KR20170017420A - 종이형 전립선암 진단센서, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 전립선암 진단방법 - Google Patents

종이형 전립선암 진단센서, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 전립선암 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄소기반 나노구조체와 필터페이퍼를 활용한 종이형 전립선암 진단센서, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 전립선암 진단방법을 제공하는바, 기존 방법인 ELISA에 비해 손쉽고 저렴하며 신속하게 초기 전립선암의 진단이 가능하다. 또한, 다양한 바이오마커에 적용하여 질병 진단이 가능하므로 폭넓은 의료 진단에 사용될 수 있다.

Description

종이형 전립선암 진단센서, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 전립선암 진단방법{PAPER SHEET TYPE DIAGNOSIS SENSOR FOR PROSTATE CANCER, METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND DIAGNOSIS METHOD USING THE SAME}
본 발명은 종이형 센싱부를 포함하는 전립선암 진단센서, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 전립선암 진단방법에 관한 것이다.
전립선암은 전립선, 남성 생식 기관 내의 선(gland)에서 발현하는 암의 형태이다. 상기 암 세포는 전립선에서 다른 신체 부위, 특히 뼈 및 림프절로 전이될 수 있다.
전립선암의 진단 비율은 세계에 걸쳐 폭넓게 다르며, 동남아시아에서의 진단 비율은 유럽 및 미국보다 낮다. 전립선암은 남성에게서 발생하는 가장 일반적인 유형의 암 중 하나이며, 50세 이후에 발생률이 급증한다. 초기 전립선암은 보통 증상이 없으며 대부분 전립선특이항원 (Prostate Specific Antigen) 검사나 직장수지검사에서 발견이 되며, 치료 시기가 늦어져 주변 조직으로의 암 전이로 인해 사망에 이르게 된다.
전립선-특이항원(Prostate specific antigen; PSA)은 분자량이 34,000 Dalton으로 전립선 표피에서 높은 수준으로 발현되는 세린 단백질 분해 효소로서 현재 혈중 PSA (Prostate specific antigen)의 양을 측정하는 키트들이 많이 유통되고 있으며, 건강한 남자의 혈액에는 2 ng/mL 이하의 PSA가 존재하며 전립선암이 발병하면 그 양이 증가하는 것으로 진단된다.
따라서 혈액에서 PSA양이 증가하면 전립선암, 전립선 비대증과 같은 전립선 질환의 발생을 표시하는바, 전립선암 진단에 주로 사용되는 PSA의 컷오프(cut-off)는 3 내지 4 ng/mL로 보는 것이 일반화되어 있으며, PSA양이 10 ng/mL 이상이면 전립선암일 확률이 67% 라는 보고가 있다.
그러나 상기와 같이 종래의 혈액을 이용하는 ELISA 형태의 진단키트는 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 리더기 및 Automation 장비와 같은 특수장비 및 전문인력을 필요로 하기 때문에 의료환경이 열악한 지역에서는 적용할 수 없다는 사용상의 제약을 가지고 있고, 검사 결과를 얻기까지 오랜 시간이 걸린다는 문제점이 있다.
따라서, 전립선암 조기진단을 통한 성공적인 치료를 위해 높은 실용성과 신뢰도를 가지는 전립선암 진단센서의 개발이 요구된다.
한국등록특허 제10-1495131호 한국공개특허 제10-2010-0075452호
본 발명의 목적은 높은 신뢰성의 전립선암 진단율과 저비용으로 신속한 진단이 가능하며, 수월한 치료를 위해 초기단계에서 진단을 가능하게 하는 전립선암 진단센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 전립선암 진단센서를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 얻은 전립선암 진단센서를 활용하여 전립선암을 초기단계에서도 효과적이고 신뢰성 있게 진단하는 방법을 제공하는 데 있다.
이에 본 발명자들은 항체-탄소기반 나노구조체와, 상기 항체-탄소기반 나노구조체가 실린지 필터링으로 증착된 필터페이퍼를 포함하는 종이형 센싱부; 및 상기 센싱부의 전기저항 변화를 측정할 수 있는 검출부;를 포함하고, 상기 종이형 센싱부는 실린지 필터링 증착 후 필터페이퍼의 원 중심에서 가장자리 방향으로 방사형 절단하여 얻은 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서를 제공한다.
일 예에서, 상기 항체는 전립선암 특이적 항체(Prostate specific antigen; PSA) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 예에서, 상기 탄소기반 나노구조체는 단일벽 탄소나노튜브, 이중벽 탄소나노튜브, 다중벽 탄소나노튜브, 그라파이트, 및 그래핀(graphene) 중에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 예에서, 상기 필터페이퍼는 예를 들어 0.3 ~ 0.5 um 크기의 미세기공을 갖는 셀룰로오즈 에스테르 필터페이퍼일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 예에서, 상기 필터페이퍼를 방사형 절단하여 얻은 종이형 센싱부는 5 x 2 mm2의 직사각형일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 예에서, 상기 PSA 농도를 0 ng/mL ~ 500 ng/mL 의 범위에서 1 ng/mL 감도로 측정 가능할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 예에서, 상기 진단센서는 종이형 센싱부가 배치될 기판; 및 상기 센싱부의 양 끝단에 형성된 전극;을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 관점은, 하기 단계들을 포함하는 종이형 전립선암 진단센서의 제조방법을 제공한다.
탄소기반 나노구조체에 카르복실기를 부착하는 카르복실화 단계;
상기 카르복실화 된 탄소기반 나노구조체에 전립선암 특이적 항체를 결합시켜 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계;
상기 얻어진 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 실린지 필터링으로 필터페이퍼 상에 증착하는 단계; 및
상기 실린지 필터링된 필터페이퍼를 원 중심에서 가장자리 쪽으로 방사형 절단하여 종이형 센싱부를 얻는 단계;
일 예에서, 상기 카르복실화는 탄소기반 나노구조체를 105℃에서 3시간 동안 20 mL의 3.0 M 질산에서 환류시켜 수행할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 예에서, 상기 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계는, 항체를 탄소기반 나노구조체 혼합액에 첨가하고 밤새 8시간 동안 실온에서 교반하여 반응시키는 항체 수용 단계; 및
상기 항체와 반응한 탄소기반 나노구조체에 블록킹제(blocking agent)를 넣고 실온 ~ 40 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 배양하여 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계;를 포함한다.
상기 MWCNT의 농도는 6.5 ug/mL 이고, 필터페이퍼 당 Ab-MWCNT 용액의 정제된 체적은 200 mL 이다.
본 발명의 또 하나의 관점은, 상기 종이형 전립선암 진단센서를 이용한 전립선암의 진단방법에 관한 것이다.
일 예에서, 상기 종이형 센싱부를 젖은 상태로 30 ~ 40 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 생체시료와 배양하여 항원-항체 반응을 수행하는 단계;
상기 종이형 센싱부를 건조한 후 전기저항 변화를 측정할 수 있는 검출부와 조립하여 전기저항을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 전기저항을 기본 저항과 비교하여 상대적 전기저항(R/R0) 수치를 얻는 단계를 포함한다.
일 예에서, 상기 상대적 전기저항(R/R0) 수치를 바탕으로 환산한 PSA 항원의 농도가 4 ng/mL 보다 높다면 전립선암이 초기 단계로 진단할 수 있다.
본 발명은 탄소기반 나노구조체와 필터페이퍼에 기반한 종이형 바이오센서를 제공한다. 이에 따르면, 전립선암의 초기 검진을 위해, PSA 레벨은 센서의 전기저항을 150% 이상 변화시켰다. 최대 검출 범위는 500 ng/mL 이고, 검출한계는 1.18 ng/mL이다. 종이 기반의 바이오센서는 ELISA 기반의 검출방법보다 23배 저렴하고 12배나 더 빠르다. 더욱이, 최대 검출 수치가 약 50배 이상 더 높다. 검출 범위와 민감도는 초기 단계의 전립선암을 진단하기에 충분하다. PSA 뿐만 아니라 다양한 타겟 생체분자와 특이적으로 반응하는 바이오마커를 CNT에 결합시켜 적용할 수 있는바, 매우 유용한 진단 툴이 될 것으로 기대된다.
도 1 은 본 발명의 일 실시예에 따라 MWCNT가 PSA 항체로 활성화되어 항체가 부착된 항체-MWCNT를 얻는 과정을 나타내는 반응식 1이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 종이형 센싱부의 제조과정 및 PSA 검출 과정을 나타내는 반응식 2이다.
도 3은 본 발명의 일 실시에에 따른 종이형 전립선암 진단센서를 이용하여 전립선암을 진단하는 과정을 나타내는 반응식 3이다.
도 4는 MWCNT, 3일간 질산에 담근 카르복실화된 MWCT, 및 Ab-MWCNT의 IR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 MWCNT 기반 센서부들의 SEM 과 AFM 이미지이다; a와 b는 각각 카르복실화된 MWCNT의 SEM 및 AFM 이미지이고, c와 d는 Ab-MWCNT의 SEM과 AFM 이미지이며, e와 d는 PSA-Ab-MWCNT의 SEM과 AFM 이미지이다.
도 6은 전류 범위 1.40 mA(a), 및 1.00 uA(b)에서 MWCNT, 카르복실기로 활성화된 MWCNT, Ab-MWCNT, 및 PSA-Ab-MWCNT에 대한 I-V 커브를 나타낸다.
도 7은 MWCNT 표면 개질에 의한 전기적 저항의 변화를 나타낸다. 데이터 점은 좌측부터 카르복실화된 MWCNT, Ab-MWCNT, 및 PSA-Ab-MWCNT(PSA; 1000 ng/mL)를 나타낸다.
도 8은 (a) 넓은 범위(0 - 1000 ng/mL)와 (b) 좁고 낮은 범위(0 - 10ng/mL)의 PSA 농도에서 바이오센서의 상대 저항을 나타낸 그래프이다.
도 9는 종이형 센서의 절단 방법에 따른 저항균일성 측정 결과로 (a) 본원발명의 세로 방사형으로 절단한 센서의 저항균일성과 (b) 가로 방사형으로 절단한 센서의 저항균일성 측정 결과 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에서 "전립선암"은 예를 들어 문헌[Prostate. In: Edge SB, Byrd DR, Compton CC, et al., eds.: AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer, 2010, pp 457-68](본 원에서 참조인용됨)에서 제공되는 바와 같이 전립선암의 병기 및 등급으로 더 세분화될 수 있다. 또한, 비정상 전립선 상태는 양성 전립선 비대증(BPH), 안드로겐 감응성 전립선암, 안드로겐 비감응성 또는 내성 전립선암, 침략적 전립선암, 비침략적 전립선암, 전이성 전립선암 및 비전이성 전립선암 중 1 이상으로 분류될 수 있다.
용어 "진단" 은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 전립선암 발병 여부를 확인하는 것이다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 항원-결합 활성을 보이는 한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 비롯하여(그들에 한정되지 않음) 다양한 항체 구조를 포함한다. 진단용 항체는 스트립의 제조에 사용할 수 있는 통상의 상업적으로 이용 가능한 항체의 원료인 정제된 단일클론 anti-PSA, 토끼 anti-PSA, 산양 anti-쥐 IgG 등 원료로 제공되는 것들을 사용 할 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 항체는 전립선암 특이적 항체(Prostate specific antigen; PSA)일 수 있다.
종이형 전립선암 진단센서
본 발명의 일 예에 다른 전립선암 진단센서는 종이형 센싱부 및 검출부를 포함한다. 상기 종이형 센싱부는 항체가 부착된 항체-탄소기반 나노구조체와, 상기 항체-탄소기반 나노구조체가 실린지 필터링으로 증착된 필터페이퍼를 포함한다.
본 발명은 탄소기반 나노구조체와 필터페이퍼를 활용한 종이형 센서를 제공하는바, 탄소기반 나노구조체들을 매트 형태로 만들면 이들 상호접촉 장벽이 전기전도도를 결정하는데, 구조체의 외벽에 항체를 부착한 후 검출하고자 하는 항원의 함량에 따라 탄소기반 나노구조체들 상호 간의 접촉장벽 변화가 생기고 이에 따른 전기전도도 변화를 측정함으로써 항원 등의 생체물질 농도를 결정하는 원리이다.
상기 탄소기반 나노구조체들을 층상의 매트 형태로 만들기 위해 실린지 필터링 방식을 이용하는바, 실린지 필터링은 주사기(syringe)에 탄소나노튜브를 포함하는 용액을 넣은 후, 누르는 압력을 이용하여 용매는 필터를 통과하고 필터에 나노튜브가 걸러져서 메트 형태로 만들어지게 하는 방법이다. 이러한 실린지 필터링을 이용하여 항체-탄소기반 나노구조체를 증착하는 경우 균일한 두께의 메트형 층을 형성할 수 있고 증착시간이 매우 단축되며 오염의 가능성도 적기 때문에 매우 유용한 방법이다. 상기 증착된 항체-탄소기반 나노구조체층의 두께는 약 3 ~ 5 um 일 수 있다.
본 발명에서는 상기 실린지 필터링으로 필터페이퍼 상에 항체-탄소기반 나노구조체로 이루어진 층을 증착한 후 필터페이퍼를 원 중심에서 가장자리 방향으로 방사형 절단한 절단부를 센싱부로 이용한다. 상기 방사형 절단부에서 항체-탄소기반 나노구조체 층의 균일성이 가장 우수하기 때문에 이를 이용하면 센싱부 전반에 걸쳐서 기본 저항을 일정하게 유지하는데 매우 효과적이기 때문이다. 상기 방사형 절단부의 형태는 원 중심에서 가장자리 방향으로 긴 길이를 갖는 직사각형 형태로서, 본 발명의 일 실시예에서는 5 x 2 mm2의 직사각형 형태를 이용하였지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탄소기반 나노구조체는 탄소 성분으로 이루어진 나노 사이즈의 구조체를 의미하며, 제조 과정에서 포함되는 환원산 성분 등이 일부 포함되어 있을 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 다중벽 탄소나노튜브가 사용되었으나 이에 한정되지 않으며, 예를 들어 단일벽 탄소나노튜브, 이중벽 탄소나노튜브, 다중벽 탄소나노튜브, 그라파이트, 그래핀(graphene), 그래핀 나노플레이트 등이 적용될 수 있다. 이하, 탄소기반 나노구조체를 경우에 따라‘탄소구조체’로 약칭하기도 한다.
상기 필터페이퍼는 항체-탄소구조체층이 용이하게 형성될 수 있도록 균일하고 미세한 공극(micro-pore)이 형성된 것을 이용하는 것이 바람직하며, 일 예에서, 0.3 ~ 0.5 um 크기의 미세기공(micro-pore)을 갖는 셀룰로오스에스테르 소재의 필터페이퍼를 들 수 있다.
본 발명에 따른 종이형 전립선암 진단센서의 최대 검출 범위는 500 ng/mL 이고, 검출한계는 1.18 ng/mL이다. 본 발명자들이 실험한 바에 따르면 항체-항원 결합반응에 따라 탄소구조체들 사이의 접촉 포텐셜이 증가하여 상대 저항 변화값이 항체의 농도 의존적으로 거의 선형적으로 나타남을 확인하였다. 예를 들어 PSA 항체의 경우 농도를 0 ng/mL ~ 500 ng/mL 의 범위에서 1 ng/mL 감도로 측정가능하였다. 통상 PSA 수치가 4 ng/mL 보다 높다면 전립선암 초기 단계로 판단할 수 있으므로 본 발명의 진단센서를 이용하면 전립선암 초기 단계의 진단이 가능하다.
상기 진단센서에서 검출부는 상기 종이형 센싱부가 배치되는 기판; 상기 센싱부의 양 끝단에 형성된 전극;을 포함하고, 상기 전극에 전선이 연결되어 전류가 흐를 수 있다. 이러한 검출부는 전도도에 영향을 미치는 생체분자와 항체-탄소구조체 사이의 전하전달모델과 함께 탄소구조체 상호간의 접촉 포텐셜의 변화에 따른 저항변화를 검출할 수 있다.
상기 기판은 유리, 실리콘, 또는 이들의 혼합으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 전극은 금, 백금, 크롬, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 및 티타늄으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 종이형 전립선암 진단센서는 전립선암 발현 위험성이 증가된 대상체에 대하여 전립선암 발병 여부를 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 전립선암 발현 위험성이 증가된 대상체는 전립선암의 추가 신호 또는 증상에 대해서 모니터링되어야 한다. 전립선암 발현 위험성이 증가된 대상체를 확인하기 위한 본 발명에서 제공되는 진단방법은 전립선암의 다른 알려진 위험 요인 또는 신호, 예컨대 비한정적으로 요류(urinary stream) 감소, 위급, 망설임, 야간뇨, 잔뇨감(incomplete bladder emptying) 및 연령의 평가와 함께 이용될 수 있다.
종이형 전립선암 진단센서의 제조방법
도 1 및 2의 반응식 1과 2를 참조하여 본 발명의 일 예에 따른 종이형 전립선암 진단센서를 제조하는 방법을 설명한다. 탄소기반 나노구조체에 카르복실기를 부착하는 카르복실화 단계(110); 상기 카르복실화 된 탄소기반 나노구조체에 항체를 결합시켜 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계(120); 및 상기 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 실린지 필터링으로 필터페이퍼 상에 증착하는 단계(130); 상기 실린지 필터링된 필터페이퍼를 원 중심에서 가장자리 쪽으로 방사형 절단하여 종이형 센싱부를 얻는 단계(140);를 포함한다.
상기 카르복실화(110)는 탄소기반 나노구조체를 105 ℃에서 3시간 내지 3일 동안 질산용액에서 환류시켜 수행될 수 있다.
상기 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계(120)는 일 예에서, 항체를 탄소기반 나노구조체 혼합액에 첨가하고 6 ~ 12 시간 동안 실온에서 교반하여 반응시키는 항체 수용단계(121); 및 상기 항체 수용 탄소기반 나노구조체에 블록킹제(blocking agent)를 넣고 실온 ~ 40 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 배양하여 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계(122)를 포함한다.
즉, 먼저 항체와 탄소구조체를 반응시킨 후 BSA와 같은 비반응성 블록킹제를 첨가하여 탄소구조체층에서 항체가 결합되지 않는 부위에 부착되게 함으로써 비특이적 항원결합을 미리 방지할 수 있다.
다음으로 항체-결합된 탄소기반 나노구조체 증착단계(130)은 실린지 필터링법에 의해 원형의 필터페이퍼 상에 선행 단계에서 얻어진 비특이적 사이트가 블록킹된 항체-탄소구조체층을 형성한다. 실린지 필터링법은 당업계에 널리 공지되어 있으며 공지된 방법을 본 발명에 동일하게 적용할 수 있다.
마지막으로, 필터페이퍼를 절단하는 단계(140)는 방사형으로 원형 필터페이퍼의 중심쪽에서 가장자리 쪽으로 긴 길이가 되는 직사각 형태로 절단하며, 절단 방법은 특별히 제한되지 않는다.
종이형 전립선암 진단센서를 이용한 전립선암 진단방법
도 3의 반응식 3를 참조하여 본 발명의 일 예에 따른 전립선암 진단방법을 설명한다.
종이형 센싱부를 젖은 상태로 30 ~ 40 ℃에서 1 ~ 3시간 동안 시료와 배양하여 항원-항체 반응을 수행하는 단계(210);
상기 종이형 센싱부를 실온에서 건조한 후 전기저항 변화를 측정할 수 있는 검출부와 조립하여 전기저항을 측정하는 단계(220); 및
상기 측정된 전기저항을 기본 전기저항과 비교하여 상대적 전기저항(R/R0) 수치를 얻는 단계(230; 도시되지 않음)를 포함한다.
먼저, 항체-탄소구조체층이 형성된 종이형 센싱부에 검체시료를 넣고 항원-항체반응(210)을 유도한다. 이 때에는 센싱부가 건조상태가 되면 안되고 바람직하게는 젖은 상태로 30 ~ 40 ℃에서 1 ~ 3시간 동안 배양하면서 반응이 진행된다.
다음으로, 항원-항체반응이 완료되면 종이형 센싱부를 실온에서 약 30분 내지 2시간 정도 건조한다(221). 건조된 센싱부를 기판(슬라이드글라스) 상에 올리고 전극을 연결하여 검출부와 조립하며 전기저항을 측정한다(222).
마지막으로, 측정된 전기저항을 항원이 결합되지 않은 항체-탄소구조체층의 기본 저항값과 비교하여 상대적 전기저항(R/R0) 수치를 얻는다. 일 예에서, 상대적 전기저항(R/R0) 수치를 바탕으로 환산한 PSA 항원의 농도가 4 ng/mL 보다 높다면 전립선암이 초기 단계로 진단할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험재료
질산(64.0~65.0%)은 덕산과학(DUKSAN science)에서 구입하였다. PBS(pH=7.2)버퍼 용액은 Biosesang Inc로부터 구입하였다. 1 M 2-(N-몰포리노)에탄설포닉산(MES, pH=5.0)과 0.05%의 Tween20 + 1% BSA(bovine serum albumin) in PBS는 Tech&Innovation에서 구입하였다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), N-히드록시설포숙신이미드 소듐염(NHSS), 마우스에서 생산된 모노클로널 항-KLK3 항체(종 반응성이 인간 PSA 항체인)와 PSA(prostate specific antigen from human semen)은 Sigma-Aldrich 로부터 구입하였다. 미세기공 필터페이퍼(셀룰로오스 에스테르 혼합, 직경 25mm, 공극 사이즈 0.45um) 는 Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 로부터 구입하였다. MWCNT(multi-wall carbon nanotubes, 직경 20 nm, 길이 5 um)는 Carbon Nano-material Technology Co.에서 구입하였다. MWCNT는 철과 몰리브덴 촉매를 사용하여 CVD 법에 의해 생산되었다.
약어의 설명
- MWCNT; 다중벽 탄소나노튜브
- 카르복실화된 MWCNT; 카르복실화 단계(110)를 거친 MWCNT
- Ab-MWCNT; 항체 결합 단계(120)를 거쳐 PSA 항체가 부착된 MWCNT
< 실시예 1>
1-1. 탄소기반 나노구조체의 카르복실화 단계
도 1에 나타난 반응식 1은 MWCNT 와 PSA 항체가 활성화되는 과정을 나타낸다. 검출 시스템은 37 ℃에서 1.5시간 동안 배양하여 수행된다. 이하, 반응식 1을 참고하여 본 발명을 더욱 상세히 살펴본다. 제1 단계는 탄소기반 나노구조체의 카르복실화 단계(110)이다.
먼저 MWCNT(300 mg)을 105 ℃에서 3시간 동안 20 mL의 3.0 M 질산에서 환류시켜 MWCNT 상에 카르복실기를 생성하였다. 상기 기능화 된 MWCNT 용액을 증류수로 10회 이상 원심분리 세척하여 pH가 7에 접근하게 한다. 카르복실화 된 MWCNT를 100 ℃ 오븐에서 24시간 동안 건조하였다. MWCNT 표면의 카르복실기는 Fourier transform infrared spectrometer(FT-IR, JASCO FT/IR-4100)으로 확인하였다.
1-2. 항체-탄소기반 나노구조체 얻는 단계
상기 카르복실화된 MWCNT는 다음 단계(120)에서 PSA 항체를 수용할 수 있다. 상기 카르복실화된 MWCNT(1.3 mg)을 0.1 M MES 버퍼액 4 mL에 0.4 mmol EDC 및 0.1 mmol NHSS 와 함께 분산시킨다. 상기 분산액을 초음파충격기(Jeio Tech, UC-02)로 1분간 초음파 분해한 후 vortex mixer(Scientific industies, Inc)로 실온에서 15분간 혼합한다. 상기 얻어진 혼합액을 3000 rpm으로 10분간 원심분리(Hanil Science Industrial Co.Ltd, HA-1000-3) 하고, 상층액을 버린다. 적어도 5회 이상 PBS로 세척하여 침전물에서 과량의 EDC와 NHSS를 제거한다. PSA 항체 0.5 mL (0.01 mg/mL)를 혼합액에 첨가하고 밤새 실온에서 교반하여 MWCNT에 부착한다. 이러한 과정이 반응식 1의 제2 단계 중 PSA 항체 수용반응 (121)이다.
다음 단계는, MWCNT 기반의 바이오센서를 제조하는 것으로 PSA 항체가 부착된 MWCNT와 타겟 PSA 사이의 원하지 않는 반응을 억제하는 단계(122)이다. 0.05 % Tween20 in 1 % BSA(100 uL) 의 혼합액을 상기 PSA 항체가 부가된 혼합액(2 mL)에 첨가하여 MWCNT 표면에서 PSA의 부착을 방지한다. BSA는 MWCNT 표면을 완전히 감싸서 무차별적인(비특이적) PSA 부착을 방지한다. Tween20은 PSA 항체의 결합 위치를 깨끗하게 한다. 상기 혼합액을 실온에서 1.5시간 동안 배양한 후, 3000 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거한다. 첨전물을 PBS 버퍼로 5회 이상 수세 및 원심분리하여 임의의 FREE PSA 항체 및 BSA를 제거한다. 이와 같이 PSA 항체가 부착된 MWCNT에 블록킹제(BSA)를 반응시키고, 항체가 결합된 MWCNT를 얻는 단계(122)이다. 상기 얻어진 샘플을 Ab-MWCNT 라고 하며, 이는 PSA 항체가 부착된 MWCNT를 의미한다.
1-3. 필터페이퍼 증착단계
상기 Ab-MWCNT 는 실린지 필터링에 의해 미세 기공의 필터페이퍼 상에 증착된다. 이 단계는 반응식 2의 제1 단계(도2 참조)이다. 미세 기공의 필터페이퍼 상에 증착된 Ab-MWCNT는 항체의 활성을 위해 센싱이 완료될 때까지 건조상태가 되면 안된다.
상기 필터페이퍼 상에 증착된 Ab-MWCNT는 필터페이퍼의 중심에서 원주 방향으로 5 x 2 mm2 크기로 절단하여 종이형 센싱부를 얻는다. 이러한 방사형 절단 방법은 모든 센싱부의 저항 균일성을 유지하는데 매우 중요하다.
[실시예 2] 종이형 진단센서를 이용한 전립선암 진단
2-1. 항원-항체반응 단계
상기 실시예 1-3에서 제조된 종이형 센싱부(PSA-Ab-MWCNT)는 BSA 블록킹 된 PSA-Ab-MWCNT가 미세기공 필터페이퍼에 증착된 것이다.
종이형 센서에 0 ~ 1000 ng/mL의 PSA 농도를 포함하는 PBS 버퍼용액 100 uL를 부가한다. 모든 단백질의 생물학적 활성을 유지하기 위해 종이형 센서는 건조되지 않아야 한다. 즉, PSA 항체와 PSA 간의 site 위치 특이적 반응이 완료될 때까지 젖은 상태로 있어야 한다. 상기 site 특이적 반응은 센싱부를 37℃에서 1.5 시간 동안 배양하여 완료되었다.
2-2. 전기저항 측정 단계
상기 배양한 후 연속하여 종이형 센싱부를 실온에서 30분 이상 공기 중에서 건조한다. 다음으로 바이오센서 형태로 조립한 후 전기 저항(반응식 3 참조)을 측정한다. 건조된 종이형 센싱부의 저항은 대기 조건에서 디지털 멀티메터(Hewlett-Packard Co. multimeter 3478A 또는 Agilant 34401)을 사용하여 측정할 수 있다. 검출부로서 실버 페이스트 전극이 센싱부와 구리 와이어 사이의 전기적 접촉을 유지하기 위해 사용된다. 물질의 기본 형태학적 정보는 원자간력현미경 (AFM, Park scientific instruments) 및 주사전자현미경 (SEM, HITACHI S-2400)으로 관찰한다.
2-3. 상대적 전기저항 얻는 단계
특정 농도의 PSA에 대해 측정된 센서 저항을, PSA를 포함하지 않는 (PSA 농도 0 ng/mL) PBS 버퍼 용액 (100 uL)과 접촉한 종이형센서를 37 ℃에서 1.5시간 동안 배양하고 30분 간 건조 후 측정된 저항인 기본 전기저항(background) 과 비교한다. 측정된 센서 저항을 센서의 물리적 형상을 고려하여 표준화한다. 센서의 두께는 고려하지 않는다. 왜냐하면 백그라운드 저항과 모든 저항값을 비교하였고, 모든 센서는 하나의 필터페이퍼로 제조하였기 때문이다. 센서의 기본 저항값을 일정하게 유지하기 위해서 가장 중요한 요소는 미세기공의 필터페이퍼 상에 증착된 MWCNT 층의 균일도이다.
MWCNT 층의 균일도는 MWCNT의 농도를 6.5 ug/mL로 조절함으로써 얻어질 수 있다. 필터페이퍼 당 사용된 Ab-MWCNT 용액의 부피는 200 mL 이다. 증착된 MWCNT의 두께는 ~4.5 um였다. 또한, 도 2의 반응식 2에 나타난 것과 같이 중심에서 원으로 절단하는 센싱부의 방사형절단 방법은 일정한 저항을 유지하는데 매우 중요한 것이다.
PSA의 농도를 측정하는 이 방법은 널리 사용되고 있는 ELISA에 비해 휴대성, 시간 절약 및 비용 절감 등의 매우 우수한 이점이 있다.
< 실험예 1> 항체-탄소구조체 결합 검증
도 4은 MWCNT, 3일간 질산에 담궈 카르복실화된 MWCT, 및 Ab-MWCNT의 IR 스펙트럼을 나타낸다. MWCNT의 탄소-탄소 이중 결합에 대응하는 피크 위치는 1630cm-1에서 나타났다. 그리고 1715 cm-1은 카르복실기의 C=O 결합에 대응되며 이는 MWCNT를 질산으로 처리하여 생겨난 것이다. 상기 카르복실기는 MWCNT의 표면에 위치하여 항체 내의 L-라이신 단위체의 아민기와 반응할 수 있다. 이는 간단한 치환 반응으로 아마이드기가 형성된다. 반응이 일어나기 전에 카르복실화된 MWCNT를 EDC/NHSS로 처리하여 카르복실기의 히드록시기와 항체가 상호 치환반응을 하도록 유도한다. Ab-MWCNT의 IR 스펙트럼은 도 1에서 파란 선으로 나타나 있는데, 1550 cm-1 부근에서 아마이드 결합에 해당하는 복합적인 피크가 나타나있다.
< 실험예 2> 항체-탄소구조체 결합 검증
도 5는 MWCNT 기반 요소들의 SEM 과 AFM 이미지이다. 샘플이 필터페이퍼 상에 증착되어 있고, 이미지 촬영을 위해 대기 조건에서 2시간 이상 건조되었다. 도 2의 a와 b는 각각 카르복실화된 MWCNT의 SEM 및 AFM 이미지이다. 양 이미지에서 MWCNT의 직경은 약 20 nm 정도였다. 이는 수용체 MWCNT의 직경에 대응하는 것이다. 카르복실화된 MWCNT의 표면에는 아무런 손상도 관찰되지 않았다. 모든 MWCNT가 구별가능하였다.
도 5 c와 d는 Ab-MWCNT의 SEM과 AFM 이미지이다. 항체가 부착된 MWCNT의 직경을 관찰해보면 카르복실화된 MWCNT와 유사하게 나타났다. 임의의 불규칙하게 부착된 물체가 튜브 표면에서 관찰되었다. 이는 항체의 부착이 MWCNT 표면 전체에 코팅된 것이 아닐 수 있다는 것을 의미한다. SEM 이미지 상의 솜뭉치(cotton ball)같은 덩어리는 부착된 항체로 추정된다.
도 5e와 f는 PSA-Ab-MWCNT의 SEM과 AFM 이미지이다. 대부분 MWCNT의 SEM 이미지는 단백질(PSA 항체와 PSA)으로 덮여 있다. 솜뭉치 같은 부분은 증착된 필름의 전면에 걸쳐 퍼져 있다. 솜뭉치 같은 부분의 형태는 AFM 이미지에서는 단백질의 부드러움 때문에 명확하게 관찰되지 않는다. 선택적으로 관찰된 증착 필름의 조밀함은 카르복실화된 MWCNT Ab.MWCNT > PSA-Ab-MWCNT 순으로 나타났다. 필름의 AFM 이미지로부터 RMS(실효값) 거칠기는 육안 관찰과 동일한 순으로 나타났다. MWCNT, Ab-MWCNT, 및 PSA-Ab-MWCNT는 각각 38, 32, 61 nm였다.
<실험예 3> 종이형 센서부의 전기저항 변화 측정
도 6은 전류 범위 1.40 mA(a), 및 1.00 uA(b)에서 MWCNT, 카르복실기로 활성화된 MWCNT, Ab-MWCNT, 및 PSA-Ab-MWCNT에 대한 I-V 커브를 나타낸다. 또한, 표 1은 도 6에서 계산된 MWCNT, 카르복실화된 MWCNT, Ab-MWCNT, 및 PSA-Ab-MWCNT의 상대 저항값이다.
Initial amount of the CNTs(mg) I-V curve slope Resistance(Ω)
MWCNTs 1.16 0.117 117
Carboxylated MWCNTs 1.16 0.585 585
Ab-MWCNTs 1.30 0.916 916
PSA-Ab-MWCNTs 1.30 1.36 1360
도 6 및 표 1을 참조하면, 모든 MWCNT는 낮은 전류 범위(-1.0 uA에서 +1.0 uA 까지) 뿐만 아니라 높은 전류레벨(-1.4 mA 에서 +1.4 mA까지)에서도 옴의 법칙(Ohm’s law)을 따른다. 더 많은 양의 단백질이 MWCNT에 부착될수록 I-V 커브의 기울기는 높아진다.
각각의 MWCNT의 전기 저항은 표 1에 기재되고 이는 도 7에 나타난 직선 기울기로부터 추정할 수 있다. 전기적 저항은 MWCNT를 카르복실화함에 의해 500% 증가되었다. MWCNT에서 카르복실화 과정 동안의 전도성의 기원이 되는 탄소-sp2 성격 감소는 이러한 저항 증가를 유발할 수 있다. PSA 항체가 카르복실기에 부착되었을 때 Ab-MWCNT의 전기적 저항은 카르복실화된 MWCNT보다 약 160% 정도가 더 높게 증가되었다. 증가된 저항은 단백질(PSA-항체)의 추가적 부착에 의해 MWCNT들 사이의 접촉에너지장벽(contact potential barrier)의 증가에 기인한 것으로 생각된다. 동일한 이유로, PSA-Ab-MWCNT(PSA, 1000 ng/mL)의 저항은 Ab-MWCNT에 비해 약 150% 높아졌다. 이러한 CNT의 단계적 증가는 도 4에 명확하게 나타나 있다.
도 7은 MWCNT 표면 개질에 의한 전기적 저항의 변화를 나타낸다. 데이터 점은 좌측부터 MWCNT, 카르복실화된 MWCNT, Ab-MWCNT 및 PSA-Ab-MWCNT(PSA; 1000 ng/mL)를 나타낸다.
CNT에 부착된 생체분자가 상온 상압에서 보통 p형 전도도를 가지는 CNT로부터 전자를 뺏으면, 전도도는 증가될 것이고(off 전류 증가), 전계 트랜지스터(FET)의 문턱전압(threshold voltage, VTH)은 p-character의 증가로 인해 더욱 음의 전압으로 이동한다. 만일 생체분자가 전자를 CNT에 제공한다면 반대현상이 관측될 것이다. 전하 전달 모델에 더하여, CNT 표면에 생체분자의 흡착에 의한 전도성 CNT 가닥들 사이의 접촉에너지장벽 증가는 FET의 VTH 변화 없이 전도도 감소를 유발한다.
따라서, CNT에 부착될 수 있는 타겟 생체분자의 수치는 생체분자-CNT의 저항 변화와 FET의 VTH 이동으로 결정될 수 있다. 그러나, SiO2/Si 와이퍼위에 있는 Au 마이크로 전극들 사이에 형성된 CNT-FET에서 생체분자 부가에 따른 VTH의 이동은 관찰할 수 없었고, 단지 생체분자의 노출에 의한 FET의 off-전류의 감소만을 관찰할 수 있었다. 이는 CNT에서 생체분자로 전자 이동이 없음을 의미하고, 이는 전하 캐리어의 밀도(charge carrier concentration)가 일정하고, 생체분자 부착에 의한 CNT들 사이의 접촉 에너지가 증가된다는 것을 의미한다. 최근, 금속 부착된 CNT를 사용하여 조립한 FET가 이러한 이유로 우수한 탄화수소 검출 능력을 가지게 됨을 확인하였다.
센싱부(Ab-MWCNT)의 PSA와의 반응에 의한 상대적 전기저항(R/R0; 여기서 R은 특정 농도의 PSA를 감지한 센서의 저항값이고, R0는 PSA 가 포함되지 않은 버퍼용액을 감지한 센서의 저항값이다)이 도 8나타나 있다. 도 8(a)는 상대 저항의 변화값이 0 ~ 500 ng/mL 범위에서 PSA의 농도 의존적으로 거의 선형적으로 나타나고 있음을 보여준다. 이는 PSA의 농도가 500 ng/mL 이내 이면 센서의 전기저항 측정으로 그 농도를 추정할 수 있음을 의미한다. 그러나, 만약 PSA 의 농도가 > 500 ng/mL 이라면, 센싱부의 저항은 포화된 것으로 나타난다.
도 8(b)는 낮은 PSA 농도범위(0 - 10 ng/mL)에서 상대 저항의 변화를 나타낸다. 이러한 범위에서 상대 저항은 PSA 농도에 선형적 의존관계로 나타났다. 센서 그래프에 나타난 것과 같이, 전립선암 초기 단계에서 발견되는 매우 낮은 수치의 PSA를 검출할 수 있다. 만약, PSA 수치가 4ng/mL 보다 높다면 전립선암이 초기 단계에 있다고 할 수 있다.
하나의 필터 페이퍼에서 준비된 11개의 센서로 blank sample(0 ng/mL의 PSA)을 검출했을 때 시그널 평균값으로부터 2배의 standard deviation 으로 추정한 결과 검출한계는 1.18 ng/mL 이었다.
<실험예 4> 종이형 센서의 절단 방법에 따른 저항균일성 측정
본원발명의 종이형 센서를 제조함에 있어 절단 방법에 따른 저항균일성이 달라짐을 확인하였고, 이에 따라 도 9(a) 및 도 9(b)에 나타난바와 같이 2가지 절단 형태로 필터 페이퍼를 잘라 비교·실험하였다.
도 9(a)의 세로 방사형 절단 종이형 센서의 저항균일성을 측정한 결과, 세로 방사형 절단으로 만들어진 11개의 센서로부터는 표준편차가 0.00332으로 나타났으며 R/R0 값의 범위가 0.99 ~ 1.00 으로 저항균일성이 일정함을 나타냈다. 이는 본원발명 센서의 검출한계인 1.18 ng/mL를 검출하는데 문제가 없는 결과이다. 본원발명의 종이형 센서는 PSA 검출과정에서 습도, 온도, 주변의 환경에 따라 발생할 수 있는 오차를 배제하고자 각각 Background 검출지와 Indicator 검출지 두 장의 센서를 사용하게 되며 Background와 Indicator의 전기 저항 차이를 R/R0 값으로 나타내어 PSA 농도를 계산한다. 따라서 Background와 Indicator의 전기저항 값을 비교하기 위해서는 두 장의 검출지는 같은 초기 전기저항 값을 가져야한다.
반면 도 9(b)의 가로 방사형 절단 종이형 센서의 저항균일성을 측정한 결과, 가로 방사형 절단으로 만들어진 11개의 센서로부터 얻어진 전기저항의 표준편차는 0.0438으로 나타났으며, 이것은 4 ng/mL 의 PSA를 검출신호 보다 큰 값이기 때문에 센서 제작에 부적격하다. 또한 R/R0 값이 최저값으로 0.91, 최고값으로 1.06으로 측정되어 값이 일정하지 않아 본원발명의 종이형 센서의 PSA 검출 방식에 적합하지 않다는 사실을 확인하였다. 저항균일성을 보장하지 못할 경우 실험의 재현성과 PSA 농도 측정의 정확도가 크게 감소한다.
이러한 사실로 본원발명의 세로 방사형으로 절단한 종이형 센서가 가로 방사형으로 절단한 종이형 센서보다 우수한 효과를 보이며, 진단을 위한 센서로 적합함을 확인하였다(도 9 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 항체가 부착된 항체-탄소기반 나노구조체와, 상기 항체-탄소기반 나노구조체가 실린지 필터링으로 증착된 필터페이퍼를 포함하는 종이형 센싱부; 및
    상기 센싱부의 전기저항 변화를 측정할 수 있는 검출부;를 포함하고,
    상기 종이형 센싱부는 실린지 필터링 증착 후 필터페이퍼의 원 중심에서 가장자리 방향으로 방사형 절단하여 얻은 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 전립선암 특이적 항체(Prostate specific antigen; PSA) 인 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 탄소기반 나노구조체는 단일벽 탄소나노튜브, 이중벽 탄소나노튜브, 다중벽 탄소나노튜브, 그라파이트, 및 그래핀(graphene) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 필터페이퍼는 0.3 ~ 0.5 um 크기의 미세기공을 갖는 셀룰로오즈 에스테르 필터페이퍼인 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 필터페이퍼를 방사형 절단하여 얻은 종이형 센싱부는 5 x 2 mm2의 직사각형인 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 센서의 최대 검출 범위는 500 ng/mL 이고, 검출한계는 1.18 ng/mL인 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 PSA 농도를 0 ng/mL ~ 500 ng/mL 의 범위에서 1 ng/mL 감도로 측정 가능한 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 종이형 센싱부가 배치되는 기판; 및 상기 센싱부의 양 끝단에 형성되는 2개의 전극;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서.
  9. 탄소기반 나노구조체에 카르복실기를 부착하는 카르복실화 단계;
    상기 카르복실화 된 탄소기반 나노구조체에 항체를 결합시켜 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계; 및
    상기 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 실린지 필터링으로 필터페이퍼 상에 증착하는 단계;
    상기 실린지 필터링된 필터페이퍼를 원 중심에서 가장자리 쪽으로 방사형 절단하여 종이형 센싱부를 얻는 단계;
    를 포함하는, 종이형 전립선암 진단센서의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 카르복실화는 탄소기반 나노구조체를 105 ℃에서 3시간 내지 3일 동안 질산용액에서 환류시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계는,
    상기 탄소기반 나노구조체 용액에 항체를 첨가하고 6 ~ 12시간 동안 실온에서 교반하여 반응시키는 항체 수용단계; 및
    상기 항체 수용 탄소기반 나노구조체에 블록킹제(blocking agent)를 넣고 실온 ~ 40 ℃에서 1 ~ 3시간 동안 배양하여 항체-결합된 탄소기반 나노구조체를 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서의 제조방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 종이형 전립선암 진단센서를 이용한 전립선암의 진단방법으로서,
    상기 종이형 센싱부를 젖은 상태로 30 ~ 40℃에서 1 ~ 3시간 동안 시료와 배양하여 항원-항체 반응을 수행하는 단계;
    상기 종이형 센싱부를 실온에서 건조한 후 전기저항 변화를 측정할 수 있는 검출부와 조립하여 전기저항을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 전기저항을 기본 전기저항과 비교하여 상대적 전기저항(R/R0) 수치를 얻는 단계;
    를 포함하는, 종이형 전립선암 진단센서를 이용한 전립선암의 진단방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 상대적 전기저항(R/R0) 수치를 바탕으로 환산한 PSA 항원의 농도가 4 ng/mL 보다 높다면 전립선암이 초기 단계로 진단하는 것을 특징으로 하는, 종이형 전립선암 진단센서를 이용한 전립선암의 진단방법.
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