KR101164645B1 - Ｇｃｐⅱ 돌연변이를 함유하는 알츠하이머 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루타메이트(glutamate) 생성 저해 및 베타 아밀로이드(β-amyloid)분해 활성을 갖는 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S) 및 상기 GCPⅡ 돌연변이(K699S)를 유효성분으로 함유하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)가 야생형 GCPⅡ에 비해 Aβ 분해 활성이 우수할 뿐만 아니라, 야생형 GCPⅡ가 갖고 있지 않은 글루타메이트(glutamate) 생성을 저해하는 활성을 동시에 보유하고 있으므로, 야생형 GCPⅡ보다 그 효과가 현저히 우수하고 안정성 또한 우수하다는 것을 확인함으로써, GCPⅡ 돌연변이(K699S)를 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료제에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Description

ＧＣＰⅡ 돌연변이를 함유하는 알츠하이머 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition to preventing and treating of Alzheimer's disease comprising GCPⅡ mutant}
본 발명은 글루타메이트(glutamate) 생성 저해 및 베타 아밀로이드(β-amyloid)분해 활성을 갖는 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S), 및 상기 GCPⅡ 돌연변이(K699S)를 유효성분으로 함유하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ)는 뇌에 존재하는 94 내지 100 kDa의 분명한 분자량을 가진 유형 Ⅱ 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이고, 주로 신경교(glia) 내에 있으며, NAAG(N-acetylaspartylglutamate)를 NAA(N-acetylaspartate) 및 글루타메이트(glutamate)로 가수분해함에 따라, 흥분성 신호전달(glutamatergic transmission)에 영향을 미친다. NAAG 가수분해로 인해 생성된 글루타메이트는 중추신경계에서 주요한 흥분성 신경전달물질로서 신경계에 필수적인 요소로 작용하지만 뇌 속의 과다한 축적은 뇌세포의 사멸과 변성을 초래하여 알츠하이머, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병와 같은 퇴행성 뇌질환을 야기하는 것으로 알려져 있다(Choi, W. H., Oh, Y. S., Ahn, J. Y., Kim, S. R. and Ha, T. Y.(2005) Antioxidative and protective effects of Ulmus davidiana var . japonica extracts on glutamate-induced cytotoxicity in PC12 cells. Korean J. Food Sci . Technol. 37, 479-483; Jeon, H. J., Park, S. W. and Mun, B. S. (2004) Effects of Gwibitang on glutamate-induced death in rat neonatal astrocytes. J Korean Oriental Med . 25, 184-193; Lee, J., Kim, M. S., Lee, C., Kim, H. Y., Choi, D. H., Kim, T. Y., Son, Y. and Park, R. (2003) Role of morphine in the glutamate-induced oxidative damage of C6 glial cells. Korean J Anesthesiol . 45, 271-277).
GCPⅡ는 효소 활성 및 발현 부위에 따라 다양한 이름이 있다. 전립선에서 GCPⅡ의 강한 발현(GCPⅡ의 기능 장소는 알려지지 않음) 때문에 PSMA라 명명하며, 중추신경계에서 뇌 신경전달물질(brain neurotransmitter), NAAG를 대사작용시키므로, GCPⅡ를 NAALADase라 명명하며, 전반부 소장(proximal small intestine)에서 폴리-지-글루타메이트 엽산(poly-g-glutamated folate), 엽산 가수분해효소(folate hydrolase) FOLH1 및 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase)로서 글루타메이트 카르복시펩티다아제Ⅱ(glutamate carboxypeptidaseⅡ, GCPⅡ)로부터 감마에 연결된 글루타메이트(gamma-linked glutamate)를 제거하는 역할을 한다.
또한, GCPⅡ의 구조는 GCPⅡ의 촉매 기전 및 기질 특이성에 대한 통찰을 제공한다. GCPⅡ는 활성 부위에 이핵성 Zn2 + 중심(binuclear Zn2 + centre)이 있고, 이 활성부위에서 두 개의 아연 원자는 결합 카르복시산염 리간드(bridging carboxylate ligand)를 공유한다. α-NAAG는 GCPⅡ의 아르기닌(arginine) 부분과 상호작용하는 글루타메이트 곁가지(glutamate side chain) 종류와 결합하고, 카르보닐(carbonyl)이 공격받는 것으로부터 산소, 및 C-말단은 아연 이온과 결합한다. 기질(예를 들어, α-NAAG에서의 NAA)의 나머지는 Arg-210과 특이적 상호작용하는 기질-결합 공간으로부터 수용된다. 좀 더 큰 기질(예를 들어, 네 개의 γ와 연결된 글루타메이트까지 함께 있는 폴리-γ-글루타메이트 엽산(poly- γ-glutamated folates with up to four γ-linked glutamates) (9))은 포켓과의 입체 충돌을 피하기 위해 약간의 구조적 재배열을 요구하고 결합의 교대 방법을 가질 수 있다. 또한, GCPⅡ는 두 개의 활성 부위인 S1' 포켓 및 S1 포켓이 있다(Mlcochova P., Plechanovova A., Barinka C., Mahadevan D., Saldanha J. W., Rjlisek L., Konvalinka J.(2007) Mapping of the active site of glutamate carboxypeptidase II by site-directed mutagenesis. FEBS J. 274(18) : 4731-41). 상기 S1 포켓이 GCPⅡ 기질 특이성의 '미세-조정(fine-tuning)'으로서 작용한다면, 상기 S1' 포켓은 NAAG 및 GCPⅡ 억제제의 주요한 높은 친화성 결합(affinity binding)에 기여하게 된다.
지금까지, GCPⅡ의 주요 기능은 NAAG 가수분해 작용이 있는 것으로 보고되었다. 따라서, 강력하고 선택적인 GCPⅡ 억제제, 즉 2-PMPA(2-(Phosphonomethyl) pentanedioic acid)는 뇌졸중(stroke), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis) 및 신경성 통증(neuropathic pain)의 임상 전의 모델에서 뇌 글루타메이트를 감소시키고 신경보호효과를 제공한다고 보고된 바 있다.
이전 연구에서, GCPⅡ가 Aβ(amyloid β)의 분해 효과를 통해 Aβ가 뇌내에 축적되는 것을 방지 또는 제거함으로써 알츠하이머 질환 및 다운 증후군 등의 질병 치료에 이용할 수 있다고 보고한 바 있다(특허 공개번호: 10-2007-0023832). 그러나, GCPⅡ의 NAAG 가수분해로 인해 생성되는 글루타메이트는 신경독성을 유발할 뿐만 아니라 뇌 속의 과다한 축적은 뇌세포의 사멸과 변성을 초래하여 알츠하이머, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병와 같은 퇴행성 뇌질환을 야기하는 것으로 알려져 있으므로 GCPⅡ 사용시의 안정성을 보장하기 어려웠다. 따라서, 이를 보완할 수 있는 방법이 요구되었다.
이에 본 발명자들은 이를 보완할 수 있는 방법을 연구한 결과, GCPⅡ의 다양한 돌연변이를 제조하고, 이의 활성을 분석하여 GCPⅡ 돌연변이인 K699S가 야생형 GCPⅡ 보다 Aβ 분해에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라 야생형 GCPⅡ가 갖고 있지 않은 글루타메이트의 생성 또한 저해하는 효과까지 있으므로, 야생형 GCPⅡ 보다 우수한 효과가 있고 안정성 또한 우수함으로 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료제에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 글루타메이트(glutamate) 생성 저해 및 베타 아밀로이드(β-amyloid)분해 활성을 갖는 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 GCPⅡ 돌연변이(K699S)를 이용한 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 GCPⅡ 돌연변이(K699S)를 이용한 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ)의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이를 유효성분으로 함유하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이가 발현되는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 유전자를 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 단백질을 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 발현 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포에서 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 발현 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)가 야생형 GCPⅡ에 비해 Aβ 분해 활성이 우수할 뿐만 아니라 야생형 GCPⅡ가 갖고 있지 않은 글루타메이트(glutamate) 생성을 저해하는 활성을 동시에 보유하고 있으므로, 야생형 GCPⅡ보다 그 효과가 현저히 우수하고 안정성 또한 우수하여, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료제에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 2-PMPA가 Aβ 및 NAAG 분해에 미치는 영향을 나타낸 그림이다.
(a, b) rhGCPⅡ를 2-PMPA 또는 EDTA가 있거나 또는 없이 Aβ40 또는 NAAG와 함께 인큐베이트시켰다. Aβ40 또는 NAAG 수준을 ELISA 또는 NAAG 분해 분석(cleavage assay)으로 검출하였다. (c) 렌티바이러스 GCPⅡ(lentiviral GCPⅡ)를 마우스 일차 성상세포 내에 감염시킨 후, 단량체의 Aβ40을 세포 내에 처리하였다. 그리고, 2-PMPA를 다양한 투여량으로 처리하였다. 세포 성장 배지에서 상기 Aβ40의 농도를 ELISA 분석으로 측정하였다. (d,e) 8달 된 APP Swedish/PS1E9 형질전환 마우스의 복강내에 1달 동안 2-PMPA의 10 mg/kg 또는 PBS 2/wk을 주입하였다(9 번). 막 단편(membrane fraction)을 NAAG 및 ELISA 분석으로 분석하였다.
도 2. GCPⅡ의 위치선택적 돌연변이를 나타낸 그림이다.
(a) 프라이머(primer)의 서열을 위치선택적 돌연변이 실험에 사용하였다. (b) 형질도입된 HEK293 세포에서 다양한 돌연변이 단백질의 발현을 나타냈다.
도 3. GCPⅡ의 S1' 포켓 돌연변이에서 NAAG 분해 활성을 나타낸 그림이다.
(a) S1' 포켓(R210A, K699S)에서 치환이 있는 돌연변이 단백질은 NAAG(N-acetyl-aspartyl-glutamate)를 분해하지 않았다. 그러나, S1 포켓(R536L, R548P)에서 돌연변이가 있는 다른 단백질은 약 40% 정도 NAAG 분해 활성을 갖는다. (b) GCPⅡ의 NAAG 분해 활성은 Aβ 펩타이드에 영향을 받지 않았다.
도 4. GCPⅡ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향을 나타낸 그림이다.
(a, b) H4 세포에서, 과발현된 S1' 돌연변이(K699S)는 아밀로이드-β40(amyloid-β40)을 분해하였지만, S1 돌연변이(G548P)는 분해하지 않았다. (c) 남은 Aβ은 G548P를 제외하고 K699S에 의해 감소하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)를 제공한다.
상기 GCPⅡ 돌연변이(K699S)는 구체적으로 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 것이고, 보다 구체적으로 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 GCPⅡ 돌연변이는 구체적으로 글루타메이트(glutamate) 생성 저해 활성 및 베타 아밀로이드(β-amyloid) 분해 활성을 동시에 갖는 것이나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ)의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이를 유효성분으로 함유하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 GCPⅡ 돌연변이는 구체적으로 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 GCPⅡ 돌연변이는 구체적으로 글루타메이트(glutamate) 생성 저해 활성 및 베타 아밀로이드(β-amyloid) 분해 활성을 동시에 갖는 것이나 이에 한정되지 않는다.
상기 베타 아밀로이드(β-amyloid)는 구체적으로 용해성(soluble) 또는 불용성(insoluble) 베타 아밀로이드인 것이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 GCPⅡ의 특이적 억제제인 2-PMPA의 Aβ 펩타이드에 대한 효과를 확인하기 위하여, 재조합 인간 GCPⅡ(rhGCPⅡ)를 Aβ1-40과 함께 인큐베이트시켰고 다양한 투여량으로 2-PMPA를 첨가했으며 ELISA로 분석하였다. 그 결과, rhGCPⅡ는 대조군과 비교하여 80% 정도 Aβ1-40 펩타이드를 분해시켰지만, 2-PMPA는 GCPⅡ의 Aβ1-40 분해에 아무런 효과가 없었다는 것을 확인하였고(도 1a 참조). 2-PMPA는 1차 마우스 성상세포에서 렌티바이러스 GCPⅡ의 Aβ1-40 분해를 차단하지 않았다는 것을 확인하였고(도 1c 참조), GCPⅡ에 의한 NAAG의 가수분해는 2-PMPA에 의해 완전히 차단되었다는 것을 확인하였다(도 1b 참조). 또한, 마우스 뇌에서 2-PMPA의 효과를 알아보기 위하여, 2-PMPA를 형질전환 AD 모델 마우스 내에 처리하였다. 본 발명자들은 2-PMPA(10 mg/kg, 복강 내로, 1달 동안 2X/wk)를 8달 된 APP Swedish/PS1Δ9 형질전환 마우스에 처리하였다. 피질 막 단편(cortical membrane fraction)에서 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 수준을 ELISA로 분석하였고 GCPⅡ의 NAAG 분해 활성을 NAAG 분석으로 측정하였다. 그 결과, NAAG 분해는 PBS 대조군과 비교하여 2-PMPA를 처리한 마우스에서 약 90% 감소하였지만(도 1d 참조), Aβ1-40 및 Aβ1-42의 총 수준은 2-PMPA의 처리에 의해 변화되지 않았다는 것을 확인하였다(도 1e 참조). 따라서, GCPⅡ에서 NAAG 또는 Aβ 분해 부위가 다르다는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 GCPⅡ가 S1 및 S1' 포켓이라 명명된 두 개의 활성 부위로 구성되어 있다는 것을 바탕으로 GCPⅡ[ref]의 다양한 돌연변이인, GCPⅡ의 7개의 돌연변이(R210A, D387N, P388A, R536L, G548P, Y552I, K699S)를 제작하였다(도 2a 참조). 각 돌연변이가 있는, 두 개의 상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 아미노산을 위치선택적 돌연변이로 변화시켰다. 돌연변이가 있는 다양한 GCPⅡ의 발현을 확인하기 위하여, 돌연변이 플라스미드를 HEK293T 세포 이내에 형질도입시킨 후 웨스턴 블롯팅(wetern blotting)으로 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 밴드의 패턴은 rhGCPⅡ와 유사했고 하나의 밴드는 GCPⅡ의 예측된 크기인 98 kDa에서 두드러지게 보였다는 것을 확인하였다(도 2b 참조).
본 발명자들은 GCPⅡ 돌연변이의 효소 활성의 변화를 관찰하였다. 다양한 돌연변이의 효소 활성을 분석하기 위하여, S1' 포켓(R210A, K699S) 및 S1 포켓(R536L, G548P)에 치환이 있는 돌연변이 단백질을 H4 세포에 형질도입시켰다. NAAG의 가수분해를 측정하기 위하여, 세포 용해물을 [H]3이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 GCPⅡ의 특이적 기질과 함께 인큐베이트시켰다. 그 결과, 상기 S1' 포켓 돌연변이(R210A, K699S)는 NAAG를 가수분해하는 활성을 완전히 잃어버렸으나, 상기 S1 포켓 돌연변이(R536L, G548P)는 야생형 GCPⅡ와 비교하여 40% 정도 활성을 유지한다는 것을 확인하였다(도 3a 참조). 추가적으로, GCPⅡ의 NAAG 분해와 Aβ 분해간의 경쟁적 저해 효과를 알아보기 위하여, rhGCPⅡ를 [H]3이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 Aβ 펩타이드를 농도별로 인큐베이트시켰다. 그 결과, GCPⅡ의 NAAG 분해 활성은 Aβ 펩타이드에 영향을 받지 않았다는 것을 확인하였다(도 3b 참조). 따라서, S1' 포켓에서의 NAAG 가수분해는 Aβ에 의해 영향받지 않는다는 것을 확인하여 GCPⅡ에서의 NAAG 분해와 Aβ 분해기전이 다르다는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 돌연변이 GCPⅡ의 Aβ clearance 활성을 동정하기 위하여, 다양한 돌연변이 플라스미드를 내인성의 GCPⅡ를 발현하지 않는 것으로 알려진 PC3 세포에 형질도입시켰다. 48시간 후, 상기 세포 용해물을 Aβ(2 μM)와 혼합하여 밤새도록 인큐베이트시켰다. 남은 Aβ 펩타이드는 6E10 항체를 이용하여 닷 블롯팅(dot blotting) 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 확인하였다. 그 결과, K699S 돌연변이는 야생형보다 Aβ를 좀 더 분해하였지만 G548P 돌연변이는 Aβ 분해 활성을 잃었다는 것을 확인하였다(도 4a, b 참조). 또한, 배양 배지에서 외인적으로 처리된 Aβ 펩타이드에서 GCPⅡ의 분해 활성을 확인하기 위하여, 형질도입 후 다음 날, 배지 내에 Aβ를 1 ng/ml로 처리하였고 37℃에서 8 시간 동안 인큐베이트시킴으로써 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과, 웨스턴 블롯팅과 유사하게, 남은 Aβ은 G548P는 제외하고 K699S에 의해 감소하였다는 것을 확인하였다(도 4c 참조). 따라서, S1 포켓이 Aβ를 분해에서 S1' 포켓보다 좀 더 중요하다는 것을 통하여 NAAG 가수분해 활성 및 Aβ 분해 활성의 작용은 GCPⅡ 효소에 따라 다르게 조절된다는 것을 확인하였다.
그러므로, 본 발명에 따른 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)는 기존에 알려진 야생형 GCPⅡ와 비교하여, Aβ 분해에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라 야생형 GCPⅡ가 가지고 있는 안정성 보장의 어려움을 극복하는, NAAG 가수분해로 인해 생성되고 신경독성을 유발하는 글루타메이트(glutamate)의 생성 또한 동시에 저해하는 효과까지 있으므로, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고, 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
본 발명의 GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제등이 될 수 있다.
본 발명의 GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물의 투여 방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장 또는 경구 투여를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.1μg/kg ~ 0.1g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료용 조성물은 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 호르몬 치료, 약물치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이가 발현되는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
상기 발현 벡터는 구체적으로 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 레트로 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스성 발현 벡터인 것이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)는 기존에 알려진 야생형 GCPⅡ와 비교하여, Aβ 분해에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라 야생형 GCPⅡ가 가지고 있는 안정성 보장의 어려움을 극복하는, NAAG 가수분해로 인해 생성되고 신경독성을 유발하는 글루타메이트(glutamate)의 생성 또한 동시에 저해하는 효과까지 있으므로, GCPⅡ 돌연변이가 발현되는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 GCPⅡ 돌연변이를 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 GCPⅡ 돌연변이를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 유전자를 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 GCPⅡ 돌연변이 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)는 기존에 알려진 야생형 GCPⅡ와 비교하여, Aβ 분해에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라, 야생형 GCPⅡ가 가지고 있는 안정성 보장의 어려움을 극복하는, NAAG 가수분해로 인해 생성되고 신경독성을 유발하는 글루타메이트(glutamate)의 생성 또한 동시에 저해하는 효과까지 있으므로, GCPⅡ 돌연변이 유전자를 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 단백질을 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 GCPⅡ 돌연변이 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)는 기존에 알려진 야생형 GCPⅡ와 비교하여, Aβ 분해에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라 야생형 GCPⅡ가 가지고 있는 안정성 보장의 어려움을 극복하는, NAAG 가수분해로 인해 생성되고 신경독성을 유발하는 글루타메이트(glutamate)의 생성 또한 동시에 저해하는 효과까지 있으므로, GCPⅡ 돌연변이 단백질을 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 발현 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포에서 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 발현 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 수준은 구체적으로 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)는 기존에 알려진 야생형 GCPⅡ와 비교하여, Aβ 분해에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라, 야생형 GCPⅡ가 가지고 있는 안정성 보장의 어려움을 극복하는, NAAG 가수분해로 인해 생성되고 신경독성을 유발하는 글루타메이트(glutamate)의 생성 또한 동시에 저해하는 효과까지 있으므로, GCPⅡ 돌연변이 단백질의 발현 변화는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 수준은 구체적으로 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ) 돌연변이(K699S)는 기존에 알려진 야생형 GCPⅡ와 비교하여, Aβ 분해에 우수한 효과가 있을 뿐만 아니라, 야생형 GCPⅡ가 가지고 있는 안정성 보장의 어려움을 극복하는, NAAG 가수분해로 인해 생성되고 신경독성을 유발하는 글루타메이트(glutamate)의 생성 또한 동시에 저해하는 효과까지 있으므로, GCPⅡ 돌연변이 단백질의 활성 변화는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 GCP-Ⅱ 돌연변이 유전자를 포함하는 조성물과 시험 대상 물질간의 반응 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 및 DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
예를 들면, 시험관 내(in vitro)에서 상기 유전자와 시험 대상 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류 세포와 시험 대상 물질을 반응시킨 후 노던 블랏 분석(northern blot assay), 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포내로 도입한 후 시험 대상 물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다.
이러한 경우 본 발명의 조성물은 GCP-Ⅱ 돌연변이 유전자 외에도 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질을 포함하는 조성물과 시험 대상 물질간의 반응 확인은 단백질-단백질 및 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
예를 들면, GCP-Ⅱ 돌연변이 유전자 또는 GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질과 시험 대상 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), GCP-Ⅱ 돌연변이 단백질에 결합하는 파지-디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high troughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포기반 스크리닝(cell-based screeing) 또는 DNA 마이크로어레이(microarray)를 이용하는 스크리닝 방법등을 사용할 수 있다.
이러한 경우 본 발명의 조성물은 GCP-Ⅱ 돌연변이로부터 발현된 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체내(in vivo) 실험을 위하여, 상기 단백질을 발현하는 세포 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에서 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포등을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 시험 대상 물질은 통상적인 선정방식에 따라 Aβ의 뇌내 축적 또는 글루타메이트의 생성 예방 및 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물 등이 될 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 2- PMPA 가 Aβ 및 NAAG 분해에 미치는 영향 확인
<1-1> 세포배양 및 형질도입
HEK293T 세포 및 H4 세포(American Type Culture Collection, ATCC, Edinburg, VA, USA)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)(FBS; GIBCO) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)(GIBCO)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's 배지)(DMEM; GIBCO)에, PC3 세포를 10% 우태아 혈청(FBS; GIBCO) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO)이 첨가된 RPMI 배지 1640 (GIBCO)에 5% CO2를 포함하는 습식 배양기(humidified incubator)에서 37℃에서 배양하였다. 일시적인 형질도입을 제조사의 지침서를 따라 Lipofectamine 2000 시약 또는 Lipofectamine Plus 시약(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다.
<1-2> Aβ 펩타이드의 준비
Aβ1-40 또는 Aβ1-42(Invitrogen) 펩타이드를 최종적으로 1mM 농도로 차가운 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)(HFIP; Sigma)과 함께 준비하였다. 실온에서 40 분 동안 흔들었고 4℃에서 20 분 동안 둔 다음, HFIP를 진공상태에서 제거하였다. 펩타이드 펠릿(pellet)을 -70℃에 저장하였다. 상기 펠릿을 최종 5mM 농도가 되도록 DMSO로 용해시켰고 최종 1mM 농도가 되도록 증류수를 첨가하였다.
<1-3> ELISA 분석을 통한 2- PMPA 가 Aβ 분해에 미치는 영향 확인
hGCPⅡ 및 다양한 돌연변이 hGCPⅡ 유전자를 암호화하는 벡터(vector)를 12-웰 플레이트에서 PC3 세포 내로 형질도입시켰다. 배양 배지를 약 30 시간 후에 2-PMPA((2-(Phosphonomethyl) pentanedioic acid)가 있거나 또는 없이 Aβ1-40 또는 Aβ1-42 펩타이드가 처리된 배지로 바꾸었고, 세포를 다시 8 시간 동안 인큐베이트시켰다. 상기 배지를 수득하였고 제조사의 프로토콜을 따라 ELISA 키트(Invitrogen)를 이용하여 남은 Aβ1-40 또는 Aβ1-42를 분석하였다. 공(empty) pcDNA3 공 벡터로 형질도입된 세포를 음성 대조군으로서 이용하였다.
그 결과, 도 1a에서 보는 바와 같이 rhGCPⅡ는 대조군과 비교하여 약 80% Aβ1-40를 분해시켰지만, 2-PMPA는 GCPⅡ의 Aβ1-40 분열에 효과가 없음을 확인하였다(도 1a).
<1-4> NAAG 분해 분석을 통한 2- PMPA 가 NAAG 분해에 미치는 영향 확인
내인성으로 또는 과발현된 글루타메이트 카르복시펩티다아제 Ⅱ(Glutamate carboxypeptidase Ⅱ, GCPⅡ) 단백질의 활성을 하기와 같은 방법으로 측정하였다. 세포 용해물(50 μg)을 37℃에서 한 시간 동안 50 mM HEPES 및 150 mM NaCl을 포함하는 총 100 μl의 부피에서 GCPⅡ 특이적 억제제인 2-PMPA의 20 nM 또는 EDTA가 함께 있거나 또는 없이 NAAG(N-acetyl-L-aspartyl-L-[3,4-3H] glutamate; NEN corporation)의 20μM과 함께 인큐베이트시켰다. 반응 후에, 시료 혼합물(sample mixture)을 96 웰 컬럼(well column)(Havard apparatus)에 준비된 AG 1-X8 음이온교환 수지(anion-exchange resin)(Biorad)에 사용하였고 5분 동안 2000 rpm으로 원심분리하였다. 시료 혼합물과 함께 묶인 수지(resin)를 0.5 mM 포름산염(formate)(100 ml)으로 용리하였고 5분 동안 2000 rpm으로 원심분리하였다. 전이한 모든 용리된 시료를 1 ml의 섬광 용액(Optiphase HiSafe; Wallac)과 함께 혼합하였고 방사능을 섬광 계수기(Wallac Inc.)로 측정하였다.
그 결과, 도 1b에서 보는 바와 같이 2-PMPA가 GCPⅡ에 의한 NAAG 가수분해를 완전히 차단한 것을 확인하였다(도 1b).
<1-5> GCP Ⅱ 플라스미드 및 렌티바이러스 제작을 통한 2- PMPA 가 렌티바이러 스 GCP Ⅱ의 Aβ 분해에 미치는 영향 확인
hGCPⅡ 플라스미드를 하기에 기재한 것과 같이 준비하였다. 인간 별아교세포에 해당하는 U87-MG 세포에서 RNA를 분리한 후 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에서 hGCPⅡ의 증폭을 위하여 하기의 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 이용하였다. 플라스미드 생성을 위하여 PCR 산물을 pcDNA3 벡터내에 클로닝하였다:
정방향 5′-GATGTGGAATCTCCTTCACGAAAC-3'(서열번호 3); 및
역방향 5′-ATCCTCTTAGGCTACTTCACTCAAAG-3'(서열번호 4).
렌티바이러스 hGCPⅡ를 Macrogen Inc. (Seoul, Korea)로 준비하였다. hGCPⅡ cDNA를 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 프로모터 및 형광 단백질(GFP)이 있는 IRES 서열을 포함하는 렌티바이러스 컨스트럭트(construct)(LentiM1.4-hGCPII) 내에 클로닝하였다. 바이러스 제작을 위하여, hGCPⅡ, VSV-G 및 gag-pol 발현 벡터를 Lipofectamine Plus(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 293T 세포 내에 함께 형질도입시킨 후, 단량체의 AβDMF 세포 내에 처리하고 2-PMPA를 처리하였다. 세포 성장 배지에서의 Aβ1-40의 농도를 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 1c에서 보는 바와 같이 2-PMPA는 렌티바이러스 GCPⅡ의 Aβ1-40 분해를 차단하지 않았음을 확인하였다(도 1c).
<1-6> 형질전환 동물
이중-형질도입 APP Swedish/PS1△E9 마우스를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였고 C57BL/6J 백그라운드 계통(background strain)에서 야생형 마우스와 교배(crossing)하는 것에 의해 이중 유전자접합체(hemizygotes)를 유지하였다. 모든 동물들을 표준 동물 관리 프로토콜에 따라 사육하였고 한국 식약청(the Korean Food and Drug Administration)에서 무균사육시설(pathogen-free facility)에서 유지하였다. 마우스 유전자형을 하기의 프라이머(primer)를 이용하여 PCR 방법으로 확인하였다:
PrP(mouse prion protein):
정방향 5'-CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG-3'(서열번호 5);
역방향 5'-GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACC-3'(서열번호 6);
인간(human) APP:
정방향 5'-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'(서열번호 7); 및
역방향 5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3'(서열번호 8).
Aβs의 뇌 수준에서 GCPⅡ 억제제의 효과를 측정하기 위하여, 처리된 군은 복강내 주사로 한 달 동안 PBS 2X/wk에 용해된 2-PMPA (10 mg/kg)를 주입하였다. 처리하지 않은 군은 대조군으로서 같은 양의 PBS를 주입하였다. 마우스가 8 달이 되었을 때 처리를 시작하였다.
<1-7> 2- PMPA 의 마우스 뇌에서의 효과 확인
2-PMPA의 효과를 마우스의 뇌에서 알아보기 위하여, 상기 실시예 <1-6>의 방법으로 형질전환된 8달 된 APP Swedish/PS1Δ9 마우스의 복강 내에 1달 동안 2-PMPA의 10 mg/kg 또는 PBS 2/wk을 9 번 처리하였다. 피질 막 단편(cortical membrane fraction)에서 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 수준을 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 분석하였고 GCPⅡ의 NAAG 분해 활성을 상기 실시예 <1-4>의 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 1d에서 보는 바와 같이 2-PMPA를 처리한 마우스에서 NAAG 분해는 PBS 대조군과 비교하여 약 90% 감소한 것을 확인하였고(도 1d), 도 1e에서 보는 바와 같이 2-PMPA의 처리에 의해 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 수준은 변화하지 않았다는 것을 확인하였다(도 1e).
< 실시예 2> GCP Ⅱ의 위치선택적 돌연변이 발현 확인
<2-1> GCP Ⅱ의 위치선택적 돌연변이( Site - directed mutagenesis )
pcDNA-hGCPⅡ 플라스미드(50 ng)를 주형(template)으로 사용하였고, 각 돌연변이를 희망했던 돌연변이를 생산(harboring)하는 두 개의 상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 1)로 도입하였다. Pfu Ultra High-Fidelity DNA 폴리메라아제(polymerase)(stratagene)의 2.5U를 이용하여 연장시켰고 열린 원형 가닥(nicked circular strand)(95℃, 5 분 → (95℃, 50 초 → 55℃, 1 분 → 80℃, 8 분 20 초 → 72℃, 1 분) 22번 순환(cycle) → 4℃, 무한대(∞))에서 결과로 초래된 돌연변이 프라이머(125 ng)를 만들었다. 메틸화(methylated)되고, 돌연변이 되지 않은 부모형 DNA(nonmutated parental DNA) 주형을 37℃에서 한 시간 동안 Dpn I (NEB)의 20U로 digest시켰다. 그런 다음, 원형(circular) dsDNA를 DH5a 적격 세포(competent cell) 내로 변환시켰다. 각각의 돌연변이를 순서결정법(sequencing)(Cosmo corporation)으로 확인하였다.
그 결과, 도 2a에서 보는 바와 같이 GCPⅡ의 7개의 돌연변이(R210A, D387N, P388A, R536L, G548P, Y552I, K699S)를 제작하였다(도 2a).
<2-2> 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통한 GCP Ⅱ 돌연변이 발현 확인
GCPⅡ 돌연변이의 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>의 방법을 따라 돌연변이 플라스미드를 HEK293T 세포 내에 형질도입시킨 후, 세포를 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)(PBS; GIBCO)으로 세척하였고 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Sigma)이 있는 RIPA 완충용액(150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0.5 % sodium deoxycholate, 0.1 % SDS, 50 mM Tris at pH8.0)으로 용해시켰다. 용해물을 브레드포드(Bradford) 분석으로 단백질의 농도를 측정하였다. 단백질의 같은 농도를 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 첨가하여 10 분 동안 끓였고 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막(GE Healthcare)으로 전기이동시켰고 한 시간 동안 실온에서 5% 탈지 건조 밀크(nonfat dry milk)를 넣은 TBS-T로 차단(block)하였다. 그런 다음, 상기 막을 4℃에서 밤새도록 5% 탈지 건조 밀크에 anti-PSMA (abcam; ab41034, 1:1000), Y-PSMA (Maine Biotech, 1:1000) 또는 anti-a-tubulin 항체(antibody) (Sigma-Aldrich; T6199, 1:50000)와 함께 인큐베이트시켰다. TBST-T로 세 번 세척한 후, 블롯을 실온에서 2 시간 동안 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Jackson IR; 115-035-071, 1:10000) 또는 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (Jackson IR; 115-035-046, 1:10000)와 함께 인큐베이트시켰다. 세 번 세척한 후, 단백질을 화학발광의 기질(chemiluminescent substrate)(Thermo Scientific)을 이용하여 검출하였다.
그 결과, 도 2b에서 보는 바와 같이 밴드의 패턴은 rhGCPⅡ와 유사했고 하나의 밴드는 GCPⅡ의 예측된 크기인 98 kDa에서 두드러지게 보인 것을 확인하였다(도 2b).
< 실시예 3> GCP Ⅱ 돌연변이의 NAAG 분해에 미치는 영향 확인
GCPⅡ 돌연변이의 NAAG 분해에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>의 방법에 따라 S1' 포켓(R210A, K699S) 및 S1 포켓(R536L, G548P)에 치환이 있는 돌연변이 단백질을 H4 세포에 형질도입시켰다. NAAG의 가수분해를 측정하기 위하여, 상기 실시예 <1-4>의 방법에 따라 세포 용해물을 [H]3이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 GCPⅡ의 특이적 기질과 함께 인큐베이트시켰고 상기 실시예 <2-2>의 방법에 따라 단백질 발현의 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 3a에서 보는 바와 같이 S1' 포켓 돌연변이(R210A, K699S)는 NAAG를 가수분해하는 활성을 완전히 잃어버렸으나, S1 포켓 돌연변이(R536L, G548P)는 야생형 GCPⅡ와 비교하여 40% 정도 활성을 유지하고 있음을 확인하였다(도 3a).
GCPⅡ의 NAAG 분해에서 Aβ의 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 <1-4>의 방법에 따라 rhGCPⅡ를 [H]3이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 Aβ 펩타이드와 함께 동시에 인큐베이트시켰다.
그 결과, 도 3b에서 보는 바와 같이 GCPⅡ의 NAAG 분해 활성은 Aβ 펩타이드에 영향을 받지 않았다는 것을 확인하였다(도 3b).
< 실시예 4> GCP Ⅱ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향 확인
<4-1> GCP Ⅱ/Aβ 복합체 모델링
Aβ-S1 및 S1' 포켓의 결합의 MODE를 program O (http://xray.bmc.uu.se/alw yn/A-Z_frameset.html) (PDB file: 1z0q (Ab), 2oot (GCPII))를 이용하여 만들었다. 계산적 모형(mputational docking)을 메뉴얼 도킹(manual docking) 방법을 이용하여 수행하였다.
GCPⅡ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-5>의 방법 및 상기 실시예 <4-1>의 방법에 따라, 다양한 돌연변이 플라스미드를 내인성의 GCPⅡ를 발현하지 않는 것으로 알려진 PC3 세포에 형질도입시켰다. 48시간 후, 상기 세포 용해물을 Aβ(2 μM)와 혼합하여 밤새도록 인큐베이트시켰다.
<4-2> 닷 블롯팅(dot blotting)을 통한 GCP Ⅱ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향 확인
발현된 GCPII에 의해 잘리지 않고 남은 Aβ 펩타이드의 양을 확인하기 위하여 세포 용해물과 Aβ(2 μM)와 혼합물을 하기의 닷 블롯팅(dot blotting) 방법 및 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 확인하였다. 세포 용해물과 Aβ(2 μM)와 혼합물 1 ㎕를 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막에 떨어뜨린 후 완전히 말렸다. 말린 막을 한 시간 동안 실온에서 5% 탈지 건조 밀크(nonfat dry milk)를 넣은 TBS-T로 차단(block)하였다. 그런 다음, 상기 막을 4℃에서 밤새도록 5% 탈지 건조 밀크에 anti-Aβ antibody, 6E10 (SIGNET; SIG-39300, 1:2000)와 함께 인큐베이트시켰다. TBS-T로 세 번 세척한 후, 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-confugated goat anti-mouse IgG (Jackson IR; 115-035-071, 1:10000)와 함께 인큐베이트시켰다. 세 번 세척한 후, 단백질을 화학발광기질을 이용하여 검출하였다.
그 결과, 도 4a, b에서 보는 바와 같이 K699S 돌연변이는 야생형보다 Aβ를 좀 더 분해하였지만 G548P 돌연변이는 Aβ 분해의 활성을 잃었다는 것을 확인하였다(도 4a, b).
Aβ 펩타이드에서 GCPⅡ의 분해 활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-3> 및 상기 실시예 <4-1>의 방법에 따라, 형질도입 후 다음 날, 배지 내에 Aβ를 1 ng/ml로 처리하였고 37℃에서 8 시간 동안 인큐베이트시켰다.
그 결과, 도 4c에서 보는 바와 같이 남은 Aβ은 G548P를 제외하고 K699S에 의해 감소하였다는 것을 확인하였다(도 4c).
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료를 위한 약제의 개발과 이를 이용한 예방 또는 치료 방법 개발, 즉 단백질 치료제, 발현 및 활성 조절물질, 유전자 치료제 또는 세포 치료제 등에 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (14)

  1. GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ)의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이를 유효성분으로 함유하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, GCPⅡ 돌연변이는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, GCPⅡ 돌연변이는 글루타메이트(glutamate) 생성 저해 활성 및 베타 아밀로이드(β-amyloid) 분해 활성을 동시에 갖는 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 베타 아밀로이드(β-amyloid)는 용해성(soluble) 또는 불용성(insoluble) 베타 아밀로이드인 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이가 발현되는 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제.
  6. 제 5항에 있어서, 발현 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 레트로 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스성 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제.
  7. GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 유전자를 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, GCPⅡ 돌연변이 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물.
  9. GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 단백질을 포함하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, GCPⅡ 돌연변이 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 약학적 조성물.
  11. 1) GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 발현 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 세포에서 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 발현 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 수준은 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  13. 1) GCPⅡ의 전체 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 699번째 아미노산인 라이신(Lysine, K)을 세린(Serine, S)으로 변이시킨 GCPⅡ 돌연변이 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 GCPⅡ 돌연변이 단백질의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 수준은 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환을 수반하는 다운 증후군, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
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