KR20100075452A - 전립선암 치료 및 진단의 표적 유전자로서의 pkib 및 naaladl2 - Google Patents

전립선암 치료 및 진단의 표적 유전자로서의 pkib 및 naaladl2 Download PDF

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유스케 나카무라
히데와키 나카가와
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 정상의 기관들에 비해 PKIB 또는 NAALADL2의 과발현을 검출함으로써 전립선암 특히, 호르몬-불감성 전립선암(HRPC) 또는 거세-저항성 전립선암(CRPC)을 검출하는 방법을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 전립선암에서 PKIB 또는 NAALADL2의 과발현, PKIB 또는 NAALADL2의 세포 증식 기능, PKIB 또는 NAALADL2의 세포내 국소화 또는 PKIB 와 PKA-C 간의 상호작용에 근거하여, HRPC를 포함하는 전립선암 치료 및 예방용 화합물 확인 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 대한 이중 가닥 분자를 투여함으로써 전립선암을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 유용한 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물뿐만 아니라, 그것들을 암호화하는 이중 가닥 분자와 벡터를 포함하는 물(物)을 제공한다.

Description

전립선암 치료 및 진단의 표적 유전자로서의 PKIB 및 NAALADL2{PKIB AND NAALADL2 FOR TARGET GENES OF PROSTATE CANCER THERAPY AND DIAGNOSIS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2007년 8월 24일에 출원된 미국 가 특허 출원 제 60/957,853호 및 2008년 3월 12일에 출원된 미국 가 특허 출원 제 61/036,030호의 우선권을 주장한다. 이에 의하여 상기 가 출원의 전체 내용은 모든 목적을 위하여 참조에 의해 본 명세서에 통합된다.
기술 분야
본 발명은 생물 과학 분야에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 암 진단 및 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전립선암을 치료 및 예방하기 위한 방법뿐만 아니라 전립선암을 검출 및 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전립선암을 예방하기 위한 물질을 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.
전립선암(prostate cancer, PC)은 남성에게 가장 흔한 악성 종양이고, 미국과 유럽에서 암-관련 사망의 두 번째 원인이다(GronbergH, Lancet 2003361:859-64.). 서구 스타일 식단의 보급과 노령 인구의 급증으로 인해, 전립선암(PC)의 발병률은 대부분의 선진국들에서 현저하게 증가해 왔다(Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64. and Hsing AW etal ., Epidemiol Rev 200123:3-13.). 혈청을 이용한 전립선-특이적 항원(Prostate-specific antigen, PSA)을 스크리닝하는 것은 PC의 조기 발견의 현저한 향상을 가져왔고, 수술과 방사선 치료에 의해 치유될 수 있는 국소화된 질병을 가진 환자 비율의 증가를 가져왔다(Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64. and Hsing AW etal ., Epidemiol Rev 200123:3-13.). 그러나, 이러한 PC 환자의 20-30%는 여전히 병의 재발을 겪고 있다(Feldman BJ etal ., Nat Rev Cancer 20011:34-45. and Han M etal ., J Urol 2001166:416-9.).
안드로겐(androgen)/안드로겐 수용체(androgen receptor, AR) 신호 경로는 PC 발달 및 진행에 있어 중심적인 역할을 수행하고, PC 성장(growth)은 보통 상대적으로 초기 단계에서는 안드로겐-의존적이다(Feldman BJ etal ., Nat Rev Cancer 20011:34-45. and Han M etal ., J Urol 2001166:416-9.). 따라서, 재발 또는 진행된 병을 지닌 대부분의 환자들은, 수술이나 의학적 거세에 의해 고환의 안드로겐 생산을 저해하는 안드로겐-제거 치료에 잘 반응한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 환자들은 결국 호르몬-불감성 전립선암(hormone-refractory prostate cancers, HRPCs)이라 불리는 안드로겐-독립적이고 더 공격적인 표현형을 얻게된다. 그렇지 않다 하더라도, 그들은 결국 안드로겐-제거 치료(거세)에 내성이 생기고, 기본적으로 치명적인 질병인 거세-저항성 전립선암(castration-resistant prostate cancers, CRPCs)이라 불리는 더 공격적인 표현형들을 얻게될 수 있다(Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61.). 최근에 도세탁셀(docetaxel)과 프레드니손(prednisone)의 조합이 호르몬-저항성 PC 환자들의 호전을 위한 새로운 모범안으로 제시되었으나(Tannock IF etal ., N Engl J Med 2004351:1502-12.), 그것들이 치료법을 제시하지는 못하고 HRPC 환자의 생존에 있어 그것들의 이점은 매우 제한적이다. 따라서, 현재 많은 그룹들이 HRPC의 성장에 기여하는 새로운 분자 표적이나 신호 경로를 규명하기 위해 다양한 접근을 시도하고 있다(Scher HI et al ., J Clin Onco l200523:8253-61.).
거세-저항성 진행의 기작은 AR과 관련된 것 및 AR을 우회하거나 AR과 독립적인 것의 2가지 경로로 나누어질 것으로 추정된다. 그것들은 상호 배타적이지 않고, 빈번하게 CRPC 세포에서 공존한다(Feldman BJ, Feldman D. Nat Rev Cancer 2001 1:34-45, Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61.). CRPC 세포들에서는 많은 AR-우회적 또는 독립적 경로들이 활성화되는 것으로 보고되는데, 이는 그것들의 더 암적이고 공격적인 표현형에 기여할 수 있다. Her-2/neu와 IL-6/STAT3와 같은 독립적 경로와 AR 경로 사이에 혼선(cross-talk)이 발생할 수도 있다(Feldman BJ, Feldman D. Nat Rev Cancer 2001 1:34-45, Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61, Grossmann ME, et al. JNCI 2001 93:1687-97, Yang L, et al. BBRC 2003 305: 462-469.).
독립적 경로들 중에, PTEN-PI3K-Akt 경로는 CRPC의 표현형을 설명할 수 있는 가장 결정적인 경로들 중의 하나이다. Akt는 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-포스페이트(PIP3)에 의해 활성화되는 세린/트레오닌 인산화효소이고, 활성화 또는 인산화 된 Akt는 GSK3β, BAD, FOXO 와 mTOR를 조절함으로써 세포 성장과 세포 생존을 모두 증진시킨다(Sharma M, et al. J Biol Chem 2002 277: 30935-41, Pap M, Cooper GM. J Biol Chem 1998 273:19929-32, Downward J. 1998 Curr Opin Cell Biol 10:262-67, Datta SR, et al. Cell 1997 91: 231-41, Downward J. Cell Develop Biol 2004 15:177-82, Vivanco I and Sawyers C. Nat Rev Cancer 2002 2: 289-501, Hay N. Cancer Cell 2005 8:179-83).
종양 억제제 PTEN은 PIP3로부터 인산기(phosphate)를 제거하는 지방 포스파타아제로서, 일반 세포에서 Akt 활성화를 억제하고 세포를 사멸시키도록 하는 반면, 일부 종양 세포들은 PTEN 돌연변이를 지니고 있거나 PTEN 발현이 결핍되어 있어, Akt의 활성화를 유발한다. 그것의 항-세포사멸적 기능과 더불어, PC 세포에서는 활성화 된 Akt가 직접 AR에 결합하여 안드로겐이 없는 상태에서 AR을 인산화시키는데, 이 역시 CRPC 표현형에 기여할 수 있다(Wen Y, et al. Cancer Res 2000 60: 6841-45).
사실, 인산화 된 Akt의 수준은 높은 글리슨 분화도(Gleason grade)의 PC에서 증가되었고, 이는 PC 진행이나 CRPC 진행과 연관되어 있다(Malik SN, et al. Clin Cancer Res 2002 8: 1168-71, Kreisberg JI, et al. Cancer Res 2004 64:5232-36).
Akt가 활성화되기 위해 Akt의 Thr308과 Ser473 잔기(residue)가 인산화되어야 한다. 포스포이노시티드-의존적 인산화효소(phosphoinisitide-dependent kinase 1, PDK1)는 Thr308의 인산화를 촉매할 수 있고, 많은 인산화효소들은 Ser473의 인산화를 촉매하는 소위 PDK2로서 기능을 하는 것으로 알려져 있으나, 그것들 전부 또는 일부가 암 세포에서 생리학적 PDK2로서 작용을 하는지 여부는 아직 규명될 여지가 있다(Grossmann ME, et al. JNCI 2001 93:1687-97, Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67.).
반면에, cAMP-의존적 단백질 인산화효소 A(cAMP-dependent protein kinase A, PKA)는 흔히 cAMP에 의해 개시되는 다양한 생리학적 또는 병리학적 효과를 매개하고, G-단백질과 결합하는데 필수적이라고 여겨진다. 많은 리간드-수용체 시스템은 PKA 신호 경로를 활성화시키고, 그것의 활성화는 세포 성장 및 분화와 관련되어 있다(Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67, Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66).
PC에서는 여러 보고들이 PKA와 안드로겐-독립적 성장 및 신경내분비(neuroendocrine) 분화의 연관성을 시사한다(Cox ME, et al. J Biol Chem 2000 275: 13812-8, Deeble PD, Cox ME, et al. Cancer Res 2007 67:663-72). 또한, PKA 경로와 AR 경로 사이의 혼선은 PC 세포들의 안드로겐-독립적 또는 거세-저항적 성장과 연관되어 있음을 암시한다(Stork PJ, Schmitt JM.TrendsCellBiol 2002 12:258-66, Sadar MD. J Biol Chem 1999 274: 7777-83).
이 PKA 경로는 PKA-조절 서브유닛(PKA-R)이나 PKA 억제제와 같은 많은 종류의 요소(factor)들에 의해 조절되어 지고(Taylor SS, Kim C, Vigil D, et al. BBA 2005 1754: 25-37, Dalton GD, Dewey WL. Neuropeptides 2006 40: 23-34), 이러한 조절 요소들은 PKA 경로를 조절하기 위해 암세포에서 비정상적으로 발현되고, 그 중 일부는 암 치료를 위한 표적이 된다(Miller WR. Ann NY Acad Sci 2002 968: 37-48, 2002).
먼저, 임상적 HRPCs 또는 CRPCs의 분자적 특성을 특징짓고 HRPC 또는 CRPC 치료를 위한 분자 표적을 확인하기 위해, LLM(laser microbeam microdissection)을 이용하여 HRPC 또는 CRPC 조직으로부터 분리한 암 세포들에 대해 게놈-범위 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행하였고, HRPC 또는 CRPC 세포들에서 많은 수의 조절되지 않은(de-regulated) 유전자들이 확인되었으며, 그 중 일부는 안드로겐-독립적이고 공격적인 표현형에 관여할 것이다(Tamura K etal .,CancerRes200767:5117-25.).
도 1 A 현미해부 된(NPmix) 일반 전립선암 상피 세포들, 전체 일반 전립선 조직, 및 생명기관(vital organ)(심장, 폐, 간, 및 신장)과 비교하여, 반-정량적 RT-PCR로 HRPC 세포들에서는 PKIB 과발현을 확인하였으나(5/5), HSPC 세포들에서는 관찰되지 않았다. ACTB는 각각의 cDNA 내용물을 정량하는데 이용되었다. B PKIB 발현의 다중 조직 노던(MTN) 블럿 분석에 의해 인간 성체 기관들 중 방광(placenta)에서는 약 1.5-kb 띠(band)가 보였으나, 생명기관들(심장, 폐, 간, 및 신장)에서는 관찰되지 않았다. PKIB 발현의 노던 블럿 분석은 여러 PC 세포주들(22Rv1 및 PC-3)이 PKIB를 강하게 발현하는 반면, 다른 일반 성체 기관들은 PKIB를 발현하지 않음을 보였다. C-F는 PC 조직들의 면역조직화학적 분석을 나타낸다. C 전립선 상피내 종양(prostatic intraepithelial neoplasia, PIN)은 PKIB에 대해 약한 염색 (+)을 보였다. D 글리슨 분화도 3을 갖는 PC는 약한 염색 (+)를 보이는 반면, 일반 전립선 상피세포(N)는 음성 염색을 보였다. E 글리슨 분화도 5을 갖는 PC는 PKIB에 대해 강한 양성 염색 (+++)을 보였다. F HRPC 또한 강한 양성 염색 (+++)을 보였다.
도 2 A 현미해부 된(NPmix) 일반 전립선암 상피 세포들, 전체 일반 전립선 조직, 및 생명기관(vital organ)(심장, 폐, 간, 및 신장)과 비교하여, 반-정량적 RT-PCR로 HRPC 세포들에서는 NAALADL2 과발현을 확인하였다(7/11). ACTB는 각각의 cDNA 내용물을 정량하는데 이용되었다. B NAALADL2 발현의 다중 조직 노던(MTN) 블럿 분석에 의해 인간 성체 기관들 중 PC 세포주들에서만 약 10-kb, 6-kb, 및 5-kb의 3 가지 띠들(bands)이 보였고, 생명기관들(심장, 폐, 간, 및 신장)에서는 관찰되지 않았다.
도 3 PKIB-siRNA가 PC 세포들의 성장에 미치는 영향. A RT-PCR로 si1 및 si2에 의한 PKIB 발현에 미치는 녹다운 효과를 확인하였으나, 22Rv1(왼쪽) 및 LNCaP(HP) 세포들(오른쪽)에서 si3 및 음성 대조군 siEGFP에 의한 효과는 관찰되지 않았다. ACTB는 RNAs를 정량하는데 이용되었다. B PKIB에 대한 표시된 siRNA-발현 벡터들(si1, si2 및 si3) 및 음성 대조군 벡터(siEGFP)로 각각 형질감염된 22Rv1(왼쪽) 및 LNCaP(HP) 세포들(오른쪽)의 MTT 분석. 제네틴과 함께 20일 배양한 후, 각각의 평균값이 SD(표준편차)를 암시하는 오차 막대와 함께 표시되었다. Y-축 상의 ABS는 microplate reader로 490nm 및 참조로서 630nm에서의 흡광도를 의미한다. 이러한 실험들은 3중으로 수행되었다. 녹다운 효과가 관찰되지 않은 si3 및 siEGFP에 비해, si2 및 si3로 형질감염된 22Rv1(왼쪽) 및 LNCaP(HP) 세포들(오른쪽)은 생존가능한 세포들의 수가 현저하게 감소되었다(P<0.01, Student's t-test). C PKIB에 대한 표시된 siRNA-발현 벡터들(si1, si2 및 si3) 및 음성 대조군 벡터(siEGFP)로 각각 형질감염된 22Rv1(왼쪽) 및 LNCaP(HP) 세포들(오른쪽)의 콜로니 형성 분석. 제네틴과 함께 20일 배양 후, 세포들은 0.1% 결정 바이올렛 염색으로 시각화되었다.
도 4 NAALADL2-siRNA가 PC 세포들의 성장에 미치는 영향. A RT-PCR로 si1 및 si#690에 의한 NAALADL2 발현에 미치는 녹다운 효과를 확인하였으나, 22Rv1 세포들에서 si#913, si#1328 및 음성 대조군 siEGFP에 의한 효과는 관찰되지 않았다. ACTB는 RNAs를 정량하는데 이용되었다. B PKIB에 대한 표시된 siRNA-발현 벡터들(si#690, si#913 및 si#1328) 및 음성 대조군 벡터(siEGFP)로 각각 형질감염된 22Rv1(왼쪽) 및 LNCaP(HP) 세포들(오른쪽)의 MTT 분석. 제네틴과 함께 20일 배양한 후, 각각의 평균값이 SD(표준편차)를 암시하는 오차 막대와 함께 표시되었다. Y-축 상의 ABS는 microplate reader로 490nm 및 참조로서 630nm에서의 흡광도를 의미한다. 이러한 실험들은 3중으로 수행되었다. 녹다운 효과가 관찰되지 않은 다른 siRNA에 비해, si#690으로 형질감염된 22Rv1tvh들은 생존가능한 세포들의 수가 현저하게 감소되었다(P<0.01, Student's t-test). C NAALADL2에 대한 표시된 siRNA-발현 벡터들(si#690, si#913 및 si#1328) 및 음성 대조군 벡터(siEGFP)로 각각 형질감염된 22Rv1 세포들의 콜로니 형성 분석. 제네틴과 함께 20일 배양 후, 세포들은 0.1% 결정 바이올렛 염색으로 시각화되었다. D RT-PCR은 다른 NAALADL2-발현 C4-2B 세포에서 si#690에 상응하는 합성된 RNA 이중체에 의해 NAALADL2에 미치는 녹다운의 영향을 확인하였다. ACTB는 RNAs를 정량하는데 이용되었다. E 대조군 RNA 이중체 siEGFP에 비해, si#690에 상응하는 합성된 RNA 이중체는 C4-2B 세포들의 세포 생존력을 억제하였다(P<0.01, Student's t-test).
도 5 PKIB(A) NAALADL2(B) 단백질들의 세포 내 위치. 항-태그(tag) 항체를 이용한 면역세포화학적 분석은 외재적 PKIB가 세포질에 위치하고, 외재적인 NAALADL2 단백질이 주로 세포질 막에 위치함을 보였다. C PKIB-Myc 및 HA-PKA-C 발현 벡터들이 22Rv1 세포들로 함께 형질감염되었고, 그것들의 세포용해물들을 각각 태그(tag) 항체로 면역침강시켰다. PKIB-Myc는 PKA-C와 함께 면역침강되었고, 그 반대도 마찬가지임을 보이면서, PKIB와 PKA-C 간의 직접적 상호작용을 암시하였다. D 면역세포화학적 분석은 대조군 siRNArk PC-3 세포들에 형질감염되었을 때, 대부분의 PKA-C가 세포질에 위치하고 PKA-C 단백질의 일부 신호가 핵에서 확인됨(도 5의 D, 왼쪽)이 관찰되었다. 반면에, siRNA가 PC-3 세포들에서 내재적인 PKIB를 무력화시키는 경우, 면역세포화학적 분석은 핵에서 PKA-C의 신호를 전혀 또는 거의 관찰할 수 없음을 보였다(도 5의 D, 오른쪽). E siRNA 이중체를 PC 세포들에서 처리한 후, 핵 PKA-C를 더욱 정량적으로 분석하기 위해 상기 세포들을 핵 및 세포질 부분으로 분별하였다. 분별된 세포 용해물의 단백질 30㎍을 항-PKA-C 항체 및 적재(loading) 및 핵-분별된 대조군을 위한 항-laminB 항체(Calbiochem)를 이용하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 대조군 siRNA에서의 양과 비교하여, 핵 내 PKA-C의 양은 PKIB 녹다운에서 명백히 감소한 반면, 세포질 내 PKA-C의 양은 PKIB 녹다운에서 약간 증가하였다.
도 6 A RT-PCR로 DU145-유래 클론들(PKIB #1, #2,및 #3)에서 PKIB의 구조적 발현을 확인하였다. B 웨스턴 블럿 분석으로 DU145-유래 클론들(PKIB #1, #2,및 #3)에서 PKIB의 구조적 발현을 확인하였다. C 외재적 PKIB를 높은 수준으로 발현하는 DU145 클론들(클론 1-3)과 허위(Mock) 벡터로 형질감염된 DU145 클론들(#1, #2, #3 혼합물의 혼합물)의 시험관 내 성장 속도. X-, 및 Y-축은 씨딩(seeding) 후 일자와 1일의 흡광도 값을 대조군으로 하여 비교된 지름의 흡광도로 계산된 상대적 성장 속도를 나타낸다. PKIB-과발현 세포는 허위 세포보다 더 빨리 성장하여, 전립선암에서 PKIB의 성장-촉진 효과를 보여준다. D 2 x 106개의 DU145 세포들이 안정적으로 PKIb를 발현하거나(오른쪽) 또는 허위 세포들(왼쪽)은 수컷 누드 마우스들의 옆구리에 접종되었다. 접종 15일 후, 종양들은 오른쪽 측면에서는 형성되었으나(PKIB++; 화살표), 왼쪽에서는 형성되지 않았다(Mock). E PKIB 발현 벡터로 형질감염한 후, NIH3T3세포의 침투적 성질을 나타내는 마트리젤 침투 분석. Y-축은 마드리젤-코팅된 필터를 통해 이동한 세포의 수를 나타낸다. 분석은 3회 수행되었고, 각각의 평균값이 SD(표준편차)를 의미하는 오차 막대와 함께 표시되었다. PKIBdml 과발현은 NIH3T3 세포들의 침투적 성질을 현저히 증가시켰다(P=0.0052).
도 7 A LNCaP 및 PC-3 세포들에서 siRNA 이중체(siPKIB)에 의한 PKIB의 녹다운(knockdown)이 Akt의 Ser473에서 인산화를 감소시켰다. siEGFP 이중체의 형질감염은 음성 대조군으로 역할하였다. PKIB의 녹다운은 RT-PCR에 의해 확인되었고, ACTB는 적재(loading) 대조군으로 역할하였다. B PKIB의 과발현은 PC-3 및 22Rv1 세포들에서 Akt의 Ser473에 인산화를 촉진시켰다. PKIB 과발현은 HA-태그 항체를 이용한 웨스턴 블럿에 의해 확인되었다. C PKA-C의 과발현 역시 PC-3 세포들에서 Akt의 Ser473에서 인산화를 촉진시켰다. PKA-C 과발현은 HA-태그 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 통해 확인되었고, Akt의 전체 양은 적재(loading) 대조군으로 역할하였다. D 재조합 PKIB 및 PKA-C 단백질들을 이용한 Akt의 시험관 내 인산화효소 분석. Akt-Ser473의 인산화는 항-포스포(phospho)-Akt(Ser473) 항체(Cell Signaling)에 의해 검출되었고, Akt의 전체 양은 항-Akt 항체에 의해 검출되었다. PKA-C 인산화효소에 PKIB의 첨가는 시험관 내에서 Akt-Ser473의 인산화를 현저히 증가시켰다.
도 8
PKIB 발현은 임상적 PC 조직들에서 Akt 인산화와 연관되어 있다. 그림들은 A PKIB 및 B 인산화된 Akt의 PC 조직들의 페이스-온-페이스 슬라이드들 상에서 면역조직화학분석을 나타낸다.
본 발명의 요약
HRPC 또는 CRPC 세포의 게놈-범위 발현 프로파일(profile)을 기반으로, 두 분자 표적, PKIB (GenBank 접근번호: NM_181795) 와 NAALADL2 (GenBank 접근번호: NM_207015와 AK021754)가 PC 치료와 진단에 유용함을 확인하였다. 그리고, 상기 단백질들은 HRPC의 신규한 치료법의 개발을 위한 분자 표적으로서 유용하다.
PKIB는, CRPC에서 과발현되는 유전자로서, PKA 경로에서 조절 요소들 중 하나이다. 본 발명자들은 이것이 PKA 경로와 Akt 경로 사이의 기능적 연결(functional linking)을 통해 PC 세포의 생존력과 그것의 암적인 표현형에 기여한다는 것을 규명하였다.
PKIB는 PKI(protein kinase A inhibitor, 단백질 인산화효소 A 억제제) 족(family)에 속한다. PKIA는 단백질 인산화효소 A 촉매 서브유닛(PKA-C)(GenBank 접근번호: NM_002730)의 인산화효소 활성을 억제하고, PKA-C에 직접 결합함으로써 PKA-C를 핵에서 세포질로 수송하는 것으로 여겨진다(Glass DB etal ., J Biol Chem 1986261:12166-71. and Wen W etal ., J Biol Chem 1994269:32214-20.). 단백질 인산화효소 A(protein kinase A, PKA), cAMP-의존적 단백질 인산화효소 A는 흔히 cAMP에 의해 개시되는 다양한 생리학적 또는 병리학적 효과를 매개하고, G-단백질과 결합하는데 필수적이라고 여겨지며, 많은 리간드-수용체 시스템은 PKA 신호 경로를 활성화시키고, 그것의 활성화는 세포 성장 및 분화와 관련되어 있다(Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67, Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66). PC에서는, 여러 보고들이 PKA와 안드로겐-독립적 성장 및 신경내분비(neuroendocrine) 분화와 그것의 연관성을 시사하고(Cox ME, et al. J Biol Chem 2000 275: 13812-8, Deeble PD, Cox ME, et al. Cancer Res 2007 67:663-72), PKA 경로와 AR 경로 사이의 혼선(cross-talk)은 PC의 안드로겐-독립적 성장과 연관되어 있음을 암시한다(Stork PJ, Schmitt JM.TrendsCellBiol 2002 12:258-66, Sadar MD. J Biol Chem 1999 274: 7777-83).
NAALADL2는 신규한 유형 II 막 단백질이고, 글루타메이트 카르복시펩티다아제 II(glutamate carboxypeptidase II, GCPII) 족에 속한다. 전립선-특이적 막 항체(prostat-specific membrane antigen, PSMA)로 불리는 GCPII의 전립선 형태는 PC에서 발현되고, PSMA의 증가된 수준은 PC 진행 및 HRPC와 관련이 있다(Rajasekaran AK et al ., Am J Physiol Cell Physiol 2005288:C975-81. and Murphy GP et al.,Prostate 200042:145-9.). PSMA와 그것의 상동성 및 그것의 유사한 발현 양상(pattern)을 고려하면, NAALADL2는 "PSMA2"라고 명명되어야 한다. PSMA는 FDA-승인된 PC-이미징 물질인 111In-표지된 7E11 단일클론 항체의 표적이다(Prostascint, Cytogen, Princeton,NJ). PMSA는 PSMA-발현 세포들에 대한 이미징 물질이나 치료제의 특이적 운반을 위한 임상 실험들이 진행중인 J591과 같은 단일클론 항체들에 의해 표적화된다(Murphy GP et al ., Prostate 200042:145-9. and Holmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.). 종양 마커로서 그것의 특성과 더불어, PSMA는 기질이 폴리-감마-글루타메이트화 엽산(poly-γ-glutamated folate)을 포함하는 GPC 활성을 가진다(Zhou J et al ., Nature Review Drug Disc 20054:1015-26.). PSMA의 효소적 활성은 약의 불활성 글루타민화 형태가 선택적으로 분해되어 오직 PSMA를 발현하는 세포에서만 활성화되는 전구약물(prodrug)의 설계를 위해 활용될 수 있다(DennyWAetal .,EurJMedChem200136:577-95.). 그러나, PSMA가 PC 진행과 어떻게 연관되어 있는지는 완전히 밝혀지지 않고 있으며, PSMA 기능이나 활성 그 자체를 표적화하는 것의 가능성 또한 여전히 규명될 여지가 있다.
본 발명은 환자 유래 생물학적 시료(sample)에서 PIKB와 NAALADL2의 발현 수준을 측정함으로써 개체의 PC에 대한 소인을 진단 또는 측정하는 방법을 특징화한다. 정상 대조군의 상기 유전자 발현 수준에 비해 그 유전자의 발현 수준의 증가는 그 개체에서 PC가 발달되고 있거나 그럴 위험이 있다는 것을 암시한다.
적어도 부분적으로, 본 발명은 특이적 서열을 구성하는 이중 가닥의 분자들이 전립선 암 세포의 세포 성장을 억제하는데 효과적이라는 발견에 기초한다. 특이적으로, PIKB와 NAALADL2 유전자를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA가 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 관점에 따르면, 이중-가닥의 분자들은 벡터에 암호화될 수 있고, 그 벡터로부터 발현될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 이중-가닥의 분자나 벡터를 투여함으로써 세포 성장 억제 및 PC 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 이중 가닥 분자들 또는 벡터들 중 최소한 하나를 포함하는 암 치료를 위한 조성물과 관련이 있다. 또는, 본 발명은 피검 화합물을 PIKB나 NAALANDL2 단백질을 발현하는 세포와 접촉(contact)시킨 다음 PIKB나 NAALANDL2 단백질의 발현 수준을 감소시키는 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, PC을 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 추가적으로 제공한다.
나아가, 본 발명은 PIKB와 단백질 인산화효소 A 촉매 서브유닛(PKA-C) 간의 결합이 검출되는, PC 치료 또는 예방용 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. PIKB와 PKA-C 간의 결합을 억제하는 화합물들은 PC의 증상을 감소시킬 것으로 예상된다. 아울러, 본 발명은 세포 표면에서 NAALANDL2이 검출되는 암을 검출하기 위한 항체의 스크리닝 방법을 제공한다. NAALANDL2를 인지하는 항체는 PC을 검출하기 위해 사용되어 진다.
발명의 상세한 설명
정의
본 명세서에서 사용된 단어는 특별히 지시하지 않는 이상 단수를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료(biological sample)"은 전체 개체 또는 그의 조직의 부분집합(subset), 세포 또는 구성 부분(예, 혈액을 포함하지만 이에 한정되지 않는 체액(body fluid), 점액(mucus), 림프액(lymphatic fluid), 활액(synovial fluid), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 타액(saliva), 양수(amniotic fluid), 양막 제대혈(amniotic cord blood), 소변(urine), 질액(vaginal fluid) 및 정액(semen))을 의미한다. 추가적으로, "생물학적 시료(biological sample)"은 균질현탁액(homogenate), 세포용해물(lysate), 세포추출물(extract), 전체 개체나 그것의 세포의 부분집합(subset)으로부터 제조된 배양세포(cell culture) 또는 배양조직(tissue culture), 조직, 또는 구성 부분, 또는 파편(fraction) 또는 그의 부분(portion)을 의미한다. 마지막으로 "생물학적 시료(biological sample)"은 개체가 증식되어 단백질들이나 폴리뉴클레오티드들 같은 세포 구성요소(component)가 포함된 영양 배양액(nutrient broth) 또는 젤(gel)을 의미한다.
본 명세서에서 호환적으로 사용되는 용어 '폴리뉴클레오티드', '올리고뉴클레오티드'는 특별히 다른 암시가 없는 이상, 일반적으로 수용되는 단일-문자(single-letter) 코드를 말한다. 상기 용어는 하나 또는 그 이상의 핵산들이 에스터 결합에 의해 연결된 핵산(뉴클레오티드) 중합체에 적용된다. 상기 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
이중 가닥 분자
본 명세서에서 사용되는 용어 "분리된 이중 가닥 분자"는, 예를 들어, 짧은 간섭 RNA(SiRNA; 예, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 또는 작은 머리핀 RNA(shRNA)와 짧은 간선 DNA/RNA(SiN/R-NA; 예, DNA와 RNA의 이중 가닥 키메라(dsD/R-NA) 또는 DNA와 RNA의 작은 머리핀 키메라(shD/R-NA)))를 포함하는 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA"는 표적 mRNA의 번역을 막는 이중 가닥 RNA 분자를 말한다. DNA가 주형이 되어 RNA가 전사되는 표준 기술을 포함하는, 세포 내 siRNA 도입의 표준 기술이 사용된다. 상기 siRNA는 PKIB 또는 NAALADL2 센스 핵산 서열("센스 가닥"이라고도 명명된다.), PKIB 또는 NAALADL2 안티센스 핵산 서열("안티센스 가닥"이라고도 명명된다.) 또는 양자 모두를 포함한다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 센스 및 상보적인 안티센스 핵산 서열 양자를 모두 가지는 단일 전사체, 예를 들어 머리핀(hairpin), 같은 것으로 구성될 수 있다. 상기 siRNA는 dsRNA나 shRNA일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "dsRNA"는 서로에 상보적인 서열을 포함하고, 이중 가닥 RNA 분자를 형성하기 위해 상보적인 서열을 통해 함께 결합(anneal)하는 두 RNA 분자의 구조체를 말한다. 두 가닥의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열(protein coding sequence)로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" RNA들뿐만 아니라, 표적 유전자의 비-암호화 부위로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "shRNA"는, 센스 및 안티센스 가닥을 예로 들 수 있는, 서로에 대해 상보적인 첫 번째 및 두 번째 부위를 포함하는 센스 및 안티센스 가닥, 스텝-루프(stem-loop) 구조를 가지는 siRNA를 말한다. 그러한 염기 쌍합(pairing)이 충분히 존재하는 부위의 상보성 및 방향성의 정도는 루프 부위 내에 존재하는 뉴클레오티드들(또는 뉴클레오티드 유사체들) 간의 염기 쌍합의 결핍으로 인해 유발되는 루프 부위에 의해 연결되는 첫 번째 및 두 번째 부위들 사이에서 발생한다. 상기 shRNA의 루프 부위는 센스 및 안티센스 가닥 중간 단일-가닥 부위이고, "중간 단일-가닥(intervening single-strand)"으로 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "siER-NA"는 RNA 및 DNA 양자로 구성되는 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드 분자를 말하고, RNA와 DNA의 혼성체 및 키메라(chimera)를 포함하며, 표적 mRNA의 번역을 막는다. 여기서, 혼성체는 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 DNA로 구성된 폴리뉴클레오티드와 RNA로 구성된 폴리뉴클레오티드가 서로에 혼성화된 것을 의미하고; 반면 키메라(chimera)는 이중 가닥 분자로 구성되는 가닥 중 하나 또는 둘 모두가 RNA와 DNA를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 세포 내 siD/R-NA 도입의 표준 기술들이 사용된다.
상기 siD/R-Na는 PKIB 또는 NAALADL2 센스 핵산 서열("센스 가닥"이라고도 명명된다.), PKIB 또는 NAALADL2 안티센스 핵산 서열("안티센스 가닥"이라고도 명명된다.) 또는 양자 모두를 포함한다. 상기 siD/R-NA는 표적 유전자로부터 센스 및 상보적인 안티센스 핵산 서열 양자를 모두 가지는 단일 전사체, 예를 들어 머리핀(hairpin), 같은 것으로 구성될 수 있다. 상기 siD/R-NA는 dsD/R-NA나 shD/R-NA일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "dsD/R-NA"는 서로에 상보적인 서열을 포함하고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 형성하기 위해 상보적인 서열을 통해 함께 결합(anneal)하는 두 분자의 구조체를 말한다. 두 가닥의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열(protein coding sequence)로부터 선택되는 "센스" 또는 "안티센스" RNA들뿐만 아니라, 표적 유전자의 비-암호화 부위로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자로 구성될 수 있다. dsD/R-NA를 형성하는 두 분자 중 하나 또는 둘 모두는 RNA 및 DNA (키메라 분자, chimeric molecule) 둘 모두로 구성되거나, 또는 둘 중 하나는 RNA로 구성되고 나머지 하나는 DNA(혼성체 이중 가닥)로 구성된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "shD/R-NA"는, 센스 및 안티센스 가닥을 예로 들 수 있는, 서로에 대해 상보적인 첫 번째 및 두 번째 부위를 포함하고 스텝-루프(stem-loop) 구조를 가지는 siRNA를 말한다. 그러한 염기 쌍합이 충분히 존재하는 부위의 상보성 및 방향성의 정도는 루프 부위 내에 존재하는 뉴클레오티드들(또는 뉴클레오티드 유사체) 간의 염기 쌍합의 결핍으로 인해 유발되는 루프 부위에 의해 연결된 첫 번째 및 두 번째 부위 사이에서 일어난다. 상기 shD/R-NA의 루프(loop) 부위는 센스 및 안티센스 가닥 중간 단일-가닥 부위이고, "중간 단일-가닥(intervening single-strand)"으로 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분리된 핵산"은 그것의 본래 환경(예, 자연적으로 발생되었다면 자연적 환경)으로부터 제거된 핵산이고, 따라서, 그것의 자연적 상태로부터 합성적으로 변경된다. 본 발명에서 분리된 핵산은 DNA, RNA 그리고 이들의 유도체를 포함한다.
표적 mRNA에 혼성되는, PKIB 또는 NAALADL2에 대한 이중 가닥 분자는 일반적으로 유전자의 단일-가닥 mRNA 전사체와 결합(associating)하여, 번역을 방해(interfering)하고, 결과적으로 단백질의 발현을 억제함으로써 PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 의해 암호화되는 PKIB 또는 NAALADL2 단백질의 생산을 감소시키거나 억제한다. 전립선암 세포주에서 PKIB의 발현은 서로 다른 1개 또는 2개의 dsRNA에 의해 억제된다(도 3); 전립선암 세포주에서 NAALADL2의 발현은 dsRNA에 의해 억제된다(도 4).
그러므로 본 발명은 PKIB 또는 NAALADL2 유전자를 발현하는 세포에 도입 시 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현을 억제하는 특성을 지닌 분리된 이중가닥 분자를 제공한다. 이중 가닥 분자의 표적 서열은 하기와 같은 siRNA 디자인 알고리즘에 의해 설계된다.
PKIB 표적 서열은, 예를 들어, 하기 뉴클레오티드들을 포함한다.
서열번호 16,
서열번호 17
NAALADL2 표적 서열은, 예를 들어, 하기 뉴클레오티드들을 포함한다.
서열번호 19
특히, 본 발명은 하기 [1] 내지 [16]와 같은 이중 가닥 분자를 제공한다:
[1] 세포에 도입 시, PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 및 세포 성장을 억제하고, 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되며, 상기 센스 가닥은 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 서열을 포함하는, 분리된 이중 가닥 분자;
[2] 약 100개 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 가지는 [1]의 이중 가닥 분자;
[3] 약 75개 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 가지는 [2]의 이중 가닥 분자;
[4] 약 50개 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 가지는 [3]의 이중 가닥 분자;
[5] 약 25개 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 가지는 [4]의 이중 가닥 분자;
[6] 약 19개 내지 약 25개 뉴클레오티드 사이의 길이를 가지는 [5]의 이중 가닥 분자;
[7] 중간 단일-가닥(intervening single-strand)에 의해 연결된 센스 및 안티센스 가닥을 모두 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된, [1]의 이중 가닥 분자;
[8] 5'-[A]-[B]-[A']-3'의 일반식을 가지며, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 [7]의 이중 가닥 분자;
[9] RNA를 포함하는 [1]의 이중 가닥 분자;
[10] DNA와 RNA를 모두 포함하는 [1]의 이중 가닥 분자;
[11] DNA 폴리뉴클레오티드와 RNA 폴리뉴클레오티드의 혼성체인 [10]의 이중 가닥 분자;
[12] 센스 및 안티센스 가닥은 각각 DNA 및 RNA로 구성된 [11]의 이중 가닥 분자;
[13] DNA와 RNA의 키메라(chimera)인 [10]의 이중 가닥 분자;
[14] 안티센스의 3' 말단 측면 부위, 또는 센스 가닥의 5' 말단 측면 부위와 안티센스 가닥의 3' 말단 측면 부위 모두가 RNA로 구성된 [13]의 이중 가닥 분자;
[15] 측면 부위는 9개 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성된 [14]의 이중 가닥 분자; 및
[16] 3' 돌출(overhang)을 포함하는 [1]의 이중 가닥 분자.
이하, 본 발명의 이중 가닥 분자를 더욱 상세히 설명한다.
세포 내에서 표적 유전자 발현을 억제하는 능력을 갖는 이중 가닥 분자를 설계하는 방법은 알려져 있다(전체가 참조로서 본 명세서에 통합된, 예를 들어, 미국 특허 6,506,559호 참조). 예를 들어, siRNAs를 설계하기 위한 컴퓨터 프로그램은 앰비온(Ambion) 웹사이트에서 사용할 수 있다(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html).
상기 컴퓨터 프로그램은 하기 프로토콜에 근거하여 이중 가닥 분자를 위한 표적 뉴클레오티드 서열을 선별한다.
표적 부위( site )의 선별
1. 전사체의 AUG 개시 코돈과 함께 시작하면서, 하류(downstream)를 스캐닝하여 AA 디-뉴클레오티드(di-nucleotide) 서열을 찾는다. 각각 AA와 잠재적 siRNA 표적 사이트(site)로서 3'에 인접한 19개의 뉴클레오티드들의 발생을 기록한다. Tuschl 등은 5'과 3' 비번역 부위(untranslated regions, UTRs)와 개시 코돈(75 염기 이내) 근처 부위는 조절 단백질 결합 부위에 풍부할 수 있고, UTR-결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체가 siRNA 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 방해할 수 있기 때문에 이들 부위에 대한 siRNA의 설계는 회피할 것을 추천한다.
2. 잠재적 표적 사이트(site)와 적절한 게놈 데이터베이스(인간, 마우스, 랫 등)를 비교하고, 고려개체(consideration)에서 다른 암호화 서열과 현저한 성동성을 가진 모든 표적 서열들을 제거한다. 기본적으로, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에 NCBI 서버상에서 찾을 수 있는 BLAST가 이용된다(Altschul SF , Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402).
3. 합성의 개체이 되는 표적 서열을 선별한다. 검출할 유전자의 길이에 따라 여러 표적 서열을 선별하는 것이 전형적이다.
상기 프로토콜에 의해, 본 발명의 분리된 이중 가닥 분자의 표적 서열은 다음과 같이 설계된다
서열번호 16 및
PKIB 유전자를 위한 서열번호 17; 뉴클레오티드
NAALADL2 유전자를 위한 서열번호 19; 뉴클레오티드
상기 표적 유전자들을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 상기 이중 가닥 분자들의 성능을 위해, 상기 표적 서열을 표적화하는 이중 가닥의 분자들을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 하기의 군에서 선택되는 특정 서열을 표적화하는 이중 가닥 분자를 제공한다:
서열번호 16 및
PKIB 유전자를 위한 서열번호 17; 뉴클레오티드
NAALADL2 유전자를 위한 서열번호 19; 뉴클레오티드
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 단일 표적 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 서열로 향하게 되거나 복수의 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 서열로 향하게 될 수 있다.
상기 PKIB 유전자 또는 NAALADL2 유전자의 일부와 동일한 뉴클레오티드 서열(예, siRNA에 상보적이고 길이가 동일한 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 내에 폴리뉴클레오티드)은 PKIB 또는 NAALADL2 표적 서열을 의미한다. 상기 표적 서열은 5' 비번역 부위(UTR), 개방 판독 틀(open reading frame, OFR) 또는 3' 비번역 부위(UTR)를 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 siRNA는 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 발현의 상류 또는 하류 조절자에 상보적인 핵산 서열이다. 상류 또는 하류 조절자의 예들은 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 프로모터에 결합하는 전사 인자, PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드와 상호작용하는 인산화효소 또는 포스파타아제, PKIB 또는 NAALADL2 프로모터 또는 엔헨서(enhancer)를 포함한다.
상기 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 표적 서열을 표적화하는 본 발명의 이중 가닥 분자는 표적 서열 및/또는 표적 서열에 상보적인 서열의 핵산 서열 중 어느 것을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. PKIB 유전자를 표적화하는 폴리뉴클레오티드의 예들은 서열번호 16 또는 17의 서열 및/또는 상기 뉴클레오티드들에 상보적인 서열을 포함하는 것들을 포함한다; NAALADL2 유전자를 표적화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 및/또는 상기 뉴클레오티드들에 상보적인 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 그러나, 본 발명은 상기 예에 한정되지 않고, 상기 변형된 분자가 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현을 억제하는 능력을 유지하는 한 상기 핵산 서열 내의 작은 변형들이 허용된다. 본 명세서에서, 핵산 서열 내의 "부수적 변형"은 서열에 하나, 둘 또는 여러 개 핵산의 치환, 삭제, 추가 또는 삽입을 의미한다. 전형적으로, 부수적 변형은 4개 또는 그 이하, 때로는 3개 또는 그 이하의, 종종, 서열에서 둘 또는 그 이하 핵산의 치환, 삭제, 추가 또는 삽입일 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 이중 가닥 분자는 실시예에서 활용되는 방법을 이용하여 그것의 성능을 시험할 수 있다. 실시예에서는, PKIB 또는 NAALADL2 유전자 산물의 생산을 감소시키는 성능을 위해 표준 방법에 따라 상기 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 mRNA의 다양한 부분의 센스 가닥 또는 그에 상응하는 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 분자를 전립선암 세포주(예, 22Rv1, LNCaP(HP) 및 C4-2B)에서 시험관 내(in vitro) 시험하였다. 더욱이, 예를 들어, 후보 분자의 부재 하에서 배양된 세포와 비교하여 후보 이중 가닥 분자와 접촉한 세포에서 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 산물의 감소는 실시예 1, "반-정량적 RT-PCR" 항목에서 언급한 PKIB 또는 NAALADL2 mRNA를 위한 프라이머를 이용한, 예, RT-PCR에 의해 검출될 수 있다. 그런 다음, PKIB 또는 NAALADL2 유전자 산물의 생산을 감소시키는 서열들의 세포성장 억제 효과를 위해 상기 서열들을 시험관 내(in vitro) 세포-기반 분석으로 시험할 수 있다. 그런 다음, PKIB 또는 NAALADL2 산물의 생산 감소와 암 세포 성장의 감소를 확인하기 위해, 암을 지닌 동물들(예, 누드 마우스 이종이식(xenograft) 모델들)을 이용한 시험관 내(in vitro) 세포-기반 분석으로 세포 성장을 억제하는 서열들의 시험관 내(in vitro) 성능을 시험할 수 있다.
상기 분리된 폴리뉴클레오티드가 RNA 또는 그의 유도체이면, 뉴클레오티드 서열 내 염기 "t"는 "u"로 치환되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "상보적"은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위 간의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 훅스틴(Hoogsteen) 염기 짝지음을 의미하고, 용어 "결합(binding)"은 두 폴리뉴클레오티드 간의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-이인산에스터 연결(non-phosphodiester linkage)를 포함할 때, 이러한 폴리뉴클레오티드들은 서로에 같은 방법으로도 결합될 수 있다. 일반적으로, 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열들은 아주 적거나 거의 없는 불일치(mismatch)를 포함하는 안정적인 이중체(duplex)를 형성하기 위해 적절한 조건하에서 혼성화된다. 더욱이, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 상기 혼성에 의해 이중 가닥 분자 또는 머리핀 루프(hair loop) 구조를 형성할 수 있다. 선호되는 구현예에서, 상기 이중체(duplex)는 매 10쌍마다 1개 이하의 불일치를 포함한다. 특별히 선호되는 구현예에서, 상기 이중체(duplex)는 상기 이중체의 가닥들이 완전히 상보적이고, 불일치를 포함하지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드는 PKIB의 길이가 1990개의 뉴클레오티드보다 짧고, NAALADL2의 길이가 4912 뉴클레오티드보다 짧다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 모든 유전자의 길이가 500, 200, 100, 75, 50, 또는 25 뉴클레오티드보다 짧다. 본 발명의 상기 분리된 폴리뉴클레오티드들은 PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 대한 이중 가닥 분자를 형성하거나 또는 상기 이중 가닥 분자들을 암호화하는 DNA 주형을 제작하는데 유용하다. 상기 폴리뉴클레오티드들이 이중 가닥 분자를 형성하는데 유용한 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 19개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 21개 이하의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 19개 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-이인산에스터 연결(non-phosphodiester linkage)를 포함할 수 있다. 당업계에서 잘 알려진 화학적 변형은 이중 가닥 분자의 안정성, 가용성, 및/또는 세포 흡입(cell uptake)의 증가를 가능하게 한다. 본 발명의 분자에 적용될 수 있는 다른 종류의 화학적 변형들은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다(WO03/070744; WO2005/045037). 한 구현예에서, 변형은 분해에 대한 저항성의 증가나 흡입 증가를 제공함에 이용될 수 있다. 상기 변형의 예는 포스포로티오에티트 연결(phosphorothioate linkage), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드(특히, 이중 가닥 분자의 센스 가닥 상에서), 2' 디옥시-플로오로 리보뉴클레오티드, 2' 디옥시 리보뉴클레오티드, "보편적 염기(universal base)" 뉴클레오티드, 5'-C-메틸 뉴클레오티드, 및 반전된 디옥시염기결핍(inverted deoxyabasic) 잔기 통합(incorporation)을 포함한다(US20060122137). 또 다른 구현예에서, 변형들은 안정성을 증가시키거나 또는 이중 가닥 분자의 표적화 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 변형들은 이중 가닥 분자의 상보적인 두 가닥 간의 화학적 교차 연결(chemical cross linking), 이중 가닥 분자의 3' 또는 5' 말단의 화학적 변형, 당 변형, 뉴클레오염기 변형 및/또는 백본(backbone) 변형, 2-플루오로 변형 리보뉴클레오티드 및 2'-디옥시 리보뉴클레오티드를 포함한다(WO2004/029212). 또 다른 구현예에서, 변형은 표적 mRNA 및/또는 상보적인 이중 가닥 분자 가닥에서 상보적인 뉴클레오티드의 친화도(affinity)를 증가 또는 감소시키는데 이용될 수 있다(WO2005/044976). 예를 들어, 비변형 피리미딘 뉴클레오티드는 2-티오(thio), 5-알키닐(alkynal), 5-메틸, 또는 5-프로피닐 피리미딘으로 치환될 수 있다. 추가적으로 비변형 퓨린은 7-데자(deza), 7-알킬(alkyl), 또는 7-알케닐(alkenyl) 퓨린으로 치환될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 이중 가닥 분자가 3' 돌출(overhang)을 갖는 이중 가닥 분자인 경우, 뉴클레오티드가 돌출된 3' 말단 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드로 치환될 수 있다(Elbashir SM 등, Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200). 보다 상세하게, US20060234970와 같은 공개 문헌이 참조될 수 있다. 본 발명은 상기 예에 한정되지 아니하고, 결과 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 능력을 유지하는 한 알려진 모든 화학적 변형들이 본 발명의 이중 가닥을 위해 이용될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 DNA와 RNA를 모두 포함할 수 있다(예, dsD/R-NA 또는 shD/R-NA). 특히, DNA 가닥과 RNA 가닥 또는 DNA-RNA 키메라(chimera) 폴리뉴클레오티드의 혼성체 폴리뉴클레오티드는 증가된 안정성을 보인다. DNA와 RNA의 혼합(mixing)(예, DNA 가닥(폴리뉴클레오티드)과 RNA 가닥(폴리뉴클레오티드)으로 구성된 혼성체 유형 이중 가닥 분자), 단일가닥(폴리뉴클레오티드) 중 어느 하나 또는 둘 모두 상의 DNA와 RNA 모두를 포함하는 키메라(chimera) 유형 이중 가닥 분자, 또는 같은 종류의 다른 것들은 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 증가시키기 위해 형성될 수 있다. 상기 DNA 가닥과 RNA 가닥의 혼성체는 그것이 유전자를 발현하는 세포로 도입 시 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성(acrivity)을 갖는 한 상기 센스 가닥이 DNA이고, 안티센스 가닥이 RNA이거나 또는 그 반대일 수 있다. 바람직하게는, 상기 센스 가닥 폴리뉴클레오티드가 DNA이고, 상기 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 또한, 상기 키메라(chimera) 유형 이중 가닥 분자는 그것이 유전자를 발현하는 세포로 도입 시 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성(acrivity)을 갖는 한 센스 및 안티센스 가닥 모두 DNA및 RNA로 구성되거나, 센스 및 안티센스 가닥의 어느 하나가 DNA 및 RNA로 구성될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자의 안정성을 증가시키기 위해, 상기 분자는 바람직하게 가능한 한 많은 DNA를 포함하는 반면, 표적 유전자 발현의 억제를 유도하기 위해, 상기 분자는 발현의 충분한 억제를 유도하는 범위 내에서 RNA일 것이 요구된다. 키메라(chimera) 유형 이중 가닥 분자의 선호되는 예로서, 상기 이중 가닥 분자의 상류 일부 부위(upsteam partial region)(예, 센스 또는 안티센스 가닥 내 표적 서열 또는 이에 상보적인 서열 측면 부위)는 RNA이다. 바람직하게, 상기 상류 일부 부위는 센스 가닥의 5' 측(5' 말단)과 안티센스 가닥의 3' 측(3' 말단)을 의미한다. 대신에, 센스 가닥의 5' 말단 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단의 측면 부위가 상류 일부 부위라고 일컬어진다. 즉, 바람직한 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단 측면 부위나, 또는 센스 가닥의 5' 말단 측면 부위 및 안티센스 가닥의 3' 말단 측면 부위가 모두 RNA로 구성된다. 예를 들어, 본 발명의 상기 키메라(chimera) 또는 혼성체 유형 이중 가닥 분자는 하기의 조합을 포함한다.
센스 가닥: 5'-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5' : 안티센스 가닥,
센스 가닥: 5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-[DNA]-5' : 안티센스 가닥, 및
센스 가닥: 5'-(RNA)-[DNA]-3'
3'-(RNA)-5' : 안티센스 가닥.
상기 상류 일부 부위는 바람직하게 상기 이중 가닥 분자의 상기 센스 또는 안티센스 가닥 내 표적 서열 또는 이에 상보적인 서열의 말단으로부터 세어 9개 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성되는 도메인이다. 더욱이, 상기와 같은 키메라(chimera) 유형 이중 가닥 분자의 선호되는 예는 적어도 상기 폴리뉴클레오티드의 상류 절반 부위(센스 가닥의 5' 측 부위 및 안티센스 가닥의 3' 측 부위)는 RNA이고 나머지 절반은 DNA인 19개 내지 21개 뉴클레오티드의 가닥 길이를 갖는 것들을 포함한다. 상기와 같은 키메라 유형 이중 가닥 분자에서, 표적 유전자의 발현을 억제하는 효과는 전체 안티센스 가닥이 RNA인 경우에 훨씬 높다(US20050004064).
본 발명에서, 상기 이중 가닥 분자는 짧은 머리핀 RNA(shRNA) 및 DNA와 RNA로 구성되는 짧은 머리핀(shER-NA)과 같은 머리핀을 형성할 수 있다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 RNA 간섭(interference)을 통해 유전자 발현을 침묵(silence)시키는데 이용될 수 있는 단단한 머리핀 돌림(turn)을 만드는 RNA 또는 RNA와 DNA의 혼합물의 서열이다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 단일 가닥 상에서 루프 서열에 의해 분리되는 센스 표적 서열과 안티센스 표적 서열을 포함한다. 일반적으로, 상기 머리핀 구조는 세포 장치(cellular machinery)에 의해 dsRNA 또는 dsD/R-NA로 분해된 다음 RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 결합된다. 상기 복합체는 상기 dsRNA 또는 dsD/R-NA의 표적 서열과 일치하는 mRNA들에 결합하여 분해한다.
머리핀 루프 구조를 형성하기 위해, 임의의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 루프 서열이 센스 및 안티센스 서열 사이에 위치할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 갖는 이중가닥 분자를 제공하는데, [A]는 표적 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥이다. 상기 표적 서열은, 예를 들어, 하기의 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되어질 수 있다:
서열번호 16, 또는
PKIB를 위한 서열번호 16; 뉴클레오티드
NAALADL2를 위한 서열번호 19; 뉴클레오티드.
본 발명은 상기 실시예들에 한정되지 아니하고, 상기 이중 가닥 분자가 표적화되는 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현을 억제하는 능력을 유지하는 한 [A] 내의 표적 서열은 상기 예들로부터 변형된 서열일 수 있다. 부위 [B]를 구성하는 루프를 형성하기 위해 상기 부위 [A]는 [A']에 혼성화된다. 상기 중간 단일-가닥 단백질 [B](예, 루프 서열)은 바람직하게 3개 내지 23개 길이의 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 루프 서열은 하기 서열들로 구성된 군에서 선택될 수 있다(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html). 추가적으로, 23개 뉴클레오티드로 구성되는 루프(loop) 서열은 또한 활성 siRNA를 제공한다(Jacque JM 등, Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26):
CCC, CCACC, 또는 CCACACC: Jacque JM 등, Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG: Lee NS 등, Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5; Fruscoloni P 등, Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10; 및
UUCAAGAGA: Dykxhoorn DM 등, Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67.
머리핀 루프 구조를 갖는 본 발명의 모범이 되고, 바람직한 이중 가닥 분자는 하기와 같다. 하기 구조에서, 상기 루프 서열은 AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC, 및 UUCAAGAGA로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다; 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 아니한다:
gauaugccaucccagauuu-[B]-aaaucugggauggcauauc (표적 서열 서열번호 16에 대한);
gucaaauuccccaaauuaa-[B]-uuaauuuggggaauuugac (표적 서열 서열번호 17에 대한); 및
guguccagaggccaauauu-[B]-aauauuggccucuggacac (표적 서열 서열번호 19에 대한).
추가적으로, 상기 이중 가닥 분자의 억제 활성을 강화하기 위해, 뉴클레오티드 "u"는 표적 서열의 안티센스 가닥의 3' 말단에 3' 돌출(overhang)로서 첨가될 수 있다. 첨가되는 "u"의 개수는 적어도 2개, 일반적으로 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 5개이다. 상기 첨가되는 "u"들은 이중 가닥 분자의 안티센스 가닥의 3' 말단에서 단일 가닥을 형성한다.
이중 가닥 분자의 제조방법은 특별히 한정되지 아니하나, 당업계에서 알려진 화학적 합성 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 화학적 합성 방법에 따를 때, 센스 및 안티센스 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 개별적으로 합성된 다음 이중 가닥 분자를 얻기 위한 적절한 방법을 통해 함께 결합될 수 있다. 결합을 위한 특별한 예는 합성된 단일-가닥 폴리뉴클레오티드가 바람직하게는 적어도 3:7의 몰 비율로, 더욱 바람직하게는 약 4:6, 그리고 가장 바람직하게는 실질적으로 동일 몰 양(예, 약 5:5의 몰 비율)으로 혼합되는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 혼합물을 이중 가닥 분자가 분리(dissociate)되는 온도까지 가열한 다음 점차적으로 식힌다(cool down). 상기 결합된 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 알려진 주로 이용되는 방법에 의해 정제(purify)될 수 있다. 정제(purification) 방법의 예는 아가로즈 젤 전기영동을 이용한 방법이나 또는 남아있는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드가 예를 들어, 적절한 효소에 의한 분해(degradation)에 의해 선택적으로 제거되는 방법을 포함한다.
PKIB 또는 NAALADL2 서열 측면에 있으면서, 발현이 독립적으로, 또는 시간적이거나 공간적인 방법으로 조절될 수 있는 조절 서열들은 동일하거나 다를 수 있다. 상기 이중 가닥 분자는 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 주형을 예를 들어, 작은 핵 RNA(small nuclear RNA, snRNA) U6로부터 유래한 RNA pol III 전사 단위 또는 인간 H1 RNA 프로모터를 포함하는 벡터에 클로닝함으로써 세포내적으로 전사시킬 수 있다.
이중 가닥 분자를 포함하는 벡터
본 명세서에서 설명한 하나 이상의 이중 가닥 분자을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포 또한 본 발명에 포함된다. 바람직하게 본 발명의 벡터는 본 발명의 이중 가닥 분자를 발현가능한 형태로 암호화한다. 본 명세서에서 어구 "발현가능한 형태로"는 세포내 도입 시, 벡터가 분자를 발현할 것을 의미한다. 선호되는 구현예에서, 상기 벡터는 상기 이중 가닥 분자의 발현을 위해 필요한 조절 요소들(elements)을 포함한다. 본 발명의 상기와 같은 벡터들은 본 발명의 이중 가닥 분자들을 생산하거나, 또는 직접적으로 암 치료용 활성 성분으로서 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터들은, 예를 들어, PKIB 또는 NAALADL2 서열을 발현 벡터 내로 클로닝하여 조절 서열들이 양 가닥의 발현(DNA 분자의 전서에 의해)을 모두 허용하는 방법으로 PKIB 또는 NAALADL2 서열에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 제조될 수 있다(Lee NS 등, Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5). 예를 들어, mRNA에 대해 안티센스 가닥인 RNA 분자가 첫 번째 프로모터에 의해 전사되고(예, 클로닝 된 DNA의 3' 말단 측면에 위치한 프로모터 서열) mRNA에 대해 센스 가닥인 RNA 분자가 두 번째 프로모터에 의해 전사된다(예, 클로닝된 DNA의 5' 말단 측면에 위치한 프로모터 서열). 상기 센스 및 안티센스 가닥들은 유전자의 침묵(silencing)을 위한 이중 가닥 분자 구조체들을 생성하기 위해 생체 내(in vivo)에서 혼성화된다. 대신에, 상기 이중 가닥 분자의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 암호화하는 두 벡터 구조들이 각각 센스 및 안티센스(anti-sense) 가닥을 발현한 다음 이중 가닥 분자 구조체를 형성하기 위해 활용되어진다. 더욱이, 상기 클로닝된 서열은 2차 구조(secondary structure)를 갖는 구조체(예, 머리핀); 즉, 유전자의 센스 및 상보적인 안티센스 서열 모두를 포함하는 벡터의 단일 전사체를 암호화할 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 표적 세포의 게놈에 안정적으로 삽입되기 위해 제공될 수 있다(상동 재조합 카세트 벡터의 설명을 위한 예, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들어, Wolff 등, Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조할 수 있다. DNA-기반 운반 기술들의 예들은 "드러난 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피피카인(bupivicaine), 중합체, 펩티드-매개) 운반, 양이온 지질 복합체, 및 입자-매개("유전자 총(gene gun)") 또는 압력-매개 운반을 포함한다(예, 미국 특허 No. 5,922,687 참조).
본 발명의 벡터는, 예를 들어, 바이러스성 또는 박테리아성 벡터일 수 있다. 발현벡터의 예들은 인두종(vaccinia)이나 계두(fowlpox)와 같은 감쇄된 바이러스의 숙주를 포함한다(예, 미국 특허 No. 4,722,848 참조). 이러한 접근은 인두종(vaccinia) 바이러스의 이용(예, 이중 가닥 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터로서)과 연관된다. 표적 유전자를 발현하는 세포 내로 도입됨과 함께, 상기 재조합 인두종(vaccinia) 바이러스는 상기 분자를 발현하고 따라서 세포의 증식(proliferation)을 억제한다. 이용가능한 벡터의 또 다른 예는 바실 칼멧 궤린(Bacille Calmette Guerin, BCG)을 포함한다. BCG 벡터는 Stover등, Nature 1991, 351: 456-60에 설명되어 있다. 다양한 종류의 다른 벡터는 치료상의 투여와 상기 이중 가닥 분자의 생산을 위해 유용하다; 예들은 아데노 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이럴 벡터, 살모넬라 typhi 벡터, 독이 제거된 탄저균(anthrax) 독소(toxin) 벡터, 및 기타 같은 종류의 것을 포함한다. 예를 들어, Shata 등, Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock 등, J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; and Hipp 등, In Vivo 2000, 14: 571-85을 참조할 수 있다.
이중 가닥 분자를 이용한 암 치료 방법
본 발명에서, PKIB를 위한 3가지 다른 dsRNA, 및 NAALADL2를 위한 3가지 다른 dsRNA는 세포 성장을 억제하는 그것들의 능력을 시험하기 위해 제작되었다. 상기 PKIB를 위한 두 dsRNA는 세포 증식의 억제와 동시에 두 전립선암 세포주에서 상기 유전자들의 발현을 효과적으로 무력화(knock down)하였다(도 3의 A, B 및 C 참조). NAALADL2를 위한 한 dsRNA는 전립선암 세포주에서 발현 수준과 세포 성장 활성을 현저하게 감소시켰다(도 4의 A 내지 E 참조).
따라서, 본 발명은 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 억제를 통해 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 기능장애를 유도함으로써, 세포 성장(예, 전립선암 세포 성장)을 억제하는 방법을 제공한다. PKIB 또는 NAALADL2 유전자 발현은 PKIB 또는 NAALADL2 유전자를 특이적으로 표적화하는 본 발명의 상기 이중 가닥 분자들 중 어느 하나, 또는 상기 이중 가닥 분자들 중 어느 하나를 발현할 수 있는 본 발명의 벡터들 중 어느 하나에 의해 억제될 수 있다.
암 세포의 세포 성장을 억제하는 본 발명의 이중 가닥 분자 및 벡터들의 이러한 능력은 이것들이 암 치료 방법으로 사용될 수 있음을 의미한다. 따라서, PKIB 또는 NAALADL2 유전자들은 일반 기관들에서는 검출되기 어렵기 때문에, 본 발명은 PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 대한 이중 가닥 분자 또는 상기 분자를 발현하는 벡터를 투여함으로써 역효과(adverse effect)없이 전립선암 환자를 치료하는 방법을 제공한다(도 1 및 2 참조).
억제 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "특이적으로 억제"는 PKIB 또는 NAALADL2의 발현이나 생물학적 기능을 억제하는 작용제 또는 리간드의 능력을 의미한다. 특이적 억제는 전형적으로 기저치(background)에 비해 적어도 약 2배의 억제, 바람직하게는 약 10배 이상이고, 가장 바람직하게는 100배 이상의 PKIB 또는 NAALADL2 발현(예, 전사 또는 번역) 또는 관측된 생물학적 기능(예, 세포 성장 또는 증식, 세포사멸의 억제)의 억제를 초래한다. 발현 수준 및/또는 생물학적 기능은 처리 및 비처리 세포들 또는 처리 전후의 세포 집단을 비교하는 맥락으로 관측될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 또는 생물학적 기능은 완전히 억제된다. 전형적으로, 특이적 억제는 적절한 통계적 시험을 이용하는 PKIB 또는 NAALADL2 발현 또는 생물학적 기능에서 통계적으로 의미있는 감소이다(예, p = 0.05).
특별히, 본 발명은 하기 [1] 내지 [23]의 방법을 제공한다.
[1] PKIB 유전자 또는 NAALADL2 유전자를 과발현하는 세포에서 상기 유전자의 발현 및 세포 증식을 억제하고, 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 분리된 이중 가닥 분자를 적어도 하나 이상 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암 치료방법.
[2] 상기 센스 가닥은 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 [1]의 방법.
[3] 상기 전립선암은 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암인 것을 특징으로 하는 [1]의 방법;
[4] 복수 개 종류의 이중 가닥 분자가 투여되는 것을 특징으로 하는 [1]의 방법;
[5] 상기 복수 개 종류의 이중 가닥 분자는 동일한 유전자를 표적화하는 것을 특징으로 하는 [4]의 방법;
[6] 상기 이중 가닥 분자는 100개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [1]의 방법;
[7] 상기 이중 가닥 분자는 75개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [6]의 방법;
[8] 상기 이중 가닥 분자는 50개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [7]의 방법;
[9] 상기 이중 가닥 분자는 25개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [8]의 방법;
[10] 상기 이중 가닥 분자는 25개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [9]의 방법;
[11] 상기 이중 가닥 분자는 중간 단일-가닥(intervening single-strand)에 의해 연결되어진 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 [1]의 방법;.
[12] 상기 이중 가닥 분자는 5'-[A]-[B]-[A']-3'의 일반식을 가지며, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 [11]의 방법;
[13] 상기 이중 가닥 분자는 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 [1]의 방법;
[14] 상기 이중 가닥 분자는 DNA와 RNA를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 [1]의 방법;
[15] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 폴리뉴클레오티드와 RNA 폴리뉴클레오티드의 혼성체인 것을 특징으로 하는 [14]의 방법;
[16] 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 DNA와 RNA로 구성된 것을 특징으로 하는 [15]의 방법;
[17] 상기 이중 가닥 분자는 DNA와 RNA의 키메라(chimera)인 [14]의 방법;
[18] 안티센스의 3' 말단 측면 부위, 또는 센스 가닥의 5' 말단 측면 부위와 안티센스 가닥의 3' 말단 측면 부위 모두가 RNA로 구성된 [17]의방법;
[19] 상기 측면 부위는 9개 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성된 [18]의 방법;
[20] 상기 이중 가닥 분자는 3' 돌출(overhang)을 포함하는 [1]의 방법;
[21] 상기 이중 가닥 분자는 벡터에 의해 암호화 된 [1]의 방법;
[22] 상기 벡터에 의해 암호화되는 이중 가닥 분자는 5'-[A]-[B]-[A']-3'의 일반식을 가지고, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 [21]의 방법; 및
[23] 상기 이중 가닥 분자는 형질감염-촉진 작용제(transfection-enhancing agent) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 추가적으로 포함된 [1]의 방법.
이하, 본 발명의 방법을 상세히 설명한다.
PKIB 또는 NAALADL2 유전자를 발현하는 세포의 성장 은 상기 세포를 PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 대한 이중 가닥 분자, 상기 분자를 발현하는 벡터 또는 이들을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 억제된다. 상기 세포들은 추가적으로 형질감염 작용제와 접촉될 수 있다. 적절한 형질감염 작용제들은 당업계에 잘 알려져있다. 어구 "세포 성장의 억제"는 상기 분자에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포가 낮은 비율로 증식하거나 생존력이 감소한 것을 의미한다. 세포 성장은 예를 들어, MTT 세포 증식 분석법을 이용하는 것과 같은 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다.
세포가 본 발명 이중 가닥 분자의 표적 유전자를 발현 또는 과발현하는 한, 본 발명의 방법에 따라, 모든 종류의 세포의 성장이 억제될 수 있다. 예시적인 세포는 전립선암 세포를 포함한다.
따라서, PKIB 또는 NAALADL2와 관련된 질병을 겪고 있거나 이러한 질병의 발병 위험을 겪고 있는 환자들은 본 발명 이중 가닥 분자 중 하나 이상, 상기 분자 중 하나 이상을 발현하는 하나 이상의 벡터 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다. 예를 들어, 전립선암 환자들은 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다. 암의 유형은 진단될 종양의 특별한 유형에 따른 표준 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 전립선암은 전립선-특이적 항원(prostate-specific antigen, PSA) 또는 수지 직장 검사(digital rectal exam)로 진단될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 치료될 환자들은 PT-PCR이나 면역분석법을 통해 환자로부터 유래한 생체조직에서 PKIB 또는 NAAKADK2의 발현을 검출함으로써 선별된다. 바람직하게는, 본 발명의 치료 전에, 개체으로부터 유래한 상기 생체조직의 표본(specimen)은 예를 들어, 면역조직화학적 분석 또는 RT-PCR과 같이 당업계에서 잘 알려진 방법으로 PKIB 또는 NAALADL2 유전자 과발현 여부가 확인된다.
세포 성장을 억제하고, 그로써 암을 치료하는 본 발명의 방법에 따라, 복수 개 종류의 이중 가닥 분자(또는 이를 발현하는 벡터들, 또는 이를 포함하는 조성물들)를 투여 시, 각각의 분자는 PKIB 및/또는 NAALADL2의 동일 또는 상이한 표적 서열로 향하게 될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 PKIB 또는 NAALADL2로 향하는 이중 가닥 분자를 활용할 수 있다. 대신에, 예를 들어 상기 방법은 PKIB 및 NAALADL2로부터 선택되는 하나, 둘 또는 그 이상의 표적 서열로 향하는 이중 가닥 분자들을 활용할 수 있다.
세포 성장을 억제하기 위해, 본 발명의 이중 가닥 분자는 상기 분자와 이에 상응하는 mRNA 전사체의 결합을 달성할 형태로 세포 내에 직접 도입될 수 있다. 대신에, 상기와 같이, 상기 이중 가닥 분자를 암호화하는 DNA는 벡터로서 세포 내에 도입될 수 있다. 상기 이중 가닥 분자 및 벡터를 세포 내로 도입하기 위해, FuGENE(Rochediagnostices), 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen), 올리고펙타민(Oligofectamine)(Invitrogen), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector)(Wako pure Chemical)와 같은 형질감염-촉진 작용제가 이용될 수 있다.
치료제가 개체 내에서 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 감소, 또는 암의 크기, 파급, 전이 잠재력의 감소를 유발한다면, 효력이 있다고 판명될 수 있다. 상기 치료제가 예방적으로 적용된다면, "효력이 있다"는 것은 치료제가 암의 형성을 지체 또는 방해하거나 암의 임상적 증상을 억제 또는 완화시키는 것을 의미한다. 효능은 특정 암 유형을 진단 또는 치료하는 알려진 모든 종류의 방법과 관련하여 측정되어 진다.
예방 및 예방법은 병으로부터 사망률 또는 질병률의 부담을 줄이는 모든 활동을 포함한다. 예방 및 예방법은 "1차적, 2차적 및 3차적 예방 수준"에서 일어날 수 있다. 1차적 예방 및 예방법은 병의 발생을 피하는 것인 반면, 예방 및 예방법의 2차 및 3차적 수준은 기능을 회복하고, 질병-관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 형성된 질병의 부정적 효과를 감소시키는 것뿐만 아니라, 질병의 진행 및 증상의 발생의 예방 및 예방법을 목적으로 하는 활동을 포함한다. 대신에, 특별한 장애의 심각성을 완화시키는 것을 목적으로하는 광범위의 예방적 치료(예를 들어, 종양의 증식 및 전이의 감소, 신생혈관형성(angiogenesis)의 감소)를 포함한다.
암의 예방을 위한 치료 및/또는 그것의 수술 후 재발의 방지는 암 세포의 수술적 제거, 암적 세포의 성장 억제, 종양의 퇴화(involution) 또는 퇴보(regression), 암의 재발 및 억제의 유도, 종양 퇴보(regression), 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 단계 모두를 포함한다. 암의 치료 및/또는 예방은 암을 지닌 개인들의 사망률을 감소시키고 예후를 증진시키며, 혈액 내 종양 마커의 수위를 감소시키고, 암에 수반되는 검출가능한 증상을 효과적으로 감소시킨다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 화학량론적 양으로 표적 mRNA(PKIB 또는 NAALADL2)를 분해하는 것으로 이해된다. 어떠한 이론에 의해 결합되어질 것을 바라지 않지만, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 촉매적인 방법으로 표적 mRNA의 분해를 야기한다. 따라서, 표준적인 암 치료법과 비교했을 때, 현저히 적은 이중 가닥 분자는 치료적인 효과를 위해 암의 부위 또는 그 근처로 운반되어질 필요가 있다.
당업자는 개체의 체중, 나이, 성별, 병의 유형, 증상 및 다른 조건; 투여의 경로(route); 및 상기 투여가 국부적인지 또는 전신적인지 여부와 같은 인자들을 감안하여, 상기 개체에 투여될 본 발명의 이중 가닥 분자의 효과적인 양을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 상기 이중 가닥의 효과적인 양은 암의 부위 또는 그 근처에서 약 1nM 내지 약 100nM, 바람직하게는 약 2nM 내지 50nM, 보다 바람직하게는 약 2.5nM 내지 약 10nM의 세포 간 농도를 포함한다. 상기 이중 가닥 분자의 더 많거나 혹은 더 적은 양이 투여될 수 있는지는 심사숙고된다.
본 발명의 방법은 암(예를 들어, 전립선암, 특히 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암)의 성장 또는 전이를 억제하는데 이용될 수 있다. 특히, PKIB의 표적 서열(예, 서열번호 16 및 17)을 포함하는 이중 가닥 분자는 전립선암의 치료를 위해 특별히 선호된다; NAALADL2의 표적서열(예, 서열번호 19)을 포함하는 이중 가닥 분자는 전립선암의 치료를 위해 특별히 선호된다.
암 치료를 위해, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 또한 상기 이중 가닥 분자와 다른 약학적 작용제와 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 대신에, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 암 치료를 위해 설계된 또 다른 치료적 방법과의 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 암 치료 또는 암 전이 예방을 위해 현재 이용되는 치료적 방법(예, 방사선 치료, 수술 및 cisplatin, carboplatin, cyclophosphamide, 5-fluorouracil, adriamycin, daunorubicin 또는 tamoxifen과 같은 화학치료적 작용제를 이용한 치료)과의 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 이중 가닥 분자는 이중 가닥 분자 그 자체로서, 운반 시료와 함께, 또는 상기 이중 가닥을 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스성 벡터 중 어느 하나로서 개체에 투여될 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자와 함께 투여되는 적절한 운반 시료들은 Mirus Transit TKO(R) 친유성 시료; lipofectamine; cellfectin; 또는 폴리양이온(polycation; 예, 폴리리신(polylysine)), 또는 리포좀을 포함한다. 선호되는 운반 시료는 리포좀(liposomes)이다.
리포좀은 전립선 종양 조직과 같은 특별한 조직으로 상기 이중 가닥 분자의 운반을 도울 수 있고, 또한 상기 이중 가닥 분자의 혈액 반감기(half-life)를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사용에 적합한 리포좀은 일반적으로 중성 또는 음전하로 하전된 인지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함하는 표준 소낭-형성(vesicle-forming) 지질로부터 형성된다. 지질은 일반적으로 바람직한 리포좀 크기 및 혈액 흐름 내에서 리포좀의 반감기와 같은 인자를 고려함으로써 선별된다. 예를 들어, Szoka 등, Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467; 및 미국 특허. Nos. 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 및 5,019,369에 기재된 바와 같이 리포좀을 제작하는 다양한 방법들이 알려져 있고, 상기 문헌들의 전체적인 상세한 설명은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 가닥 분자를 캡슐로 싼 상기 리포좀은 상기 리포좀을 암 부위로 운반할 수 있는 리간드 분자를 포함한다. 종양 또는 혈관 표피 세포에 노출된 수용체에 결합하는, 종양 항원 또는 상피 세포 표면 항체에 결합하는 단일클론 항체와 같은 리간드가 선호된다.
특별히 바람직하게는, 단핵 대식세포와 내망세피계에 의해 제거되는 것을 피하기 위해 본 발명의 이중 가닥 분자를 캡슐로 싼 리포좀은, 예를 들어, 구조의 표면에 결합된 옵소닌화-억제 성분을 가지게 하는 것등과 같이 변형된다. 한 구현예에서, 본 발명의 리포좀은 옵소닌화-억제제 성분과 리간드를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 리포좀 제작에 사용되는 옵소닌화-억제 성분은 전형적으로 리포좀 막에 결합된 큰 친수성 다중체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 옵소닌화 억제 성분은 예를 들어, 지질-수용성 닻(anchor)을 막 자체에 끼워 넣거나, 또는 막 지질의 활성 그룹에 직접 결합시키는 등과 같이 화학적 또는 물리적으로 막에 부착되었을 때, 옵소닌화 억제 성분이 리포좀 막에 "결합"된다고 한다. 상기 옵소닌화-억제 친수성 다중체는 대식세포-단핵구계(macrophage-monocyte system, "MMS")와 내망세피계(reticuloendothelial system, "RES")에 의한 리포좀의 흡수(uptake)를 현저히 감소시키는 보호 표면 층(protective surface layer)을 형성한다; 예, 미국 특허 No. 4,920,016에 기재된 바와 같이, 상기의 전체적인 상세한 설명은 본 명세서에 참조로서 통합된다. 따라서, 옵소닌화-억제 성분으로 변형된 리포좀은 변형되지 않은 리포좀보다 훨씬 오래 순환에 잔존한다. 이러한 이유 때문에, 상기 리포좀은 종종 "스텔스(stealth)" 리포좀이라고 불린다.
스텔스 리포좀들은 다공성의 또는 "새기 쉬운" 미세혈관(microvasculature)에 의해 제공된 조직에서 축적되어지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 예를 들어 고형 종양(solid tumor)과 같이 상기 미세혈관 결함(defects)에 의해 특징화되는 표적 조직은 효율적으로 상기 리포좀을 축적할 것이다; Gabizon 등, Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53 참조. 게다가, RES에 의해 감소된 흡수는 간과 비장에 현저한 축적을 막음으로써 스텔스 리포좀의 독성을 낮춘다. 따라서, 옵소닌화-억제 성분으로 변형된 본 발명의 리포좀은 본 발명의 이중 가닥 분자를 종양 세포로 운반할 수 있다.
리포좀을 변형하는데 적합한 옵소닌화 억제 성분은 바람직하게는 약 500 내지 40,000달톤, 더욱 바람직하게는 약 2,000 내지 20,000달톤의 분자량을 지닌 수용성 다중체이다. 상기 다중체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 또는 폴리포로필렌 글리콜(polypropylene glycol, PPG) 유도체들을 포함한다; 메톡시 PEG 또는 PPG, 및PEG 또는 PPG 스테아르산염(stearate); 폴리아크릴아미드 또는 폴리 N-비닐 피롤리돈(pyrrolidone)과 같은 합성 다중체; 선형, 가지형, 또는 수지상형의 폴리아미도아민; 폴리아크릴산; 강글리오시드 GM. sub.1과 같은 강글리오시드뿐만 아니라, 카복실 또는 아미노 그룹들이 화학적으로 연결된 폴리비닐알콜 및 폴리자일리톨과 같은 폴리알콜. PEG, 메톡시 PEG, 또는 메톡시 PPG, 또는 이들의 유도체들의 공중합체(copolymer)들 역시 적합하다. 게다가, 상기 옵소닌화 억제 중합체는 PEG의 공중합체의 블럭(block) 및 폴리아미노산, 다당류(polysaccharide), 폴리아미도아민, 폴리에틸렌아민, 또는 폴리핵산 중 어느 하나일 수 있다. 상기 옵소닌화 억제 중합체는 또한 갈락투론산(galacturonic acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 마누론산(mannuronic acid), 히알루론산(hyaluronic acid), 펙트산(pectic acid), 노이라민산(neuraminic acid), 알긴산(alginic acid), 카리기난(carrageenan)과 같은 아미노산 또는 카복실산을 포함하는 천연 다당류; 아민화된 다당류 또는 올리고당(oligosaccharides)(선형 또는 가지형); 또는 예를 들어, 탄산(carbonic acids)의 유도체들과 반응하여 결과적으로 카복실 그룹이 연결된 것과 같이 카복실화 된 다당류 또는 올리고당(oligosaccharides)일 수 있다.
바람직하게는, 상기 옵소닌화-억제 성분은 PEG, PPG, 또는 이들의 유도체이다. PEG 또는 PEG-유도체로 변형된 리포좀은 종종 "PEG화 리포좀"으로 불려진다.
상기 옵소닌화 억제 성분은 잘 알려진 다양한 모든 방법에 의해 리포좀 막에 결합될 수 있다. 예를 들어, PEG의 N-히드록시숙신이미드 에스터는 포스파티딜-에탄올아민 지질-수용성 닻(anchor)에 결합된 다음 막에 결합될 수 있다. 유사하게, 덱스트란(dextran) 중합체는 Na(CN)BH. sub. 3 및 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)과 물을 60℃에서 30:12 비율로 혼합한 것과 같은 용매 혼합물(solvent mixture)을 이용한 환원적 아민화를 통해 스테아릴아민 지질-수용성 닻(anchor)으로 유도체화(derivatization)될 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 분자를 발현하는 벡터는 상기에서 기재한 바와 같다. 또한, 본 발명의 이중 가닥 분자를 하나 이상 발현하는 상기 벡터들은 직접, 또는 Mirus Transit LT1(R) 친유성 시료; lipofectin; lipofectamine; cellfectin; 또는 폴리양이온(polycation; 예, 폴리리신(polylysine)), 또는 리포좀을 포함하는 적합한 운반 시료와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 이중 가닥 분자를 발현하는 재조합 바이러스성 벡터를 환자 내 암 부위로 운반하는 방법은 당업계의 기술에 속한다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 상기 이중 가닥 분자를 암 부위로 운반하는 적합한 모든 수단에 의해 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 이중 가닥 분자는 유전자 총, 전기천공법, 또는 다른 적합한 비경구 또는 경구 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
적합한 경구 투여 경로는 구강, 직장, 또는 비강 운반을 포함한다.
적합한 비경구 투여경로는 혈관내 투여(예, 정맥 볼루스 주사(intravenous bolus injection), 정맥내 주입(intravenous infusion), 동맥 내 볼루스 주사(intra-arterial bolus injection), 정맥내 주입(intra-arterial infusion) 및 맥관(vasculature)으로의 카테터 점적주사(catheter instillation)); 조직 근처- 및 내부- 주사(peri- and intra-tissue injection)(예, 종양 내- 및 종양-근처 주사(peri-tumoral and intra-tumoral injection)); 피하 주입을 포함하는 피하 주사 또는 축적(삼투-펌프에 의한 것처럼); 예를 들어 카테터 또는 다른 대체 기구(예, 좌약 또는 다공성, 비-다공성, 또는 아교질의 물질을 포함하는 주입관(implant))등에 의한 암 부위 또는 그 근처에 직접 바르는 약; 및 흡입제를 포함한다. 상기 이중 가닥 분자 또는 벡터의 주사 또는 주입은 암의 부위 또는 그 근처에서 행하여 지는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 1회 복용 또는 복수 회 복용으로 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 이중 가닥 분자의 주입에 의해 투여되는 곳에서, 상기 주입은 1회 유지된 복용일 수 있거나, 또는 복수회의 주입에 의해 운반될 수 있다. 조직 내로 상기 작용제의 직접 주입은 암 부위 또는 그 근처에서 행해짐이 바람직하다. 조직 내로 상기 작용제의 복수 회 주입은 암 부위 또는 그 근처에서 행해짐이 특히 바람직하다.
또한, 당업자는 개체에 본 발명의 상기 이중 가닥 분자를 투여하기 위한 적절한 복용계획을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 이중 가닥 분자는 개체에 예를 들어, 암 부위 또는 그 근처에 1회 주사 또는 주입하는 것과 같이 한번 투여될 수 있다. 대신에, 상기 이중 가닥 분자는 약 3일 내지 약 28일의 기간 동안 개체에 매일 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 바람직한 복용계획에서는, 상기 이중 가닥 분자는 7일 동안 하루에 한번 씩 암 부위 또는 그 근처에 주사된다. 복용 계획이 복수회의 투여를 포함하는 경우, 개체에 투여되는 이중 가닥 분자의 유효량이 전체 복용 계획을 초과하여 투여된 이중 가닥 분자의 전체 양을 포함할 수 있다.
이중 가닥 분자를 포함하는 조성물
나아가, 본 발명은 본 발명의 이중 가닥 분자 또는 상기 분자를 암호화하는 벡터 중 적어도 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특별히, 본 발명은 하기 조성물 [1] 내지 [23]을 제공한다:
[1] PKIB 유전자 또는 NAALADL2 유전자의 발현과 세포 증식을 억제하고, 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 분리된 이중 가닥 분자를 하나 이상 포함하는, 전립선암 치료용 조성물.
[2] 상기 센스 가닥은 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 [1]의 조성물.
[3] 상기 치료될 전립선암은 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암인 것을 특징으로 하는 [1]의 조성물;
[4] 복수 개 종류의 이중 가닥 분자가 투여되는 것을 특징으로 하는 [1]의 조성물;
[5] 상기 복수 개 종류의 이중 가닥 분자는 동일한 유전자를 표적화하는 것을 특징으로 하는 [4]의 조성물;
[6] 상기 이중 가닥 분자는 100개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [1]의 조성물;
[7] 상기 이중 가닥 분자는 75개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [6]의 조성물;
[8] 상기 이중 가닥 분자는 50개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [7]의 조성물;
[9] 상기 이중 가닥 분자는 25개의 뉴클레오티드보다 짧은 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [8]의 조성물;
[10] 상기 이중 가닥 분자는 약 19개 내지 약 25개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 [9]의 조성물;
[11] 상기 이중 가닥 분자는 중간 단일-가닥(intervening single-strand)에 의해 연결되어진 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 [1]의 조성물;
[12] 상기 이중 가닥 분자는 5'-[A]-[B]-[A']-3'의 일반식을 가지고, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 [11]의 조성물;
[13] 상기 이중 가닥 분자는 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 [1]의 조성물;
[14] 상기 이중 가닥 분자는 DNA와 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 [1]의 조성물;
[15] 상기 이중 가닥 분자는 DNA 폴리뉴클레오티드와 RNA 폴리뉴클레오티드의 혼성체인 것을 특징으로 하는 [14]의 조성물;
[16] 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 DNA와 RNA로 구성된 것을 특징으로 하는 [15]의 조성물;
[17] 상기 이중 가닥 분자는 DNA와 RNA의 키메라(chimera)인 [14]의 조성물;
[18] 안티센스의 3' 말단 측면 부위, 또는 센스 가닥의 5' 말단 측면 부위와 안티센스 가닥의 3' 말단 측면 부위 모두가 RNA로 구성된 [17]의 조성물;
[19] 상기 측면 부위는 9개 내지 13개의 뉴클레오티드로 구성된 [18]의 조성물;
[20] 상기 이중 가닥 분자는 3' 돌출(overhang)을 포함하는 [1]의 조성물;
[21] 상기 이중 가닥 분자는 벡터에 의해 암호화되고, 상기 조성물에 포함된 [1]의 조성물;
[22] 상기 이중 가닥 분자는 5'-[A]-[B]-[A']-3'의 일반식을 가지고, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 [21]의 조성물; 및
[23] 이중 가닥 분자는 상기 조성물은 형질감염-촉진 작용제(transfection-enhancing agent) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 [1]의 조성물.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
당업계에 알려진 기술에 따라 , 개체에 투여함에 앞서 본 발명의 상기 이중 가닥 분자는 약학적 조성물로서 제형되는 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물은 최소한 무균(sterile)이고 발열성 물질이 없는(pyrogen-free) 것으로 특징화된다. 본 명세서에서 사용된 "약학적 제형들(pharmaceutical formulations)"은 인간 및 수의용(veterinary) 제형을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물을 제작하는 방법은 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)에 기재된 바와 같이 당업계의 기술분야에 속하고, 상기의 전체적인 상세한 설명은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
본 발명의 약학적 제형은 본 발명의 상기 이중 가닥 분자들 또는 이들을 암호화하는 벡터(예, 0.1 내지 90 중량%) 또는 생리학적으로 허용가능한 담체(carrier) 매개체(medium)와 혼합된, 상기 분자의 생리학적으로 허용가능한 염 중 하나 이상을 포함한다. 선호되는 생리학적으로 허용가능한 담체 매개체는 물, 완충된 물, 일반 식염수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산(hyaluronic acid) 및 기타 이와 같은 종류의 것이다.
본 발명에 따를 때, 상기 조성물은 복수 개 종류의 이중 가닥 분자를 포함할 수 있고, 상기 분자들 각각은 PKIB 및/또는 NAALADL2와 동일 또는 상이한 표적 서열로 향할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 PKIB 또는 NAALADL2로 향하는 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다. 대신에, 예를 들어, 상기 조성물은 PKIB 및 NAALADL2로부터 선택되는 하나, 둘 또는 그 이상의 표적 서열로 향하는 이중 가닥 분자를 포함할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 조성물은 하나 또는 복수 개의 이중 가닥 분자들을 암호화하는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 벡터는 하나, 둘 또는 여러 종류의 본 발명의 이중 가닥 분자들을 암호화할 수 있다. 대신에, 본 발명의 조성물은 상이한 이중 가닥 분자를 각각 암호화하는 복수 개 종류의 벡터를 포함할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 이중 가닥 분자는 본 발명의 조성물 내에 리포좀으로 포함될 수 있다. 하기 "이중 가닥 분자를 이용한 암 치료 방법" 항목을 참조할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 관습적인 약학적 부형제(excipients) 및/또는 첨가제(additives)을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 부형제들은 안정제(stabilizers), 항산화제(antioxidants), 오스몰 조절 작용제(osmolality adjusting agents), 완충액, 및 pH 조절 작용제(pH adjusting agents)를 포함한다. 적합한 첨가제들은 생리학적으로 생체적합한 완충액(physiologically biocompatible buffers)(예, 트로메타민 염화수소(tromethamine hydrochloride)), 킬란트(chelants)(DTPA 또는 DTPA-비스아미드(DTPA-bisamide)와 같은)의 첨가, 또는 칼슘 킬레이트 복합체(예를 들어 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아미드(CaNaDTPA-bisamide)), 또는, 선택적으로, 칼슘 또는 나트륨 염의 첨가(예를 들어, 염화칼슘, 아스코르브산칼슘(calcium ascorbate), 글루콘산칼슘(calcium gluconate) 또는 젖산칼슘(calcium lactate))를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 사용을 위해 액체 형태로 포장되거나, 또는 감압 동결 건조(lyophilized)될 수 있다.
고체 조성물의 경우, 관습적인 비독성의(nontoxic) 고체 담체가 사용될 수 있다; 예를 들어, 약학적 등급의 마니톨(mannitol), 락토오스, 녹말, 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 사카린나트륨(sodium saccharin), 활석(talcum), 셀룰로오즈, 포도당, 수크로즈, 탄산마그네슘(magnesium carbonate), 및 기타 이와 같은 종류의 것.
예를 들어, 구강 투여를 위한 고체 약학적 조성물은 상기 담체와 부형제 및 20-95%, 바람직하게는 25-75%의 본 발명의 이중 가닥 분자들 중 어느 하나가 포함될 수 있다. 연무제의(흡입제의) 투여를 위한 약학적 조성물은 상기에 기재한 바와 같이 리포좀으로 캡슐화한 하나 이상의 0.01-20 중량%, 바람직하게는 1-10 중량%의 본 발명의 이중 가닥 분자 및 촉진제(propellants)를 포함할 수 있다. 또한, 담체는 선택에 따라 포함될 수도 있다; 예, 비강 내 운반을 위한 레시틴(lecithin).
상기와 더불어, 본 발명의 이중 가닥 분자의 생체 내(in vivo) 기능을 억제하지 않는 한, 본 발명의 조성물은 다른 약학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 암 치료를 위해 관습적으로 이용되는 화학치료용 작용제를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 PKIB 및/또는 NAALADL2 유전자를 발현하는 암 치료용 약학적 조성물을 제조함에 본 발명의 상기 이중 가닥 핵산 분자의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되고, 세포 내에서 PKIB 유전자 또는 NAALADL2 유전자의 발현을 억제하는 분리된 이중 가닥 핵산 분자의 용도와 관련이 있고, PKIB 및/또는 NAALADL2 유전자를 발현하는 암 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위해 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군에서 선택되는 서열로 표적화된다.
대신에, 본 발명은 추가적으로 PKIB 및/또는 NAALADL2 유전자를 발현하는 암 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 것으로서, 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 PKIB 및/또는 NAALADL2 유전자의 발현을 억제하는 이중 가닥 핵산 분자를 제형하는 단계를 포함하는 방법 또는 과정을 제공하는데, 상기 분자는 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되고, 활성 성분으로 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군에서 선택되는 서열로 표적화된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 PKIB 및/또는 NAALADL2 유전자를 발현하는 암 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 것으로서, 활성 성분을 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 방법 또는 과정을 제공하는데, 상기 활성 성분은 세포 내에서 PKIB 및/또는 NAALADL2 유전자의 발현을 억제하는 이중 가닥 핵산 분자이고, 상기 분자는 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성되고, 활성 성분으로 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군에서 선택되는 서열로 표적화된다.
대신에, 본 발명에 따를 때, 전립선암 치료를 위한 약학적 조성물 제조를 위한 본 발명의 상기 이중 가닥의 용도가 제공된다. 추가적으로 본 발명은 또한 전립선암 치료를 위한 본 발명의 상기 이중 가닥 분자를 제공한다.
전립선암 진단 방법
PKIB 또는 NAALADL2의 발현은 특히 전립선 암에서 증가되어 나타난다(도 1의 A, B, C,. D, E, F 및 도 2의 A 및 H). 따라서, 본 명세서에서 확인되는 유전자뿐만 아니라 그것의 전사 및 번역 산물도 전립선암을 위한 마커로서 진단적 활용을 찾고, 세포 시료 내에서 PKIB 또는 NAALADL2의 발현을 측정함으로써, 전립선암을 진단할 수 있다. 특히, 본 발명은 개체에서 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 수위를 측정함으로써 전립선암을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 진단될 수 있는 상기 전립선암은 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암을 포함한다.
본 발명의 방법은 개체의 조건을 결정하기 위해 초기 결과를 제공할 수 있다. 이러한 초기 결과들은 병을 진단하는 의사, 간호사, 또는 기타 개인현업자(practitioner)를 돕기 위해 추가적인 정보와 조합될 수 있다. 대신에 본 발명은 개체-유래 조직에서 암적인 세포들을 검출하기 위해 이용될 수 있고, 의사에게 병 진단을 위한 유용한 정보를 제공한다.
특히 본 발명은 하기 [1] 내지 [10]의 방법을 제공한다:
[1] 하기 (a) 내지 (b) 단계를 포함하는 전립선암 존재의 진단 또는 검출 방법:
(a) 생물학적 시료에서 PKIB 또는 NAALADL2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 발현 수위를 검출하는 단계; 및
(b) 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 발현 수준의 증가를 전립선암과 연관짓는 단계.
[2] 상기 발현 수준은 상기 정상 대조군 수준에 비해 최소한 10% 이상인 것을 특징으로 하는 [1]의 방법.
[3] 상기 발현 수준은 하기 (i) 내지 (iii)의 방법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 검출되는 [1]의 방법:
(i) PKIB 또는 NAALADL2의 서열을 포함하는 mRNA를 검출하는 방법,
(ii) PKIB 또는 NAALADL2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 검출하는 방법,
(iii) PKIB 또는 NAALADL2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 방법.
[4] 상기 전립선암은 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암인 것을 특징으로 하는 [1]의 방법.
[5] 상기 발현 수준은 상기 유전자의 유전자 전사체에 대한 탐침의 혼성을 검출함으로써 측정하는 것을 특징으로 하는 [3]의 방법.
[6] 상기 발현 수준은 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 상기 유전자의 발현 수준으로 결정되는 것을 특징으로 하는 [3]의 방법.
[7] 상기 생물학적 시료은 생체조직, 가래, 혈액 또는 소변을 포함하는 [1]의 방법.
[8] 상기 개체-유래(subject-derived) 생물학적 시료은 상피 세포를 포함하는 [1]의 방법.
[9] 상기 개체-유래(subject-derived) 생물학적 시료은 암 세포를 포함하는 [1]의 방법.
[10] 상기 개체-유래(subject-derived) 생물학적 시료은 암적인 상피 세포를 포함하는 [1]의 방법.
이하, 전립선암의 존재를 진단 또는 검출하는 방법을 더욱 상세히 설명한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 진단되는 개체은 포유동물이다. 예시적인 포유동물은, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류(primate), 마우스, 랫, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 진단을 수행하기 위해, 진단될 개체으로부터 생물학적 시료을 수집하는 것이 선호된다. 상기 생물학적 물질이 PKIB 또는 NAALADL2의 목적 전사 또는 번역 산물을 포함하는 한, 모든 생물학적 물질이 생물학적 시료로서 사용될 수 있다. 상기 생물학적 시료은 체조직 및 혈액, 가래 및 소변과 같은 체액을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 바람직하게, 상기 생물학적 시료은 상피 세포, 더욱 바람직하게는 암적인 상피 세포 또는 암적일 것으로 의심되는 전립선 조직으로부터 유래된 상피 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 나아가, 필요하다면, 상기 세포는 입수된 체조직 및 체액으로부터 정제된 다음, 생물학적 시료로 사용될 수 있다.
본 발명에 따를 때, 상기 개체-유래 생물학적 시료에서 상기 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 수준이 측정된다. 상기 발현 수준은 당업계에서 알려진 방법들을 이용하여, 전사 산물(핵산) 수준에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 PKIB 또는 NAALADL2의 mRNA는 혼성 방법(예, 노던 혼성(Northern hybridization))에 의해 탐침을 이용하여 정량될 수 있다. 상기 검출은 침 또는 어레이(array) 상에서 수행될 수 있다. 어레이의 용도는 바람직하게 PKIB 또는 NAALADL2를 포함하는 복수 개의 유전자(예, 다양한 암 특이적 유전자)의 발현 수준을 검출하기 위한 것이다. 당업자는 PKIB(서열번호 1; GenBank accession number: NM_181795) 또는 NAALADL2(서열번호 3; GenBank accession number: NM_207015 또는 서열번호 5; GenBank accession number: AK021754)의 서열 정보를 활용하여 상기와 같은 탐침들을 제작할 수 있다. 예를 들어, PKIB 또는 NAALADL2의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광물 및 동위원소와 같은 적합한 표지로 표지화될 수 있고, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 혼성화된 표지들의 강도로서 검출될 수 있다. 추가적으로, 상기 PKIB 또는 NAALADL2의 전사 산물은 프라이머들을 이용하여 증폭-기반 검출 방법(예, RT-PCR)에 의해 정량화될 수 있다. 상기와 같은 프라이머들은 상기 유전자의 입수가능한 서열 정보를 기반으로 제작될 수 있다. 예를 들어, 실시예에서 사용된 프라이머들(서열번호 9 내지 15)은 RT-PCR 또는 노던 블럿(Northern blot)에 의한 검출을 위해 이용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 아니한다.
특히, 본 발명의 방법을 위해 사용되어 지는 탐침 또는 프라이머는 엄격한, 적당히 온건한, 또는 낮게 엄격한 조건하에서 PKIB 또는 NAALADL2의 mRNA에 혼성화된다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "엄격한 (혼성) 조건들"은 탐침 또는 프라이머가 다른 서열이 아닌 그것의 표적 서열에 혼성화 될 조건을 의미한다. 엄격한 조건들은 서열-의존적이고, 상이한 환경하에서 서로 다를 수 있다. 더 긴 서열의 특이적 혼성은 더 짧은 서열보다 더 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로 엄격한 조건의 상기 온도는 특정 이온 세기 및 pH에서 특이적 서열을 위한 열적 녹는점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택되어 진다. 상기 Tm은 평형상태에서 표적 서열에 상보적인 탐침의 50%가 표적 서열에 혼성되는 온도(특정 이온 세기, pH 및 핵산 농도하에서)이다. 상기 표적 서열은 일반적으로 과도하게 존재하므로, Tm에서, 탐침의 50%가 평형상태에서 채워진다. 전형적으로, 엄격한 조건들은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온보다 낮은, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온( 또는 다른 염)인 것이고, 상기 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머(10 내지 50 뉴클레오티드)인 경우 최소한 약 30℃이고, 긴 탐침 또는 프라이머인 경우 최소한 약 60℃이다. 또한, 엄격한 조건들은 포름아미드와 같은 불안정화 작용제(destabilizing agents)의 첨가를 통해 형성될 수 있다.
대신에, 상기 번역 산물은 본 발명의 진단을 위해 검출될 수 있다. 예를 들어, PKIB 또는 NAALADL2 단백질의 양이 측정될 수 있다. 번역 산물로서 단백질의 양을 측정하는 방법은 PKIB 또는 NAALADL2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하는 면역분석(immunoassay) 방법들을 포함한다. 상기 항체는 단일클론 또는 다중클론일 수 있다. 추가적으로 항체의 조각이 PKIB 또는 NAALADL2 단백질에 대한 결합력을 유지하는 한, 상기 항체의 모든 조각 또는 변형(예, 키메라성 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv 등)이 검출을 위해 이용될 수 있다. 단백질의 검출을 위해 이러한 종류의 항체들을 제작하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이러한 항체들 및 이의 등가물들을 제작하기 위해 모든 방법들이 본 발명에서 이용될 수 있다. 바람직하게는, PKIB에 결합하는 상기 항체는 SARAGRRNALPDIQSSAATD (서열번호 33) 또는 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK (서열번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 항원결정기 펩티드로 제작된다. 반면, NAALADL2에 결합하는 상기 항체는 세포외 도메인 (서열번호 32)를 포함하는 항원결정기 펩티드로 제작된다.
PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 번역 산물을 기반으로 상기 유전자의 발현 수준을 검출하는 또 다른 방법으로서, 염색의 강도는 PKIB 또는 NAALADL2 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직화학적 분석을 통해 관찰될 수 있다. 다시 말해, 강한 염색의 관찰은 증가된 상기 단백질의 존재와 동시에 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 높은 발현수준을 의미한다.
더욱이, PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 수준과 함께, 예를 들어, 전립선암에서 별개로 발현되는 것으로 알려진 유전자들 같은 다른 암 -관련 유전자의 발현 또한 진단의 정확도를 증가시키기 위해 측정될 수 있다.
PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 대조군 수준에서 발현 수준이, 예를 들어, 10%, 25%, 또는 50% 증가했거나; 또는 1.1 배, 1.5 배, 2.0배, 5.0배, 10.0배, 또는 그 이상 더 증가한 경우, 생물학적 시료에서 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 수준이 증가했다고 고려할 수 있다.
상기 대조군 수준은 병 상태(암적 또는 비-암적)가 알려진 개체/개체들로부터 미리 수집되어 보관된 시료을 이용함으로써 시험 생물학적 시료과 동시에 측정될 수 있다. 대신에, 상기 대조군 수준은 병 상태가 알려진 개체들로부터 유래한 시료에서 미리 측정된 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 수준(들)을 분석함으로써 얻은 결과를 기반으로 통계학적 방법에 의해 측정될 수 있다. 추가적으로 상기 대조군 수준은 미리 시험된 세포들로부터 발현 양상의 데이터베이스일 수 있다. 더욱이 본 발명의 관점에 따를 때, 생물학적 시료에서 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 수준은 복수 개의 참조 시료들로부터 측정된 복수 개의 대조군 수준들과 비교될 수 있다. 환자-유래 생물학적 시료과 유사한 유형의 조직으로부터 유래한 참조 시료로부터 측정된 대조군 수준을 이용하는 것이 선호된다. 더욱이, 병 상태가 알려진 집단에서 PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 수준의 표준 값을 이용하는 것이 선호된다. 상기 표준 값은 당업계에 알려진 모든 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 평균±2 S.D 또는 평균±3 S.D의 범위는 표준 값으로 사용될 수 있다. 본 발명의 관점에서, 암적이지 않다고 알려진 생물학적 시료에서 측정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준"이라 명명된다. 반면에, 대조군 수준이 암적인 생물학적 시료에서 측정된다면, 이는 "암적 대조군 수준"이라고 명명된다.
PKIB 또는 NAALADL2 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가하거나, 암적 대조군 수준과 유사하면, 상기 개체은 암을 겪고 있거나, 암 발생의 위험이 있다고 진단될 수 있다. 추가적으로 복수 개의 암-관련 유전자들의 발현 수준이 비교되었을 때, 상기 시료과 참조 시료 간 유전자 발현 양상의 유사성은 개체이 암을 겪고 있거나, 암 발생의 위험이 있다는 것을 암시한다.
시험 생물학적 시료과 상기 대조군 수준의 발현 수준들 간 차이는 세포의 암적 또는 비-암적 상태에 따라 발현 수준들이 다르지 않은 것으로 알려진 대조군 핵산(예, 항존 유전자(housekeeping genes))의 발현 수준으로 표준화될 수 있다. 예시적인 대조군 유전자는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드 3 포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보좀 단백직 P1을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다.
항-전립선암 화합물의 스크리닝
본 발명의 관점에서, 본 발명의 스크리닝 방법들을 통해 확인될 작용제는 모든 화합물 또는 여러 화합물들을 포함하는 조성물일 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 세포 또는 단백질에 노출되는 피검 작용제는 단일 화합물 또는 화합물들의 조합일 수 있다. 화합물들의 조합이 상기 방법에서 사용될 때, 상기 화합물들은 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다.
예를 들어, 세포 추출물, 세포 배양 상청액, 발효중인 미생물의 산물, 해양 생물의 추출물, 식물 추출물, 정제된 단백질 또는 조단백질, 펩티드, 비-펩티드 화합물들, 합성 미세분자 화합물들(안티센스 RNA, siRNA, 리보자임 등과 같은 핵산 구조체를 포함하는) 및 천연 화합물들 같은 모든 피검 작용제가 본 발명의 스크리닝 방법에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 피검 작용제는 (1)생물학적 라이브러리들, (2) 공간적으로 접근가능한 평행 고체 상 또는 용액 상 라이브러리들, (3) 디컨볼루션(deconvolution)이 필요한 합성 라이브러리 방법들, (4) "일-비드 일-화합물" 라이브러리 방법 및 (5) 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 선별을 이용한 합성 라이브러리 방법들을 포함하여, 당업계에서 알려진 조합라이브러리 방법들 내 모든 다양한 접근법들을 이용해 얻을 수 있다. 다른 4가지 접근법들은 펩티드, 비-펩티드 저중합체(oligomer) 또는 화합물들의 작은 분자 라이브러리들에 적용가능한 반면(Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67), 친화도 크로마토그래피 선별을 이용한 상기 생물학적 라이브러리 방법들은 펩티드 라이브러리들에 한정된다. 분자적 라이브러리들의 합성 방법의 예들은 당업계에서 찾을 수 있다(DeWitt 등, Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13; Erb 등, Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6; Zuckermann 등, J Med Chem 37: 2678-85, 1994; Cho 등, Science 1993, 261: 1303-5; Carell 등, Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059; Carell 등, Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061; Gallop 등, J Med Chem 1994, 37: 1233-51). 화합물들의 라이브러리들은 용액(Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21 참조) 또는 비드(Lam, Nature 1991, 354: 82-4), 칩(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6), 박테리아(미국특허 No. 5,223,409), 포자(미국특허 No. 5,571,698; 5,403,484, 및 5,223,409), 플라스미드(Cull 등, Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9), 또는 파지(Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90; Devlin, Science 1990, 249: 404-6; Cwirla 등, Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10; 미국 특허 출원 2002103360) 상에서 제공될 수 있다.
본 발명의 모든 스크리닝 방법들에 의해 스크리닝되는 화합물의 구조의 일부가 첨가, 삭제, 및/또는 대체에 의해 변환된 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 확인된 작용제에 포함된다.
추가적으로, 스크리닝된 피검 작용제가 단백질인 경우, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 얻기 위해, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 유추하기 위해 상기 단백질의 전체 아미노산 서열이 측정되거나 또는 상기 아미노산 서열을 기반으로 탐침으로서의 올리고 DNA를 제작하기 위해 얻어진 단백질의 부분적 아미노산 서열을 분석하여, 단백질을 암호화하는 DNA를 얻기 위해 상기 탐침으로 cDNA 라이브러리들을 스크리닝할 수 있다. 상기 얻어진 DNA는 암 치료 또는 예방용 후보인 피검 작용제의 제작에 있어서 그것의 사용가능성에 의해 확인된다.
또한, 본 명세서에 기재된 스크리닝에 유용한 피검 작용제들은 PKIB 또는 NAALADL2 단백질 또는 생체 내에서(in vivo) 원래 단백질의 생물학적 활성을 결핍한 이들의 부분 펩티드들일 수 있다.
비록 피검 작용제의 제작이 당업계에서 잘 알려져 있지만, 이하 본 명세서에서는, 본 발명의 스크리닝 방법을 위해 피검 작용제를 확인하고 이러한 작용제의 라이브러리들을 제작하는 추가적인 지침을 제공한다.
(i) 분자 설계
피검 작용제 라이브러리들의 제작은 원하는 특성들을 갖는 것으로 알려진 화합물들의 분자 구조 및/또는 억제되는 표적 분자(예, PKIB 및 NAALADL2)들의 분자 구조에 대한 정보에 의해 촉진된다. 추가적인 평가에 적합한 피검 작용제의 사전 스크리닝에 대한 한 가지 접근법은 피검 작용제와 그것의 표적 간의 상호작용의 컴퓨터 모델링이다.
컴퓨터 모델링 기술은 선택된 분자 및 상기 분자와 상호작용할 합리적인 설계의 새로운 화합물의 3차원적 원자 구조의 시각화를 가능하게 한다. 상기 3차원적 구조는 전형적으로 선택된 분자의 x선 결정 분석(x-ray crystallographic analysis) 또는 NMR 영상으로부터 얻은 데이터에 의존한다. 상기 분자 동역학은 역장(force field) 데이터를 필요로 한다. 상기 컴퓨터 그래픽 체계들은 새로운 화합물이 상기 표적 분자에 연결될 방법의 예측이 가능하게 하고, 결합 특이성을 완벽하게 하기 위해 상기 화합물의 구조와 상기 표적 분자의 실험적 조작을 가능하게 한다. 분자와 화합물 중 어느 하나 또는 둘 모두에 작은 변화들이 발생할 때 어떠한 분자-화합물 상호작용이 일어날 것인지의 예측은 주로 분자 설계 프로그램과 사용자 간의 사용하기 쉽고(user-friendly), 메뉴에 따라 조작하는 구조의(menu-driven) 인터페이스(interface)와 결부된 분자 역학 소프트웨어와 전산적으로 강화된 컴퓨터들을 필요로 한다.
상기에서 일반적으로 기재한 분자 모델링 체계의 예는 CHARMm 및 QUANTA programs, Polygen Corporation, Waltham, Mass를 포함한다. CHARMm은 에너지 최소화와 분자 역학 기능들을 수행한다. QUANTA는 분자 구조의 제작, 그래픽 모델링 및 분석을 수행한다. QUANTA는 분자 서로의 행동의 상호작용적인 제작, 변형, 시각화 및 분석을 가능하게 한다.
핵산 구성요소의 모델 수용체와 관련한 Askew 등, J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90의 논문, 및 Rotivinen 등 Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66; Ripka, New Scientist 1988, 54-8; McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22; Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62와같은 많은 논문들이 특이적 단백질들과 상호작용하는 약물들의 컴퓨터 모델링을 검토한다.
화학물질들을 스크리닝하고 그래픽으로 표현하는 다른 컴퓨터 프로그램들또한 BioDesign, Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada, and Hypercube, Inc., Cambridge, Ontario와 같은 회사로부터 입수가능하다. DesJarlais 등, J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng 등, J Computer Chem 1992, 13: 505-24; Meng 등, Proteins 1993, 17: 266-78; Shoichet 등, Science 1993, 259: 1445-50을 참조할 수 있다.
(ii) 조합 화학적 합성
피검 작용제의 조합 라이브러리들은 알려진 화합물들에 존재하는 핵심 구조들의 정보와 관련된 합리적인 제약 설계 프로그램의 부분으로서 생성될 수 있다. 상기와 같은 접근법은 상기 라이브러리가 높은 처리율의 스크리닝을 촉진하면서, 합리적인 크기에서 유지될 수 있게 한다. 대신에, 간단하고, 특히 짧고, 다중체의 분자 라이브러리는 상기 라이브러리를 구성하는 분자족의 모든 순열을 간단히 합성함에 의해 제작될 수 있다. 이러한 후자의 접근법의 예는 6개 아미노산 길이의 모든 펩티드들의 라이브러리이다. 이러한 펩티드 라이브러리는 6개 아미노산의 모든 순열을 포함한다. 이러한 유형의 라이브러리는 선형 조합 화학적 라이브러리로 명명된다.
조합 화학적 라이브러리들의 제작은 당업자에게 잘 알려져 있고, 화학적 또는 생물학적 합성 모두에 의해 생성될 수 있다. 조합 화학적 라이브러리는 펩티드 라이브러리들(미국 특허 5,010,175; Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93; Houghten 등, Nature 1991, 354: 84-6 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 화학적 다양성 라이브러리들을 생성하기 위해 다른 화학들 또한 이용될 수 있다. 이러한 화학들은 펩티드들(예, PCT 공개 No. WO 91/19735), 암호화된 펩티드들(예, WO 93/20242), 무작위 생-저중합체들(bio-oligomers)(예, WO 92/00091), 벤조디아제핀들(benzodiazepines)(예, US Patent 5,288,514), 히단토인(hydantoin), 벤조디아제핀(benzodiazepines) 및 디펩티드(dipeptides)와 같은 다이버소머(diversomers)(DeWitt 등, Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13), 비닐자리 폴리펩티드(vinylogous polypeptides (Hagihara 등, J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568), 포도당 비계(glucose scaffolding)를 이용한 비펩티드성 펩티도미메틱스(nonpeptidal peptidomimetics)(Hirschmann 등, J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8), 작은 화합물 라이브러리들의 유사 유기적 합성(analogous organic syntheses of small compound libraries)(Chen 등, J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661), 올리고카바메이트(oligocarbamates)(Cho 등, Science 1993, 261: 1303), 및/또는 펩티딜포스포네이트(peptidylphosphonates)(Campbell 등, J Org Chem 1994, 59: 658), 핵산 라이브러리(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(예, 미국 특허 5,539,083 참조), 항체 라이브러리(예, Vaughan 등, Nature Biotechnology 1996, 14(3):309-14 및 PCT/US96/10287 참조), 탄수화물 라이브러리(예, Liang 등, Science 1996, 274: 1520-22; 미국 특허 5,593,853 참조), 및 작은 유기 분자 라이브러리(예, 벤조디아제핀, Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1;6(6):624-31.; 이소프레노이드(isoprenoids), 미국 특허 5,569,588; 티아조리디논(thiazolidinones) 및 메타티아자논(metathiazanones), 미국 특허 5,549,974; 피롤리딘(pyrrolidines), 미국 특허 5,525,735 및 5,519,134; 모폴리노(morpholino) 화합물들, 미국 특허 5,506,337; 벤조디아제핀, 5,288,514, 및 기타 같은 종류의 것 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 아니한다.
(iii) 파지 디스플레이
또 다른 접근법은 라이브러리 생성을 위해 재조합 박테리오파지를 이용한다. "파지 방법"을 이용하여(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90; Cwirla 등, Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82; Devlin 등, Science 1990, 249: 404-6), 매우 큰 라이브러리들을 제작할 수 있다(예, 106 -108 화학적 독립체들). 두 번째 접근법은 1차적으로 예를 들어, Geysen 방법(Geysen 등, Molecular Immunology 1986, 23: 709-15; Geysen 등, J Immunologic Method 1987, 102: 259-74) 및 Fodor등의 방법(Science 1991, 251: 767-73)과 같은 화학적 방법을 이용한다. Furka 등(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR:013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93), Houghten(미국 특허 4,631,211) 및 Rutter 등(미국 특허 5,010,175)은 효능제(agonists) 또는 길항제(antagonists)로서 시험될 수 있는 펩티드들의 혼합물을 제조하는 방법을 기재하고 있다.
조합 라이브러리들의 제작용 기기들은 상업적으로 입수가능하다(357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA 참조). 또한, 다양한 조합 라이브러리들은 그 자체로 상업적으로 입수가능하다(예, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, 등 참조).
PKIB 또는 NAALADL2 결합 화합물의 스크리닝
본 발명에서, PKIB 또는 NAALADL2의 과발현은 일반 기관들에서 발현되지 않는 대신에 전립선암에서 검출된다(도 1 및 2 참조). 따라서, PKIB 또는 NAALADL2 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 상기 유전자의 전사 조절 부위를 이용하여, 상기 유전자의 발현이나 상기 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변화시키는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이러한 화합물들은 전립선암 치료 또는 예방용 제약으로 이용된다.
본 발명은 PKIB 또는 NAALADL2에 결합하는 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 전립선암에서 PKIB 및 NAALADL2의 발현때문에, PKIB 또는 NAALADL2에 결합하는 작용제는 전립선암 세포의 증식을 억제하는데 유용하고, 따라서 전립선암을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 전립선암 세포의 증식을 억제하는 작용제를 제공하고, PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드를 이용하여 전립선암 치료 또는 예방용 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 특히, 상기와 같은 스크리닝 방법의 구현예는 하기 단계를 포함한다:
a) 피검 화합물을 PKIB 또는 NAALADL2의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉(contact)시키는 단계;
b) 상기 폴리펩티드와 상기 피검 화합물 간의 결합 활성을 검출하는 단계; 및
c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 피검 화합물을 선별하는 단계.
이하, 본 발명의 방법을 보다 상세히 설명한다.
스크리닝에 이용되는 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 또는 천연 단백질 또는 이에 부분 펩티드일 수 있다. 피검 화합물과 접촉하는 상기 폴리펩티드는 예를 들어, 정제된 폴리펩티드, 수용성 단백질, 담체에 결합한 형태, 또는 다른 폴리펩티드와 융합된 융합 단백질일 수 있다.
예를 들어, PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드를 이용하여 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 당업자에게 잘 알려진 많은 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝은 예를 들어, 면역침강법(예, 하기 [실시예 1]의 " PKIB PKAC 간의 상호작용")와 같은 방법, 특히 하기의 방법으로 수행될 수 있다. PKIB 또는 NAALADL2를 암호화하는 유전자는 pSV2neo, PCDNA I, PCDNA3.1, PCAGGS 및 PCD8와 같은 외래 유전자들을 위한 발현벡터에 상기 유전자를 삽입함으로써 숙주(예, 동물) 세포들에서 발현된다. 상기 발현을 위해 이용되는 프로모터는 공통적으로 사용될 수 있는 모든 프로모터일 수 있고, 예를 들어 SV40 초기 프로모터(Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)), EF-a 프로모터(Kim 등, Gene 91: 217-23 (1990)), CAG 프로모터 (Niwa 등, Gene 108: 193 (1991)), RSV LTR 프로모터 (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), SRa 프로모터 (Takebe 등, Mol Cell Biol 8: 466 (1988)), CMV 즉시 초기 프로모터 (Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)), SV40 후기 프로모터 (Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), 아데노바이러스 후기 프로모터 (Kaufman 등, Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), HSV TK 프로모터 등을 포함할 수 있다.
외래 유전자를 발현하기 위해 숙주 세포 내로의 상기 유전자 도입은 당업자에게 잘 알려진 예를 들어, 전기천공법(Chu 등, Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), 칼슘 포스페이트 방법(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), DEAE 덱스트란 방법(DEAE dextran method)(Lopata 등, Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)), 리포펙틴 방법(Derijard B., Cell 76: 1025-37 (1994); Lamb 등, Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran 등, Science 259: 230-4 (1993)) 및 기타 같은 종류의 것 등의 모든 방법에 따라 수행될 수 있다. PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 특이성이 밝혀진 모노클론 항체의 항원결정기를 폴리펩티드의 N- 또는 C- 말단에 도입함으로써 모노클론 항체의 인식 부위(항원결정기)를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 항원결정기-항체 시스템이 이용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). 다중 클로닝 부위를 이용함으로써, 예를 들어 베타-갈락토시다아제, 말토즈 결합 단백질, 글루타티온 S-트랜스페라아제, 및 녹색 형광 단백질(GFP)와 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터들이 상업적으로 입수가능하다. 또한, 융합에 의해 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드의 성질을 변화시키지 않는 한, 수 개 또는 다수 개의 아미노산으로 구성되는 작은 항원결정기만을 도입함으로써 제작되는 융합 단백질도 사용될 수 있다. 폴리히스티딘(His-tag), 인플루엔자 응집 HA, 인간 c-myc, FLAG, 소낭성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7-tag), 인간 단순 헤르페스 바이러스 당단백질(human simple herpes virus glycoprotein, HSV-tag), E-tag(단일클론 파지 상의 항원결정기) 및 이와 같은 종류의 것등의 항원결정기들과 이들을 인식하는 단일클론 항체들은 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 결합하는 단백질들을 스크리닝하기 위한 항원결정기-항체 시스템으로 이용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).
면역침강법에서, 이러한 항체들을 적당한 세제를 이용하여 제작한 세포 용해물에 첨가함으로써 면역 복합체가 형성된다. 상기 면역 복합체는 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드와 결합력을 포함하는 폴리펩티드, 및 항체로 구성된다. 또한, 면역침강법은 하기와 같이 제작될 수 있는 상기 항원결정기에 대한 항체를 이용하는 것뿐만 아니라, PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 면역 복합체는 예를 들어, 항체가 마우스 IgG 항체인 경우, 단백질 A 세파로오즈(sepharose) 또는 단백질 G 세파로오즈(sepharose)에 의해 침강될 수 있다. PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 의해 암호화되는 상기 폴리펩티드가 GST와 같은 항원결정기와 융합 단백질로서 제작될 경우, 면역 복합체는 글루타티온-세파로오즈 4B(glutathione-Sepharose 4B)와 같이 상기 항원결정기들에 특이적으로 결합하는 물질을 이용함으로써, PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하는 것과 같은 방법으로 형성될 수 있다.
면역침강법은 예를 들어, 문헌(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988))의 방법들에 따르거나 또는 하기와 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.
SDS-PAGE는 면역침강된 단백질들의 분석을 위해 공통적으로 이용되고, 결합된 단백질은 적정 농도의 젤을 이용한 단백질의 분자량에 의해 분석될 수 있다. PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 결합된 단백질은 쿠마시 염색 또는 은 염색과 같은 정상의 염색 방법에 의해 검출하기 어렵기 때문에, 35S-메티오닌 또는 35S-시스테인과 같은 방사선 동위원소를 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하고, 세포 내에서 단백질을 표지화하고, 상기 단백질을 검출함으로써 상기 단백질을 위한 검출 민감도를 증가시킬 수 있다. 단백질의 분자량이 밝혀진 경우, 표적 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 젤로부터 직접 정제될 수 있고, 그것의 서열이 결정되리 수 있다. 상기 폴리펩티드를 이용한 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 예를 들어, 웨스트-웨스턴(West-western) 블럿팅 분석법(Skolnik 등, Cell 65: 83-90 (1991)이 이용될 수 있다. 특히, 파지 벡터(예, ZAP)를 이용하여, LB-아가로즈 상에서 단백질을 발현시키고, 필터 상에서 발현된 단백질을 고정하여, 상기 필터와 정제 및 표지된 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드를 반응시킨 후, 표지에 따라 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 결합된 단백질을 발현하는 플라크들(plaques)을 검출하여, PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현할 것으로 기대되는 배양된 세포(예, LNCaP, 22Rv1, PC-3 DU-145 and C4-2B)로부터 cDNA 라이브러리를 제작함으로써 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 바이오틴(biotin) 및 아비딘(avidin) 간의 결합을 활용하거나, 또는 PKIB나 NAALADL2 폴리펩티드 또는 PKIB나 NAALADL2에 융합된 펩티드나 폴리펩티드(예, GST)에 특이적으로 결합하는 항체를 활용함으로써 표지될 수 있다. 방사선 동위원소나 형광등을 이용한 방법 또한 이용될 수 있다.
대신에, 본 발명의 스크리닝 방법의 또 다른 구현예에서, 세포를 활용한 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 이용될 수 있다(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”, “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”, “MATCHMAKER one-Hybrid system” (Clontech); “HybriZAP Two-Hybrid 벡터 System” (Stratagene); the references “Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)”, “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”).
상기 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SRF-결합 부위 또는 GAL4-결합 부위에 융합되고 효모 세포에서 발현된다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현할 것으로 기대되는 세포들로부터 제작되어, 상기 라이브러리가 발현되었을 때, 상기 단백질이 VP16 또는 GAL4 전사 활성화 부위에 융합된다. 다음, 상기 cDNA 라이브러리는 상기 효모 세포로 도입되고, 상기 라이브러리로부터 유래한 cDNA는 양성으로 검출된 클론들로부터 분리된다(본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질이 효모 세포들에서 발현되었을 때, 상기 두 결합이 리포터 유전자를 활성화시켜 양성 클론들이 검출가능하도록 한다). 상기 cDNA에 의해 암호화되는 단백질은 상기의 분리된 cDNA를 E. coli로 도입되어 단백질을 발현함으로써 제작된다. HIS3 유전자와 더불어, 예를 들어 Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라아제 유전자 및 이와 같은 것들도 리포터 유전자로서 이용될 수 있다.
또한, PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 화합물은 친화도 크로마토그래피를 이용하여 스크리닝 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 폴리펩티드는 친화도 컬럼의 담체 상에 고정될 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 피검 화합물이 상기 컬럼에 가해진다. 본 명세서의 피검 화합물은, 예를 들어, 세포 추출물들, 세포 용해물들 및 기타 이와 같은 것일 수 있다. 상기 피검 화합물을 적재(loading)한 후, 상기 컬럼을 세척하고, 본 발명의 상기 폴리펩티드에 결합된 화합물들이 제작될 수 있다. 상기 피검 화합물이 단백질인 경우, 상기에서 수득된 단백질의 아미노산 서열을 분석하고, 상기 서열을 기반으로 올리고 DNA를 합성하며, 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 얻기 위한 탐침으로서 상기 올리고 DNA를 이용하여 cDNA 라이브러리들을 스크리닝한다.
표면 플라즈몬 공명 현상을 이용한 바이오센서(biosensor)는 본 발명에서 결합된 화합물을 정량하거나 검출하는 수단으로서 이용될 수 있다. 상기와 같은 바이오센서가 이용될 경우, 표지하지 않은 소량의 폴리펩티드만을 이용하여, 본 발명의 상기 폴리펩티드와 피검 화합물 간의 상호작용이 표면 플라즈몬 신호로서 실시간으로 관측할 수 있다(예, BIAcore, Pharmacia). 따라서, BIAcore와 같은 바이오센서를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드와 피검화합물 간의 결합을 평가할 수 있다.
고정화된 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드가 합성 화학적 화합물들, 또는 천연 물질 저장고 또는 무작위 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리에 노출되었을 때 결합하는 분자를 스크리닝하는 방법들과 단백질 뿐만 아니라 PKIB 또는 NAALADL2 단백질에 결합하는 화학적 화합물(효능제(agonists) 및 길항제(antagonists)를 포함)도 분리하기 위한, 조합 화학 기술들에 기반한 높은-처리율(Wrighton 등, Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996))을 이용한 스크리닝 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
선호되는 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 선별되는 피검 화합물은 그의 치료적 효과를 평가하기 위한 추가적인 스크리닝을 위한 후보물질이다.
PKIB 또는 NAALADL2 의 생물학적 활성을 억제하는 화합물의 스크리닝
본 발명에서 상기 PKIB 또는 NAALADL2 단백질은 전립선암 세포의 세포증식을 촉진하는 활성을 가진 것으로 밝혀지고 있다(도 3의 C, 도 4의 C 및 도6 참조). 추가적으로, PKIB 는 PKA-C 핵 축적 활성을 가지는 것으로 밝혀지고 있다(도 5의 D 및 E). 본 발명에서, 상기 PKA-C 핵 축적은 핵에서 PKA-C의 이출(export)을 억제하거나, 핵으로 PKA-C 수송을 촉진하는 것을 의미한다. 이러한 생물학적 활성들을 이용하여, 이러한 단백질들의 이러한 활성들을 억제하는 화합물이 스크리닝될 수 있고, 그 화합물은 전립선암의 치료 또는 예방에 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 전립선암의 증식을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법 및 전립선암 치료 또는 예방용 화합물 스크리닝을 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하고, PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 이용하여 전립선암을 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
a) 피검 화합물을 PKIB 또는 NAALADL2의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉(contact)시키는 단계;
b) 단계 a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및
c) 피검 화합물의 부재 하에서 검출된 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비해 PKIB 또는 NAALADL2의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 피검 화합물을 선별하는 단계.
이하, 본 발명의 방법을 보다 상세히 설명한다.
PKIB 또는 NAALADL2 단백질의 생물학적 활성을 포함하는 한, 모든 폴리펩티드들이 스크리닝을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, PKIB 또는 NAALADL2 단백질이 이용될 수 있고, 상기 단백질들의 기능적 등가물 폴리펩티드들 또한 이용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드들은 세포 내생적 또는 외생적으로 발현될 수 있다. 추가적으로, 이러한 생물학적 활성은 상기 PKIB 또는 NAALADL2 단백질의 세포-증식 활성 또는 PKIB 단백질의 PKA-C 핵 축적 활성을 포함한다.
상기 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 PKIB 또는 NAALADL2 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 길항제(antagonists) 후보이다. 용어 "길항제(antagonist)"는 폴리펩티드에 결합함으로써 이의 기능을 억제하는 분자들을 일컫는다. 상기 용어는 또한, PKIB 또는 NAALADL2를 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 분자들을 일컫는다. 아울러, 상기 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 상기 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드와 분자들(DNAs와 단백질들을 포함)의 생체 내(in vivo) 상호작용을 억제하는 화합물의 후보이다.
본 발명의 방법에서 검출되는 생물학적 활성이 세포 증식인 경우, 상기 생물학적 활성은, 예를 들어, 도 3의 C 및 도 4의 D에서 보여지는 바와 같이, 콜로니 형성 활성(colony forming activity)을 측정하는 것뿐만 아니라, 예를 들어, 상기 PKIB 또는 NAALADL2 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제작하고, 피검 화합물과 함께 세포를 배양한 후, 세포 증식의 속도를 측정하여, 세포 주기를 측정함으로써 검출될 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 "생물학적 활성을 억제한다"는 상기 화합물의 부재시와 비교하여 PKIB 또는 NAALADL2의 생물학적 활성이 바람직하게는 최소한 10%, 더욱 바람직하게는 25%, 50% 또는 75%, 가장 바람직하게는 90% 억제된 것이다.
본 발명의 방법에서 검출되는 상기 생물학적 활성이 PKA-C 핵 축적인 경우, 상기 생물학적 활성은 도 5의 D 및 E에서 보여지는 바와 같이, 예를 들어, 면역세포화학법 또는 웨스턴 블럿팅을 이용하여, 예를 들어, 상기 PKIB 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제작하고, 피검 화합물과 함께 세포를 배양한 후, 핵 내 PKA-C 단백질의 양을 측정함으로써 검출될 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 "생물학적 활성을 억제한다"는 상기 화합물의 부재시와 비교하여 PKIB의 생물학적 활성이 바람직하게는 최소한 10%, 더욱 바람직하게는 25%, 50% 또는 75%, 가장 바람직하게는 90% 억제된 것이다.
선호되는 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 선별되는 피검 화합물은 이의 치료적 효과를 평가하기 위한 추가적인 스크리닝을 위한 후보일 수 있다.
PKIB 또는 NAALADL2 의 발현을 변경하는 화합물의 스크리닝
본 발명에서, siRNA에 의한 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 감소는 암 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다(도 3 및 4 참조). 따라서, 본 발명은 PKIB 또는 NAALADL2의 발현을 억제하는 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. PKIB 또는 NAALADL2의 발현을 억제하는 작용제는 전립선암 세포들의 증식을 억제하는데 유용하고, 따라서 전립선암을 치료하고 예방하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 전립선암의 증식을 억제하는 작용제를 스크리닝하는 방법, 및 전립선암을 치료 또는 예방하기 위한 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 스크리닝은 예를 들어, 하기와 같은 단계들을 포함한다:
a) 후보 화합물과 PKIB 또는 NAALADL2를 발현하는 세포를 접촉(contact)시키는 단계; 및
b) 대조군에 비해 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 수준을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.
이하, 본 발명의 방법을 상세히 설명한다.
OKIB 또는 NAALADL2를 발현하는 세포들은, 예를 들어, 전립선암에서 형성된 세포주를 포함한다; 이러한 세포들은 본 발명의 상기 스크리닝을 위해 이용될 수 있다(예, LNCaP, 22Rv1, PC-3, DU-145 및 C4-2B). 발현 수준은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들면, TR-PCR, 노던 블럿 분석(Northern blot assay), 웨스턴 블럿 분석(Western-blot assay), 면역염색(immunostaining) 및 유세포분석법(flow cytometry analysis)와 같은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 예측될 수 있다. 본 명세서에서 정의된 "발현 수준을 감소시킨다"는 상기 화합물의 부재시 발현 수준과 비교하여 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 수준이 바람직하게는 최소한 10%, 더욱 바람직하게는 25%, 50% 또는 75%, 가장 바람직하게는 95% 수준으로 감소된 것이다. 본 명세서의 상기 화합물은 화학적 화합물, 이중 가닥 뉴클레오티드 등을 포함한다. 상기 이중 가닥 뉴클레오티드의 제작은 상기 설명한 바와 같다. 스크리닝 방법에서, PKIB 또는 NAALADL2의 발현 수준을 감소시키는 화합물은 전립선암의 치료 또는 예방을 위해 이용되는 후보 작용제로 선별될 수 있다.
대신에, 본 발명의 스크리닝 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다:
a) 후보 화합물을, PKIB 또는 NAALADL2의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절하에 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계;
b) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
c) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성 수준을 감소시킨 후보 화합물을 선별하는 단계.
적절한 리포터 유전자들과 숙주 세포들은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 리포터 유전자들은 루시퍼라아제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green florescence protein, GFP), 디스코소마 sp. 적색 형광 단백질(Discosoma sp. Red Fluorescent Protein, DsRed), 클로람페니콜 아세치르트란스페라제(Chrolamphenicol Acetyltransferase, CAT), lacZ 및 베타-글루쿠로니다스(β-glucuronidase, GUS)이고, 숙주 세포들은 COS7, HEK293, HeLa등 이다. 스크리닝을 위해 요구되는 상기 리포터 구조체는 리포터 유전자 서열을 PKIB 또는 NAALADL2의 전사 조절 부위에 연결함으로써 제작되어 질 수 있다. 본 명세서에서 상기 PKIB 또는 NAALADL2의 전사 조절 부위는 개시 코돈부터 최소한 500bp 상류, 바람직하게는 1000bp, 더욱 바람직하게는 5000 또는 10000bp 상류까지 부위이다. 전사 조절 부위를 포함하는 뉴클레오티드 절편은 게놈 라이브러리에서 분리할 수 있고, PCR에 의해 증폭될 수 있다. 전사 조절 부위 확인을 위한 방법 또한, 잘 알려진 분석 프로토콜이다(Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press). 상기 리포터 구조체를 포함하는 벡터는 숙주 세포들로 감염되고, 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성은 당업계에 잘 알려진 방법(예, 루미노메터(luminometer), 흡수 스펙트로메터(absorption spectrometer), 유세포분석(flow cytometer) 등을 이용)으로 검출된다. 본 명세서에서 정의된 "발현 또는 활성을 감소시킨다"는 상기 화합물의 부재시와 비교하여 리포터 유전자의 발현 또는 활성이 바람직하게는 최소한 10%, 더욱 바람직하게는 25%, 50% 또는 75% 감소, 가장 바람직하게는 95% 감소 된 것이다.
선호되는 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 선별되는 피검 화합물은 이의 치료적 효과를 평가하기 위한 추가적 스크리닝의 후보물질일 수 있다.
PKIB PKA -C 간 결합을 감소시키는 화합물의 스크리닝
본 발명에서, PKIB와 PKA-C 간의 상호작용은 면역침강법에 의해 보여진다(도 5의 C 참조). 더욱이, PKA는 PKIB의 부재하에 핵에서 세포질로 이출된다(도 5의 D 참조). 본 발명은 PKIB 와 PKA-C 간의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. PKIB와 PKA-C 간의 결합을 억제하는 화합물은 전립선암 세포들의 증식을 억제하는데 유용하고, 따라서 전립선암을 치료하고 예방하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 전립선암 세포들의 증식을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법과 전립선암을 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
더욱 특별히, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 피검 화합물의 존재하에서 PKIB 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 PKA-C 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 접촉시키는 단계;
b) 상기 폴리펩티드 간의 결합을 검출하는 단계;
c) 상기 폴리펩티드 간의 결합을 억제하는 피검 화합물을 선별하는 단계.
본 명세서의 "PKIB 폴리펩티드의 기능적 등가물"은 PKA-C 결합 도메인;가기질(pseudosubstrate) 모티프(RRNA:서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 일컫는다. 비슷하게, "PKA-C 폴리펩티드의 기능적 등가물"은 PKIB 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 일컫는다.
이하, 본 발명의 방법을 보다 상세히 설명한다.
PKIB와 PKA-C 간의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 당업자에게 잘 알려진 많은 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝은 시험관 내 분석 시스템으로서 수행될 수 있다. 더욱 특별히, 먼저, PKA-C 또는 PKIB 폴리펩티드가 지지대에 결합되고, 다른 폴리펩티드가 그의 피검 화합물과 함께 추가된다. 다음으로, 상기 혼합물을 인규베이션하고 세척한 후, 지지대에 결합한 다른 폴리펩티드를 검출 또는 측정한다. 예상되는 후부 화합물은 상기 다른 폴리펩티드의 검출 양을 감소시킨다. 이때, PKA-C 또는 PKIB 폴리펩티드는 천연 단백질로서 뿐만 아니라, 유전자 재조합 기술에 의해 제작된 재조합 단백질로서도 제작될 수 있다. 상기 천연 단백질은 예를 들어, 친화도 크로마토그래피에 의해 제작될 수 있다. 반면에, 상기 재조합 단백질은 단백질을 그 속에서 발현시키기 위해서 PKA-C를 암호화하는 DNA로 형질감염된 세포들을 배양한 다음, 회복시킴으로써 제작될 수 있다.
단백질과의 결합에 이용될 수 있는 지지대의 예는 아가로즈, 셀룰로즈 및 덱스트란과 같은 불용성 다당류; 및 폴리아크릴아미드, 폴리스이렌 및 실리콘과 같은 합성 레진; 바람직하게는 이용될 수 있는 상기 물질들로부터 제작된 상업적으로 입수가능한 비드와 플레이트(예, 복수-웰 플레이트, 바이오센서 칩 등)를 포함한다. 비드를 이용할 경우, 그것들은 컬럼에 가득 채워질 수 있다. 대신에, 당업계에서 알려진 자성 비드의 이용은 자성을 통해 비드 상에 결합된 단백질들을 즉시 분리할 수 있다.
지지대에 단백질의 결합은 화학적 결합 및 물리적 흡수와 같은 정상의 방법들에 따라 수행될 수 있다. 대신에, 단백질은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체들을 통해 지지대에 결합 될 수 있다. 더욱이, 지지대에 단백질의 결합은 또한 아비딘(avidin)과 바이오틴(biotin)의 수단에 의해서도 수행될 수 있다. 완충용액이 단백질 간의 결합을 억제하지 않는 한, 단백질 간의 결합은 예를 들어, 인산염 완충용액과 트리스 완충용액과 같은 완충용액에서 수행되나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서, 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 바이오센서는 결합된 단백질을 검출 또는 정량하는 수단으로서 이용될 수 있다. 그러한 바이오센서가 이용되는 경우, 단백질 간의 상호작용은 표지하지 않은 소량의 폴리펩티드만을 이용하여(예, BIAcore, Pharmacia), 표면 플라즈몬 공명 신호로서 실시간으로 관측할 수 있다. BIAcore와 같은 바이오센서를 이용하여 PKA-C와 PKIB 간의 결합을 평가할 수 있다.
대신에 PKA-C 또는 PKIB는 표지될 수 있고, 상기 폴리펩티드의 표지는 결합 활성을 검출 또는 측정하기 위해 이용될 수 있다. 특히, 상기 폴레펩티드 중 어느 하나를 사전-표지한 후, 상기 표지된 폴리펩티드는 피검 화합물과 함께 다른 폴리펩티드와 접촉된 다음, 결합된 폴리펩티드는 세척 후, 상기 표지에 따라 검출 또는 측정된다. 방사선 동위원소(예, 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I), 효소(예, 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), 양고추냉이 퍼록시다아제(horseradish peroxidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase)), 형광 물질들(예, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiosyanete, FITC), 로다민(rhodamine)) 및 바이오틴/아비딘(biotin/avidin)과 같은 표지 물질들은 본 발명의 방법에서 단백질을 표지하는데 이용될 수 있다. 상기 단백질이 방사선 동위원소로 표지된 경우, 검출 또는 측정은 액체 신틸레이션(scintillation)에 의해 수행될 수 있다. 대신에, 효소들로 표지된 단백질들은 발색(generation of color)과 같은 기질의 효소적 변화를 흡광계(absorptiometer)로 검출하기 위해, 상기 효소의 기질을 첨가함으로써 검출 또는 측정할 수 있다. 추가적으로, 형광 물질이 표지로서 사용된 경우, 상기 결합된 단백질은 형광광도계(fluorophotometer)를 이용하여 검출 또는 측정될 수 있다.
추가적으로, PKA-C와 PKIB 간의 결합은 PKA-C 또는 PKIB에 대한 항체들을 이용하여 검출 또는 측정할 수도 있다. 예를 들어, 지지대 상에 고정된 PKA-C 폴리펩티드를 피검 화합물 및 PKIB와 접촉시킨 후, 혼합물을 인큐베이션(incubation) 및 세척하고, PKIB에 대한 항체를 이용하여 검출 또는 측정이 수행될 수 있다. 대신에, PKIB는 지지대 상에 고정될 수 있고, PKA-C에 대한 항체가 항체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 스크리닝에서 항체를 이용하는 경우, 상기 항체는 바람직하게 상기 기재한 표지 물질들 중 어느 하나로 표지되고, 상기 표지 물질에 기반하여 검출 또는 측정된다. 대신에, PKA-C 및 PKIB에 대한 항체는 표지 물질로 표지된 2차항체로 검출될 1차 항체로서 이용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 스크리닝에서 단백질에 결합 된 상기 항체는 단백질 G 또는 단백질 A 컬럼을 통해 검출 또는 측정 될 수 있다.
대신에, 본 발명의 스크리닝 방법의 또 다른 구현예에서, 세포를 활용한 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 이용될 수 있다(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”, “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”, “MATCHMAKER one-Hybrid system” (Clontech); “HybriZAP Two-Hybrid 벡터 System” (Stratagene); the references “Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)”, “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”).
상기 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에서, 예를 들어, PKA-C 폴리펩티드는 SRF-결합 부위 또는 GAL4-결합 부위에 융합되고 효모 세포에서 발현된다. PKA-C 폴리펩티드에 결합하는 PKIB 폴리펩티드는 VP16 또는 GAL4 전사 활성화 부위에 융합되고, 또한 피검 화합물의 존재하에 효모 세포들에서 발현된다. 대신에 PKIB 폴리펩티드는 SRF-결합 부위나 GAL4-결합 부위에 융합될 수 있고, PKA-C 폴리펩티드는 VP16 또는 GAL4 전사 활성화 부위에 융합될 수 있다. 상기와 같은 둘의 결합은 리포터 유전자를 활성화시키고, 양성 클론들을 검출할 수 있게 한다. HIS3 유전자와 더불어, 예를 들어 Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라아제 유전자 및 이와 같은 것들도 리포터 유전자로서 이용될 수 있다.
더욱이, PKA-C는 PKIB 존재 하에서는 핵에, PKIB 부재 하에서는 세포질에 위치하므로, 본 발명의 스크리닝 방법은 PKA-C의 핵 위치를 검출한다. 예를 들어, PKA-C와 PKIB 모두를 발현하는 세포들을 피검 화합물과 접촉시킨 후, 세척한다. 상기 세포들을 예를 들어, 70% 에탄올 또는 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 항-PKA-C 항체로 검출한다. PKA-C가 대략 세포질에서 검출되면, 상기 피검 화합물은 전립선암 예방을 위해 이용된다. 이때, PKA-C와 PKIB는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 세포로 강화-발현될(force-expressed) 수 있다. 따라서, PKA-C 및 PKIB를 모두 발현하는 세포들은 피검 화합물과 접촉되고, 상기 세포들의 핵 추출물은 잘 알려진 방법에 의해 제작된다(예, Merck Biosciencedp 의해 생산된 Subcellular ProteoExtract Kit (S-PEK)). 핵 추출물에서 PKA-C의 양은 웨스턴 블럿 분석(western blot assay)에 의해 검출된다.
선호되는 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 선별되는 피검 화합물은 그것의 치료적 효과를 평가하기 위한 추가적인 스크리닝의 후보물질일 수 있다. 즉, 상기 스크리닝 방법은 추가적으로 하기 단계들을 포함한다:
d) 단계 c)에서 선별된 후보 화합물을 PKIB 및 PKA-C를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및
e) 후보 화합물의 부재 하에서 검출되는 발현 수준과 비교하여 Akt의 인산화 수준을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.
당업자에 잘 알려진 Akt 인산화의 검출 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예들 항목에 기재된 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)이잉숑될 수 있다. 더욱 바람직하게는, Akt의 인산화 수준(서열번호 35)은 473 세린 잔기에서 검출된다.
PKIB 기능의 억제를 통해 Akt 인산화를 감소시키는 화합물의 스크리닝
본 발명에서, Akt 인산화는 PKIB에 의해 감소된다(도 7의 A 참조). 더욱이, 상기 Akt 인산화는 PKIB 또는 PKA-C 중 어느 하나 또는 둘 모두의 과발현에 의해 촉진된다(도 7의 B 및 C 참조). 본 발명은 PKIB와 PKA-C 간의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 Akt 인산화는 HRPC 진행 및 그것의 암적인 표현형에 결정적인 역할을 하므로(Sellers, W. R. & Sawyers, C. L. (2002) in Somatic Genetics of Prostate Cancer: Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantoff, P. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia), Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM., Curr Cancer Drug Targets. 2007 Sep;7(6):591-604, Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98(13):7200-5, Feldman BJ, Feldman D, Nat Rev Cancer 2001;1(1):34-45, Malik SN, Brattain M, Ghosh PM, Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI., Clin Cancer Res. 2002;8(4):1168-71), PKIB 기능의 억제를 통한 Akt 인산화를 감소시키는 화합물은 전립선암 세포들의 증식을 억제할 것으로 기대되고, 따라서 전립선암을 치료 또는 억제하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 전립선암 세포들의 증식을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법, 및 전립선암, 바람직하게는 HRPC를 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
더욱 특별히, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 후보 화합물과 PKIB 또는 PKA-C를 발현하는 세포를 접촉(contact)시키는 단계; 및
b) 후보 화합물의 부재하에서 검출되는 발현수준에 비해 Akt의 인산화 수준을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.
대신에, 전립선암의 치료 및/또는 예방을 위해 적절한 후보 화합물은 본 발명에 의해서 확인될 수 있다. 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) PKIB 폴리펩티드에 의한 Akt의 인산화에 적합한 조건하에서 PKIB 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물, PKA-C 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물 및 Akt를 피검 화합물과 함께 하기 i. 내지iii.으로 구성되는 군에서 선택되는 폴리펩티드인 Akt가 PKIB에 의해 인산화되기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계;
i. 서열번호 35(Akt)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
ii. 서열번호 35의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 삭제, 또는 삽입된 폴리펩티드로서, 서열번호 35의 아미노산 서열을 구성하는 폴리펩티드와 등가적인 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드;
iii. 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 서열번호 35의 아미노산 서열을 구성하는 폴리펩티드와 등가적인 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드;
b) Akt의 인산화 수준을 검출하는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 측정한 Akt의 인산화 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계; 및
d) 상기 대조군 수준에 비해 Akt의 인산화 수준을 감소시킨 화합물을 선별하는 단계.
선호되는 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 선별되는 피검 화함물은 그것의 치료적 효과를 평가하기 위한 추가적인 스크리닝의 후보물질일 수 있다.
바람직하게는, Akt의 인산화 수준은 서열번호 35의 아미노산 서열의 473 세린 잔기 또는 상기 폴리펩티드의 동일한 위치에서 검출될 수 있다. 당업자에 잘 알려진 Akt 인산화의 검출 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예들 항목에 기재된 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)이 이용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, PKIB에 의한 Akt의 인산화를 위해 적절한 조건은 ATP와 같은 인산기 공여체(phosphate donor)의 존재하에서 Akt, PKIB 및 PKA-C를 함께 인큐베이션함으로써 제공될 수 있다. PKIB에 의한 Akt 인산화를 위한 적절한 조건은 또한 PKIB, PKA-C 및상기 폴리펩티드들을 발현하는 세포를 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 세포는 상기 폴레펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 품고 있는 형질감염체 세포일 수 있다. 상기 인큐베이션 후, Akt의 인산화 수준은 인산화된 Akt를 인식하는 항체로 검출될 수 있다.
인산화된 Akt를 검출하기에 앞서, Akt는 다른 요소들, 또는 Akt를 발현하는 세포의 세포용해물로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 젤 전기영동은 잔존 구성성분으로부터 Akt를 분리하는데 이용될 수 있다. 대신에, 항-Akt 항체를 갖는 담체와 Akt를 접촉시킴으로서 Akt를 포착할 수 있다. 상기 표지된 인산기 공여체가 이용될 경우, Akt의 인산화 수준은 상기 표지를 추적함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 방사성-표지된 ATP(예, 32P-ATP)가 인산기 주개로 이용될 경우, 분리된 Akt의 방사성 활성은 Akt의 인산화 수준과 서로 관련이 있다. 대신에, 인산화되지 않은 Akt로부터 인산화된 Akt를 특이적으로 인식하는 항체는 인산화된 Akt를 검출하는데 이용될 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 Ser-473 잔기에 인산화된 Akt를 인식한다.
상기 단백질에 기능적으로 등가인 폴리펩티드들을 제작하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 단백질 내로 돌연변이를 도입하는 알려진 방법을 포함한다. 일반적으로 단백질 내 하나 이상의 아미노산의 변형은 단백질의 기능에 영향이 없다고 알려져 있다(Mark DF 등, Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Wang A 등, Science 1984, 224:1431-3; Dalbadie-McFarland G 등, Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 사실, 돌연변이되거나 변형된 단백질들, 특정 아미노산 서열의 아미노산 잔기 하나 이상이 치환, 삭제, 삽입, 및/또는 첨가됨으로써 변형된 아미노산 서열들을 가지는 단백질들은 원래의 생물학적 활성을 유지하는 것으로 알려져 왔다(Mark 등, Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland 등, Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)). 따라서, 당업자는 유사한 기능을 갖는 단백질을 초래하는 단백질의 변형인 단일 아미노산 또는 아미노산들의 작은 비율을 변경시키는 아미노산 서열에의 개별적인 첨가, 삭제, 삽입, 또는 치환 또는 "보존된 변형들"이라 여겨지는 것들은 본 발명의 맥락에서 고려된다고 인식할 것이다.
예를 들어, 당업자는 예를 들어 부위-지정 돌연변이법(site-directed mutagenesis)을 이용하여 Akt, PKA-C 또는 PKIB 단백질의 아미노산 서열에 적절한 돌연변이를 도입함으로써, 이들 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 제작할 수 있다(Hashimoto-Gotoh 등, Gene 152:271-5 (1995); Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramer 등, Nucleic Acids Res. 12:9441-56 (1984); Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985); Kunkel TA, 등, Methods Enzymol. 1991;204:125-39.). 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 Akt, PKA-C 또는 PKIB의 아미노산 서열들을 갖는 것들을 포함하여, Akt, PKA-C 또는 PKIB와 각각 기능적으로 등가인 돌연변이된 폴리펩티드들을 제공한다. 상기 단백질의 활성이 유지되는 한, 아미노산 돌연변이의 수는 특별히 제한되지 아니한다. 그러나, 일반적으로 5% 이하의 아미노산 서열이 변경되는 것이 선호된다. 따라서, 선호되는 구현예에서는, 그러한 돌연변이체에서 돌연변이된 아미노산의 수는 일반적으로 30개의 아미노산 이하, 전형적으로 20개의 아미노산 이하, 더욱 전형적으로 10개 아미노산 이하, 바람직하게는 5-6개의 아미노산 이하이고 더욱 바람직하게는 1-3개의 아미노산이다. 돌연변이될 아미노산 잔기는 바람직하게 아미노산 곁-사슬의 특성이 보존된 다른 아미노산으로 돌연변이된다(보존된 아미노산 치환으로 알려진 과정). 아미노산 곁 사슬의 특성들의 예는 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기나 특성을 공통적으로 가진 곁사슬들: 지방성(aliphatic) 곁-사슬(G, A, V, L, I, P); 수산기 포함 곁-사슬(S, T, Y); 황 원자 포함 곁-사슬(C, M);카르복실 산 및 아미도 포함 곁-사슬(D, N, E, Q); 염기 포함 곁-사슬(R, K, H); 및 방향성(aromatic) 포함 곁-사슬(H, F, Y, W)이 있다. 상기 삽입된 문자는 아미노산의 1-문자 코드를 의미한다. 추가적으로, 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적인 친환 표는 당업계에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 하기 8개 그룹 각각은 서로에 대해 보존적인 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파라긴산(D), 글루타민산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M) (예, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 폴리펩티드들은 본 발명의 Akt, PKA-C 또는 PKIB 단백질을 포함한다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 아니하고, 원래 단백질의 결합 활성이 유지되는 한, Akt, PKA-C 및 PKIB 단백질은 비-보존적 변형들을 포함한다. 추가적으로, 상기 변형된 단백질은 다형의(polymorphic) 변형체들, 이종 간 동족체들(interspecies homologous), 및 이러한 단백질들의 대립유전자에 의해 암호화되는 것들을 배제하지 않는다.
Akt, PKA-C 또는 PKIB의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가된 폴리펩티드의 예는 Akt, PKA-C 또는 PKIB를 각각 포함하는 융합 단백질이다. 따라서, 융합 단백질, 예, Akt PKA-C 또는 PKIB 및 다른 펩티드 또는 단백질,은 본 발명에 포함된다. 융합 단백질은 Akt, PKA-C 또는 PKIB를 암호화하는 DNA와 다른 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 DNA를 틀이 맞게 연결하고, 융합 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 이를 숙주 세포에서 발현하는 것과 같이 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 제작될 수 있다. 본 발명의 단백질에 융합된 펩티드들 또는 단백질들에는 어떠한 제한도 없다.
Akt, PKA-C 또는 PKIB 단백질들에 융합되는 폴리펩티드로서 이용될 수 있는 알려진 펩티드들은 예를 들어, FLAG (Hopp TP 등, Biotechnology 1988 6: 1204-10), 6xHis containing six His (histidine) 잔기들, 10xHis, Influenza agglutinin (HA), 인간 c-myc 절편, VSP-GP 절편, p18HIV 절편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원 절편, lck tag, alpha-tubulin 절편, B-tag, 단백질 C 절편, 및 기타 같은 종류의 것들을 포함한다. 본 발명의 단백질에 융합될 수 있는 단백질들의 예들은 GST(glutathione-S-transferase), 인플루엔자 어글루티닌(Influenza agglutinin, HA), 면역글로불린 불변 부위(immunoglobulin constant region), 베타-갈락토시다아제(beta -galactosidase), MBP(maltose-binding protein), 및 기타 이와 같은 종류의 것들을 포함한다.
융합 단백질들은 상업적으로 입수가능한 상기 융합 단백질 또는 상기 기재한 단백질들을 암호화하는 DNA를 Akt, PKA-C 또는 PKIB 단백질을 암호화하는 DNA와 융합하고, 제조한 융합 DNA를 발현함으로써 제작될 수 있다.
기능적으로 등가인 폴리펩티드들을 분리하기 위한 당업계에서 알려진 대체적인 방법은 예를 들어, 혼성 기술과 관련있다(Sambrook 등, Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)). 당업자는 Akt(예, 서열번호 36), PKA-C 또는 PKIB와 높은 상동성을 가진 DNA를 즉시 분리할 수 있고, 상기 분리된 DNA로부터 Akt, PKA-C 또는 PKIB와 기능적으로 등가인 폴리펩티드들을 분리할 수 있다. 본 발명의 단백질들은 Akt, PKA-C 또는 PKIB를 암호화하는 DNA 서열의 전체 또는 일부와 혼성화하는 DNA와 Akt, PKA-C 또는 PKIB에 기능적으로 등가인 DNA에 의해 암호화되는 것들을 포함한다. 이러한 폴리펩티드들은 인간으로 부터 유래된 단백질에 상응하는 포유동물 유사체를 포함한다(예를 들어, 원숭이, fot 토끼, 소 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드). 동물에서 유래한 Akt, PKA-C 또는 PKIB를 암호화하는 DNA에 높은 상동성이 있는 cDNA를 분리함에, 전립선암 조직들을 이용하는 것이 보다 바람직하다.
인간 Akt, PKA-C 또는 PKIB 단백질에 기능적으로 등가인 단백질을 암호화하는 DNA를 분리하기 위한 혼성의 조건은 당업자에 의해 관례적으로 선별될 수 있다. 어구 "엄격한 (혼성) 조건들"은 핵산 분자가, 전형적으로 핵산의 복합 혼합물에서, 그것의 표적 서열에 혼성화되나, 다른 서열들에 대해서는 검출가능하지 않은 조건을 의미한다. 엄격한 조건들은 서열-의존적이고, 다른 환경에서 서로 다를 것이다. 보다 긴 서열들은 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 핵산의 혼성에 대한 확장된 지침은 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)에서 찾을 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 적절한 혼성 조건들은 당업자에 의해 관례적으로 선별될 수 있다.
일반적으로, 엄격한 조건들은 특정 이온 세기 및 pH에서 특이적 서열을 위한 열적 녹는점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택되어 진다. 상기 Tm은 평형상태에서 표적 서열에 상보적인 탐침의 50%가 표적 서열에 혼성되는 온도(특정 이온 세기, pH 및핵산 농도하에서)이다(상기 표적 서열은 일반적으로 과도하게 존재하므로, Tm에서, 탐침의 50%가 평형상태에서 채워진다). 또한, 엄격한 조건들은 포름아미드와 같은 불안정화 작용제(destabilizing agents)의 첨가를 통해 형성될 수 있다. 선택적이거나 특이적인 혼성을 위해, 양성 신호는 바람직하게 바탕의 최소한 2배인 것이 바람직하고, 바탕 혼성의 10배인 것이 더욱 바람직하다.
예시적인 엄격한 혼성 조건들은 하기를 포함한다: 50% 포름아미드, 5배(5x) SSC, 및 1% SDS로 42℃에서 인큐베이션하거나, 또는 5배(5x) SSC, 1% SDS로 65℃에서 인큐베이션하고, 0.2배(0.2x) SSC, 및 0.1% SDS로 50℃에서 세척한다. 또한, 적절한 혼성 조건들은 "Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)를 이용하고, 표지된 탐침을 첨가한 후, 68℃에서 1 시간 또는 그 이상동안 데워 68℃에서 30분 또는 그 이상동안 사전혼성화(prehybridization)를 포함한다.
세척 단계는 예를 들어 낮은 엄격함의 조건하에서, 수행될 수 있다. 따라서, 예시적인 낮은 엄격함 조건은, 예를 들어, 42℃, 2배(2x) SSC, 0.1% SDS, 또는 바람직하게 50℃, 2배(2x) SSC, 0.1% SDS를 포함할 수 있다. 대신에, 예시적인 높은 엄격함 조건은, 예를 들어, 2배(2x) SSC, 0.01% SDS로 상온에서 20분 동안 3회 세척한 다음, 1배(1x) SSC, 0.1% SDS로 37℃에서 20분 동안 3회 세척하고, 1배(1x) SSC, 0.1% SDS로 50℃에서 20분 동안 2번 세척하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 온도 및 염 농도와 같은 여러 인자들은 혼성의 엄격함에 영향을 줄 수 있고, 당업자는 요구되는 엄격함을 달성하기 위해 상기 인자들을 적절히 선택할 수 있다.
바람직하게는, 상기 기능적으로 등가인 폴리펩티드는 본 발명에서 기재하고 있는 본래의 Akt, PKA-C 또는 PKIB 서열에 최소한 약 80% 상동성, 더욱 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 폴리펩티드의 상기 상동성은 “Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA80:726-30(1983)의 알고리즘을 따라 결정될 수 있다. 다른 구현예에서는, 상기 기능적 등가물 폴리펩티드는 엄격한 조건들 하에서(하기 정의된 바와 같이) 상기 기능적 등가물 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
혼성 대신에, 유전자 증폭 방법은, 예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 방법, Akt 또는 PKIB에 대한 서열 정보를 기반으로 합성된 프라이머를 이용하여, Akt, PKA-C 또는 PKIB에 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 분리하기 위해 활용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 유용한 Akt, PKA-C 또는 PKIB 기능적 등가물은 그것을 생성하기 위해 이용되는 세포 또는 활용되는 숙주나 정제 방법에 따라, 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 당 사슬들의 존부, 또는 형태 상 변형들을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 그것이 Akt, PKA-C 또는 PKIB 폴리펩티드 중 어느 하나의 기능적 등가물인 한, 그것은 본 발명의 범위에 속한다.
NAALADL2 에 결합하는 항체의 스크리닝
NAALALD2는 새로운 유형 II 막 단백질이고, 글루타메이트 카르복시펩티다아제 II 족(glutamate carboxypeptidase II (GCPII) family)에 속한다. 또한, 유명한 전립선암 마커, 전립선-특이적 막 항체(prostate-specific membrane antigen, PSMA)는 GCPII 족에 속한다(Rajasekaran AK 등, Am J Physiol Cell Physiol 2005 288: C975-81. and Murphy GP 등, Prostate 2000 42: 145-9.). NAALADL2는 PSMA와 상동성을 보이고, 1개의 막전위(transmembrane)를 가지고, 플라즈마 막에 위한다(도 5의 H 참조). PMSA는 FDA-승인된 전립선암-영상화 작용제, 111In-labled 7E11 단일클론 항체(Prostascint, Cytogen, Princeton, NJ),의 표적이고, PMSA는 영상화 작용제의 특이적 운반 또는 PMSA-발현 세포들에 대한 치료제를 위한 임상시험 중인 J591과 같은 단일클론 항체들에 의해 표적화된다(Murphy GP 등, Prostate 2000 42: 145-9. and Holmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.). 따라서, 전립선암의 진단 또는 예방에 이용될 수 있는 항-NAALADL2 항체는 지표(index)로서 세포 표면에 있는 NAALADL2의 결합 능력을 이용하는 스크리닝을 통해 확인될 수 있다. 상기 스크리닝 방법의 구현예는 하기 단계들을 포함한다:
a) 후보 항체와 NAALADL2를 발현하는 세포를 접촉(contact)시키는 단계; 및
b) 세포 표면 상의 NAALADL2에 결합하는 피검 항체를 선별하는 단계.
이하, 본 발명의 방법을 상세히 설명한다.
대신에, NAALADL2의 추정 상 세포외 도메인은 서열번호 32이다. 따라서, 세포외에 NAALADL2에 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 후보 항체를 서열번호 32로 구성되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
b) 상기 폴리펩티드에 결합하는 피검 항체를 선별하는 단계.
하기 항목에 기재된 항체 또는 항체 절편 또는 비-항체 결합 단백질은 전립선암과 같은 NAALADL2 발현 세포들의 친화도을 검출함으로써 선별된다. 상기 세포들에 비특이적인 결합은 상온에서 3% BSA가 포함된 PBS를 30분 동안 처리함으로써 차단된다. 세포들은 후보 항체 또는 항체 절편과 함께 상온에서 60분 동안 배양된다. PBS로 세척한 후, 상기 세포들은 상온에서 60분 동안 FITC-접합된 2차 항체로 염색되고, 형광광도계를 이용하여 검출된다. 대신에, 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용한 바이오센서는 본 발명에서 항체 또는 항체 절편을 검출 또는 정량하기 위한 수단으로서 이용될 수 있다. 본 발명에서 세포 표면 상의 NAALADL2 펩티드를 검출할 수 있는 항체 또는 항체 절편이 선별된다.
선호되는 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 선별되는 피검 화합물들은 그의 치료적 효과를 평가하기 위해 추가적인 스크리닝을 위한 후보물질일 수 있다.
항체
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 지정된 단백질 또는 그의 펩티드에 특이적으로 반응적인 면역글로불린들과 그의 절편들을 포함한다. 항체는 인간 항체들, 영장류화 된 항체들, 키메라성 항체들, 이중특이적(bispecific) 항체들, 인간화된 항체들, 다른 단백질들 또는 방사성표지들에 융합된 항체들, 및 항체 절편들을 포함할 수 있다. 추가적으로, 항체는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되고 온전한 모노클론 항체들, 다중클론(polyclonal) 항체들, 두 개 이상의 온전한 항체들로부터 형성된 다중특이적(multispecific) 항체들(예, 이중특이적(bispecific) 항체들), 및 항체 절편들이 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 특별히 이들을 포함한다. "항체"는 모든 부류들을 의미한다(예. IgA, IgD, IgE, IgG and IgM).
본 발명은 PKIB 또는 NAALADL2에 대한 항체들을 이용한다. 더욱 바람직하게, 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대한 항체들은 PKIB에 대한 항체들로서 이용될 수 있고, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대한 항체들은 NAALADL2에 대한 항체들로서 이용될 수 있다.
상기 항체들은 알려진 방법들에 의해 제공될 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 항체들의 생산을 위한 예시적인 기술들을 기재한다.
(i)다중클론(polyclonal) 항체들
바람직하게 다중클론 항체들은 관련된 항원 및 보조제의 다중 피하(subcutaneous (sc)) 또는 복강(intraperitoneal (ip)) 주사들을 통해 동물들에서 마련된다. 상기 관련된 항원을 예를 들어, 열쇠구멍 삿갓조 개헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민(serum albumin), 소 티로글로불린(bovine thyroglobulin), 또는 예를 들어, 메일이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(시스테인 잔기들을 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)(리신 잔기를 통한), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 숙신산무수물(succinic anhydride), SOC12, 또는 R과 R'이 서로 다른 알킬기인 R'N=C=NR과 같은 이중기능적(bifunctional) 또는 유도체화 작용제를 이용한 대두 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)와 같은 면역화될 종에서 면역성인 단백질에 접합하는 것은 유용할 수 있다.
동물들은 예를 들어, 100㎍ 또는 5㎍의 단백질 또는 접합체(각각, 토끼 또는 마우스에서)와 2 부피의 Freund의 완전 보조제를 혼합하고 상기 용액을 복수 개의 부위들에 피내(intradermally) 주사함으로써 상기 항원, 면역성의 접합체들, 또는 유도체들에 대해 면역화된다. 1 개월 후, Freund의 완전 보조제 내 펩티드 또는 접합체의 원래 양의 1/5 내지 1/10을 복수 개의 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물들을 신장시켰다. 7 내지 14일 후, 상기 동물들을 출혈시키고, 항체 역가(antibody titer)를 위해 혈청을 분석하였다. 동물들을 역가 고원(titer plateaus)에 다다를 때까지 신장시켰다. 바람직하게는, 동일하지만, 다른 단백질에 접합 및/또는 다른 교차-연결 시료를 통해 접합된 항원의 접합체로 상기 동물을 신장시킨다.
또한, 접합체들은 재조합 세포 배양에서 단백질 융합으로서 제작될 수 있다. 또한, 면역 반응을 촉진하기 위해 명반(alum)과 같은 응집 작용제들이 적절히 이용될 수 있다.
(ii) 모노클론 항체들
단일클론 항체들은 예를 들어, 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 가능한 돌연변이를 제외하면 집단을 구성하는 개별 항체들이 동일한 실질적으로 상동성 있는 항체들의 집단에서 얻어진다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 분리된 항체들의 혼합물이 존재하지 않는 항체의 특성을 암시한다.
예를 들어, 단일클론 항체들은 Kohler 등, Nature, 256: 495 (1975)에서 처음 설명한 하이브리도마(hybridoma) 방법을 이용하여 제작될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법들에 의해 제작될 수 있다(미국 특허 No. 4,816,567).
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물은 면역화를 위해 이용될 단백질에 특이적으로 결합할 항체들을 생산하거나 생산할 수 있는 림프구들(lymphocytes)을 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역화된다. 대신에, 림프구들은 시험관 내에서 면역화 될 수 있다. 그 다음, 하이브리도마 세포를 형성하기 위해, 림프구들은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합 작용제를 이용하여 골수종 세포들과 융합된다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
따라서, 제작된 상기 하이브리도마 세포들은 바람직하게 융합되지 않은, 원래(parental) 골수종 세포들의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질들을 포함하는 적절한 배양 배지에 뿌려지고 키워진다. 예를 들어, 만약 원래(parental) 골수종 세포들에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase(HGPRT or HPRT))이 결핍되었다면, 하이브리도마 세포를 위한 상기 배양 배지는 HGPRT-결핍 세포들의 성장을 방해하는 물질들인 하이포크산틴, 아미노프테린(aminopterin), 및 티미딘을 포함할 것이다(HAT 배지).
선호되는 골수종 세포들은 효율적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포들에 의해 항체의 안정한 높은-수준의 생산을 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 예민한 것들이다. 이 중에, 선호되는 골수종 세포주들은 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, California, USA)에서 입수가능한 MOPC-21 및MPC-11 마우스 종양들 및 American Type Culture Collection(Manassas, Virginia, USA)에서 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포들에서 유래한 것들과 같은 쥐과의(murine) 골수종 세포주들이다. 또한, 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주들은 인간 모노클론 항체들의 생산을 위해 설명되었다(Kozbor, J. Immunol., 133: 300 1 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포들이 자라는 배양 배지는 항체에 대한 모노클론 항체들의 생산을 위해 분석된다. 바람직하게, 하이브리도마 세포들에 의해 생산된 모노클론 항체들의 결합 특이성은 면연침강법 또는 방사성면역분석(radioimmunoassay, RIA) 또는 효소면역분석(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)과 같은 시험관 내 결합 분석에 의해 측정된다. 예를 들어, 상기 단일클론 항체의 결합 친화도는 Munson 등(Anal. Biochem., 107: 220 (1980))의 30 Scatchard analysis에 의해 측정될 수 있다.
하이브리도마 세포들이 원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체들을 생산하는 것을 확인한 후, 상기 클론들은 한계 희석 과정들에 의해 계대되고 표준 방법들에 의해 키워질 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 예를 들어, 상기와 같은 목적을 위한 적절한 배양 배지는 D-MEM 또는 RPML-1640 배지를 포함한다. 추가적으로 상기 하이브리도마 세포들은 동물의 생체 내에서 복수(ascites) 종양으로서 키워질 수 있다.
상기 계대된 클론들에 의해 분비되는 상기 단일클론 항체들은 예를 들어, 단백질 A-세파로즈, 하이드록실아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석(dialysis), 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 관습적인 면역글로불린 정제 과정을 통해 배양 배지, 복수액(ascites fluid), 또는 혈청으로부터 적절히 분리된다.
단일클론 항체들을 암호화하는 DNA는 관습적인 과정을 이용해 즉시 분리되어 서열분석된다(예, 쥐과의 항체들의 중 사슬(heavy chain) 및 경 사슬(light chain)을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용함으로써). 상기 하이브리도마 세포들은 그러한 DNA의 선호되는 자원으로서의 역할을 한다. 분리되면, 재조합 숙주 세포들에서 단일클론 항체들을 합성하기 위해, 상기 DNA는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. coli 세포들, simian COS 세포들, Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포들, 또는 골수종 세포들과 같은 숙주 세포들 내로 형질감염될 발현벡터로 배치될 수 있다.
박테리아에서 항체를 암호화하는 DNA의 재조합 발현에 관한 재고 논문은 Skerra 등, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)을 포함한다.
PKIB 또는 NAALADL2에 대해 반응성을 띄는 특이적 항체들, 또는 항체 절편들을 생성하는 또 다른 방법은 PKIB 또는 NAALADL2 단백질 또는 펩티드를 이용하여 박테리아에서 발현되는 면역글로불린 유전자들, 또는 그의 단백질들을 암호화하는 발현 라이브러리들을 스크리닝하는 것이다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 PKIB 절편은 PKIB의 대체로서 이용될 수 있고, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 NAALADL2 절편은 NAALADL2의 대체로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 Fab 절편들, VH 부위들 및 Fv 부위들은 파지 발현 라이브러리들을 이용하여 박테리아에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Ward 등, Nature 341: 544-546 (1989); Huse 등, Science 246: 1275- 1281 (1989); 및 McCafferty 등, Nature 348: 552-554 (1990)을 참조할 수 있다. 예를 들어, PKIB 펩티드, 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 PKIB 절편, NAALADL2 펩티드, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 NAALADL2 절편을 이용하여 그러한 라이브러리들을 스크리닝하는 것은 상기 PKIB, PKIB 절편, NAALADL2 또는 NAALADL2 절편에 반응성을 띄는 면역글로불린 절편들을 확인할 수 있다. 대신에, 상기 SCID-hu 마우스(Genpharm에서 입수가능한)는 항체들 또는 이들의 절편을 생산하는데 이용될 수 있다.
추가적인 구현예에서, 항체들 또는 항체 절편들은 McCafferty 등, Nature, 348: 552-554 (1990)에서 설명하는 기술들을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리들로부터 분리될 수 있다. Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks 등, J MoL BioL, 222: 581-597 (1991)은 각각 파지 라이브러리들을 이용한 쥐과 및 인간 항체들의 분리에 대해 기재하고 있다. 후속 간행물들은 매우 큰 파니 라이브러리들을 제작하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체 내 재조합(Waterhouse 등, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993))뿐만 아니라, 사슬 셔플링(chain shuffling)을 통한 높은 친화도(nM 범위) 인간 항체들의 생산(Marks 등, BiolTechnology, 10: 779-783 (1992))에 대해서도 기재하고 있다. 따라서, 이러한 기술들은 단일클론 항체들의 분리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술들의 실용적인 대안들이다.
또한, 상기 DNA는, 예를 들어, 상동성 있는 쥐과의 서열들 대신에 인간 중- 및 경-사슬 고정 도메인들을 위한 암호화 서열을 대체하거나(미국 특허 No. 4,816,567; Morrison, 등, Proc. Natl Acad. ScL USA, 81: 6851 (1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드를 위한 암호화 서열의 전부 또는 일부의 면역글로불린 암호화 서열에 공유적으로 연결함으로써 변형될 수 있다.
전형적으로, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-조합 부위와 다른 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원-조합 부위를 포함하는 키메라성의 2가(bivalent) 항체를 제조하기 위해 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드들은 항체의 고정 도메인들로 대체되거나, 또는 항체의 하나의 항원-조합 부위의 가변 도메인들로 대체된다.
(iii) 인간화된 항체들
비-인간 항체들을 인간화하기 위한 방법들이 당업계에서 설명되어 왔다. 바람직하게, 인간화된 항체는 비-인간의 자원으로부터 상기 항체로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기들을 가진다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기들은 종종 "이입" 잔기들이라고 일컬어지고, 이들은 전형적으로 "이입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 인간화는 필수적으로 Winter 및 동료들의 방법에 따라 초가변적 부위 서열을 인간 항체의 상응하는 서열들로 대체함으로써 수행된다(Jones 등, Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann 등, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science, 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 그러한 "인간화된" 항체들은 실질적으로 하나 이하의 본래 인간 가변 도메인이 비-인간 종들로부터 유래한 상응하는 서열에 의해 대체된 키메라성의 항체들이다(미국 특허 No. 4,816,567). 실제로, 인간화된 항체들은 전형적으로 일부 초가변적인 부위 잔기들과 가능한 일부 FR 잔기들이 설취료 항체들에서 유사한 부위들로부터 유래한 잔기들에 의해 대체된 인간 항체들이다.
인간화된 항체들을 제작하는데 이용될 인간 가변 도메인들, 경- 및 중-사슬 모두,의 선택은 항원성 저감에 매우 중요하다. 이른바 "최-적합(best-fit)" 방법에 따를 때, 설취류 항체의 가변 도메인의 서열은 알려진 인간 가변-도메인 서열들의 전체 라이브러리에 대해서 스크리닝된다. 그 다음, 설취류의 서열에 가장 근접한 상기 인간 서열은 인간화된 항체를 위한 인간 구조 부위(human framework region, FR)로서 허용된다(Suns 등, J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia 등, J. Mol. Biol, 196: 901 (1987)). 또 다른 방법은 경사슬 또는 중사슬들의 특별한 하위군의 모든 인간 항체들의 공통 배열(consensus sequence)로부터 유래한 특별한 구조 부위(framework region)를 이용한다. 상기 동일한 구조는 여러 다른 인간화된 항체들을 위해 이용될 수 있다(Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta 등, J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
항체들이 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성들을 유지한 채 인간화되는 것은 매우 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 선호되는 방법에 따르면, 인간화된 항체들은 원래 서열들 및 원래 인간화된 서열들의 3-차원적 모델들을 이용한 다양한 개념상 인간화된 산물들의 분석 과정을 통해 제작된다. 3-차원적 면역글로불린 모델들은 정상적으로 이용가능하고 당업자에게 친숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열들의 유망한 3-차원 구조적 구조들을 도해하고 표시하는 컴퓨터 프로그램들이 이용가능하다. 이러한 표시들의 정밀 조사는 예를 들어, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기들의 분석과 같은 후보 면역글로불린 서열의 기능상 잔기들의 유사 역할의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방법으로, FR 잔기들은 수령체(recipient) 및 이입 서열들로부터 선별 및 조합될 수 있으므로 표적 항원에 대한 증가된 친화도과 같은 상기 원하는 항체 특성이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 상기 초가변적 부위 잔기들은 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는 것과 관련된다.
(iv) 인간 항체들
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체들이 생성될 수 있다. 예를 들어, 현재는 내재적인 면역글로불린 생산의 부재 하에, 면역화되어, 인간 항체들의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질감염 동물(예, 마우스)들을 제작할 수 있다. 예를 들어, 키메라성 및 생식-계열(germ-line) 돌연변이 마우스들의 항체 중-사슬 연결 부위(joining region, JH) 유전자의 동형접합성의(homozygous) 삭제는 내재적인 항체 생산의 완전한 억제를 유발한다는 것이 설명되어왔다. 그러한 생식 계열 돌연변이 마우스들에서 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이(array)의 전이(transfer)는 항원 문제(challenge)에 따른 인간 항체의 생산을 유발할 것이다. 예를 들어, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann 등, Year in immuno., 7: 33 (1993); 및 미국 특허 Nos. 5,591,669,5,589,369 및 5,545,807을 참조할 수 있다.
대신에, 파지 디스플레이 기술(McCafferty 등, Nature 348: 552-553 (1990))은 면역화 되지 않은(unimmunized) 공여체들(donors)에서 유래한 면역글로불린 가변(variable, V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체들 및 항체 절편들을 시험관 내에서 생산하는데 이용될 수 있다. 이런 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 사상(filamentous) 박테리오파지의 주요한 또는 부수적 외막 단백질 유전자 중 어느 하나로 클로닝된 구조(in-frame)이고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 절편들로서 표시된다. 또한, 상기 선형 입자들은 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 복제본을 포함하므로, 항체의 기능적 특성들에 기반한 선택들은 그러한 특성들을 보이는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 유발한다. 따라서, 상기 파지는 B 세포의 특성들 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형태(formats)로 수행될 수 있다; 이들의 재고(review)를 위해 예를 들어, Johnson, Kevin S. 및 Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-57 1 (1993)을 참조할 수 있다. V-유전자 단편들의 여러 자원들은 파지 디스플레이를 위해 이용될 수 있다.
Clackson 등(Nature, 352 : 624-628 (1991))은 면역화된 마우스들의 비장으로부터 유래한 V 유전자들의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론(oxazolone) 항체들의 다양한 어레이를 분리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여체로부터 V 유전자들의 레퍼토리가 제작될 수 있고, 항원(자가 항원(self antigen)을 포함)들의 다양한 어레이에 대한 항체들은 필수적으로 Marks 등, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith 등, EMBO J. 12: 725-734 (1993)에 따라 분리될 수 있다. 또한, 미국 특허 Nos. 5,565,332 및 5,573,905을 참조할 수 있다.
또한, 인간 항체들은 시험관 내에서 활성화된 B 세포들에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 20 5,567,610 및 5,229,275 참조). SCID 마우스들을 이용한 인간 항체 생성의 선호되는 수단은 공동 소유의, 함께 계류중인 출원들에 자세히 기재되어 있다.
(v) 항체 절편들
항체 절편들의 생산을 위해 다양한 기술들이 발전되어져 왔다. 전통적으로, 이러한 절편들은 온전한 항체들의 단백질 가수분해를 통해 유래되었다(예, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 Brennan 등, Science, 229: 81 (1985) 참조). 그러나, 현재 이러한 절편들은 재조합 숙주 세포들에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 절편들은 상기 설명한 항체 파지 라이브러리들로부터 분리될 수 있다. 대신에, F(ab') 2 절편들을 형성하기 위해 Fab'-SH 절편들은 E. coli로부터 직접 회수되어 화학적으로 연결될 수 있다(Carter 등, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab') 2 절편들은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 절편들의 생산을 위한 다른 기술들은 당업자에게 명백하다. 다른 구현예들에서, 항체의 선택은 단일 사슬 Fv 절편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 No. 5,571,894; 및 미국 특허 No. 5,587,458을 참조할 수 있다. 또한, 상기 항체 절편은 예를 들어 미국 특허 5,641,870에서 기재하고 있는 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체 절편들은 단일특이적(monospecific)이거나 또는 이중특이적(bispecific)일 수 있다.
(vi) 비-항체 결합 단백질
용어 "비-항체 결합 단백질" 또는 "비-항체 리간드" 또는 "항원 결합 단백질"은 하기에서 상세히 설명하는 바와 같이, 호환적으로 애드넥틴(adnectins), 아비머(avimers), 단일 사슬 폴리펩티드 결합 분자들 및 항체-유사 결합 펩티도미메틱스를 포함하는 비-면역글로불린 단백질 비계(scaffolds)를 이용하는 항체 모방체를 일컫는다.
항체와 유사한 방법으로 표적화하고 표적에 결합하는 다른 화합물들은 발전되어 왔다. 이러한 어떤 "항체 모방체"는 항체들의 다양한 부위들을 위한 대체적인 단백질 틀로서 비-면역글로불린 단백질 비계를 이용한다.
예를 들어, Ladner 등(미국 특허 No. 5,260,203)은 분자적으로 분리되어 있지만 응집된 항체의 경사슬 및 중사슬 가변 부위의 결합 특이성과 유사한 결합 특이성을 가진 단일 폴리펩티드 사슬 결합 분자들을 기재하고 있다. 상기 단일-사슬 결합 분자는 펩티드 연결자(peptide linker)에 의해 연결된 항체의 중 및 경 가변 부위 모두의 항원 결합 부위들을 포함하고, 두 펩티드 항체의 구조와 유사한 구조로 접힐 것이다. 상기 단일-사슬 결합 분자는 관습적인 항체들에 비해 예를 들어, 더 작은 크기, 더 큰 안정성, 및 더 쉬운 변형과 같은 여러가지 이점들을 보인다.
Ku 등(Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 (1995))은 cytochrome b562에 기반한 항체들의 대안을 상세히 설명하고 있다. Ku 등(1995)은 소 혈청 알부민에 대한 결합을 위해 cytochrome b562의 루프들 중 2개가 무작위로 선별된 라이브러리를 생성하였다. 상기 개별적인 돌연변이들이 항-BSA 항체들과 유사하게 BSA에 선택적으로 결합하는 것을 발견하였다.
Lipovsek 등(미국 특허 Nos. 6,818,418 및 7,115,396)은 피브로넥틴(fibronectin) 또는 피브로넥틴-유사 단백질 비계(scaffold) 및 하나 이상의 가변 루프를 특징으로 하는 항체 모방자에 대해 상세히 설명하고 있다. 애드넥틴(Adnectins)처럼 알려진, 이러한 피르보넥틴-기반 항체 모방자들은 어떤 표적화된 리간드에 대한 높은 친화도 및 특이성을 포함하는 자연적 또는 인공적 항체들의 동일한 특성을 많이 보인다. 신규하거나 또는 개선된 결합 단백질의 진화를 위한 모든 기술들이 상기 항체 모방자와 함께 이용될 수 있다.
상기 피브로넥틴-기반 항체 모방자의 구조는 IgG 중사슬의 가변 부위의 구조와 유사한다. 따라서, 이러한 모방자들은 자연과 유사한 항원 결합 특성 및 본래 항체들의 항원에 대한 결합력을 보인다. 추가적으로, 이러한 피브로넥틴-기반 항체 모방체들은 항체들 및 항체 절편들에 비해 어떤 이점들을 보인다. 예를 들어, 이러한 항체 모방체들은 본래의 접힘 안정성(native fold stablility)을 위해 이황화 결합에 의존하지 않고, 따라서, 정상적으로 항체들이 분해되는 조건들 하에서도 안정하다. 추가적으로, 이러한 피브로넥틴-기반 항체 모방체들이 구조가 IgG 중사슬의 구조와 유사하므로, 생체 내에서 항체들의 친화도 성숙화 과정과 유사한 루프 무작위화 및 셔플링(shuffling)을 위한 과정을 시험관 내에서 이용할 수 있다.
Beste 등(Proc Natl Acad Sci USA 96(5):1898-1903 (1999))은 리포칼린(lipocalin) 비계(Anticalin(R))에 기반한 항체 모방체에 대해 상세히 설명하고 있다. 리포칼린은 단백질의 말단에 4 개의 가변 루프를 가진 베타-배럴(β-barrel)로 구성된다. Beste(1999)은 상기 루프들에 무작위 돌연변이법을 가하였고, 예를 들어, 피브로넥틴과의 결합을 위해 선별하였다. 3가지 변이체들이 피브로넥틴과의 특이적 결합을 보였고, 한가지 변이체는 항-피브로넥틴 항체의 결합과 유사한 결합을 보였다. 추가적인 분석은 모든 무작위화된 위치들이 가변적임을 보여 안티칼린(Anticalin(R))이 항체들의 대체제로서 이용되기에 적합함을 보였다.
안티칼린은 항체들에 비해, 감소된 생산 비용, 보관 상 증가된 안정성 및 감소된 면역학적 반응을 포함하는 여러 가지 이점들을 제공하는, 전형적으로 160 내지 180 사이 잔기들의 작은 단일 사슬 폴리펩티드이다.
Hamilton 등(미국 특허 No. 5,770,380)은 결합 부위들로서 이용된 다중 가변 폴리펩티드 루브들과 결합한, 칼릭사렌(calixarene)의 견고한, 비-펩티드 유기적 비계를 이용한 합성적 항체 모방체에 관해 상세히 설명하고 있다. 서로에 관해, 상기 펩티드 루프들은 칼릭사렌의 기하학적으로 동일한 측면에서 돌출된다. 이러한 기학적 구조때문에, 모든 루프들이 리간드에 대한 결합 친화도를 증가시켜, 결합에 이용될 수 있다. 그러나, 다른 항체 모방체들과 비교하여, 상기 칼릭사렌-기반 항체 모방체는 배타적으로 펩티드를 구성하지 않고, 따라서 단백질 가수분해 효소들에 의해 공격받기가 쉽지 않다. 상기 비계는 순수하게 펩티드, DNA 또는 RNA로만 구성되지 않아서, 상기 항체 모방체는 극한 환경적 조건에서도 상대적으로 안정하고 긴 수명을 가진다. 더욱이, 상기 칼릭사렌-기반 항체 모방체는 상대적으로 작기 때문에, 면역성 반응을 잘 일으키지 않는다.
Murali 등(Cell Mol Biol. 49(2):209-216 (2003))은 항체들을 더 작은 펩티도미메틱스로 감소시키는 방법학을 논하면서, 항체들의 대제체로서도 유용할 수 있는 "항체 유사 결합 펩티도미메틱스(antibody like binding peptidomemetics, ABiP)"라고 명명하고 있다.
Silverman 등(Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561)은 "아비머(avimers)"라고 불리는 다중 도메인들을 포함하는 단일-사슬 폴리펩티드인 융합 단백질들을 상세히 설명하고 있다. 시험관 내 엑손 셔플링(shuffling) 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인들로부터 개발된 상기 아비머는 다양한 표적 분자들에 대한 그것들의 친화도 및 특이성 측면에서 항체들과 다소 유사한 결합 단백질의 한 부류이다. 결과적인 다중도메인 단백질들은 단일-항원결정기 결합 단백질들에 비해 개선된 친화도(일부 경우에는 나노몰 수준보다 적은(sub-nanomolar)) 및 특이성을 보이는 다중 독립 결합 도메인을 포함할 수 있다. 아비머의 제작 방법과 이용에 과한 추가적인 상세한 설명은, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 Nos. 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 및 20050221384에 상세히 기재되어 있다.
비-면역글로불린 단백질 틀에 덧붙여, 항체 특성들은 또한 모두 본 발명의 사용에 적합한 RNA 분자들 및 비자연적 저중합체들(예, 단백질가수분해효소 억제제들, 벤조디아제핀, 퓨린 유도체들 및 베타-회전 모방체)을 포함하는 화합물에서 모방되어 왔다.
비록, 피검 작용제 라이브러리들의 제작이 당업계에 잘 알려져 있지만, 이하, 본 명세서에서 본 발명의 스크리닝 방법을 위한 피검 작용제들의 확인 및 그러한 작용제들의 라이브러리 제작에 관한 추가적인 지침을 제공한다.
(vii) 항체 접합체들 및 기타 변형들
본 명세서의 방법에서 이용되거나 또는 제조의 논문에 포함된 항체들은 선택적으로 세포독성 또는 치료적 작용제에 접합된다.
또한, 항체 및 하나 이상의 칼리키아미신(calicheamicin), 메이탄시네(maytansine)(미국 특허 No. 5,208,020), 트리코텐(trichothene), 및 CC1065와 같은 작은 분자 독소들의 접합들도 본 명세서에서 고려된다. 본 발명의 선호되는 한 구현예에서, 상기 항체들은 하나 이상의 메이탄시네(maytansine) 분자들과 접합된다(예, 항체 분자 당 약 1 내지 약 10 메이탄시네 분자들). 예를 들어, 메이탄시네-항체 접합체를 생성하기 위해, 메이탄시네는 May-SH3으로 환원되어 변형된 항체들과 반응할 수 있는 May SS-Me로 전환될 수 있다(Chari 등 Cancer Research 52: 127-131 (1992)). 대신에, 상기 항체들은 하나 이상의 칼리키아미신(calicheamicin) 분자에 접합될 수 있다. 상기 항생제의 칼리키아미신(calicheamicin) 족은 피코몰 수준보다 적은 농도에서 이중 가닥 DNA 단편(breaks)을 생산할 수 있다. 이용될 수 있는 칼리키아미신(calicheamicin)의 구조적 유사체들은 감마1 I, 알파2 I, 알파3 I, N-아세틸-감마l I, PSAG 및 쎄타1 I을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다(Hinman 등 Cancer Research 53 : 3336-3342 (1993) and Lode et al, Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).
이용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소들과 이의 절편들은 디프테이라(diphtheria) A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 절편들, 외독소(exotoxin) A 사슬(황색포도상구균(Pseudomonas aeruginosa)에서 유래), 리신 A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, 알파 사르신(alpha sarcin), 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 컬신(curcin), 크로틴(crotin), 비누풀(saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테신(tricothecenes)을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 출판된 WO 93/21232을 참조할 수 있다.
추가적으로 본 발명은 다양한 방사성 동위원소들과 접합된 항체들을 고려한다. 예들은 2 llAt, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 2 l2Bi, 32P 및 Lu의 방사성 동위원소들을 포함한다.
상기 항체 및 세포독성 작용제의 접합체들은 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트( N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionate, SPDP), 숙신이미딜-4-(N-메일이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 이미노티올란(iminothiolane, IT), 이미도에스터(imidoester)의 이중 기능적 유도체들(디메틸 아디피미데이트 HCL과 같은), 활성 에스터들(디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate)와 같은), 알데히드(글루타르알데히드와 같은), 비스-아지도(bis-azido) 화합물들(비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민(bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine)과 같은), 비스-디아조늄(bis-diazonium) 유도체들(비스-(p-이다조늄벤조일)-에틸렌디아민(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine)과 같은), 디이소시아네이트(톨리엔 2,6-디이소시아네이트(tolyene 2,6-diisocyanate)와 같은), 및 비스-활성 플루오린 화합물들(1, 5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)과 같은)과 같은 다양한 이중 기능적인 단백질 연결 작용제를 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 리신(ricin) 면역독소(immunotoxin)은 Vitetta 등 Science 238: 1098 (1987)에 기재된 것처럼 제작될 수 있다. 탄소-14-표지된 1 이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트 산(isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid, MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드와 항체의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅 작용제이다. W094/11026을 참조할 수 있다. 상기 연결자는 세포 독성 약물의 세포 내 방출을 촉진하는 "절개가능한 연결자"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정한(acid-labile) 연결자, 펩티다아제-민감성(peptidase-sensitive) 연결자, 디메틸(dimethyl) 연결자 또는 이황화-포함(disulfide-containing) 연결자(Charm 등 Cancer Research 52: 127-131 (1992))가 이용될 수 있다.
대신에, 항체 및 세포독성의 작용제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어, 재조합 기술들 또는 펩티드 합성에 의해 제작될 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서는, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여하고, 제거 작용제(clearing agent)ffm 이용하여 순환으로부터 결합되지 않은 접합체를 제거한 후, 세포독성 작용제(예, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드"(예, 아비딘)를 투여하여 종양 사전표적화(pretargeting)하는데 활용하기 위해서 상기 항체는 "수용체(receptor)"(스트렙트아비딘(streptavidin)과 같은)에 접합될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 항체들은 전구-약물(pro-drug)(예, 펩티드성 화학치료적 작용제, W081/01145 참조)을 활성 항-암 약물로 전환하는 효소를 활성화하는 전구약물(prodrug)과 접합될 수 있다. 예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 No. 4,975,278을 참고할 수 있다.
그러한 접합체들의 효소 구성 요소는 전구약물을 그것의 더욱 활성적이고 세포독성인 형태로 전환시키는 한, 그러한 방법으로 전구약물에 작용할 수 있는 모든 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 효소들은 포스페이트(phosphate)-포함 전구약물을 자유 약물로 전환하는데 유용한 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase); 설페이트(sulfate)-포함 전구약물을 자유 약물로 전환하는데 유용한 아릴설파타아제(arylsulfatase); 비-독성 5-플루오로시토신(non-toxic 5-fluorocytosine)을 항-암 약물인, 플루오로우라실(fluorouracil)로 전환하는데 유용한 시토신 디아미나아제(cytosine deaminase); 펩티드-포함 전구약물을 자유 약물로 전환하는데 유용한 세라티아 프로테아제(serratia protease), 서몰리신(thermolysin), 서브틸리신(subtilisin), 카르복시펩티다아제(carboxypeptidases), 및 카텝신(cathepsins)(카텝신 B 및 L과 같은)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체들을 포함하는 전구약물을 자유 약물로 전환하는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제(alanylcarboxypeptidases); 글리코실화된(glycosylated) 전구약물을 자유 약물로 전환하는데 유용한 13-갈락토시다아제 및 뉴라미다아제(neuraminidase)와 같은 탄수화물 분해(carbohydratecleaving) 효소; 13-락탐으로 유도체화된(derivatized) 약물을 자유 약물로 전환하는데 유용한 13-락타마제(13-lactamase); 및 아민 질소가 페녹시아세틸(phenoxyacetyl) 또는 페닐아세틸(phenylacetyl)기로 유도체화된 약물을 자유 약물로 각각 전환하는 유용한 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제와 같은 페니실린 아미다아제(penicillin amidases)를 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 대신에, 당업계에서 "앱자임(abzymes)"으로도 알려진, 효소적 활성을 가진 항체들은 본 발명의 전구약물을 자유 활성 약물로 전환하는데 이용될 수 있다(예, Massey, Nature 328: 457-458 (1987) 참조). 앱자임의 종양 세포 집단으로 운반하기 위해 항체-앱자임 접합체들은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 제작될 수 있다.
본 발명의 상기 효소들은 상기에서 설명한 이종 이중 기능적(heterobifunctional) 교차연결 시료들을 이용하는 것과 같은 당업계에 잘 알려진 기술들을 통해 항체에 공유결합적으로 결합될 수 있다. 대신에, 본 발명의 효소의 기능적으로 활성인 하나 이상의 부분에 연결된 본 발명의 항체의 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술들을 이용하여 제작될 수 있다(예, Neuberger 등, Nature, 312: 604-608 (1984) 참조). 본 명세서에서 상기 항체의 다른 변형들이 고려될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 폴리옥시알킬렌(polyoxyalkylenes), 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체와 같은 다양한 비단백질성의(nonproteinaceous) 중합체 중의 하나와 연결될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 상세히 설명된 항체들은 리포좀으로서 제형될 수 있다. 상기 항체를 포함하는 리포좀들은 Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688 (1985); Hwang 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 미국 특허 Nos. 4,485,045 및 4,544,545; 및 1997년 10월 23일에 공개된 W097/38731에 기재된 바와 같은 당업계에서 알려진 방법으로 제작된다. 촉진된 순환 시간을 가진 리포좀은 미국 특허 No. 5,013,556.에 상세히 설명되어 있다.
특히, 유용한 리포좀들은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤(cholesterol) 및 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)로 유도체화된 PEG(PEG-PE)를포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법(reverse phase evaporation method)에 의해 생성될 수 있다. 원하는 지름을 가진 리포좀을 생성하기 위해 리포좀은 특정 구멍 크기의 필터를 통해 분출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 절편들은 Martin 등 J ; Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)에 기재된 바와 같이 이황화 교환 반응(disulfide interchange reaction)을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 화학치료적 작용제는 리포좀 내에 선택적으로 포함된다. Gabizon 등 ANational Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 설명한 항체들의 아미노산 서열 변형이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성들을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 암호화 핵산으로 적절한 뉴클레오티드 변경(changes)을 도입, 또는 펩티드 합성을 통해 제작된다. 그러한 변형들은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기들을 삭제, 및/또는 삽입 및/또는 치환하는 것을 포함한다. 최종 구조체에 이르기 위해 삭제, 삽입, 및 치환의 모든 조합이 사용되어, 원하는 특성들을 가진 최종 구조체를 제공한다. 상기 아미노산 변경(changes)은 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경과 같은 항체의 번역 후 과정(post-translational processes)을 변경시킬 수 있다.
돌연변이법을 위해 선호되는 위치인 상기 항체의 어떤 잔기들 또는 부위의 확인을 위해 유용한 방법을 Cunningham and Wells Science, 244 : 1081-1085 (1989)에서 설명한 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이법(alanine scanning mutagenesis)"라고 부른다. 이때, 표적 잔기들의 잔기 또는 작용기는 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 주는 중성 또는 음전하로 하전 된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 확인(예, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같이 하전된 잔기들) 및 치환된다. 그 다음, 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치는 추가적인 또는 다른 변이체들을 치환의 부위에, 또는 치환의 부위 대신에, 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이체 도입을 위한 부위는 사전결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질은 사전결정될 필요가 없다. 예를 들어, 상응 부위에 돌연변이의 수행을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이법이 표적 코돈 또는 부위에서 수행되고, 발현된 항체 변이체들은 원하는 활성을 위해 스크리닝된다. 아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기들의 서열 간 삽입(intrasequence insertions) 뿐만 아니라, 한 개의 잔기부터 100개 이상의 잔기들을 포함하는 폴리펩티드에 이르는 길이의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합도 포함한다. 말단 삽입의 예들은 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 항체 또는 세포독성의 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입된 변이체들은 효소, 또는 항체의 혈청 반감기(half-life)를 증가시키는 폴리펩티드의 N- 또는 C-발단에의 융합을 포함한다.
변이체의 또 다른 유형은 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체들은 다른 잔기로 대체된 항체 분자에 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 항체의 치환적 돌연변이법을 위한 가장 큰 목적 부위(sites of greatest interest)는 초가변적 부위를 포함하나, FR 변이들도 또한 고려된다. 상기 항체의 생물학적 특성들에서 실질적인 변형들은 (a) 예를 들어 판상(sheet) 또는 나선형 형태와 같은 치환의 영역 내 폴리펩티드 백본(backbone)의 구조, (b) 표적 부위에 분자의 전하 또는 소수도(hydrophobicity), 또는 (c) 측면 사슬의 부피를 유지하는데 미치는 영향이 현저히 다른 치환을 선택함으로써 이루어진다.
자연적으로 발생하는 잔기들은 공통적인 측면-사슬 특성들에 기반하여 여러 군으로 나누어진다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기들: gly, pro; and
(6) 방향성(aromatic): trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이러한 부류들 중 하나의 요소를 다른 부류로 변경시키는 것을 수반한다.
또한, 분자의 산화적 안정성을 개선하고, 비정상적인 교차연결을 방지하기 위해, 상기 항체의 적적한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 일부 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합은 항체의 안정성을 개선하기 위해 항체에 추가될 수 있다(특히, 상기 항체가 Fv 절편과 같은 절편인 경우).
치환적 변이체의 특히 선호되는 유형은 본래 항체의 하나 이상의 초가변적 부위 잔기들을 치환하는 것과 관련이 있다(예, 인간화되거나 또는 인간 항체). 일반적으로, 추가적인 발전을 위해 선별된 결과적 변이체들은 그것들이 생성되는 원래의 항체에 비해 생물학적 특성들을 개선시킬 것이다. 그러한 치환적 변이체들을 생성하는 쉬운 방법은 파지 디스플레이들 이용한 친화도 성숙화(affinity maturation)이다. 간단히, 여러 초가변적인 부위 부분들(예, 6-7 부분들)은 각각의 부분에 모든 가능한 아미노 치환을 생성하기 위해 돌연변이된다. 따라서 상기와 같이 생성된 항체 변이체들은 각각의 입자 내에서 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 융합된 것으로서 사상(filamentous) 파지 입자들로부터 1가의(monovalent) 방법으로 표시된다. 그 다음, 상기 파지-표시된 변이체들은 그것들의 생물학적 활성(예, 결합 친화도)을 위해 본 명세서에 상세히 설명한 바와 같이 스크리닝 된다. 변형을 위한 후보 초가변적 부위 부분들을 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이법은 항원 결합에 현저하게 기여하는 확인된 초가변적 부위 잔기들에 대해 수행될 수 있다. 대신에, 또는 추가적으로, 항체와 항원 간의 접촉 지점들을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 그러한 접촉 잔기들 및 이웃하는 잔기들은 본 명세서에서 상술한 기술들에 따른 치환을 위한 후보이다. 그러한 변이체들이 생성되면, 변이체들의 한 구획이 본 명에서에서 설명한 바와 같이 스크리닝 되고 하나 이상의 관련 분석들에서 우수한 특성을 가진 항체들이 추가적인 발전을 위해 선별될 수 있다.
항체의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 본래 글리콜실화 양상을 변경한다. 상기 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 일부분이 삭제 및/또는 상기 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위가 추가되는 것을 의미한다.
폴리펩트드들의 글리코실화는 전형적으로 M-연결 또는 O-연결 중 어느 하나이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측면 사슬에 탄수화물 일부분이 부착되는 것을 일컫는다. X가 프롤린을 제외한 모든 아미노산인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌의 트리펩티드 서열은 아스파라긴 측면 사슬에 대한 탄수화물 일부분의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이러한 트리펩티드 서열들 중 어느 것의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine), 갈락토즈, 또는 자일로즈(xylose)와 같은 당 중 하나가 하이드록시 아미노산, 비록 5-하이드록시 프롤린(5-hydroxyproline) 또는 5-하이드록시 리신(5-hydroxylysine)이 사용될 수 있지만, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 일컫는다.
상기 항체에 글리코실화 부위의 첨가는 상기-설명한 트리펩티드 서열들을 하나 이상 포함하는 아미노산 서열로 변경함으로써 쉽게 이루어진다(N-연결 글리코실화 부위들의 경우). 또한, 상기 변경은 본래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기들을 첨가 또는 치환함으로써 달성할 수도 있다(O-연결 글리코실화 부위들의 경우). 상기 항체의 아미노산 서열 변이체들을 암호화하는 핵산 분자들은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 제작된다. 이러한 방법들은 천연 자원으로부터 분리하거나 또는 올리고뉴클레오티드-매개된(또는 부위-지정) 돌연변이법, PCR 돌연변이법, 및 항체의 앞서 제작된 변이체 또는 비-변형 형태의 카세트 돌연변이법에 의한 제작을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다.
예를 들어, 상기 항체의 항원-의존적 세포-매개 세포독성(antigen-dependent cell-mediated cyotoxicity, ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 증진시키는 것과 같이 효과자 기능을 개선하기 위해 본 발명에서 이용된 항체들을 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 것은 하나 이상의 아미노산 치환들을 항체의 Fc 부위에 도입함으로써 달성될 수 있다. 대신에 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)은 Fc 부위에 도입되어, 이 부위에서 사슬내(interchain) 이황화 결합 형성을 가능하게 할 수 있다. 상기와 같이 생성된 동형이량체성(homodimeric) 항체는 내재화 능력(internalization capability)의 증진 및/또는 보체-매개 세포 파괴(complement-mediated cell killing) 및 항체-의존적 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC))의 증가을 유발할 수 있다. Caron 등, J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J linmunol 148 : 2918-2922 (1992)을 참조할 수 있다.
또한, 항-종양 활성이 증진된 동형이량체성 항체들은 Wolff 등 Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)에 설명된 바와 같이 이종 이중 기능적 교차 연결자를 이용하여 제작될 수 있다. 대신에, 이중의 Fc 부위들을 가진 항체들은 조작될 수 있고, 그로 인해 보체 용해 및 ADCC 능력들이 증진될 수 있다. Stevenson 등 Anti-CancerDrugDesign 3: 2 19-230 (1989)을 참조할 수 있다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에서 설명한 바와 같이 어느 하나는 상기 항체(특히, 항체 절편) 내로 구출(salvage) 수용체 결합 항원결정기를 통합시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "구출 수용체 결합 항원결정기"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 책임이 있는 IgG 분자의 Fc 부위의 항원결정기를 일컫는다(예, IgGI, IgG2, IgG3, 또는 IgG4).
이하, 하기 실시예에서, 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는, 본 발명의 태양들을 기술한다.
특별히 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 정상적인 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본 명세서에서 기재된 것들과 유사 또는 등가의 방법들 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험을 위해 이용될 수는 있지만, 이하, 적절한 방법들 및 물질들을 기재한다.
이하, 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는, 하기 실시예에서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 :
이하, 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는, 하기 실시예에서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
일반적인 방법들
세포주들
COS7 세포 및, PC 세포주들 LNCaP, 22Rv1, PC-3, DU-145 및 C4-2B은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Rockville,MD)에서 구입하였고, LNCaP-유래 HRPC 세포주인 C4-2B는 ViroMedLaboratories(Minnetonka,MN)에서 구입하였다. 30회 이상 계대된 LNCaP는, 낮은 계대 수의 LNCaP 세포와는 형태학적으로 다르고 유전자-발현 양상에서도 다른 LNCaP(HP)로 정의된다. 그것들을 둘베코의 수정 이글 배지(Delbecco’s modified Eagle’s medium)(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하였다; 상기 배지에 10% 우태아혈청(Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)) 및 1%의 항생제/항진균제 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 보충하였다. 세포들을 5% CO2가 포함된 습한 공기의 환경에서 37℃로 유지하였다.
반-정량적 RT - PCR
동결된 PC 조직들로부터 유래한 PC 세포들 및 일반 전립선성 상피 세포들의 정제는 앞서 설명하였다(Tamura K 등, Cancer Res 200767:5117-25.). 조직 시료들은 통지된 동의 전립선성 바늘 생체조직(prostatic needle biopsy), 뼈 생체조직, TUR-P(상기 전립선의 경요도 절제술), 및 "온화한(warm)" 검시(autopsy)를 겪고 있는 HRPC 환자들로부터 통지받은 동의 하에 수득하였다. 동시에, 호르몬-비투여 전립선암(hormone-naive prostate cancer, HNPC) 시료들은 또한 근치적 전립선절제술(radical prostatectomy)을 겪고 있는 치료되지 않은 수술가능한 경우들에서 수득하였고, 일반 전립선 상피세포(normal prostatic epithelial cells, NPEC)은 또한 병리학적으로 명백한 전립선암 또는 PINs가 없는 것으로 확인된 전립선비대증(prostatic hyperplasia, BPH) 환자들 및 방광암(bladder cancer) 환자들로부터 수득하였다. HRPC 세포들, 호르몬-비투여 전립선암 세포들, 및 일반 전립선 상피세포들의 현미해부는 앞서 설명하였다(Tamura K 등, Cancer Res 2007 67: 5117-25.). 이러한 시료들에서 유래한 RNA들은 2-순환의 T7-기반 RNA 증폭((Epicentre Technologies, Madison, WI)) 및 그에 뒤이은 단일-가닥 cDNA의 합성이 이루어졌다. 인간 HRPC 세포주에서 유래한 전체 RNA들은 제조자의 추천에 따라 RNeasy Kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA들에 무-RNase DNase set(QIAGEN)를 처리하였고, d(T)12-18 프라이머와 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 단일-가닥 cDNA로 역-전사하였다. 하기 프라이머 서열들을 이용하였다.
β-actin(ACTB) 정방향: TTGGCTTGACTCAGGATTTA (서열번호 6)
β-actin(ACTB) 역방향: ATGCTATCACCTCCCCTGTG (서열번호 7)
PKIB 정방향: GGCACATACTAGAAGCAAAATACG (서열번호 8)
PKIB 역방향: GATGGGCAAATCATTCTTGGTA (서열번호 9)
NAALADL2 정방향: GAAAGCATCTCACATTGGTTTTC (서열번호 10)
NAALADL2 역방향: GGGTTTCAAAGAGAAACTCTGCT (서열번호 11)
NAALADL2-2 정방향: GAAGCAAAATGCCAGATGGT (서열번호 12)
NAALADL2-2 역방향: TCCTGCACAGTGTTCTAGAAAGG (서열번호 13)
상기 EST 및 NAALADL2 유전자 간의 연결을 RT-PCR로 확인하였다. 동일한 반응들로부터 발전된 cDNA 사이에 반-정량적 비교를 가능하게 하기 위해 상기 RT_PCR 지수기(exponential phase)를 측정하였다. 각각 PCR 진행 방식은 98℃, 30초의 초기 변성(denaturation) 단계에 이어 22 순환(ACTB의 경우), 23 순환(PKIB, NAALADL2의 경우) 및 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 및 72℃에서 30초 동안 Gene Amp PCR system 9600 (PE Applied Biosystems, Foster, CA) 상에 참여시켰다.
노던 블럿 분석
7개의 PC 세포주들에서 유래한 상기 전체 RNA들은 RNeasy Kit(QIAGEN)을 이용하여 추출하였고, 노던 블럿 분석을 수행하였다. mRNA Purification Kit(GE Healthcare)로 제조자의 프로토콜에 따라 mRNA가 정제되었다. PC 세포주뿐만 아니라, 일반 인간 심장, 폐, 간, 신장, 뇌, 및 전립선에서 분리한 세포들(BD Biosciences, Palo Alto, CA)에서 유래한 각각의 mRNA의 표본 부분(aliquot) 1㎍을 1% 변성 아가로즈 젤 상에서 분리하여 나일론 막들에 전이시켰다. PKIB에 특이적인 261-bp 탐침은 상기 기재한 것과 같은 프라이버 쌍을 이용하여 PCR을 통해 제작하였고, NAALADL2에 특이적인 706-bp 탐침은 하기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 통해 제작하였다: 정방향 5'-ccagtgcccagaaaccaata-3'(서열번호 14) 및 역방향 5'-tcaattcttcccatccaagaca-3'(서열번호 15). 무작위-제작된(random-primed), α32P-dCTP-표지된 탐침과의 혼성은 Megaprime DNA 표지 시스템 (GE bioscience, UK)의 지시에 따라 수행되었다. 사전혼성(prehybridization), 혼성 및 세척은 제공자의 추천에 따라 수행되었다. 상기 블럿들은 -80℃에서 7일 동안 스크린을 강화함으로써 방사능사진화(auto-radiograph)하였다.
작은 간섭 RNA ( siRNA )-발현 구조체 및 형질감염
PC 세포들에서 내재적인 PKIB 및 NAALADL2 발현을 무력화하기 위해, psiU6BX3.0 벡터가 상기 기재한 바와 같이 표적 유전자에 대한 작은 머리핀 RNA의 발현을 위해 이용되었다(Tamura K 등, Cancer Res 2007 67: 5117-25.). PKIB에 대한 siRNA를 위한 합성적 올리고뉴클레오티드들의 표적 서열들은 하기와 같다:
si1; GCCCTAAGCAGCATGTGTA (서열번호 16),
si2; GCAGTAGGCACTTAAGCAT (서열번호 17)
si3; GATGCAAAAGAGAAAGATG (서열번호 18).
NAALADL2에 대한 siRNA를 위한 합성적 올리고뉴클레오티드들의 표적 서열들은 하기와 같다:
si#690; GACTCAGTGGACCTCTTTG (서열번호 19)
si#913; GTCATCGATGTGAGTTATG (서열번호 20)
si#1328;GAGTCGTCAGCATGCAAGT (서열번호 21)
및 siEGFP; GAAGCAGCACGACTTCTTC (서열번호 22) (음성 대조군으로서). 22Rv1 and LNCaP(HP) 또는 C4-2B 세포들과 같은 PC 세포주들을 10-cm 접시들 또는 6-웰 플레이트상에서 평판배양하였고, 제조자의 지시에 따라 FuGENE6(Roche)를 이용하여 PKIB 또는 NAALADL2(8㎍/dish, 3㎍ /well)에 대한 siRNA를 발현하도록 지정된 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포들을 0.8mg/ml의 제네티신(Geneticin)(Sigma-Aldrich)으로 7일 동안 선별한 후, PKIB 또는 NAALADL2 발현 상의 무력화(knockdown) 효과를 분석하기 위해 수득하였다. PKIB 또는 NAALALD2를 위한 RT-PCR은 상기 기재된 프라이머들을 이용하여 수행되었다. 콜로니 형성 분석을 위해, siRNA를 발현하는 형질감염체들(transfectants)을 제네티신을 포함하는 배지에서 20일 동안 배양하였다. 100% 메탄올로 고정한 후, 콜로니 형성을 평가하기 위해 형질감염된 세포들을 0.1%의 결정 바이올렛-H20으로 염색하였다. 세포 생존력은 Cell 카운팅 kit-8(DOJINDO, Kumamoto, Japan)을 이용하여 정량하였다. 제네티신-포함 배지에서 20-일간 배양한 후, 상기 용액을 10%의 최종 농도로 첨가하다. 이어서 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, Microplate Reader 550 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 490nm 및 참조로서 630nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 본 발명자들은 5'-GACUCAGUGGACCUCUUUGGG-3'(서열번호 23) 및 5'-CAAAGAGGUCCACUGAGUCUU-3'(서열번호 24)와 같은 si#690에 상응하는 RNA 이중체(duplex) 또는 음성 대조군 siRNA 이중체(GCAGCACGACUUCTUUCAAGTT (서열번호 25)및 CUUGAAGAAGUCGUGCUGCTT(서열번호 26))를 합성하였고, 이들 각각은 또 다른 NAALADL2-발현 전립선암 세포주인 C4-2B 세포들에 형질감염시켰다.
면역세포화학법
PKIB 또는 NAALADL2의 개방 판독 틀(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR로 증폭시켰고, 상기 PCR-증폭 산물을 PCDNA3.1(+)/myc-HisA 벡터(Invitrogen) 또는 pIRES/HA(Clontech/BD Bioscience)에 클로닝하였다. 상기 플라스미드들은 제조자의 추천 절차에 따라 FuGENE6(Roche)를 이용하여, 유리 커버슬립(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) 상에서 평판배양된 COS7으로 형질감염시켰다. 48시간의 배양 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드로 고정시켰고, 0.1% 트리톤 X-100가 포함된 PBS를 이용해 상온에서 1분 동안 침투성을 올렸다(permeabilize). 비특이적 결합은 3% BSA가 포함된 PBS를 상온에서 30분 동안 처리함으로써 차단하였다. 세포들을 1% BSA가 포함된 PBS로 희석된 항-Myc 항체(Santa Cruz) 또는 항-HA 항체(Sigma)와 함께 상온에서 60분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 세포들을 FITC-접합 2차 항체(Santa Cruz)로 상온에서 60분 동안 염색시켰다. PBS로 세척한 후, 표본(specimen)은 DAPI(4', 6'diamidine-2'-phenylindolendihydrochrolide)가 포함된 VECTASHIELD(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)로 박제되었고, Spectral Confocal Scanning Systems(Leica, Bensheim, Germany)으로 시각화하였다.
PKIB PKA -C 간의 상호작용
PKIB-Myc 및 HA-PKA-C 발현 벡터들을 22Rv1 세포로 함께 형질감염시켰고, 형질감염 48시간 후, 상기 세포들을 세포용해 완충용액[50mM Tris-HCl (pH7.0), 250mM sucrose, 1mM DTT, 10mM EDTA, 1mM EGTA, 5mM MgCl2]으로 용해하였다. 상기 세포 용해물을 항-Myc 항체(Santa Cruz) 또는 항-HA 항체(Sigma)로 면역침강시켰고, 상기 면역침강체들을 개체으로 항-Myc 항체 또는 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
PKA -C 위치 측정( localization )
내재적인 PKIB를 더욱 효율적으로 무력화하기 위해 본 발명자들은 서열 si1에 상응하는 RNA 이중체(5'-GCCCUAAGCAGCAUGUGUAUA-3'(서열번호 27) 및 5'-UACACAUGCUGCUUAGGGCUU-3'(서열번호 28))에 상응하는 RNA 이중체를 합성하였다. 상기 RNA 이중체는 제조자의 추천 절차에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 PC-3 세포로 형질감염시켰다. 48시간의 배양 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드로 고정시켰고, 0.1% 트리톤 X-100가 포함된 PBS를 이용해 상온에서 1분 동안 침투성을 올렸다(permeabilize). 비특이적 결합은 3% BSA가 포함된 PBS를 상온에서 30분 동안 처리함으로써 차단하였다. 세포들을 1% BSA가 포함된 PBS에 의해 1:200으로 희석된 항-PKA-C 항체(C-20, Santa Cruz)와 함께 상온에서 60분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 세포들을 FITC-접합 2차 항체(Santa Cruz)로 상온에서 60분 동안 염색시켰고, Spectral Confocal Scanning Systems(Leica, Bensheim, Germany)으로 시각화하였다. 세포용해물을 분별(fractionate)하기 위해, RNA 이중체를 제조자의 추천 절차에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 LNcAP(HP) 세포들로 형질감염시켰다다. 48 시간의 배양 후, 세포들을 수득하였고, 상기 세포용해물을 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시료(NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent)(PIERCE)로 분별하였다. 분별된 세포 용해물의 단백질 30㎍을 항-PKA-C 항체 및 적재(loading) 및 핵-분별된 대조군을 위한 항-laminB 항체(Calbiochem)를 이용하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다.
PKIB -과발현 세포들의 생성 및 시험관/생체 내 성장 분석
PKIB의 개방 판독 틀(open reading frame)을 암호화하는 cDNA을 PCR로 증폭시켰고, 상기 PCR-증폭 산물을 pIRES/HA (Clontech/BD Bioscience)에 클로닝하였다. 상기 플라스미드들을 제조자의 추천 절차에 따라 FuGENE6(Roche)를 이용하여, PKIB-null PC 세포주인 DU145로 형질감염시켰다. 세포들의 집단을 0.6 mg/ml 제네시틴(Invitrogen)을 이용해 선별하였고, 클론성 DU145 세포들을 제한 희석(limiting dilution)으로 계대하였다(sub-clone). PKIB 발현은 상기 기재한 바와 같이 RT-PCR로 확인하였고, 구조적으로 PKIB를 발현하는 세 클론들이 형성되었다. 또한, 빈 pIRES/HA 벡터로 형질감염된 대조군 DU145 세포들을 허위 세포들(Mock cells)로서 형성시켰다. 상기의 형성된 클론들의 성장 곡선을 세포-카운팅 키트-8(Cell-counting kit-8)(DOJINDO)을 이용하여 측정하였다.
생체 내 성장 분석을 위해, 2 x 106개의 세포를 포함한 두 개의 안정한 클론들 및 두 개의 허위 클론들(Mock clones)을 수컷 누드 마우스들(male nude mice)의 오른쪽 및 왼쪽 옆구리에 각각 접종시켰다.
항체 생성 및 면역조직화학법
인간 PKIB(SARAGRRNALPDIQSSAATD (서열번호 33) 및 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK (서열번호 34))로부터 유래한 두 개의 펩티드들을 토끼들에 면역화시켰고, 상기 면역 혈청들을 기본적인 방법론에 따라 각각의 펩티드 항원들을 접합시키는 Affi-Gel 10 활성화된 친화도 배지(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 패킹된 친화도-컬럼 상에서 정제시켰다. PC 조직들로부터 유래한 관습적인 박편들은 외과수술적 표본들(surgical specimens)로부터 수득하였고, HRPC 조직들은 검시(autopsy) 및 TUR-P(Tamura 등 Cancer Res 67,5117-25, 2007)로 수득하였다. 상기 박푠들을 탈파라핀화시키고, Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH (Dako, Carpinteria, CA)에서 108℃로 15분간 살균시켰다. 내재적 페록시다아제 및 단백질들의 차단 후, 상기 박편들을 항-PKIB 항체(1:100으로 희석)와 함께 상온에서 60분 간 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 페록시다아제 표지된 항-토끼 면역글로불린(Envision kit, Dako)을 이용하여 면역검출(immunodetection)을 수행하였다. 최종적으로, 상기 반응물들을 3,3'-디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine)(Dako)으로 현상하였다. 대비염색은 헤마톡실실(hematoxylin)을 이용하여 수행하였다.
Akt 인산화
22Rv1, LNCaP 또는 PC-3 세포들을 서열 si1 또는 상기 기재한 PKIB expression 벡터(PCDNA3.1/HA-PKIB)에 상응하는 PKIB 올리고 siRNA로 형질감염시켰고, 48시간 또는 24시간 후에 수득하였다. 상기 세포들을 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)를 포함하는 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxychorate-Na, 0.1% sodium dodecyl sulphate [SDS])(Protease Inhibitor Cocktail Set III; CALBIOCHEM)으로 용해시켰다. 단백질 시료들을 SDS-폴리아크릴아미드 젤로 분리시켰고, PVDF 전이 막(GE Healthcare Bio-sciences) 상에 전기블럿화(electroblot)하였다. 블럿들을 토끼 단일클론 항-포스포(phospho)-Akt1(Ser473) 항체(Cell signaling), 토끼 단일클론 항-Akt1 항체(Cell signaling) 또는 마우스 단일클론 β-actin(ACTB) 항체(Sigma)와 함께 인큐베이션시켰다. 단백질 띠들(bands)은 증진된 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL) 웨스턴 블럿팅 검출 시료들(GE Healthcare Bio-sciences)을 이용해 시각화하였다.
마트리젤 ( Matrigel ) 침투 분석
PKIB를 발현하는 플라스미드들(PCDNA3.1/HA-PKIB) 또는 허위(mock) 플라스미드들 중 어느 하나로 형질감염된 NIH3T3세포들을 10% FBS를 포함하고 있는 DMEM에서 거의 포화될 때까지 배양하였다. 상기 세포들을 트립신화하여 수득하고, 혈청 또는 단백질 가수분해효소 억제제를 첨가하지 않은 DMEM으로 세척한 후, 5 x 105/ml의 농도에서 DMEM으로 혼탁하였다. 세포 혼탁액을 제작하기 전에, 마트리젤 기질(matrix)의 건조된 층을 DMEM으로 상온에서 2시간 동안 재수화하였다. 10%의 FBS를 포함하는 DMEM(0.75ml)을 각각의 낮은 챔버에 첨가시켜 처리하였다; 마트리젤을 통한 세포 침투는, 상기 기재한 바와 같이, Gimsa로 고정 및 염색하였다.
PC 세포들에서 PKIB NAALADL2 의 과발현
본 발명에서는, HRPC의 게놈범위 cDNA 마이크로어레이 분석에 의해 스크리닝된 여러 트랜스-활성화된(trans-activated) 유전자들 중에서(Tamura K 등, Cancer Res 2007 67: 5117-25.), PKIB 및 NAALADL2에 초점을 맞추었다. 9 개의 현미해부된 HRPC 세포 집단들 중 5 개에서 PKIB 과발현은 RT-PCR로 확인하였고(도 1의 A), NAALADL2 과발현은 상기 9 개 중 5 개에서 RT-PCR로 확인하였다(도 1의 A).
심장, 폐, 간, 및 신장을 포함하는 일반 기관에서 양 유전자들의 발현은 최소였고, 호르몬-민감성 또는 비투여 PC 세포들의 발현과 비교하여 HRPC 세포들은 양 유전자들의 높을 발현을 보였다. 탐침으로서 PKIB의 cDNA 절편을 이용한 노던-블럿 분석은 특이적으로 태반(placenta) 및 PC 세포주에서 약 1.3-kb 전사체를 확인하였으나, 폐, 심장, 간, 신장, 및 뇌를 포함하는 다른 기관들에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다(도 1의 B). 탐침으로서 NAALADL2의 cDNA 절편을 이용한 노던-블럿 분석은 특이적으로 PC 세포주에서 약 10-kb, 6-kb, 및 5-kb 전사체의 3개 띠들(bands)을 확인하였으나, 폐, 심장, 간, 신장, 및 뇌를 포함하는 다른 기관들에서는 발현이 전혀 관찰되지 않았다(도 2의 B).
NAALADL2의 암호화 부위를 확실히 파악하는 데이터베이스 분석 및 상기 RT-PCR은 이러한 3개의 띠들(bands)이 3' UTR 변이들을 반영하는 것임을 보였다. 인간 PKIB에 특이적인 다중클론 항체를 생성하였고, PC 세포들에서 PKIB 단백질 발현을 확인하기 위해, 32 개의 호르몬-민감성 또는 불투여 PCs 및 9개의 HRPCs를 포함하는 41개의 임상적 PC 조직들을 이용하여 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 노던 블럿 분석 및 RT-PCR에 의해 보여지는 바와 같이 PINs(도 1의 C) 및 일반 전립선 상피(도 1의 D, N으로 표시된)가 PKIB에 대해 약한 염색 (+)을 보였고, 마찬가지로, 10/32(31%)의 호르몬-비투여 PCs들 또한 PKIB에 대해 약하게 염색되거나(+) 전혀 염색되지 않았다(도 1의 D). 반면에, 22/32(69%)의 호르몬-비투여 PC(도 1의 E) 및 모든 6 개의 HRPCs(도 1의 F)는 RT-PCR 분석 결과와 일치하게 PKIB에 대해 강한 양성(++ 또는 +++)을 보였다. 추가적으로, HRPCs 뿐만 아니라, 글리슨 분화도 5를 갖는 모든 (9/9)의 호르몬-비투여 PC 또한 PKIB에 대해 강한 양성을 보였고, PKIB 발현은 글리슨 분화도와 강하게 관련되어 있어(Table 1, chi-square test, P= 1.35x10-6), PKIB 발현이 암적인 표현형 및 PC의 나쁜 예후를 암시할 수 있음을 보였다.
임상적 PC 조직에서 PKIB 발현과 글리슨 점수(Gleason Score, GS) 간의 연관성

PKIB 발현
+++ ++ + -
HRPC 9/9 - - -
HRPC 10/32 12/32 8/32 2/32
글리슨 5 7/9 2/9 - -
글리슨 4 2/11 7/11 2/11 -
글리슨 3 1/12 3/12 6/12 2/12
(+++ 대 나머지 : P =1.35×10-6)
PC 세포주에서 siRNA 에 의한 PKIB 의 무력화( knockdown )
PKIB 비정상 발현의 잠재적 성장-촉진 역할을 조사하기 위해, 여러 siRNA-발현 벡터들을 22Rv1 및 LNCaP (HP) 세포들과 같이 PKIB-발현 PC 세포주 상에 미치는 그것들의 무력화 효과를 시험하기 위해 제작하였다. si1 및 si2 구조체들이 22Rv1 세포들(왼쪽) 및 LNCaP(HP) 세포들(오른쪽)로 형질감염될 때, 현저한 무력화 효과가 반-정량적 RT-PCR에 의해 관찰되었으나, #3si 및 음성 siRNA 구조체인 siEGFP는 그러하지 않았다(도 3의 A). 제네티신을 포함하는 배양 배지로 선별 후, MTT 분석(도 3의 B) 및 콜로니 형성 분석(도 3의 C)은 22Rv1 세포들(왼쪽) 및 LNCaP(HP) 세포들(오른쪽)로의 si1 및 si2의 도입이 그것들의 세포 성장 또는 생존력을 철저하게 감소시킴을 보이는 반면, PKIB 발현에 영향을 주지 않는 다른 siRNAs의 도입은 세포 성장에 영향을 주지 않아, PKIB는 PC 세포 생존력에 중요한 역할을 함을 암시하였다.
PC 세포주에서 siRNA 에 의한 NAALADL2 의 무력화( knockdown )
NAALADL2 비정상 발현의 잠재적 성장-촉진 역할을 조사하기 위해, 여러 siRNA-발현 벡터들을 22Rv1 세포들과 같이 NAALADL2-발현 PC 세포주 상에 미치는 그것들의 녹다운 효과를 시험하기 위해 제작하였다. si#690 구조체들이 22Rv1 세포들로 형질감염될 때, 현저한 녹다운 효과가 반-정량적 RT-PCR에 의해 관찰되었으나, 다른 구조체들은 그러하지 않았다(도 4의 A). 제네티신을 포함하는 배양 배지에서 140-일 동안 선별 후, MTT 분석(도 4의 B) 및 콜로니 형성 분석(도 4의 C)은 22Rv1 세포들로의 si#690의 도입이 그것들의 세포 성장 또는 생존력을 철저하게 감소시킴을 보이는 반면, NAALADL2 발현에 영향을 주지 않는 다른 siRNAs의 도입은 세포 성장에 영향을 주지 않아, NAALADL2는 PC 세포 생존력에 중요한 역할을 함을 암시하였다. si#690에 상응하는 합성된 RNA 이중체 또는 음성대조군 siRNA 이중체를 또 다른 NAALADL2-발현 PC 세포주인 C4-2B 세포들로 형질감염시켰다. RT-PCR은 si#690 RNA 이중체가 C4-2B 세포들에서 내재적인 NAALADL2 발현을 완전히 무력화시킴을 보였고(도 4의 D), 마찬가지로 MTT 분석은 si#690 RNA 이중체가 C4-2B 세포의 성장을 억제시킴을 보였다(도 4의 E).
PKIB NAALADL2 단백질들의 세포 내( subcellular ) 위치 측정
tag 된-전장 PKIB 및 NAALADL 단백질의 발현을 위해 제작된 포유동물 발현 벡터들을 이용하여, 항-tag 항체를 이용한 면역세포화학적 분석에 의해 그것들의 세포 내 위치를 조사하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 외재적 PKIB는 세포질에 위치했고(도 5의 A), 외재적 NAALADL2 단백질은 세포질 막에 위치했다(도 5의 B). NAALADL2 는 하나의 막전위(transmembrane)를 가지고 있어, 유형-II 막 단백질로서 플라즈마(plasma) 막에 위치할 것으로 예측하였다. 상기의 데이터들은 이러한 사실 및 NAALADL2 단백질이 유형-II 막 단백질일 것이라는 것을 뒷받침한다.
PKIB PKA -C 간의 상호작용, 및 PKIB 무력화에 의한 PKA -C의 전좌( translocation )
PKIB는 PKI(단백질 인산화효소 A 억제제) 족에 속하고, PKIA는 단백질 인산화효소 A 촉매 서브유닛의 인산화효소 활성을 억제하고, PKA-C에 직접 결합함으로써 그것의 허위기질 모티프(pseudosubstrate motif)(RRNA; 서열번호 31)를 통해 PKA-C를 핵(nucleus)에서 세포질(cytoplasm)으로 수송하는 것으로 여겨진다(Glass DB 등, J Biol Chem 1986 261: 12166-71. and Wen W 등, J Biol Chem 1994 269: 32214-20.). 또한, PKIB는 허위기질 모티프(pusedosubstrate motif, RRNA)를 가지나, 그것의 억제 활성은 PKIA의 활성보다 훨씬 작고(Gamm DM 등, J Biol Chem 1995 270: 7227-32.), 세포 내에서 PKA-C를 전좌시키는 그것의 활성은 알려져 있지 않다. PKIB가 PKA-C의 위치와 관련있는지 여부를 조사하기 위해, 먼저, PKIB 및 PKA-C 간의 직접적 상호작용을 확인하였다. PKIB-Myc 및HA-PKA-C 발현 벡터들을 22Rv1 세포들로 함께 형질감염시켰고, 그것들의 세포용해물을 각각의 태그(tag) 항체로 면역침강시켰다. 도 5의 C는 PKIB-Myc가 PKA-C와 함께 면역침강되었고, 그 반대도 마찬가지임을 보이면서, PKIB와 PKA-C 간의 직접적 상호작용을 암시하였다.
다음으로, PKIB가 무력화된 PC-3 세포들 또는 LNCaP(HP) 세포들 내에서 내재적인 PKA-C의 세포 내 위치를 면역세포화학적 분석 및 세포 분별로 확인하였다. 면역세포화학적 분석은 대조군 siRNArk PC-3 세포들에 형질감염되었을 때, 대부분의 PKA-C가 세포질에 위치하고 PKA-C 단백질의 일부 신호가 핵에서 확인됨(도 5의 D, 왼쪽)이 관찰되었다. 반면에, siRNA가 PC-3 세포들에서 내재적인 PKIB를 무력화시키는 경우, 면역세포화학적 분석은 핵에서 PKA-C의 신호를 전혀 또는 거의 관찰할 수 없음을 보였다(도 5의 D, 오른쪽). 동일한 현상들이 LNCaP(HP)와 같은 다른 PKIB-발현 PC 세포주에서도 관찰되었다. 핵 PKA-C를 더욱 정량적으로 분석하기 위해, PKIB siRNA를 처리한 LNCaP(HP) 세포들에서 유래한 세포용해물을 분별하였다.
도 5의 E에 나타낸 바와 같이, 대조군 siRNA에서의 양과 비교하여, 핵 내 PKA-C의 양은 PKIB 녹다운에서 명백히 감소한 반면, 세포질 내 PKA-C의 양은 PKIB 녹다운에서 약간 증가하였다. 이러한 관찰들은 PKIA의 핵 이출 기능과는 달리, PKIB가 PKA-C의 핵으로의 수송을 촉진하거나, 또는 핵으로부터 PKA-C의 이출을 억제할 수 있음을 암시한다.
PKIB 의 과발현에 의한 PC 세포 성장 촉진
PKIB의 종양형성 기능을 조사하기 위해, 구조적으로 외재적인 PKIB를 발현한 세 클론들을 내재적인 PKIB를 전혀 또는 거의 발현하지 않는 DU145로부터 형성시켰고, 상기 클론들은 허위(Mock) DU-145 세포들의 성장과 그것들의 성장을 비교하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이 세 클론들 모두 구조적으로 외재적인 PKIB를 발현하였고(도 6의 A 및 B), 그것들은 시험관 내(도 6의 C) 및 생체 내(도 6의 D)에서 허위(Mock) 세포에 비해 빠르게 성장하여 전립선 암 내에서 PKIB의 성장-촉진 효과를 보였다. 본 면역조직화학적 분석에서 나타난 바와 같이, PKIB 과발현은 높은 글리슨 점수와 강하게 관련되어 있어, PKIB가 전립선암 세포들의 암적 또는 침투적 잠재력에 기여할 수 있음을 암시하였다. 그리고 나서, 세포 침투에 있어서, PKIB의 가능한 역할을 마트리젤 침투 분석으로 확인하였다. 도 6의 E에 나타낸 바와 같이, 허위(Mock) 벡터로 형질감염된 세포들과 비교하여, PKIB 발현 벡터로 형질감염된 NIH3T3 세포들은 마트리젤을 통한 그것의 이동을 현저히 촉진하였다.
PC 에서 PKIB Akt 인산화의 관련성
여러 보고들이 PTEN의 기능과 Akt의 활성의 결손이 전립선암의 진행과 현저히 관련되어 있고, PTEN-PI3K-Akt 경로는 HRPC 진행 및 그것의 암적인 표현형에 결정적인 역할을 수행할 것으로 보고되었다(Sellers, W. R. & Sawyers, C. L. (2002) in Somatic Genetics of Prostate Cancer: Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantoff, P. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia), Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM., Curr Cancer Drug Targets. 2007 Sep;7(6):591-604, Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98(13):7200-5, Feldman BJ, Feldman D, Nat Rev Cancer 2001;1(1):34-45, Malik SN, Brattain M, Ghosh PM, Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI., Clin Cancer Res. 2002;8(4):1168-71). 그리고 나서, PKIB가 Akt 인산화에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하였다. 먼저, si1에 상응하는 RNA 이중체를 이용하여 PC 세포주에서 PKIB 발현을 무력화시켜서, Akt의 Ser473에서 Akt 인산화를 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다. RNA 이중체에 의한 PKIB의 녹다운은 RT-PCR에 의해 확인되었다(데이터 기재 않음). 결과적으로, PKIB 녹다운은 PC 세포들에서 Akt 인산화에 명백히 영향을 미쳤다(도 7의 A). 추가적으로, 도 7의 B에 나타낸 바와 같이, PC 세포들에서 PKIB의 과발현이 또한 Ser473에서 Akt 인산화를 현저히 촉진시킨다는 것이 관찰되었다. PKIB가 PKA-C 인산화효소와 직접 상호작용하여, 그것의 기능을 변경할 수 있고, PKA-C 인산화효소의 과발현도 역시 Ser473에서 Akt의 인산화를 촉진할 수 있음이 밝혀졌다(도 7의 A). 이러한 결과들은 PKA-C 인산화효소 기능의 변경을 통해, PKIB가 PC 세포들에서 Akt 인산화(Ser473)와 관련될 수 있음을 제시하였다.
다음으로, 도 7의 B에 나타낸 바와 같이, PC 세포들에서 PKIB의 과발현은 Akt 인산화를 촉진함이 관찰되었다. PKIB는 PKA-C 인산화효소와 직접 상호작용하여, 그것의 기능을 변경할 수 있음이 밝혀졌고, PKA-C 인산화효소의 과발현은 또한 Akt 인산화를 촉진함이 확인되었다(도 7의 C). 이러한 결과들은 PKA-C 인산화효소의 변경을 통해, PKIB가 Akt 인산화와 관련될 수 있음을 제시하였다.
추가적으로, PKA-C 및/또는 PKIB에 의한 직접적인 Akt의 Ser473 인산화 여부를 확인하기 위해, 재조합 PKIB, PKA-C 인산화효소 및 Atk 단백질을 이용하여 시험관 내 인산화효소 분석을 수행하였다. 도 7의 D에 나타낸 바와 같이, PKA-C 인산화효소가 재조합 Akt와 반응할 때 인산화된 Ser473-특이적 항체는 인산화된 Akt를 검출하였고, Akt(Ser473)의 인산화 수준이 PKIB의 첨가로 인해 명백히 촉진되었다. 이는 PKA-C 인산화효소가 PCs 세포들의 성장 촉진과 진행에 기여할 수 있는 PKIB와 함께 Akt Ser373을 직접적이고 효과적으로 인산화할 수 있음을 나타낸다.
PC 조직들에서 Akt 인산화와 PKIB 과발현
결과적으로, PKIB 발현 및 Ser473에서의 Akt 인산화간의 연관성은 임상적 PC 조직들에서 확인되었다. 도 8은, PC 조직들의 페이스-온-페이스 슬라이드들에서 PKIB의 염색 양상과 pAkt(Ser473)의 염색 양상을 비교하여, PC 조직들의 대표적인 그림들을 나타내어, 상기 PC 조직에서 PKIB 발현과 Akt 인산화 간의 연관성을 암시하였다. 임상적인 PC 조직들에서 PKIB 발현과 Akt 인산화 간의 연관성을 표 2에서 정리하였다(P=0.0156, chi2-test).
임상적인 PC 조직들에서 PKIB 발현과 Ser473에서 Akt 인산화 간의 연관성
pAkt(Ser473)
PKIB 발현 ++ + -
++ (n=22) 8(36%) 10(45%) 4(18%)
+ (n=20) 2(10%) 11(55%) 7(35%)
- (n=8) 0 2(25%) 6(75%)
검토
본 발명에서는, 전립선암, 특히 호르몬-불감성 전립선암을 위한 두 분자 표적들이 임상적인 HRPC 세포들의 게놈-범위 유전자 발현 프로파일들(profiles)을 이용하여 확인하였다. 전립선암은 상대적으로 좋은 예후를 보이고, 호르몬 고갈 피료법(hormone depletion therapy)은 재발하거나 발전된 PC의 대부분에서 효과적이다. 그러나 HRPC 세포가 일단 발생하면, PC 환자들의 치료를 위해 선택의 여지가 거의 없다. 따라서, 선행 기술은 HRPC 환자들을 위한 신규한 분자 표적들의 확인 및 상기의 신규한 분자들을 표적화 함으로써 HRPCs를 위한 신규한 치료법들의 개발의 필요성을 인식하여 왔다.
PKIB 는 PKI(단백질 인산화효소 A 억제제) 족에 속하고, PKIA는 단백질 인산화효소 A 촉매 서브유닛(PKA-C)의 인산화효소 활성을 억제하고, PKA-C에 직접 결합함으로써 PKA-C를 핵(nucleus)에서 세포질(cytoplasm)으로 수송할 수 있다(Glass DB 등, J Biol Chem 1986 261: 12166-71. and Wen W 등, J Biol Chem 1994 269: 32214-20.). 단백질 인산화효소 A(PKA), cAMP-의존적 단백질 인산화효소 A는 흔히 cAMP에 의해 개시되는 다양한 생리학적 또는 병리학적 효과를 매개하고, G-단백질(G-protein)과 결합하는데 필수적이라고 여겨지며, 많은 리간드-수용체 시스템은 PKA 신호 경로를 활성화시키고, 그것의 활성화는 세포 성장 및 분화와 관련되어 있다(Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67, Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66).
PC에서는, 여러 보고들이 안드로겐-독립적 성장 및 신경내분비(neuroendocrine) 분화와 그것의 연관성을 시사하고(Cox ME, et al. J Biol Chem 2000 275: 13812-8, Deeble PD, Cox ME, et al. Cancer Res 2007 67:663-72), PKA 경로와 AR 경로 사이의 혼선(cross-talk)은 HRPC 세포들의 안드로겐-독립적 성장과 연관되어 있음을 암시한다(Stork PJ, Schmitt JM.TrendsCellBiol 2002 12:258-66, Sadar MD. J Biol Chem 1999 274: 7777-83).
본 발명에서, PKIB는 PKA-C를 핵으로 위치화시키고 PC 세포 성장을 촉진하는 반면, PKI 족의 구성으로서 PKA-C 활성 또는 PKA 경로를 억제한다. 앞선 보고들은 PKIB는 시험관 내에서 PKA-C의 억제제 활성을 일부 가지나, 그것의 Km은 PKIA 보다 훨씬 높고, PKA-C의 핵 반입을 촉진하거나 그것의 핵 이출을 억제하는 것이 PC 세포들에서는 주요한 PKIB의 기능이라고 밝혔다. 추가적으로, PKIB는 CRPCs의 공격적이고 암적인 표현형에 결정적인 역할을 하는 Akr Ser473 인산화와 강력하게 관련될 수 있다.
NAALADL2는 신규한 유형 II 막 단백질이고, 글루타메이트 카르복시펩티다아제 II(glutamate carboxypeptidase II, GCPII) 패밀리(family)에 속한다. 전립선-특이적 막 항체(prostat-specific membrane antigen, PSMA)로 불리는 GCPII의 전립선 형태는 PC에서 발현되고, PSMA의 증가된 수준은 PC 진행 및 HRPC와 관련이 있다(Rajasekaran AK et al., Am J Physiol Cell Physiol 2005288:C975-81. and Murphy GP et al.,Prostate 200042:145-9.). PSMA와 그것의 상동성(homology) 및 그것의 유사한 발현 양상(pattern)을 고려하면, NAALADL2는 "PSMA2"라고 명명되어야 한다. PSMA는 FDA-승인된 PC-이미징 물질인 111In-표지된 7E11 단일클론 항체의 표적이고(Prostascint, Cytogen, Princeton,NJ), PMSA는 PSMA-발현 세포들에 대한 이미징 물질이나 치료제의 특이적 운반(delivery)을 위한 임상 실험들이 진행중인 J591과 같은 단일클론 항체들에 의해 표적이 된다(Murphy GP et al., Prostate 200042:145-9. and Holmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.).
암 마커(tumor marker)로서 그것의 특성과 더불어, PSMA는 기질이 폴리-감마-글루타메이트화 엽산(poly-γ-glutamated folate)을 포함하는 GPC 활성을 가진다(Zhou J et al., Nature Review Drug Disc 20054:1015-26.). PSMA의 효소적 활성은 약의 불활성 글루타민화 형태는 선택적으로 분해되고, 그것에 의해서 오직 PSMA를 발현하는 세포에서만 활성화되는 전구약물(prodrug)의 설계를 위해 활용될 수 있다(DennyWAetal.,EurJMedChem200136:577-95.). 그러나, PSMA가 PC 진행과 어떻게 연관되어 있는지는 완전히 밝혀지지 않고 있으며, PSMA 기능이나 활성 그 자체를 표적화하는 것의 가능성은 이미 알려져 있다. NAALADL2는 HRPC 세포들에서 높게 발현되고, 일반 성체 기관들에서 그것의 발현은 도 2의 B에 나타낸 바와 같이 매우 제한적이다. 암 마커로서 그것의 제한적인 발현과 더불어, 그것은 PC 생존력 또는 성장과 관련될 수 있고, 이는 상기 siRNA 실험에 의해 뒷받침된다. 따라서, PMSA2에 대한 특이적 단일클론 항체는 암 마커로서 뿐만 아니라, PMSA2 활성을 막음으로써 PC 치료에 적용될 수 있다.
인간 유전자 PKIB 및 NAALADL2의 발현은 일반 기관들에 비해, 전립선암, 특히 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암에서 현저히 증가된다. 따라서, 이러한 유전자들은 관용적으로 전립선암의 진단적 마커로서 이용될 수 있고, 이에 의해 암호화되는 단백질은 전립선암의 진단적 분석에 이용될 수 있다.
본 발명자들은 PKIB 및 NAALADL2 유전자를 특이적으로 표적화하는 이중 가닥 분자들에 의해 세포 성장이 억제됨을 보였다. 따라서, 이러한 새로운 이중 가닥 분자들은 항-암 치료제의 발전을 위해 유용하다. 예를 들어, PKIB 또는 NAALADL2 단백질의 발현을 막거나, 그들의 활성을 방해하는 작용제들은 항암 작용제들, 특히 전립선암, 특히 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료를 위한 항암 작용제들로서 치료적 활용성이 있다.
추가적으로, PKIB 또는 NAALADL2 중 어느 하나의 폴리펩티드는 항암 치료제들을 위해 유요한 표적이다. 예를 들어, PKIB 또는 NAALADL2에 결합하거나, 또는 PKIB 또는 NAALADL2의 발현을 막거나, 또는 그것의 활성을 방해하거나, 또는 PKIB와 PKA-C 간의 결합을 억제하는 작용제, 또는 항-NAALADL2 항체들은 항암 작용제들, 특히 전립선암, 특히 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료를 위한 항암 작용제들로서 치료적 활용성이 있다.
본 발명은 그 특정한 태양을 참조해서 상세히 기재되어 있지만, 여기에 있어서, 본 발명의 사상 및 범위를 넘어서지 않고, 다양한 변경 및 변형이 행해질 가능성이 있는 것은, 당업자에 있어서 명백할 것이다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> PKIB and NAALADL2 for Target Genes of Prostate Cancer Therapy and Diagnosis <130> 10FPI-02-001 <150> US 60/957,853 <151> 2007-08-24 <150> US 61/036,030 <151> 2008-03-12 <160> 36 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1909 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaaaaaagc taccgtggca cgtgccccgg ggagtgatgc ggtggcccgg tttgcacgga 60 gagcgggaca ccgcctgggg agccgcgctc gtagcctggg ggcgggacgc ggcggccgct 120 ccctccgccc ccgagtagct gccaccgcct ggctgcgccc cagcccagta gctcagacgc 180 ggccgcatcc cggtggactg tagaggcggc agcgagctag agcccgagtc gcagctccgg 240 gccgcagagc gctgggcgag cgcgagcgcc agggcaccgg cagggcaggc agctgcgcgc 300 ggctggagtc atgctatact gaaaagacac ttcatcaaga taactctggg agaagcagaa 360 aaccctgtgc cagggacagg aaagatagga gaaagaaagt ttatcagaat tttttaaacc 420 tgtctcagaa ataacaacat attttaatca gagatttatg ttgctatgag gacagattca 480 tcaaaaatga ctgacgtgga gtctggggtc gccaattttg catcttcagc aagggcaggc 540 cgccggaatg ccttaccaga catccagagt tcagctgcca cagacggaac ctcagatttg 600 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350 Thr Ala Phe Gly Asn Ile Gly Ser Tyr Glu Trp Gly Glu Asp Phe Lys 355 360 365 Lys Val Leu Gln Lys Asn Val Val Ala Tyr Ile Ser Leu His Ser Pro 370 375 380 Ile Arg Gly Asn Ser Ser Leu Tyr Pro Val Ala Ser Pro Ser Leu Gln 385 390 395 400 Gln Leu Val Val Glu Lys Asn Asn Phe Asn Cys Thr Arg Arg Ala Gln 405 410 415 Cys Pro Glu Thr Asn Ile Ser Ser Ile Gln Ile Gln Gly Asp Ala Asp 420 425 430 Tyr Phe Ile Asn His Leu Gly Val Pro Ile Val Gln Phe Ala Tyr Glu 435 440 445 Asp Ile Lys Thr Leu Glu Gly Pro Ser Phe Leu Ser Glu Ala Arg Phe 450 455 460 Ser Thr Arg Ala Thr Lys Ile Glu Glu Met Asp Arg Ser Phe Asn Leu 465 470 475 480 His Glu Thr Ile Thr Lys Leu Ser Gly Glu Val Ile Leu Gln Ile Ala 485 490 495 Asn Glu Pro Val Leu Pro Phe Asn Ala Leu Asp Ile Ala Leu Glu Val 500 505 510 Gln Asn Asn Leu Lys Gly Asp Gln Pro Asn Thr His Gln Leu Leu Ala 515 520 525 Met Ala Ser Arg Leu Arg Glu Ser Ala Glu Leu Phe Gln Ser Asp Glu 530 535 540 Met Arg Pro Ala Asn Asp Pro Lys Glu Arg Ala Pro Ile Arg Ile Arg 545 550 555 560 Met Leu Asn Asp Ile Leu Gln Asp Met Glu Lys Ser Phe Leu Val Lys 565 570 575 Gln Ala Pro Pro Gly Phe Tyr Arg Asn Ile Leu Tyr His Leu Asp Glu 580 585 590 Lys Thr Ser Arg Phe Ser Ile Leu Ile Glu Ala Trp Glu His Cys Lys 595 600 605 Pro Leu Ala Ser Asn Glu Thr Leu Gln Glu Ala Leu Ser Glu Val Leu 610 615 620 Asn Ser Ile Asn Ser Ala Gln Val Tyr Phe Lys Ala Gly Leu Asp Val 625 630 635 640 Phe Lys Ser Val Leu Asp Gly Lys Asn 645 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized epitope peptode for preparing antibody <400> 33 Ser Ala Arg Ala Gly Arg Arg Asn Ala Leu Pro Asp Ile Gln Ser Ser 1 5 10 15 Ala Ala Thr Asp 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized epitope peptode for preparing antibody <400> 34 Lys Glu Lys Asp Glu Lys Thr Thr Gln Asp Gln Leu Glu Lys Pro Gln 1 5 10 15 Asn Glu Glu Lys 20 <210> 35 <211> 480 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val 405 410 415 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr 435 440 445 Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460 Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480 <210> 36 <211> 3008 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 taattatggg tctgtaacca ccctggactg ggtgctcctc actgacggac ttgtctgaac 60 ctctctttgt ctccagcgcc cagcactggg cctggcaaaa cctgagacgc ccggtacatg 120 ttggccaaat gaatgaacca gattcagacc ggcaggggcg ctgtggttta ggaggggcct 180 ggggtttctc ccaggaggtt tttgggcttg cgctggaggg ctctggactc ccgtttgcgc 240 cagtggcctg catcctggtc ctgtcttcct catgtttgaa tttctttgct ttcctagtct 300 ggggagcagg gaggagccct gtgccctgtc ccaggatcca tgggtaggaa caccatggac 360 agggagagca aacggggcca tctgtcacca ggggcttagg gaaggccgag ccagcctggg 420 tcaaagaagt caaaggggct gcctggagga ggcagcctgt cagctggtgc atcagaggct 480 gtggccaggc cagctgggct cggggagcgc cagcctgaga ggagcgcgtg agcgtcgcgg 540 gagcctcggg caccatgagc gacgtggcta ttgtgaagga gggttggctg cacaaacgag 600 gggagtacat caagacctgg cggccacgct acttcctcct caagaatgat ggcaccttca 660 ttggctacaa ggagcggccg caggatgtgg accaacgtga ggctcccctc aacaacttct 720 ctgtggcgca gtgccagctg atgaagacgg agcggccccg gcccaacacc ttcatcatcc 780 gctgcctgca gtggaccact gtcatcgaac gcaccttcca tgtggagact cctgaggagc 840 gggaggagtg gacaaccgcc atccagactg tggctgacgg cctcaagaag caggaggagg 900 aggagatgga cttccggtcg ggctcaccca gtgacaactc aggggctgaa gagatggagg 960 tgtccctggc caagcccaag caccgcgtga ccatgaacga gtttgagtac ctgaagctgc 1020 tgggcaaggg cactttcggc aaggtgatcc tggtgaagga gaaggccaca ggccgctact 1080 acgccatgaa gatcctcaag aaggaagtca tcgtggccaa ggacgaggtg gcccacacac 1140 tcaccgagaa ccgcgtcctg cagaactcca ggcacccctt cctcacagcc ctgaagtact 1200 ctttccagac ccacgaccgc ctctgctttg tcatggagta cgccaacggg ggcgagctgt 1260 tcttccacct gtcccgggag cgtgtgttct ccgaggaccg ggcccgcttc tatggcgctg 1320 agattgtgtc agccctggac tacctgcact cggagaagaa cgtggtgtac cgggacctca 1380 agctggagaa cctcatgctg gacaaggacg ggcacattaa gatcacagac ttcgggctgt 1440 gcaaggaggg gatcaaggac ggtgccacca tgaagacctt ttgcggcaca cctgagtacc 1500 tggcccccga ggtgctggag gacaatgact acggccgtgc agtggactgg tgggggctgg 1560 gcgtggtcat gtacgagatg atgtgcggtc gcctgccctt ctacaaccag gaccatgaga 1620 agctttttga gctcatcctc atggaggaga tccgcttccc gcgcacgctt ggtcccgagg 1680 ccaagtcctt gctttcaggg ctgctcaaga aggaccccaa gcagaggctt ggcgggggct 1740 ccgaggacgc caaggagatc atgcagcatc gcttctttgc cggtatcgtg tggcagcacg 1800 tgtacgagaa gaagctcagc ccacccttca agccccaggt cacgtcggag actgacacca 1860 ggtattttga tgaggagttc acggcccaga tgatcaccat cacaccacct gaccaagatg 1920 acagcatgga gtgtgtggac agcgagcgca ggccccactt cccccagttc tcctactcgg 1980 ccagcggcac ggcctgaggc ggcggtggac tgcgctggac gatagcttgg agggatggag 2040 aggcggcctc gtgccatgat ctgtatttaa tggtttttat ttctcgggtg catttgagag 2100 aagccacgct gtcctctcga gcccagatgg aaagacgttt ttgtgctgtg ggcagcaccc 2160 tcccccgcag cggggtaggg aagaaaacta tcctgcgggt tttaatttat ttcatccagt 2220 ttgttctccg ggtgtggcct cagccctcag aacaatccga ttcacgtagg gaaatgttaa 2280 ggacttctgc agctatgcgc aatgtggcat tggggggccg ggcaggtcct gcccatgtgt 2340 cccctcactc tgtcagccag ccgccctggg ctgtctgtca ccagctatct gtcatctctc 2400 tggggccctg ggcctcagtt caacctggtg gcaccagatg caacctcact atggtatgct 2460 ggccagcacc ctctcctggg ggtggcaggc acacagcagc cccccagcac taaggccgtg 2520 tctctgagga cgtcatcgga ggctgggccc ctgggatggg accagggatg ggggatgggc 2580 cagggtttac ccagtgggac agaggagcaa ggtttaaatt tgttattgtg tattatgttg 2640 ttcaaatgca ttttgggggt ttttaatctt tgtgacagga aagccctccc ccttcccctt 2700 ctgtgtcaca gttcttggtg actgtcccac cgggagcctc cccctcagat gatctctcca 2760 cggtagcact tgaccttttc gacgcttaac ctttccgctg tcgccccagg ccctccctga 2820 ctccctgtgg gggtggccat ccctgggccc ctccacgcct cctggccaga cgctgccgct 2880 gccgctgcac cacggcgttt ttttacaaca ttcaacttta gtatttttac tattataata 2940 taatatggaa ccttccctcc aaattcttca ataaaagttg cttttcaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaa 3008 1/34

Claims (46)

  1. 세포에 도입 시, PKIB 또는 NAALADL2의 생체 내(in vivo) 발현 및 세포 증식을 억제하고, 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는, 분리된 이중 가닥 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 19개 내지 25개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 중간 단일-가닥(intervening single-strand)에 의해 연결된 센스 및 안티센스 가닥을 모두 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'{여기서, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥}을 갖는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.
  6. 제 1항의 이중 가닥 분자를 발현하는 벡터.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'{여기서, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥}을 갖는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. PKIB 유전자 또는 NAALADL2 유전자를 과발현하는 세포에서 상기 유전자의 발현을 억제하고, 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 분리된 이중 가닥 분자를 적어도 하나 이상 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 19개 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 암 치료방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 중간 단일-가닥(intervening single-strand)에 의해 연결되어진 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 암 치료방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'{여기서, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥}을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료방법.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 벡터에 암호화된 것을 특징으로 하는 암 치료방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'{여기서, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥}을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료방법.
  15. 제 8항에 있어서, 상기 치료되는 암은 전립선암, 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료방법.
  16. PKIB 또는 NAALADL2의 발현을 억제하고, 이중 가닥 분자를 형성하기 위해 서로에 혼성화된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 분리된 이중 가닥 분자를 하나 이상 포함하는 암 치료용 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 19개 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 중간 단일-가닥(intervening single-strand)에 의해 연결되어진 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'{여기서, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥}을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  21. 제 16항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 벡터에 의해 암호화되어 상기 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'{여기서, [A]는 서열번호 16, 17 및 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 센스 가닥이고, [B]는 3개 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 중간 단일-가닥이며, [A']은 [A]에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥}을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  23. 제 16항에 있어서, 상기 치료되는 암은 전립선암, 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
  24. 하기 단계 (a) 내지 (b)를 포함하는, 전립선암 진단방법:
    (a) 하기 (i) 내지 (iii)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 개체-유래(subject-derived) 생물학적 시료에서 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계:
    (i) 서열번호 1, 3 또는 5에 상응하는 서열을 포함하는 mRNA를 검출,
    (ii) 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 검출, 및
    (iii) 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성을 검출; 및
    (b) 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 발현 수준의 증가와 전립선암을 연관짓는 단계.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 전립선암은 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암인 것을 특징으로 하는 진단방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 발현 수준은 상기 정상 대조군 수준에 비해 최소한 10% 이상인 것을 특징으로 하는 진단방법.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 발현 수준은 상기 개체-유래(subject-derived) 생물학적 시료의 유전자 전사체에 대한 탐침의 혼성을 검출함으로써 측정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 혼성 단계는 DNA 어레이(array) 상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  29. 제 24항에 있어서, 상기 발현 수준은 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 측정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 32, 33 또는 34로 구성되는 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  31. 제 24항에 있어서, 상기 개체-유래(subject-derived) 생물학적 시료은 생체조직, 가래, 피 또는 소변을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  32. 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합하는 항체.
  33. 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합하는 항체를 포함하는, 전립선암 검출용 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 32, 33 또는 34에 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는, 전립선암 치료 또는 예방용 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 피검 화합물을 PKIB 또는 NAALADL2의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉(contact)시키는 단계;
    b) 상기 폴리펩티드와 상기 피검 화합물 간의 결합 활성을 검출하는 단계; 및
    c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 피검 화합물을 선별하는 단계.
  36. 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는, 전립선암 치료 또는 예방용 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 피검 화합물을 PKIB 또는 NAALADL2의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉(contact)시키는 단계;
    b) 단계 a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및
    c) 피검 화합물의 부재 하에서 검출된 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성에 비해 PKIB 또는 NAALADL2의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 피검 화합물을 선별하는 단계.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 세포 증식 또는 PKA-C 핵 축적 활성의 촉진인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 하기 단계 a) 내지 b)를 포함하는, 전립선암 치료 또는 예방용 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 후보 화합물과 PKIB 또는 NAALADL2를 발현하는 세포를 접촉(contact)시키는 단계; 및
    b) 피검 화합물의 부재하에서 검출되는 발현 수준에 비해 PKIB 또는 NAALADL2의 발현 수준을 감소시키는 후보 화합물을 선별하는 단계.
  39. 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는, 전립선암 치료 또는 예방용 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 후보 화합물을, PKIB 또는 NAALADL2의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위의 조절하에 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계;
    b) 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    c) 대조군에 비해 상기 리포터 유전자의 발현 또는 활성 수준을 감소시킨 후보 화합물을 선별하는 단계.
  40. 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는, 전립선암 치료 또는 예방용 화합물 스크리닝 방법:
    a) 피검 화합물의 존재하에서 PKIB 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 PKA-C 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물과 접촉시키는 단계;
    b) 상기 폴리펩티드들 간의 결합을 검출하는 단계;
    c) 상기 폴리펩티드들 간의 결합을 억제하는 피검 화합물을 선별하는 단계.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 PKIB 폴리펩티드의 기능적 등가물은 서열번호 31로 구성된 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 상기 PKA-C 폴리펩티드의 기능적 등가물은 PKIB 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는, 전립선암 치료 또는 예방용 화합물의 스크리닝 방법:
    a) PKIB 폴리펩티드에 의한 Akt의 인산화에 적합한 조건하에서 PKIB 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물, PKA-C 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물 및 Akt를 피검 화합물과 함께 반응(incubation)시키는 단계;
    b) Akt의 인산화 수준을 검출하는 단계;
    c) 상기 단계 b)에서 측정한 Akt의 인산화 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계; 및
    d) 상기 대조군 수준에 비해 Akt의 인산화 수준을 감소시키는 화합물을 선별하는 단계.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 Akt의 인산화 수준은 서열번호 35의 아미노산 서열의 473 세린 잔기에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 상기 PKIB 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물, PKA-C 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물 및 Akt는 세포에서 발현되고, 상기 세포 또는 이의 세포용해물을 피검 화합물과 접촉시킴으로써 피검 화합물과 함께 반응(incubation)시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 35, 36, 38, 39, 40, 또는 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전립선암은 호르몬-불감성 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
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