权重和阈值，但通常模型使用训练样品的代表性组进行训练，其中优选地基础事实是已知的。例如具有已知存在转录因子复合物（=活性途径）或不存在转录因子复合物（=消极途径）的样品中的探针组的表达数据。然而，从许多不同种类癌症中获得训练样品是不实际的，在所述癌症中已知待建模途径的活化状态是何种。因此，可用的训练集由通常仅来自一类癌症的有限数目的样品组成。在本文中，方法描述为测定将测试样品分类为具有活性或消极途径所需的参数。
本领域已知考虑模型拓扑学且改变模型参数（此处权重和阈值）的训练算法（例如回归）的量级，使得模型输出（此处加权的线性得分）得到优化。在本文中我们证实两种示例性方法，其可以用于直接由表达水平计算权重，而无需优化算法。
在此处定义为“黑和白”方法的第一种方法归结为三元系统，其中加权因子是{-1，0，1}的元件。如果我们将这放入生物学背景下，则-1和1对应于在PI3K细胞信号传导途径活性的情况下分别下调和上调的基因或探针。在探针或基因不能统计上证明为上调或下调的情况下，它收到0的权重。此处，技术人员可以使用活性PI3K细胞信号传导途径样品的表达水平相比于具有消极PI3K细胞信号传导途径的样品的表达水平的左侧和右侧，两样品t检验，以测定探针或基因是上调还是下调，这考虑到使用的训练数据。在其中活性样品的平均值统计上大于消极样品（即p值低于一定阈值，例如0.3）的情况下，探针组或靶基因被确定为上调的。相反，在其中活性样品的平均值统计上低于消极样品的情况下，该探针组或靶基因被确定为在PI3K细胞信号传导途径活化后是下调的。在最低p值（左侧或右侧）超过上述阈值的情况下，该探针或基因的权重可以被定义为0。
取得权重和阈值的替代方法基于优势比的算法（例如基础e），并且因此称为“优势比”权重。基于探针/基因水平高于和低于相应阈值的阳性和阴性训练样品数目，所述阈值例如所有训练样品的中值，计算关于每种探针或基因的优势比（WO 2014/102668 A2中的等式3）。可以加入假计数，以避免除以零（WO 2014/102668 A2中的等式4）。进一步的精化是通过下述以略微更随机的方式计数高于/低于阈值的样品：假定探针/基因水平例如以某一指定的标准偏差（例如在2-log尺度上0.25）在其观察值周围正态分布，并且计数高于和低于阈值的概率质量（WO 2014/102668 A2中的等式5）。
可选地，技术人员可以采用本领域已知的优化算法诸如回归，以测定本文描述的（假-）线性模型的权重和阈值。
技术人员必须特别注意对于（假-）线性模型测定参数以良好概括的方式。或者，技术人员可以使用本领域已知能够通过在训练程序期间取得专门量度来相当良好地概括的其它机器学习方法诸如贝叶斯网络。
关于图8，使用来自PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表的所有靶基因（参见表3）和分别第一和第二层上这些靶基因的所有探针组的PI3K细胞信号传导途径的示例性“双层”（假-）线性模型使用关于具有FOXO构建体（所述FOXO构建体在用4OHT （得自GeneExpression Omnibus的GSE16573）刺激之后可诱导）的稳定转染的HUVEC细胞系的表达的连续数据来训练（还参见上述关于示范性贝叶斯网络模型的描述）。用4OHT刺激12小时的具有可诱导的FOXO构建体的细胞系被认为FOXO活性样品（n = 3），而消极FOXO样品是具有所述构建体且无4OHT刺激的细胞系（n = 3）。训练涵盖计算靶基因表达水平（此处借助于探针组强度表示）和使用如本文描述的“优势比”方法（假计数为10）的靶基因结点之间的连接的权重。随后，FOXO TF元件的活性得分通过对于上调或下调靶基因分别乘以1或-1的计算的靶基因表达得分的总和进行计算。
在图8中显示的图中，纵轴显示加权的线性得分，其中正值或负值表明FOXO TF元件“存在”或“不存在”，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性。涵盖没有用他莫昔芬刺激且因此FOXO无活性的细胞系的三个样品的第三组3被指定为消极FOXO标记，而涵盖用4OHT刺激、因此FOXO无活性的样品的第四组4被指定为活性标记。在相同数据集中，第一、第二和第五组1、2、5被正确地预测具有消极PI3K细胞信号传导途径。最后一组6由用预期针对4OHT刺激不敏感的FOXO的突变变体转染的细胞系组成。然而，在使用训练的（假-）线性模型的第六组中也发现一些活性。（图注：1 –用空载体感染的原代HUVEC，2 –用空载体+ 用OHT刺激12h的原代HUVEC，3 –用FOXO.A3.ER载体感染的原代HUVEC，4 –用FOXO.A3.ER载体 + 用OHT刺激12h的原代HUVEC，5 –用FOXO.A3.ER. H212R载体感染的原代HUVEC，6 –用FOXO.A3.ER.H212R载体 + 用OHT刺激12h的原代HUVEC）。
在下文中，图9和10中显示示例性（假-）线性模型的测试结果。
图9显示基于GSE17907的乳腺（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性（假-）线性模型的测试结果。在该图中，纵轴表明FOXO TF元件是“存在”或“不存在”的得分，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性，其中横轴以上的值对应于FOXO TF元件更可能“存在”/有活性，且横轴以下的值表明FOXO TF元件“不存在”/无活性的可能性大于其“存在”/有活性的可能性。该模型正确地预测正常乳腺样品（第5组）中的活性FOXO TF元件，如从文献已知。预测具有消极FOXO TF元件的大多数样品发现于ERBB2/HER2组（第3组），这不是出乎意料的，因为编码HER2的ERBB2基因的过度扩增与PI3K细胞信号传导途径的活性在科学上关联，因此，FOXO易位出核，导致FOXO-调节的转录的抑制。（图注：1 –未知的，2 –基底的，3 – ERBB2/HER2，4 –管腔A，5 –正常乳腺，6 –正常类似物）。
图10显示基于GSE17951的前列腺（癌症）样品的PI3K细胞信号传导途径的靶基因的短列表（参见表3）的示例性（假-）线性模型的测试结果。在该图中，纵轴表明FOXO TF元件是“存在”或“不存在”的得分，其对应于PI3K细胞信号传导途径为无活性或有活性，其中横轴以上的值对应于FOXO TF元件更可能“存在”/有活性，且横轴以下的值表明FOXO TF元件“不存在”/无活性的可能性大于其“存在”/有活性的可能性。对照组（第2组）的所有正常细胞被预测为具有活性的FOXO TF元件，而肿瘤组（第3组）中的小部分样品和活检组（第1组）中的更大部分样品被预测为具有沉默的FOXO转录，这对应于PI3K细胞信号传导途径的增加活性。在文献中，报道了前列腺癌中的PI3K细胞信号传导途径的活性（例如，Mari Kaarbø,等人, “PI3K-AKT-mTOR pathway is dominant over androgen receptor signaling inprostate cancer cells”, Cellular Oncology, Vol. 32, No. 1-2, 2010, pages 11to 27），这在这些结果中得到证实。（图注：1 –活检，2 –对照，3 –肿瘤）。
开发进行样品测量的专用测定，例如在使用qPCR来测定靶基因的mRNA水平的整合平台上而非应用数学模型（例如，示例性贝叶斯网络模型或（假-）线性模型）到来自微阵列或RNA测序的mRNA输入数据在临床应用中可能是有利的。然后可以将公开的靶基因的RNA/DNA序列用于确定在此类平台上选择何种引物和探针。
此类专用测定的确认可以通过使用基于微阵列的数学模型作为参考模型并且验证所开发的测定在一组确认样品上是否产生相似结果来完成。除专用测定外，还可以使用mRNA测序数据作为输入测量建立并校正类似的数学模型来完成这一点。
基于微阵列/RNA测序的基于使用数学模型（例如，示例性贝叶斯网络模型或（假-）线性模型）的调查所发现的最佳指示具体的途径活性的靶基因的组能够转变为在医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品上进行的多元定量PCR测定和/或解释表达测量和/或推断PI3K细胞信号传导途径的活性的计算机。为了针对细胞信号传导途径活性开发此类测试（例如，中央服务实验室中的FDA许可或CLIA遗弃的测试），需要开发标准化测试试剂盒，其需要在临床试验中临床验证以获得监管许可。
本发明涉及一种方法，所述方法包括至少基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平推断医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性。本发明还涉及一种装置，所述装置包含经配置以执行此方法的数字处理器、存储可由数字处理设备执行以执行此方法的指令的非临时性存储介质和包含用于引起数字处理设备以执行此方法的程序代码装置的计算机程序。
所述方法可以用于，例如，诊断PI3K细胞信号传导途径的（异常）活性，基于PI3K细胞信号传导途径的推断活性的预后，基于PI3K细胞信号传导途径的推断活性在临床试验中登记医学主体，选择待进行的随后测试，选择伴随诊断测试，临床决策支持系统等中。在这方面，参考公开的国际专利申请WO 2013/011479 A2 （“Assessment of cellularsignaling pathway activity using probabilistic modeling of target geneexpression”）和公开的国际专利申请WO 2014/102668 A2 （“Assessment of cellularsignaling pathway activity using linear combination（s） of target geneexpressions”），其更详细地描述这些应用。
序列表：
Seq. No.： 基因：
Seq. 1 AGRP
Seq. 2 ATG14
Seq. 3 ATP8A1
Seq. 4 BCL2L11
Seq. 5 BCL6
Seq. 6 BIRC5
Seq. 7 BNIP3
Seq. 8 BTG1
Seq. 9 C10orf10
Seq. 10 CAT
Seq. 11 CAV1
Seq. 12 CBLB
Seq. 13 CCND1
Seq. 14 CCND2
Seq. 15 CCNG2
Seq. 16 CDKN1A
Seq. 17 CDKN1B
Seq. 18 DDB1
Seq. 19 DYRK2
Seq. 20 ERBB3
Seq. 21 EREG
Seq. 22 ESR1
Seq. 23 EXT1
Seq. 24 FASLG
Seq. 25 FBXO32
Seq. 26 FGFR2
Seq. 27 GADD45A
Seq. 28 IGF1R
Seq. 29 IGFBP1
Seq. 30 IGFBP3
Seq. 31 INSR
Seq. 32 KLF2
Seq. 33 KLF4
Seq. 34 LGMN
Seq. 35 MXI1
Seq. 36 MYOD1
Seq. 37 NOS3
Seq. 38 PCK1
Seq. 39 PDK4
Seq. 40 POMC
Seq. 41 PPARGC1A
Seq. 42 PPM1D
Seq. 43 PRDX3
Seq. 44 RAG1
Seq. 45 RAG2
Seq. 46 RBL2
Seq. 47 SEMA3C
Seq. 48 SEPP1
Seq. 49 SESN1
Seq. 50 SIRT1
Seq. 51 SLC5A3
Seq. 52 SMAD4
Seq. 53 SOD2
Seq. 54 STK11
Seq. 55 TLE4
Seq. 56 TNFSF10
Seq. 57 TXNIP

Claims (15)

1.一种方法，其包括：
至少基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平推断所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性，其中所述推断包括：
测定所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中的FOXO转录因子（TF）元件的水平，所述FOXO TF元件控制PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的转录，所述测定至少部分基于评估将PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平与FOXOTF元件的水平关联的数学模型；
基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中的FOXO TF元件的测定水平推断所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性，
其中所述推断通过使用所述数学模型的数字处理设备来执行。
2.权利要求1的方法，其中所述推断包括：
至少基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种、优选至少三种靶基因的表达水平推断所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性，所述靶基因选自：AGRP、BCL2L11、BCL6、BNIP3、BTG1、CAT、CAV1、CCND1、CCND2、CCNG2、CDKN1A、CDKN1B、ESR1、FASLG、FBXO32、GADD45A、INSR、MXI1、NOS3、PCK1、POMC、PPARGC1A、PRDX3、RBL2、SOD2 和TNFSF10。
3.权利要求2的方法，其中所述推断还基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的至少一种靶基因的表达水平，所述靶基因选自：ATP8A1、C10orf10、CBLB、DDB1、DYRK2、ERBB3、EREG、EXT1、FGFR2、IGF1R、IGFBP1、IGFBP3、LGMN、PPM1D、SEMA3C、SEPP1、SESN1、SLC5A3、SMAD4 和TLE4。
4.权利要求2的方法，其中所述推断还基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的至少一种靶基因的表达水平，所述靶基因选自：ATG14、BIRC5、IGFBP1、KLF2、KLF4、MYOD1、PDK4、RAG1、RAG2、SESN1、SIRT1、STK11 和TXNIP。
5.权利要求1的方法，其还包括：
基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性确定PI3K细胞信号传导途径在所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中是否异常运行。
6.权利要求5的方法，其还包括：
为所述医学主体推荐开药，所述药物校正PI3K细胞信号传导途径的异常运行；
其中只有当基于PI3K细胞信号传导途径的推断活性确定PI3K细胞信号传导途径在所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中异常运行时才进行所述推荐。
7.权利要求1的方法，其中所述方法用于以下活动中的至少一种中：
基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性的诊断；
基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性的预后；
基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性的药物处方；
基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性预测药效；
基于医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性预测副作用；
药效的监测；
药物开发；
测定开发；
途径研究；
癌分期；
基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的推断活性在临床试验中登记所述医学主体；
待进行的后续测试的选择；和
伴随诊断测试的选择。
8.权利要求1的方法，其中所述推断包括：
至少基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的靶基因组中的两种、三种或更多种靶基因的表达水平推断所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液中的PI3K细胞信号传导途径的活性。
9.权利要求8的方法，其中
所述PI3K细胞信号传导途径的靶基因组包括选自以下的至少九种、优选所有靶基因：AGRP、BCL2L11、BCL6、BNIP3、BTG1、CAT、CAV1、CCND1、CCND2、CCNG2、CDKN1A、CDKN1B、ESR1、FASLG、FBXO32、GADD45A、INSR、MXI1、NOS3、PCK1、POMC、PPARGC1A、PRDX3、RBL2、SOD2 和TNFSF10。
10.权利要求9的方法，其中
所述PI3K细胞信号传导途径的靶基因组还包括选自以下的至少一种靶基因：ATP8A1、C10orf10、CBLB、DDB1、DYRK2、ERBB3、EREG、EXT1、FGFR2、IGF1R、IGFBP1、IGFBP3、LGMN、PPM1D、SEMA3C、SEPP1、SESN1、SLC5A3、SMAD4 和TLE4。
11.权利要求9的方法，其中
所述PI3K细胞信号传导途径的靶基因组还包括选自以下的至少一种靶基因：ATG14、BIRC5、IGFBP1、KLF2、KLF4、MYOD1、PDK4、RAG1、RAG2、SESN1、SIRT1、STK11 和TXNIP。
12.权利要求1的方法，其中所述数学模型是概率模型，优选贝叶斯网络模型，其至少部分基于将FOXO TF元件和所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平关联的条件概率，或者其中所述数学模型至少部分基于所述医学主体的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的PI3K细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平的一种或多种线性组合。
13.一种装置，其包含经配置以执行权利要求1的方法的数字处理器。
14.非临时性存储介质，其存储可由数字处理设备执行以执行权利要求1的方法的指令。
15.计算机程序，其包含用于引起数字处理设备执行权利要求1的方法的程序代码装置。
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