TW200920405A

TW200920405A - PKIB and NAALADL2 for target genes of prostate cancer therapy and diagnosis

Info

Publication number: TW200920405A
Application number: TW097131697A
Authority: TW
Inventors: Yusuke Nakamura; Hidewaki Nakagawa; Shuichi Nakatsuru
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2007-08-24
Filing date: 2008-08-20
Publication date: 2009-05-16
Also published as: RU2010111116A; US20120022128A1; CA2697512A1; KR20100075452A; BRPI0815757A2; JP2010536365A; WO2009028521A1; EP2195425A4; EP2195425A1; CN101855346A

Description

.3 0· 200920405 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】 ·. I發明關於生命科學之範4 ’更肖定地言兒，關於癌症診斷與治療的範4。本發明特別關於偵測與診斷前列腺癌的方法以及治療與預防前列腺癌的方法。本發明更關於筛選預防前列腺癌的藥劑之方法。【先前技術】剛列腺癌（PC)為最常見的男性腫瘤與美國及歐洲癌症相關死亡的第二導因（Gr〇nberg H， Lancet 2〇〇3 361.859 64)。PC的致病率在多數已開發國家明顯增加’ 係由於西方飲食的流行以及老年族群的暴增（Gr〇nberg h， Lancet 2003 361:859-64 ； and Hsing AW et al. , Epide.iol Rev 20〇1 23:3_13)。使用血清前列腺—專一抗原（pSA)篩選使早期PC j貞測有急劇的改善，並導致患有局部疾病的患者增加，該局部疾病可由手術及放射治療治癒（Gr〇nberg H， Lancet 2003 361:859-64 ； and Hsing AW et al. , Epidemio1! Rev 2001 23:3-1 3)。然而，又這些PC患者中的2〇%_3〇% 仍然復發（Feldman BJ et al·，Nat Rev cancer 200 1 1:34-35， and Han M et al.， J Urol 2001 166:416-9)。雄激素/雄激素受體（AR)訊息路徑在PC發展舆進程中扣β中間角色，相對早期的pc生長通常為雄激素依賴型 (Feldman BJ et al., Nat Rev Cancer 2001 1:34-35, and

Han M et al. ’ J ur〇l 200 1 1 66:41 6-9)。因此，多數復 2125-9924-PF;Susan 6 200920405 發或末期疾病的患者，對4 e 對雄激素—去除治療有良好反應，該、療以外科手術或醫學去卩制睪丸雄激素的生成。但疋，這些患者終究養成雄勃冬一 μ雄激切依㈣及出現更惡性的表型，稱之為荷爾蒙治療盔钕沾义ώ — .· …效的剛列腺癌（服pc)。或者，這些患者最後養成對雄激杳土 ^ 择激素-去除療法（去勢）的抗藥性及出見更心ί·生的表型’稱之為睪丸切除無效的前列腺癌 (CRPC)，基本上為致命的疾病Hi，s轉…cl. 了

Cl in Oncol 2006 23:8253-61)。近期，組合多西紫杉醇 (docetaxel)及強體松（奸6(11118〇11〇對HRp(：患者為新標準療法（Tannock IF et al.，N Engl J Med 2004 351:1 502-

12)，但不能提供治療’且對hRPC患者的存活也非常有限。因此許多社群企圖研究多種不同方法，確認造成HRPC生長的新穎分子目標或訊息路徑（Scher HI，Sawyers CL. J

Clin Oncol 2006 23:8253-61)。睪丸切除無效的進程機制假設有兩種路徑，一涉及 AR，另一繞道AR或AR非依賴型。這兩路徑並非相互排除，通常共存於 CRPC 細胞中（Feldman BJ et al·，Nat Rev

Cancer 2001 1:34-35; Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61 )。許多AR-繞道或非依賴型路徑已知在CRPC細胞中活化，造成更惡性或更具侵略性的表型。AR路徑與非依賴型路徑間的橫向交流，如Her_2/neu 及 IL-6/STAT3，也會發生（FeldmanBJetal.，NatRev

Cancer 2001 1:34-35; Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61; Grossman ME, et al. JNCI 2001 2125-9924-PF;Susan 7 200920405 * . 93:1 687-97, Yang L, et al. , BBRC 200.3 305 : 462-469. 在各獨立路徑中，PTEN-PI3K-Akt路徑似乎是最關鍵路徑，可解釋CRPC的表型。Akt是絲胺酸/蘇胺酸激酶， * · 由磷脂醯肌醇（3,4,5)-磷酸（？1?3)活化，活化或磷酸化的 Akt經調節GSK3 /3、BAD、F0X0及niTOR促進細胞生長及細胞存活（Sharma Μ，et al.，J Biol Chem 2002 277:30935-41， Pap M, Cooper GM. J Biol Chem 1 998 273:1 9929-32, Downward J. 1 998 Curr Opin Cell Biol 1 0:262-67, Datta SR, et al., Cell 1997 91:231-41, Downward J. Cell Develop Biol 2004 15:177-82, Vivanco I and Sawyers C. Nat Rev Cancer2002 2:289-501, Hay N. Cancer Cell 2005 8:179-83)。正常細胞中，一種脂磷酸酶的腫瘤抑制劑PTEN，使 PIP3的磷酸移除，會抑制Akt活化及使細胞進行細胞凋亡，而某些腫瘤細胞具有PTEN突變或喪失PTEN表現，造 4 成Akt活化。除抗細胞凋亡功能外，在前列腺癌細胞中，活化的Akt直接連接於AR，並在無雄激素存在時填酸化 AR，同樣造成 CRPC 表型（Wen Y, et al.，Cancer Res 2000 60:684卜45)。事實上’在高格理森分級（Gleason grade)PC中磷酸化Akt的量提高’與PC進程或CRPC進程有關（Malik SN，et al., Clin Cancer Res 2002 8:1 1 68-71, KreisbergJI, et al.， Cancer Res 2004 64:5232-36)。

Akt的活化需要在Thr308及Ser473殘基上磷酸化。 2125-9924-PF;Susan 8 200920405 • •.破脂酿肌醇依賴j激酶1 (PDKl )可催化Thr308的磷酸化，多種激酶推測功能類似所謂的pDK2，催化Ser473磷酸化，但是否在癌症細胞中仍作用如生理性pDK2，則仍需要確認 (Grossmann ME, et al., JNCI 2001 93:1687-97, Tasken K， Aandahl EM. PhyS〇i Review 2004 84:137-67)。另外’ cAMP依賴型蛋白激酶A(pKA)通常被認為在媒介大fe圍由cAMP開始的生理或病理效應以及與g —蛋白偶合中’是必要的。多個配位體—受體系統活化pKA訊息傳遞路徑’此活化與控制細胞生長及分化有關（Tasken K，Aandahl EM. Physol Review 2004 84:137-67, Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Bi〇i 2002 12:258-66)。前列腺癌中，數個報告推測pKA涉及雄激素非依賴型生長及神經内分泌分化（c〇x ME, et al. J Biol Chem 2000 275:13812-8, Deeble PD, Cox ME, et al., Cancer Res 2007 67:663-72)。PKA路徑與AR路徑間的橫向交流亦被推測與PC細胞的雄激素非依賴型或睪丸切除生長有關 (Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 1 2:258-66,

Sadar MD. J Biol Chem 1999 274:7777-83)。 PKA路徑由多種因子調節，如pKA—調節次單元（pKA—R) 或 PKA 抑制劑（Taylor SS，Kim C，Vigil D，et al. BBA 20 05 1754.25-37， Dalton GD， Dewey WL. Neuropeptides 2006

40:23-34)，及在腫瘤細胞中，這些調節因子異常表現於修飾PKA路控：’某些為癌症治療的標把（Mi 1丨er· WR. Ann NY

Acad Sci 2002 968:37-48， 2002)。 2125-9924-PF;Susan 9 200920405 之如為了突顯臨床HRPC或CRPC分子特徵及織別

HRPC 或CRPC治療的分子標乾，對HRPC或CRPC組織純化而來的

腫瘤細胞，以LMM(雷射微束微切割法）進行全基因組cDM » · 微陣列分析，鑑定出HRPC或CRPC細胞中數個去調節基因，某些可能涉及雄激素非依賴性及惡化表型（Tamura K et al·， Cancer Res 2007 67:5117-25)。【發明内容】基於HRPC或CRPC細胞的全基因組表現輪廟，兩分子目標 PKIB(GenBank accession runnber:NM_181795)及 NAALADL2(GenBank accession number：NM_207015 及 AK021754)已被確認為有效於pc治療與診斷。而且，此蛋白可作為HRPC新穎治療發展的分子目標。 PKIB是在PKA路徑中一調節因子，在CRpc中為過度表現基因。本案發明人證實PKIB經由功能性連接PKA路徑與Akt路控’造成PC細胞存活及其惡性表型。 PK IB屬於PK I (蛋白激酶A抑制劑）族。PK j a抑制蛋白激酶A催化次單元（PKA-C)的激酶活性（GenBank accessi〇n mimber:NM_002730)，並藉由直接連接於 pKA —c，使 pKA_c 由細胞核内移出至細胞質内（Giass DB et al.，j Bi〇i chem 1 986 26 1:1 21 66-71, and Wen W et a 1. , J Biol Chem 19 94 26 9:32 2 1 4-20 )。蛋白激酶A(PKA)，即cMp依賴型蛋白激酶A，通常被認為是在媒介大範圍由cAMp開始的生理或病理效應以及與G-蛋白偶合中，是必要的，多個配位體一受 2125-9924-PF;Susan 10 200920405 • 體系統活•化PKA訊息傳遞^路徑，此活化與控制細胞生長及分化有關（Tasken Κ，Aandahl EM, PhyS〇i Review 2〇〇4 84:1 37-67, Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 1 2 : 2 5 8-6 6 )。鈾列腺癌中’數個報告推測ρκa涉及雄激素非依賴型生長及神經内分泌分化（Cox ME，et al J βί〇1 Chem 2000 275:13812-8, Deeble PD, Cox ME, et al

Cancer Res 200 7 67 : 663-72) ’ PKA 路徑與 AR 路徑間的橫向交流亦被推測與HRPC細胞的雄激素非依賴型生長有關 (Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 1 2*258-66 Sadar MD. J Biol Chem 1999 274:7777-83)。 NAALADL2是新穎第II型膜蛋白，屬於榖胺酸羧酸肽酶II(GCPII)族。GCPII的前列腺型稱為前列腺專一膜抗原 (PSMA)表現於4列腺癌，PSMA的增加與pc進程及HRPC有關（Rajasekaran AK et al.， Am J Physiol Cell Physiol 2005 288:C975-81, and Murphy GP et al. , Prostate 2000 ;42:145-9)。考量NAALADL2與PSMA的同質性及其相似表現形式，NAALADL2應稱為，’ PSMA2” 。PSMA為FM—認同的癌症造影劑的標靶’ 111 In-標記的7E1丨單株抗體（Pr〇stascint，

Cytogen’ Pfinceton，NJhPSMA為單株抗體的目標，如 J591 ’用在造影劑特定傳輸的臨床試驗或現細胞的治療（Murphy GP et al·，Pr〇state 2000 42:145 — 9, and Holmes EH, Expert Op i η I nvest i g Drugs 20 0 1 1 0 : 5 U -9)。除了作為癌症標記外，pSMA具有gpc活性，其基質包括聚-7 -榖胺酸化葉酸酯（Zh〇u j et al.，Nature 2125-9924-PF;Susan 11 200920405

Review Drug Disc 2005 4:1015-26)。PSMA 的酵素活性可由前藥的設計而開發，其中藥劑的不活化榖胺酸形式被選擇切割’因此僅在細胞中活化表現PSMA(Denny WA et al £1^“以（：1^1112001 36 ^77-95)。然而，？81^如何與前列腺癌進程有關是完全未知’目標PSM功能或活性的可能性也是未知。本發明提出診斷或鑑別個體可能罹患前列腺癌的方法，經鑑別患者的生物樣本中PKIB及NAALADL2的表現量。任何基因的表現量增加（相較於基因正常控制量），表示個體正遭逢發展中的前列腺癌或在危險群中。本發明至少-部分是基於發現包括特定序列的雙股分子（特別是sEQIdN0.:16, 17，及19)能有效抑制前列腺癌細胞的細胞生長。特別是本發明提供小干擾謝⑷則目標PKIB及NAALADL2基因。本發明之一部分關於雙股分子，其可編碼於載體而自載體表現。因此，本發明提供抑制細 i王長及治療刖列腺癌的2 法，藉由投與本發明之雙股分 ,' ,^ 4戰體。本方法包括投j 個體一組合物，包括一個χ " 们以上的雙股分子或載體。本發明之另一方面關於、、Λ 、&療癌症的組合物，包括 -種本發明之雙股分子或載體選治療或預防前列腺癌的化本發月更棱供-種轉現mB或題飢2蛋白的^技包括使測試化合物與表 ^ NAALADL2 ^ ό # ' 接觸，然後篩選降低ΡΚΙί 及WAALADL2蛋白表現的測試化人 σ物。本發明更提供篩選治 2125-9924-PF;Susan 12 200920405 療=預防前列腺癌的化合物，偵測ρ·! κ β與蛋白激酶A催化次單元（PKA-C)間的連接。抑制麗與pKA_c連接的化人物’預期可減輕前列腺癌的症狀…，本發明更提供：測癌症的抗體的篩選方法’偵測細胞表面的naaladl2。可辨識NAALADL2的抗體用於偵測前列腺癌。【實施方式】定義「-」或「該」表示「至少一」，除非特別說明者。「生物樣本」表示整體有機體或集合的組織、細胞、或組成部分（如體液’包括血液、黏液、、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、臍帶血、尿、陰道液體及唾液）。「生物樣本」更表示來自整體有機體或集合的細胞、組織或部分組織、或其片段或部分所製備的均質的溶胞產物、萃取物、細胞培養物或組織培養物。最近，「生物樣本」表示一種介質，如繁殖有機體的營養液或膠，其包含細胞組成，如蛋白質或多核苷酸。夕核苷酸」及「募核苷酸」除非有特別指定，在此可相互交換使用，以其通用接受的字母編碼表示。此字彙用在核酸（核苷酸）聚合物，其中一或多個核酸以酯鍵結。多核苷酸或寡核苷酸由DNA、RNA或兩者組合構成。雙股分子「分離的雙股分子」表示抑制目標基因表現的核酸分子，如短干擾RNA(siRNA，如雙股核核酸（dsRNA)或小髮夾 2l25-9924-PF;Susan 13 200920405 狀 RNA(shRNA))及短干擾 DMA/RNA((siD/R-NA)，如雙股鑲喪 DNA 與 RNA(dsD/R-NA)或小髮夾狀 DNA 與 RNA(shD/R-NA))。此述「siRNA」表示一雙股RNi分子，避免目標mRNA 轉譯。導入s iRNA於細胞中的標準技術包括以轉錄的作為DNA鑄模。siRNA包括PKIB或NAALADL2意義核酸序列（亦稱為「意義股」），PKIB或NAALADL2反意義核酸序列（亦稱為反思義股」）’或兩者。siRNA可由具有目標基因的意義股與互補反意義股核酸序列兩者所構成，如髮夾狀。siRNA 可為 dsRNA 或 shRNA。此述「dsRNA」表示兩個RNA分子構成，包括兩者為互補序列’經由互補序列融合，形成雙股RNA分子。雙股核苷酸序列包含「意義股」或「反意義股」RNA，選自目標基因序列編碼的蛋白質，也包括選自目標基因非編碼區的核苷酸序列之RNA分子。此述「shRNA」表示具有線圈結構的slRNA，包括彼此互補的弟一及第二區域，即意義股與反意義股。當互補程度及區域疋位充足’區域間發生驗基配對，第一與第二區域形成線圈區，線圈中的核苷酸（或核苷酸類似物）缺少鹼基配對導致線圈形成。shRNA線圈區為介於意義股與反意義股間的單股區，也可稱為「插入單股」。此述「siD/R-NA」表示雙股多核苷酸分子，由RNA與 DNA構成，包括RNA與DNA的雜交體及嵌合體，避免目標 mRNA轉譯。雜交體表示由DNA構成的多核苷酸與構成 2125-9924-PF;Susan 14 200920405 - 的多核苷酸彼此雜交，形成r雙股分子；其中嵌合體表示

一或二股構成雙股分子’其中包含RNA與DNA。細胞中導入siD/R-NA使用標準技術。Sn)/R_NA包括pKIB或 NAALADL2意義股核酸序列（亦稱為「意義股」）、pKIB或 NAALADL2反意義股（亦稱為「反意義股」）、或兩者。siD/R-NA 可由具有來自目標基因的意義股及互補的反意義股核酸序列之單轉錄本所架構’如髮夹狀。siRNA可為dsRNA或 shRNA。此述「dsD/R-NA」表示兩分子構成物，包括互補序列，經由互補序列互相融合，形成雙股多核苷酸分子。兩股的核苷酸序列包括「意義股」或「反意義股」多核苷酸序列，選自目標基因序列編碼的蛋白質，也包括選自目標基因非編碼區的核苷酸序列之多核苷酸。由一或二分子構成 dsD/R-NA由RNA與DNA兩者構成（嵌合分子），或者，—分子由RNA構成’另一分子由DNA構成（雜交雙股）。此述「shD/R-NA」表示siD/R-NA具有線圈結構，包括彼此互補的第一及第二區域，即意義股與反意義股。當互補程度及區域定位充足，區域間發生鹼基配對，第一與第二區域形成線圈區，線圈中的核苷酸（或核苷酸類似物）缺少鹼基配對導致線圈形成。shD/R-NA線圈區為介於意義股與反意義股間的單股區，也可稱為「插入單股。 …此述「單離的核酸」表示自原環境（如㈣生成的為自然環境）移出的核酸，及改變其本質的合成核酸。本發明的分離核酸包括DNA、RNA及其衍生物。 2l25-9924-PF;Susan 15 200920405

.抗PKIB或财从⑪^的雙股分子’其分子與目標祕NA 雜交，經由與基因的正常單股mRNA轉錄本作用，會減少或抑制PKIB或NAALADL2基因編碼的蛋白質MU或 NMLADL2，因此干擾轉譯，也因此抑制蛋白^表現。前列腺癌:胞株的ΡΚΙΒ表現由！或2不同的ά_(第3圖）抑制；前列腺癌細胞株的NAALADL2表現由仳㈣人（第4圖）抑制。因此，本發明提供單離的雙股分子，在導入表現基因的細胞中時’具有抑制PKIB或NAALADL2基因表現的性質。雙股分子的目標序列由以下siRNA設計規則所設計。 PKIB目標序列，包括如核苷酸 SEQ ID NO:16 ， SEQ ID NO:17 。 NAALADL2目標序列，包括如核苷酸 SEQ ID N0:19 。本發明提供以下雙股分子[1 ] - [ 1 6 ]: [1 ] 一單離的雙股分子，在導入細胞中時，抑制找Μ或 NAALADL2基因表現及細胞生長，該分子包括一意義股與其互補之反意義月曼’彼此雜交形成雙股分子，其中該意義股包括一目標序列選自SEQ ID N0:16、17、及19 ; [2] 如[1]的雙股分子，其具有約1〇〇個核苷酸以下的長度； [3] 如[2]的雙股分子，其具有約乃個核苷酸以下的長度； [4] 如[3]的雙股分子，其具有約5〇個核苷酸以下的長度； [5 ]如[4 ]的雙版分子，其具有約2 5個核苷酸以下的長度； 2125-9924-PF;Susan 16 200920405 [6]如[5]的雙股分子，其具有約19個 . 度； ·〕25個核苦酸吟長 m如[1]的雙股分子’由單一多核芽酸構成，該包括由插入單股連接的意義股與反意義股； /皆酸 [8] 如[7]的雙股分子，呈士 ’、有 - 5 _[Α] - [Β]-[Α，]-3，，其中[Α]為-音墓机工 SEQ IDN0:16、17、及19的序列，⑻為插入單股，由㈣個核芽酸構成’及U’ ]為包括[A]互補序列的反意義股； [9] 如[1]的雙股分子，包括; [10] 如[1]的雙股分子’包括DNA及RNA; [11] 如[10]的雙股分子’為DNA多核苦酸及m多核苦酸的雜交體； [12] 如[11]的雙股分子，其中意義股與反意義股分別構成 DNA 及 RNA ; [1 3 ]如[1 〇 ]的雙股分子，為DM及RNA的嵌合體； [14]如[13]的雙股分子，其中一區域位於反意義股3，端側，或一區域位於意義股5’端側及一區域位於反意義股 3’端側，構成RNA ; [1 5 ]如[14 ]的雙股分子’其中該侧翼區域由9_丨3個核苷酸構成； Π6]如[1]的雙股分子，包括3，突出處。本發明之雙股分子將詳細說明於下。設計具有抑制細胞内目標基因表現能力的雙股分子的方法為習知（見USP 6, 506, 559，全文為本案之參考）。如 2125-9924-PF;Susan 17 200920405 可自 0' mi sc

Ambior^ 網站（http://wwwambi〇nc〇m/techiib/ siRNA_finder.html)使用電腦程式設計siRna。電腦程式基於以下方法選摆曰护诂过喊+ 友、擇目铩核苷酸序列作為雙股分子。 .. 目標位置選擇 1.開始於轉錄本的AUG起始密碼子，向下掃描至M二核苦酸序列。紀錄每個AA發生及3,相鄰的19個核普酸為潛在的siRNA目標基因。Tuschl等人建議避免設計 siRNA為5，與3’未轉譯區域⑽Rs)及接近起始密碼子的區域（在75個鹼基内）’雖然該區域可能具有較豐富的調節蛋白連接區，UTR -連接蛋白及/或轉譯開始複合物可能干擾 siRNA内核酶複合物的連接。 2·比較潛在的目標位與適當的全基因庫資料（人、小鼠、大鼠等），刪除任何與其他編碼序列有明顯相同性的目標序列。基本上可使用BUST，位於Ncm網站 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul SF et al Nuclek Acids Res 1 997 Sep ι 25( 1 7):3389_4〇2)。·’ 3.選擇具資格的目標序列進行合成。根據基因長度評估選擇數個目標序列為慣例。 & 根據此方法，設計本發明之分離的雙股分子的目標序列為 ’ SEQ ID Ν0:16 及 SEQ ID N0:17為PKIB基因、核苷酸； SEQ ID N0:19 為 NAALADL2 基因、核苷酸。 2125-9924-PF;Susan 18 200920405 目標上述目標序列的雙股分子分別被檢查其抑制表現該目標基因的細胞生長能力。因此本發明提供雙股分子，目標選自下列群組的任何序列： SEQ ID N〇Vl6 及 SEQ ID N0:17為PKIB基因、核普酸； SEQ ID NO: 1 9 為 NAALADL2 基因、核苷酸。本發明的雙股分子為單一目標ΡΚΙβ* NAAUDL2基因序列，或可為多個目標PKIB或NAAUDL2基因序列。 PKIB或NAALADL2目標序列代表核苷酸序列，與ρπβ 基因或NAALADL2基因的一部分相同（即ρκΐΒ或naaladl2 基因内的多核苷酸，互補於siRNA並與其等長）。該目標序列包括人PKIB或NAALADL2基因的5,未轉譯（υτ)區域、開放讀序框⑽F)或3,未轉譯區。或者，si腿為互補於 PKIB或NAALADL2基因表現的上游或下游調節物的核酸序列。上游或下游調節物例如連接PKIB* NAALADL2基因啟動子的轉錄因子、與_或NAALADL2多肽作用的激酶或磷酸酶、PKIB或NAALADL2啟動子或促進物。 PKIB或NAALADL2基因的 ’其包括目標序列及/或目本發明的雙股分子目標上述目標序列，包括單離的多核苷酸標序列的互補序列的任何核酸序列。目標ρκΐΒ基因的多核苦酸，例如包括SEQIDN0:16417序列及/或與其互補的序列；目標NMLADL2基因的多核普酸，包括seqi])n〇19 序列及/或與其互補的序列。然而本發明衫限於此例，也可接受上述核酸序列的小改變’尸'要該改變分子仍然具有 2125-9924-PF；Susan 19 200920405 ' 抑制ΡΚΙδ或NAALADL2辱因表現的能力。此述「小改變」在核酸序列中意味一、二、或數個取代、缺失、增加或插入核酸於序列中。一般而言，小改變可為4或以下，有時為3或以下，通常為2或以下取代、缺失、增加或插入核酸於序列中。本發明的雙股分子在實施例的方法中測試其能力。實施例中’包括ΡΚΙΒ或NAALADL2基因的mRNA多個不同部分的意義股或其互補的反意義股的雙股分子，在試管中以標準方法測試其對前列腺癌細胞株（如使用22Rvl、LNCap(Hp) 及C4-2B)中PKIB或NAALADL2基因產物的生成減少能力。再者’相較於無候選雙股分子培養的細胞相比，與候選雙股分子接觸的細胞中PKIB或NAALADL2基因產物的減少，可由RT-PCR偵測’使用實施例1 r半定量rT_pcr」的ρκΐβ 或NAALADL2 mRNA的引子。然後對減少ρΚίΒ或Naaladl2 基因產物生成的序列’進行試管内細胞基礎分析，债測細 ( 胞生長的抑制效應。然後試管内細胞基礎分析抑制細胞生長的序列，偵測使用癌症動物的生體内能力，如裸鼠異體移植模式，確認ΡΚΐβ或NAALADL2產物減少形成，減少腫瘤細胞生長。當單離的多核苷酸為RNA或其衍生物時，核苷酸序列中鹼基” t”應由” u”取代。此述「互補」表示多核苷酸的核苷酸單元間，華生克里克（watson_criCk)或胡格斯坦 (Hoogsteen)的鹼基配對，此述「連接」表示兩多核苷酸間的物理或化學作用。當此多核苷酸包括修飾過的核苷酸及/ 2125-9924-PF;Susan 20 200920405 或非磷酸二酯鍵結時，這些多核苷酸也可以以相同狀雖彼此連接。互補的多核苷酸序列通常在適當條件 τ r雜父，形成幾乎很少或沒有錯誤配對的穩定雙股。而且，本發明的早離多核苷酸的意義股與反意義股經過雜交可形成雙股分子或髮夾狀線圈結構。較佳實施例中，此雙股包含在每1 〇對配對中只有1以下的錯誤配對。在更佳的實施例中，雙0 股間為完全互補，沒有錯誤配對。 PKIB具有少於1 909個核苷酸長度的多核苷酸， NAALADL2具有少於4912個核皆酸長度的多核芽酸。例如在整個基因中，此多核苷酸少於5〇〇、2〇〇、ι〇〇、Μ、、或25個核苷酸長度。本發明的單離的多核苷酸有用於形對抗ΡΠΒ或NAALADL2基㈣雙股分子，或製備編褐上述雙股分子的鑄模DNA。當上述多核苦酸用於形成雙股分子時，上述多核苦酸可長於19個核㈣，較佳長於Η個核苷敲，更佳為介於約1 9-25個核苷酸長度。本發明的雙股分子可包括一或多個修飾過的核苦酸及或非鱗酸1旨鍵結。化學修飾方法為該技術領域中所孰 Γ，可增加上述雙股分子的穩定性、提高獲取率及/或增：、-，田胞吸收。熟知該項技術去竹者將了解其他形式的化學修飾方法併入本發明分子⑽㈣隐職咖叫在一較佳實施例中，可你田/欠& 、呈s 使用修飾方法提供改善的抗衰敗性或改〇吸收。此修飾方法句紅/丨括例如磷酸甲硫醇酯鍵結、2，-〇- 甲基核糖核苦酸（料別曰^ 2，盼… 寸別疋在上述雙股分子的意義股上）、乙—脫氧—氟化合核糖接n， χ苷酉夂、2 -脫氧核糖核苷酸、，，通 2125-9924-PF；Susan 21 200920405 用驗土才亥苦酸、5, -C-甲基核⑭、及轉位的脫氧非驗基殘基併入⑽200601 22137)。在其他較佳實施例中，㈣方法可用於加強上述雙股分子的穩定度或增加其鎖定目^ 的效率。修飾方法包括在雙股分子的兩互補股間的化學鍵結’雙股分子中-股的…，端的化學修飾，糖基修飾、核鹼基修飾、及/或骨架修飾、2_氟修都後核糖核苦酸及2’ _脫氧核糖核苷酸（W〇2〇〇4/〇29212)。在其他較佳實施例中’修飾方法可用於增加或減少目標刚二的雙股分子間的互補枝答於鬥沾補 J立補核苷酸間的親和性 (W020G5/G44976)。例如，未修飾㈣核苦酸可由2_硫基、 5-炔基、5-甲基、《5—丙炔基㈣取代。而且，未修飾嘌呤可由7-脫氧吡咯（7_deza) ' 7_烷基、7 —烯基嘌呤取代。在其他較佳實施例中，當上述雙股分子為具有3，突出物的雙股分子時’此3,-端核普酸突出核菁酸可被脫氧核糖核苷酸取代（Elbashir SM et al·，Gene Dev 2〇〇1 Jan 15， 1 5(2):1 88-200 )。詳細部分可獲自公開文獻例如 US2006 0234970。本發明不限於這些實施例，任何已知的化學修飾方法皆可用於本發明的雙股分子，只要形成保留抑制目標基因表現能力的分子即可。而且’本發明的雙股分子可包含DNA與RNA兩者，如 dsD/R-NA或shD/R-NA。更詳細地說，DNA股與RNA股的雜父夕核苷酸或DNA-RNA鑲嵌的多核苷酸，顯示穩定度增加。DNA與RNA的混合，即由dNA股（多核苷酸）與RNa股（多核苷酸）構成的雜交型雙股分子、在任一或兩單股（多核苷 2125-9924-PF;Susan 22 200920405 ι)上包含DNA與RNA兩者自 ^ 形成以促進上述雙股分子…：又“子或類似物’可交體可Λ音ϋ 、穩疋度。DNA股與Ι?ΝΑ股的雜乂篮了為意義股為DNA，及音〜、義叙為RNA，或相反也可，只的活性/現該基因的細胞時，其真有抑制目標基因表現核苦酉^可。較佳為意義股多核苦酸為舰’反意義股多

…夂”、、RNA。又嵌合型雙股分子也可為意義股及反音義股兩股皆由DNA盥4 H _ 與讓構成，或者意義股及反意義股任- 月又職與RNA構成，只要在導入表現該基因的細胞時， =具有抑制目標基因表現的活性即可。為了促進上述雙股刀子的穩疋度’上述分子較佳包含越乡dna越好，然而為了誘導抑制目標基因表現，需要—範圍㈣m以誘導足夠的上述表現的抑制作用。上述雙股分子的上游部分區域即在意義股或反意義股内跨越目標序列或其互補序列的區域）為RNA，為鑲嵌型雙股分子的較佳實施例。上述上游部分區域較佳為意義股的5’端，及反意義股的3，端。在另一實施例中，跨越到意義股5，端及/或反意義股3，端的區域表示上游部分區域。即在較佳實施例中，跨越到反意義股3’端的區域、或跨越到一股5’端的區域及跨越到反思義股3’端的區域，由rNA構成。本發明的鑲嵌型或雜交型雙股分子包括例如下列的組合。意義股；5’ -[DNA]-3， 3’ _(RNA)-[DND]-5’ ：反意義股，意義股；5’ -(RNA)- [DNA]-3，以及 3’ -（RNA)-[DND]-5’ ：反意義股， 2125-9924-PF；Susan 23 200920405 意義股，5 -(RNA)- [Djy^]_g> 3’ -CRNA)-5’ ··反意義股。上述上游部分區域較佳為由上述雙股分子的意義股或反意義舣内’自上述目標基因端或其互補序列算來的Η3 個核普酸所構成的區域。上述鑲嵌型雙股分子的更佳實施例’包括具有19-21個核苷酸長度的雙股分子，其中上述多核苦酸的至少上述上游一半區域(意義股的5，端與反意義股的3’端)為RNA，另一半為舰。上述鑲嵌型雙股分子中，當反意義股完全為RNA時，抑制目標基因表現的效果更高（US20050004064)。本發明中，上述雙股分子可形成髮夹狀，例如短髮夹狀RNA(shRNA)及由DNA與RNA構成的短髮夾狀

(shD/R-NA)。上述 shRNA 或 shD/R-NA 為 RNA 序列或 RNA 與DNA的混合物，形成一緊實的短髮夾狀線圈彎，經由rna 干擾可使基因表現呈現靜止。上述shRNA或shD/R_NA包括在一單股上具有意義的目標序列及反意義的目標序列，其中上述序列由一線圈序列分隔。上述髮夾形狀結構通常由細胞機器切斷形成dsRNA或dsD/R-NA，然後連接到rna_ 誘導的靜止複合物（RNA-induced silencing complex. RISC)。此複合物連接至並切斷與dsRNA或dsD/R-NA的目標基因配對的mRNA。由任意的核苷酸序列構成的線圈結構可位於意義股與反意義股間’以形成髮夾狀線圈結構。因此本發明也提供一種雙股分子，具有式5，- [A]-[B]-[A，]-3’ ，其中[A] 2125-9924-PF；Susan 24 200920405 為包^括目標基因的意義股乜「A1S姑皮u LB」為插入單股’及[Α’ ]為包括L A」互補序列的反音盖机 _ 。上述目標序列可選自下列核苷酸目標序列，包括如核㈣ · SEQ ID NO：16 » SEQ ID N0:17為ΡΠΒ基因、核苷酸； SEQ ID N0:19 為 NAAUDL2 基因、核苦酸。本心月不限於這些貫施例，[a ]中的目標序列可由上述實施例形成修飾過的序歹卜只要其雙股分子保留抑制目標 PKIB與NAALADL2基因表現的能力即可。區域[A]#[A，] 雜交形成線圈，此線圈由[B]所構成。此插入的單股部份 [B]，即線圈序列，較佳可為3 —23個核苷酸長度。此線圈序列可選自例如由以下序列所構成的群組 (http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.htrnl)。而且’由23個核苷酸構成的線圈序列也提供活性 siRNACJacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896):435-8, Epub 2002 Jun 26)： CCC， CCACC，或 CCACACC (Jacque JM et al·， Nature 2002 Jul 25, 418(6896):435-8, Epub 2002 Jun 26)； UUCG (Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5):500-5; Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4):1639-44, Epub 2003 Feb 10); 以及 UUCAAGAGA (Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell 2125-9924-PF;Susan 25 200920405

Biol 2003 Jun， 4(6): 457-67)。本發明的具有髮夾狀線圈結構的較佳雙股分子例示如下。在下列結構中’線圈結構可選自AUG, CCC，UUCG，CCACC， CTCGAG, AAGCUU，CCACACC，及 UUCAAGAGA。然而，本發明不限於此： gauaugccaucccagauuu-[B]-aaaucugggauggcauauc(目標序列 SEQ ID NO: 16); gucaaauuccccaaauuaa-[B]-miaauuuggggaauuugac(目標序列 SEQ ID NO: 17);以及 guguccagaggccaauauu- [B]-aauauuggccucuggacac(目標序列 SEQ ID NO: 19)。而且，為了促進上述雙股分子的抑制活性，核苦酸” u”可加到目標序列的反意義股的3’端，作為3’端突出物。加入的” u”至少2個，通常為2-10個，較佳為 2-5個。加入的” u”在上述雙股分子的反意義股的3’端形成單股。製備上述雙股分子的方法不特別限定，但較佳使用習知的化學合成方法。根據化學合成方法，意義與反意義單股的多核苷酸分別合成，然後經過適當方法黏合，獲得雙股分子。黏合的特定例包括合成的單股多核苷酸以至少約 3 : 7莫耳比混合，較佳約4 : 6，最佳為實質上等莫耳數（即約5 : 5莫耳比）。其次，將此混合物加熱到雙股分子分離的溫度，然後逐漸冷卻。此黏合的雙股多核苷酸可由通常習知方法純化。純化方法例如包括使用洋菜膠電泳方法，或 2125-9924-PF;Susan 26 200920405 者選擇性移除/¾留的單股多核苷酸，例如以適當酵素分解。跨越PKIB或NAALADL2序列的調節序列可相同或相異’其表現可在時間或空間上各自被調整。上述雙股分子可在細胞間轉錄’藉由選殖PKIB或NAALADL2基因鑄模& 載體内’此載體包括如來自小核RNA(snRNA)U6或人Hi RNA 啟動子的RNA pol III轉錄本單元。包括該雙股分子的載體本發明也包括一載體，此載體包括一個或以上的上述雙股分子，本發明也包括一細胞，此細胞包括該載體。本發明的載體較佳編碼本發明的雙股分子的表現型。此述「表現型」意味此載體，當導入於細胞中時，將表現此分子。在較佳實施例中，此載體包括上述雙股分子表現所必須的調節因素。本發明的載體可用於製造本發明的雙股分子，或直接作為治療癌症的活性成分。本發明載體可經由例如選殖PKIB或NAAUDL2序列於表見載體内而裝造，因此調節序列以操作鍵結於⑴B或 NAALADL2序列上，使雙股皆能表現（經由繼分子# 錄）（Lee NS et al.， Nat Biotechnol 2002 May， 20 (5 ).500-5 )。例如，mRNA的反意義股的驗分子由第一啟動子（例如跨越選瘦的繼3，端的啟動子序列）轉錄，囊的意義股的職分子由第二啟動子（例如跨越選殖的 DN“端的啟動子序列)轉錄。此意義股與反意義股在生 =雜交’形成-雙股分子建構物，使此基因靜止。另 Λ %例中’兩载體建構物分別編碼上述雙股分子的意義 2125-9924-PF；Susan 27 200920405 股與反意義股’分別表現此意義股與反意義股，磬後形成一雙股分子建構物。再者，此選殖序列可編碼一具有次級結構（例如髮夾狀）的建構物，又可稱為，载體的單轉錄本包括目標基因“意義股與互補的反意義股。本發明的載體也可裝備，用以達到穩定插入目標細胞的基因庫中（Thomas KR & Capecchi MR， Cell 1987 51:503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors)。見 Wolff et al

Science 1990, 247:1465-8; US Patent Nos. 5,580,859； 5,589’466; 5, 804, 566; 5, 739, 1 18; 5,736,524; 5,679’647; WO 98/04720。DNA基礎的傳輸技術例如包括” 裸DNA 、主動（布皮費卡因（bupivicaine)、聚合物、肽媒介）運輸、陽離子脂肪複合物、及顆粒間接（“基因槍，，）或壓力間接傳輸（如美國專利案5,922,687)。本發明載體可為例如病毒或細菌載體。表現載體例如包括減弱的病毒宿主，例如疫苗或雞痘（如美國專利案 4, 722, 848)。此方法涉及疫苗病毒的使用，例如作為載體以表現編碼上述雙股分子的核苷酸序列。重組疫苗病毒在導入表現目標基因的細胞中上表現該分子，因此抑制細胞增殖。另一可用的載體例如BacilIe CaImette⑸打辻 (BCG)。BCG 載體描述於 stover et al.，Nature 1991， 351:456-60。其他許多載體有效於治療上投藥及上述雙股分子的製造；例如腺及腺相關病毒載體、腺病毒載體、沙氏桿菌（Salmonella tyPhi)載體、脫毒性炭疽熱毒素载 2125-9924-PF/Susan 28 200920405 體、或類•似載體（見 Sha;ta et al.，Mol Med Today 2000, 6:66-71; Shedlock et al.， J Leukoc Biol 2000, 68:793-806; Hipp et al., In vivo 2000, 14:571-85)= 使用上述雙股分子治療癌症的方法本發明中建構對PKIB的三種不同dsRNA，對NAALADL2

的三種不同dsRNA’用以測試抑制細胞生長的能力。對pKIB 的兩種dsRNA有效地剔除兩前列腺癌細胞株的基因表現，與抑制細胞增殖吻合（第3A、3B、3C圖）。對NAALADL2的一種dsRNA顯著減少前列腺細胞株的表現量及細胞生長 (第 4A-4E 圖）。因此，本發明提供抑制細胞生長的方法，即前列腺癌細胞的生長，藉由抑制pKIB或NAALADL2基因的表現，而誘導ΡΠΒ或NAALADL2基因失去功能。ρκΐΒ或隨肌2 基因的表現可由前述專一目標ΡΠΒ或隱胤2基因的本發明雙股分子抑制或由表現任何該雙股分子的本發明載體抑制》本么明的雙股分子及载體的抑制腫瘤細胞生長的能力表不其可用於治療癌症的方法。目此，本發明提供治療：列腺癌的方法，藉由投予抗PKIB或NAALADL2基因的又版刀子或表現此分子的載體，&方法不具副作用，因為基因難以被健康臟器偵測(第卜2圖）。此述特定抑制” „ j.- 的内文 -列，在抑制的多核普酸及多胜肽 “ 4、’制PKIB或NAALADL2生物功能或表現的勺月匕力。特定的抑制通常造成ΡΠΒ或 2125-9924-PF；Susan 29 200920405 ΜΑ·2表現的抑制作用（如轉錄或轉譯）或測量出的生物力把（如、田I生長或增殖、細胞死亡的抑制），較背景試驗至少2倍，較佳大於約10倍，更佳大於m倍。比較處理與未處理的細胞中，可測i表現量及/或生物功能，或者在處理前及後測量細胞族群量。在實施例中，PKIB或 NAALADL2基因的表現或生物功能是完全被抑制的。特定的抑制作用通常是使用適當的統計測試，在統計上有意義的減少PKIB或NAALADL2的表現或生物功能（如pg〇〇5)。本發明特別提出下列方法[丨]到[23]: [1]-種治療前列腺癌的方法，包括投予至少一種分離的雙股分子的步驟，此雙股分子抑制ρκΐΒ或MALADL2基因過度表現的細胞中冗“或NAALADL2的表現或抑制此細胞增殖’此雙股分子包括一意義股及與其互補之反意義股，彼此雜交形成雙股分子。

[2 ]如[1 ]的方法，其中該意義股包括一目標序列選自SEQ ID N0:16、 17、及 19。 [3 ]如[1 ]的方法，其中被治療的前列腺癌為荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。 [4] 如[1]的方法’其中投與多種上述雙股分子。 [5] 如[4]的方法，其中上述多種雙股分子目標相同基因。 [6 ]如[1 ]的方法，其中雙股分子具有約1 00個核苷酸以下的長度。 [7]如[6]的方法，其中雙股分子具有約75個核苷酸以下的長度。 2125-9924-PF；Susan 30 200920405 [8 ]如[7 ]的方法，t Α μ 的長度。 …a股分子芦有約50個核普酸以下 [9] 如[8]的方法，龙的長度。股分子具有約25個核苦酸以下 [10] 如[9]的方法，龙苷酸以下的長度。又股刀子具有約19個-約25個核 [11] 如[1]的方法，i 、中上述雙股&;士 θ 成，該多核苷酸包括Α 〇α 早一夕核苷酸構 [12] 如[11]的$〉去，入单股連接的意義股與反意義股。 5’ -U]-[B]-[A，卜3:其中上述雙股分子具有-般式其中[A]為一意義股，包括撰白 SEQ ID N0:16 > 17 . ^ ln 巴栝選自 19的序列，[B]為插入個核苷酸構成’及「Α， Ί法& 又宙d 23 rn] ]為包括[A]互補序列的反意義股。 []勺方法，其中上述雙股分子包括RNa。 [14] 如[1]的方法，甘+，其中上述雙股分子包括DNA及RNA。 [15] 如[14]的方法忐其中上述雙股分子包括DNA多核苷酸及RNA多核苷酸的雜交體。 [16] 如[15]的方法，其中意義股與反意義股分別構成應及 RNA。 [Π]如Π4]的方法，其中上述雙股分子為dna及的鑲嵌體。 [18]如[17]的方法，其中一區域跨越於反意義股3，端側，或一區域跨越於意義股5，端側及一區域跨越於反意義股3’端側’構成RNA。 [1 9 ]如[18 ]的方法，其中該側翼區域由9 — 1 3個核苷酸構 31 2125-9924-PF；Susan 200920405 成。 [2〇]如[1]的方法’其中上述雙瑕分子包括3，突 [21 ]如[1 ]的方法，其中上述 Γ99Ί ^Γ〇 Ί 乩又驭分子編碼於栽體内。 [22] 如[21]的方法，其中編碼於載·體内的雙般式5,侧Β]-[Α’卜3’，其中⑷為-意義股包: 、自SEQ ID Ν0:16、17、及19的序列，[Β]為插入單於個核《構成’及[Α’ ]為包括[Α]互補序列的二 [23] 如[1]的方法，其中上述雙股 , 0 3於—組合物中，此組合物包括上述分子外，_ 醫藥可容許載劑。㈣-促進劑及本發明方法將於下詳細說明。經由使表現ΡΠΒ或NAALADL2基因的細胞，與抗㈣或NAALADL2基因的雙股分子接觸、舆表丹衣現此分子的載體接、或與包含此雙股分子或此載體的紐合物接觸，造成抑此細胞生長。此細胞更進-步與轉移感染劑接觸。適當的轉移感染劑為習知。此述「細胞生長一 < 一田 . 』」一,表示細 :以非常低的速_或細胞具有減少的存活率，相較於未暴露於此分子的細胞 '細胞的生長可由習知方法測量，例如使用MTT細胞增殖分析法。任何細胞生長皆可根據本發明方法受到抑制，只要此 '、田胞表現或過度表現本發明雙股分子的目標基因即可。此細胞例如前列腺癌細胞。因此，遭受PKIB或NAALADL2相關疾病的患者或危險 2125-9924-PF；Susan 32 200920405 明的雙股分子/至少一種表或至少一種包括至少一個上 ’前列腺癌患者可根據本發準方法鑑定’根據診斷的腫群’可藉由投予至少一種本聲現至少一個上述分子的載體、述分子的組合物而治療。例如明方法治療。癌症種類可由標瘤〜之類型。珂列腺癌可經由例如前列腺特定抗體 (prostate-specific antigen; psA)或數位直腸檢查而診斷。由本發明方法治療的患者較佳經過RT-PCR或免疫分析患者，由組織切片檢查偵測ρκΐβ或MALADL2表現而篩選。較佳在以本發明方法治療前，以f知方法確認來自個體的組織切片中ΡΠΒ或NAALADL2基因過度表現’此習知方法料如免疫組織化學分析或RT_PCr。根據本發明方法抑制細胞生長而因此治療癌症，當投予多種雙股A + (或纟現載體《包括&分子或載體的組合物）時，每一分子可針對ΡΠΒ及/或NAALADL2的相同目標序列，或不同目標序列。例如此方法使用雙股分子針對或NAALADL2。或者，此方法可使用雙股分子針對一種、兩種或以上的目標序列選自ΡΚΙΒ及NAALADL2。關於抑制細胞生長，本發明的雙股分子可以使此分子與對應的mRNA轉錄連接的型態，直接導入細胞中。另一實施例中，如上述編碼此雙股分子的關A可以載體型式導入細胞中。關於導入雙股分子及载體於細胞中，轉移感染促進劑可使用例如FuGENE (Rochediagnostices)、脂轉移感染素（Lipofect am in 2000)(1 nvitrogen)、募轉移感染素 (Oligofectamine)Unvitrogen)、及核轉移感染因子 2125-9924-PF;Susan 33 200920405 (Ni^cleofactor) (Waka pure Chemical)。當治療造成臨床上優勢，例如PKIB或MALADL2基因表現減少、或個體内的腫瘤體積減少、分布減少、或轉移潛力降低，則此治療可確認是有效的。當此治·療是預防性質，有效代表其阻止或預防腫瘤形成或預防或減輕癌症臨床症狀。有效性的確認與習知方法診斷或治療特定癌症型態有關。預防包括任何降低疾病的死亡或致病率的活動可發生在’-級、二級、三級預防程度，，。—級預防可避免疾病的發展，二級與三級預防包含針對疾病進展的預防、及症狀出現的預防、及減輕已存在疾病的副作用，藉由恢復功能及減輕疾病相關的併發症。或者，㈣可包括大範圍的預防治療，針對減輕料疾病的嚴純，例如減少腫瘤增殖及轉移 '減少血管新生。治療及/或癌症預防、以及術後復發的預防包括以下步驟，例如手術移除腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長、_退化或衰退、誘發腫瘤發生的緩和與抑制、及轉移減少或抑制。有效地治療及/或癌症預防降低死千亚改善罹癌個體的預後、降低血液中腫瘤標記漠度觀察症狀。 &舒_症件隨的可一 1 不 «1KINAC PK IR ；眶編麻㈣丨量數量。受㈣任何學· 相信本發明的雙股分子以催化形式造成目二

少。因此’相較於標準的癌症治療，顯著較少的雙股分Z 2125-9924-PF;Susan 34 200920405 需要傳輸到腫瘤位置上或附近，以發揮^冶療效果。熟知此技術之人士可輕易確認本發明雙股分子投與個體的有效量，考量因素例如體重、年齡、性別、疾病種類、症狀及個體的其他條件、投藥路徑、是否為局部或合成。本發明的雙股分子的有效量通常包括在腫瘤位置上或附近的細胞内濃度為約ΙηΜ-約 100nM，較佳為約以卜約5〇nM，更佳為約2. 5nM-約ι〇ηΜ。經慎重考量後，也可投與較高戋較低的雙股分子劑量。本發明可用於抑制癌症生長或轉移，例如前列腺癌，特別是荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。特別是包括PKIB目標序列（即SEQ iD _:16與1?) 的雙股分子特別適於前列腺癌的治療；包括NAAUDL2目標序列（即SEQ ID N〇 : 1 9)的雙股分子特別適於前列腺癌的治療。關於癌症治療，本發明的雙股分子也可與不同於此雙股分子的帛劑組合投與個冑H，本發明的雙股分子；與其他設計用於治療癌症的治療方法組合投與個體。例如本發明雙股分子可與目前採用治療癌症或預防癌症轉移的治療方法（例如放射治療、手術及化療，使用順麵 (dsplahn)、卡翻（carb〇platin)、環硫酸胺 (cyclophosphamide)、5-氟尿嘧啶（5_flu〇r〇uracU)、艾卓徽素（adri amy c in)、道嗓 .. w退11右紅囷素（daunorubicin)或塔莫克辛分（tamoxifen))組合投藥。本發明中，雙股分子可為裸雙股分子與傳輸試劑結合 2125-9924-PF;Susan 35 200920405 •.技與，或為秀現此雙股分子的重組質體或病毒載體投藥。與本發明雙股分子結合投藥的適當傳輸試劑包括親脂性試劑（Mirus Transit ΤΚ0®)、脂感染素（lipofectin)、脂轉移感染素（lipofeci:amin)、細胞感染•去 (cellfectin)、或聚陽離子（如聚賴胺酸）、或微脂體。較佳傳輸試劑為微脂體。微脂體可幫助雙股分子傳輸到特定組織，例如前列腺腫瘤組織’並可增加雙股分子在血液中的半生期。適用於本發明的微脂體由標準載體形成脂質所形成，通常包括帶中性或負電的碟脂質及固醇’例如膽固醇。脂質的選擇通常考慮例如所希望的微脂體體積及在血液中的半生期等因素而決定。製備微脂體已知有多種方法（例如Szoka e1： al.， Ann Rev Biophys Bioeng 1 980, 9:467； US Pat. No 4, 235, 87卜 4, 501，728、4, 837, 028、5, 01 9, 369)。包覆本發明雙股分子的微脂體較佳包括配位體分子， t 可傳輸此微脂體到腫瘤位置。配位子較佳為連接於受體、普遍於腫瘤或血管内皮細胞中者，例如連接腫瘤抗原或内皮細胞表面抗原的單株抗體。包覆本發明雙股分子的微脂體更佳經過修飾、改良，用以避免被單核巨噬細胞及網狀内皮系統清除，例如具有调理-抑制作用部位（0psonizati〇n-inhibition moiety) 連接於此結構表面。一實施例中’本發明的微脂體包括調理-抑制作用部位（0pS〇niZation-inhibition moiety)及配位體兩者。 2125-9924-PF;Susan 36 200920405 用於製備本發明微脂體的調理-抑制伟用部分 (opsonization-inhibition moiety)通常為大的親水性聚合物，連接於微脂體表面。如此述調理-抑制作用部分是，，連接”於微脂i膜’當其化學上或物理上附著於膜上，例如藉由脂溶性錨插入其膜或藉由直接連接於膜脂質的活性官能基上。此調理-抑制親水性聚合物形成一保護表層，明顯減少此微脂體被巨噬細胞單核球系統 (macrophage-monocyte system; MMS)及網狀内皮系統 (reticuloendothelial system; RES)吸收，例如美國專利案4, 920’ 016所述。以調理-抑制作用部分修飾的微脂體因此存留在循環系統中更長，相較於未修飾者。因此，此種微脂體有時稱為”鬼祟，，微脂體。鬼祟微脂體已知聚集在組織，由多孔的或，，漏出的” 微血$供給。因此，具有此種微血管缺陷（例如固體腫瘤）特徵的目標組織，將有效聚集這些微脂體（見Gabiz⑽紂 al. ’ Proc Natl Acad Sci USA 1 988，1 8:6949-53)。而且， RES吸收降低會降低鬼祟㈣體的毒性，因為避免其明顯聚集在肝及脾。因此，以調理_抑制作用部分修飾的本發明微脂體可傳輸本發明的雙股分子到腫瘤細胞。適合修飾微脂體的調理—抑制作用部分較佳為水溶性聚合物’具有分子量約5嶋"40, 0_a，較佳為約誦a—約2U_a。此聚合物包括聚乙二醇（pEG)或聚丙

二醉（PPG)衍生物’例如曱氧基PEG或PPG、及PEG或PPG 硬脂酸酯；合成的聚合物例如铲刃例如t丙烯醯胺或聚-N-乙烯批咯 2125-9924-PF；Susan 37 200920405 酮；直鏈、分支鏈：或樹枝狀分子的聚醯胺-胺 (polyamidoamine)、聚丙烯酸；聚醇，例如聚乙烯醇及聚木糖醇的羧基或胺基化學鍵結，及神經結醣脂，例如神經結醣脂（GM· sub· 1 )。PEG、甲氧基peg、或甲氧基ppg的共聚物或其衍生物也適合。而且，調理—抑制作用聚合物可為PEG與聚胺基酸、聚醣、聚醯聚乙二胺的嵌段共聚物、或者PEG與多核苷酸的嵌段共聚物。調理-抑制作用聚合物也可為天然的聚醣，含有胺基酸或羧酸’例如半乳糖醛酸、醛糖酸、甘露糖醛酸、玻尿酸、果膠酸、神經胺酸、藻酸、鹿角膠；胺化的聚醣或寡糖（直鏈或支鏈）；或羧基化聚醣或寡糖，例如與碳酸衍生物作用，與羧基鍵結。調理-抑制作用部分較佳微PEG、ppG、或其衍生物。以PEG或PEG-衍生物修飾的微脂體有時稱為” pEG化微脂體，，。调理-抑制作用部分可經任何習知技術連接到微脂體膜。例如PEG的N-羥基琥珀醯亞胺酯可連接到磷脂醯—乙醇胺月曰溶)·生1¾ ’然後連接到膜。同樣地，帛聚糖聚合物可由硬脂酸胺脂溶性錨衍生，經由Na(CN)BH_ Sub· 3及溶劑匕5物的還原性胺化作用例如四氫呋喃與水以3 〇 : 1 2比例在60t：作用。表現本發明雙股分子的載體如上所述。此表現至少一個本發明雙股分子的載體也可直接投藥，或與適當傳輸試 '、’、5投藥包括親脂性試劑（Mirus Transi t ΤΚ0®)、脂 38 2125-9924-PF；Susan 200920405 感染素（Upofectin)、脂轉移感染素（Hp〇fectamin)、細胞感染素（cell feet in)、或聚陽離子（如聚賴胺酸）、或微脂體。傳輸重組病毒載體的方法，在患者癌症位置表現本發明雙股分子，為習知方^。本發明雙股分子可經任何適於傳輸此雙股分子到癌症位置的方法投藥。例如，此雙股分子可經由基因搶（代此 2仙）、電極通透法（616(：1;1_〇1)〇]^以〇11)，或其他適當皮下或腸内投藥路徑。適當的腸内投藥路徑包括口、直腸、或鼻内傳輪。適當的皮下投藥路徑包括血管内投藥（例如靜脈内注射、靜脈内注入、動脈内注射、動脈内注入、及導管插入血管系組織間及組織内注射（例如腫瘤間及腫瘤内注射）；皮下注射或儲存物包括皮下注入（例如滲透繁浦）；直接投予癌症位置或其附近，例如使用導管或其他替代裝置 (例如輔助物或植入物包括多孔、無孔或膠狀材料)及吸入器。較佳為此雙股分子或載體的注射或注入在癌症位置或本發明的雙股分子可以單劑或多劑投藥。當以注入方式投藥本發明雙股分子時，此注入可為單持續劑或以多重 2入1專輸。直餘射此劑在癌症位置或其附近的組織為土。夕重注射此劑在癌症位置或其附近的組織更佳。熟知此項技術者亦可輕易確定適當劑 ΓΓ明雙股分子。例如可-次投予個體本發明雙= 子’例如單注射或儲存在癌症位置或其附近。或者，一天 2l25-9924-PF；Susan 39 200920405 —次或兩次、間隔芍3—約28天投〃予個體本發明雙股八 ^ 了較佳為約7天-約1 〇天。較佳的劑量療程中，一壬穴一次、持續七天注射在癌症位置或其附近。雖然劑量療程可~入多重投藥，應了解投藥此雙股分子的有效量可包括_ _ ^·樂總量在整個劑量療程以上。包括該雙股分子的組合物本發明更提供醫藥組成物，包括至少一種本路十好％的雙股分子或編碼此分子的載體。本發明具體地提供 A卜組合物[1]-[23] ·· [1 ] 一種治療前列腺癌的組合物，包括至少一箱置々里早離的雙股分子’此雙股分子抑制PKIB或NAALADL2基因表現或抑制此細胞增殖，此雙股分子包括一意義股與其互補之反^ 1 股，彼此雜交形成雙股分子。 ~ [2] 如[1]的組合物，其中該意義股包括一標你斤列選自SE〇 ID N0:16 、 17 、及 19 。 [3] 如⑴的組合物，纟中被治療的前列腺癌為荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。 “ [4] 如[1]的組合物’其中組合物包括多夕樘上述雙股分子。 [5] 如⑷的組合物，其中上述多種雙股分子目標相同基因。土 [6 ]如[1 ]的組合物’其中雙股分子呈有 "有約100個核苷酸以下的長度。 [7 ]如[6 ]的組合物，其中雙股分子刀于具有約75個核苷酸以下的長度。 2125-9924-PF;Susan 40 200920405 [8 ]如[7 ]的組合物下的長度。 [9 ]如[8 ]的組合物下的長度。其中雙股分子具有約其中雙股分子具有約 5 0個核苷酸以 2 5個核苷酸以 [1 0 ]如[9 ]的組合物，個核苷酸以下的長度。 [11 ]如[1 ]的組合物，構成，該多核苷酸包括股。約25 其中雙股分子具有、約19個_ 其中上述雙股分子由單-多核誓酸由插入單料接的意義股與反意義 [，12]如[11]的組合物…上述雙股分子具有一般式 5 -[A]-[B]-[A，]-3’ ，其中「A]A —备 μ U]為—意義股，包括選自卿IDN〇:16、17、及19的序列，[Β]為插入單股，由3 23 個核苦酸構成，及U，]為包括[A]互補序列的反意義股。 [13] 如[1]的組合物，其中上述雙股分子包括rna。 [14] 如[丨]的組合物，其中上述雙股分子包括rna。 [15] 如[14]的組合物，其中上述雙股分子包括多核苷酸及RNA多核苷酸的雜交體。 [1 6 ]如[1 5 ]的組合物，其中意義股與反意義股分別構成 DNA 及 RNA 。 [17] 如[14]的組合物，其中上述雙股分子為MA及rna 的嵌合體。 [18] 如[17]的組合物’其中一區域跨越於反意義股3’端側’或一區域跨越於意義股5 ’端側及一區域跨越於反意義股3’端側，構成RNA。 2125-9924-PF;Susan 41 200920405 [19]如[18]的組合物，其中•該侧翼區域由& 構成。 1 3個核苷酸 [20] 如[1]的組合物，其中上述雙股分子包括， [21] 如[1]的組合物，其中上述雙股分子 3突出處編碼於栽體内，而包括在上述組合物中間如[21]的組合物，其中編褐於載體内一般式5,侧—[B]-[A，卜3,，其中[A]為具有括選自SEQ ID NO : 16 ' Π、及〗q沾皮％、義股，包及丄9的序列，[B] 由3-23個核苷酸構成，及[A，] 入早股，義股。」顸序列的反意 [2 3 ]如[1 ]的組合物，其中〒上述組合物包括轉劑及醫藥可容許載劑。抄以木促進本發明方法將於下詳細說明。本發明的雙股分子較佳在投又樂則根據習知方法調配成醫樂組合物。本發明的醫藥& ㊣樂組合物特徵為至少無菌及無致病源。此述，，醫藥配方”包括括人與被醫使用的配方。製備本發明的醫藥組合物為習知方法（例如 Remington’ s

Pharmaceutical Science 17th , ’ erd., Mack Publishing

Company, Easton， Pa. (1985))。本發明的醫藥配方包括至少一種雙股分子或編碼此分子的載體（例如〇_ HO重量％) ’或此分子的生理容許鹽，與生理容許載體培地混合。較佳的生理容許載體培地為水、緩衝水、正常生理食鹽水、〇 4%生理食鹽水、〇· 3%甘胺酸、玻尿酸等。 2125-9924-PF;Susan 42 200920405 根據本發明，此組合物可包括多種雙股分子，每—分子針對ΡΚΙΒ及/或NAALADL2的相同目標序列，或不同目標序列。例如此組合物可包括雙股分子針對 ΡΚΐβ戈 NAALADL2。或者，此組合物可包括雙股分子針•·對一種、兩種或以上的目標序列選自ΡΚΙΒ及NAALADL2。本發明更包括編碼一種或多種雙股分子的載體。例如，此載體可編碼一種、兩種或多種本發明雙股分子。戈者，本發明組合物可包含多種載體，每一載體編碼不同的雙股分子。股匕W奴匕多且^ 物中。微脂體詳細見於，，使用雙股分子治療癌症的方法，，敛述。本發明的醫藥組合物也可包括習知的醫藥助劑及/_ 添加劑。適當的醫藥助劑包括穩定劑、抗氧化劑、調節劑、緩衝液、及ρΗ調節劑。滷冬 p m逋®的添加劑包括生理相容緩衝液（例如tromethamine 1 j 添加螯合劑（例如 DTPA、DTPA-雙醯胺）或鈣螯合 1如发σ劑硬合物（例如CaDTPA、 CaNaDTPA-雙醯胺）、或 # ^ a 擇性添加鈣鹽或鈉鹽（鈣、敗血酸鈣、糖基鈣或乳氯化 ^ 4孔馱鈣）。本發明包裝液態使用或冷凍乾燥。面罙、、且σ物可固體組合物而言，可使用習知無毒藥等級的甘露糖醇、乳糖、 —4，例如醫石、纖維素、葡萄糖、嚴糖、碳酸鎂等。糖_、滑例如，口服的固體醫藥組合物可包括任何上述载劑及 2125-9924-PF；Susan 43 200920405 助劑以=1〇_95%的本發明雙股分子’較•佳為25_75%。养溶少、醫藥、，且合物（吸入型）投藥包括0. 0卜20重量％，較佳 1-10 重量％的_ 々 ·. 、或夕種本發明雙股分子，包覆在上述微脂、及推進物。載劑也可視需要包括如卵磷脂於鼻内傳輸。除上过L夕卜，. 本發明組合物可包括其他醫藥活性成分， /、要其不抑制本發明雙股分子的生體内功能即可。例如此組σ物可包括習知用於治療癌症的化療劑。另 _ 督 —霄施例中，本發明也提供本發明雙股分子的使用在氣造醫藥組合物用以治療表現？1(^及/或NAALADL2 基因的癌症。办丨丨L ,. 例如，本發明關於雙股核酸分子的使用，抑制細胞内Ώ / ,、及/或NAALADL2基因的表現，此分子包括一意義股及虚_盆7^$ _ ^ /、/、互補之反意義股，彼此雜交形成雙股核酸分子目^選自SEQ ID N0:16、17、及19的序列，以製造商藥組合物治療表現PKIB及/或NAALADL2基因的癌症。或者，本發明更提供一種製造醫藥組合物的方法或過程，用以 '冶療表現PKIB及/或NAALADL2基因的癌症，其中去或過程包括調配醫藥或生理容許載劑與雙股核酸分子的V驟，此雙股分子抑制細胞内PKIB及/或NAALADL2基因的表現’此分子包括一意義股及與其互補之反意義股，彼此雜父形成雙股核酸分子，目標選自SEQ ID NO : 1 6、1 7、及19的序列’此分子作為活性成分。另 —^ —貫施例中’本發明更提供一種製造醫藥組合物的方法或過程’用以治療表現PKIB及/或NAALADL2基因的癌 2125-9924-PP;Susan 44 200920405 β症，其中此方^法或過程包括混合活性成分與醫藥或生理容許載劑的步驟，其中此活性成分為雙股核酸分子，抑制細胞内PKIB及/或NAALADL2基因的表現，此分子包括一意義股及與其互補之反意義股，彼此雜交形成雙股核酸分i·.，目標選自SEQ ID N0:16、17、及19的序列。或者，根據本發明，提供本發明的雙股分子的使用於製造醫藥組合物，治療前列腺癌。本發明更提供雙股分子以治療前列腺癌。診斷前列腺癌的方法 ΡΠΒ或NMLADL2的表現被發現在前列腺腫瘤細胞中特定地升高 uu、1b、1c、1d'1e、1f、2Al0 此，此基因的鑑定及其轉錄與轉譯產物發現具有用途，作為前列腺癌的標記物’並藉由測量細胞樣本中PKIB或的表現，診斷前列腺癌。本發明特別提供-種診 pm括確認個體内ΡΠΒ或NAALADL2的 !現量。由此方法診斷的前列腺癌包括荷爾蒙治療益效的别列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。果Γ發法可提供確認個體條件的—初步或中途結 :。::步或中途結果可與其他資料組合，幫助醫師'嘆測來自個體組織中的腫巧俱此疾病。杈彳，、醫師有效資訊以診斷本發明特別提供以下方法 [ί]-診斷或僧測前列腺癌存在的方法，包括 2125-9924~PF；Susan 45 200920405 ΡΚIB或NAALADL2胺基酸序列的基 #· (3 ) <貞測生物樣本中編碼因的表現量；及 (b)與前增加者。列腺癌基因的正常控制程度相比，符合表現程度 [][]的H纟中此表現程度較正常控制程度高至少 10%。 [3 ]如[2 ]的方法偵測：其中此表現程度由選自以下任一種方法 U)積測包括ΡΠΒ或NAALADL2序列的mRNA; (b)偵測包括PKIB或NAAUDL2胺基酸序列的蛋白質；以及貞測包括PKIB或NAALADL2胺基酸序列的蛋白f的生物活性。 [4]如[1]的方法’其中前列腺癌為荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。 [5 ]如[3 ]的方法’其中以偵測探針與此基因的轉錄本雜交確定此表現程度。 [6] 如[3]的方法，其中以編碼基因的蛋白質作為此基因的表見里偵測對抗此蛋白質的抗體連接，確認此表現程度。 [7] 如[1]的方法，其中該生物樣本包括切片組織、唾液、丘液或尿液。 [8 ]如[1 ]的方法，其中該來自個體的生物樣本包括上皮細胞。 [9 ]如[1 ]的方法，其中該來自個體的生物樣本包括腫瘤細胞0 2125-9924-Pf,-Susan 46 200920405 該來自個體％生物樣本包括腫瘤上 [10]如U]的方法，其中皮細胞。 /斷或偵測刚列腺癌存在的方法將更詳細說明如下。由本發明方法診斷的個體較佳為哺乳類。哺乳類包括非人的靈長類、小鼠、大鼠、狗1、馬及牛，但不限於此。車乂佳荒集來自需診斷的個體的生物樣本進行診斷。任何生物材料皆可作為生物樣本進行確認，只要其包括具體的PKIB或NAALADL2轉錄或轉譯產物。生物樣本包括體組織及體液’如血、唾液及尿液’但不限於此。該生物樣本較佳包括内皮細胞的細胞群，更佳包括癌的上皮細胞或來自懷疑為癌症的前列腺組織的上皮細胞。或視需要，更可將所得的體組織及體液純化出此細胞，然後作為生物樣本。根據本發明，確認來自個體的生物樣本中PKIB或 NAALADL2的表現量。此表現量可使用f知方法，確認為轉錄（核酸）產物濃度。例如ΡΚΙβ* NAAUDL2的mRNA可使用探針經雜交方法（如北方雜交方法）定量。此债測可在晶片或陣列上進行。較佳使用陣列偵測多種基因表現量（如不同的癌症特定基因），包括PKIB4 NAAUDL2。熟知該項技術者可利用 PKIB 的資訊（SEQ ID NO. : 1 ; GenBank accessiQn number:NM_1 81 795)或 NAALADL2 的資訊（SEQ ID N〇. :3;

GenBank accession numberJM一207015 或 SEQ Π) NO· .5 ;

GenBank accession number :AK021 754)，製造探針。例如 PKIB或NAALADL2的cDNA可作為探針。此探針可視需要適 2125-9924-PF;Susan 47 200920405 ^ ^ 例如染色、螢光染色及同位素定位，以此雜交標記的強度，偵測此基因表現量。而且，可使用放大基礎偵測方法（如RT_PCR)，以引子定量PKIB或NAALADL2的轉錄產物。此引子亦可以可^得的基因資訊製造。例如實施例中的引子（SEQ ID N0. :8-15)可用於以RT_PCR或北方點潰法價測’但本發明不限於此。特別地是，本發明方法所使用的探針或引子在嚴格條件、中度嚴格條件、或低度嚴格條件下，雜交ρκΐβ或 NAALADL2的mRNA。此述”嚴格（雜交）條件”表示在探針或引子雜交其目標基因、但不雜交其他序列的條件。嚴格條件是根據序列而定，在不同環境下則不同。通常嚴格條件的溫度選擇低於特定序列的熱沸點(Tm)約5。。，在定義的離子強度與PH中。在定義的離子強度、邱及核酸濃度下， Tm為互補於目標序列的探針5()%與目標序列雜交的平衡狀態下的溫度。由於目標序列通常過量存在，在^時探針以平衡狀態存在。嚴格條件通常鹽的濃度低於約⑽ 鈉離子，通常為系勺0.01 —L納離子（或其他鹽;在 PH7.0-8.3’溫度在至少約啊對短探針或引子（如個核普酸），及至少約60t對較長探針或引子。也可添加脫穩定劑如甲醯胺達到嚴格條件。〜σ 或者，可價測轉譯產物作為本發明的偵測。例如，認ΡΚΙΒ或NAALADL2蛋白質的量。_ 裡作马轉澤產物的白質的定量方法，包括免疫分析法災用将異辨識ΡΚΙΒ NAALADL2蛋白質的抗體。此抗體可為單株或多株。而 2125-9924-PF;Susan 48 200920405 抗體的任何片段威修飾（例如嵌合抗體、scFv、Fab、 FUb，）2、Fv等）可用於此偵測，只要此片段保留連接ρκιβ 或NAALADL2蛋白質的能力即可。製備這些抗體用以偵測蛋白質的方法為習知，任何方法皆可用於本發明以製造此抗體及其相同物質。連接PKIB的抗體較佳由包括 SARAGRRNALPDIQSSAATD (SEQ ID N〇:33)或 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK (SEQ ID no:%)胺基酸序列的抗原決定部位胜肽製造。而連接NAALADL2的抗體由包括細胞外區域（SEQ ID NO :32)的抗原決定部位胜肽製造。其他偵測PKIB或NAALADL2基因表現量的方法，根據其轉譯產物，使用抗PKIB或NAALADL2蛋白質的抗體經由免疫組織化學分析觀察染色強度。換言之，觀察到高染色者，表示該蛋白質的存在，且同時PKIB或NAAUDL2基因呈現南表現量。除了 PKIB或NAALADL2基因的表現量外，其他癌症相關基因的表現量，例如已知在前列腺癌中分化表現的基因，也可被確認而改善診斷的正確性。當表現在PKIB或NAALADL2的控制程度以上例如增加 10/、25%或50%時，或增加1.1倍以上、1.5倍以上倍以上、5. 0以上、10. 〇倍以上、或更多時，生物樣本中 ΡΠΒ或NAALADL2基因表現量可被認為是增加。忒控制程度可認為是先前由已知為疾病狀態的個體中蒐集及儲存的樣本所製成的測試生物樣本的同時。或者，此控制程度可由統計方法，根據分析之前由已知疾病狀態 49 2125-9924-PF；Susan 200920405 ^固《本中已相的PKIB或NAAUdu基因表現量而確能的t控制私度可進—步為之前測試細胞所建構的表現型料庫。根據本發明方面’生物樣本中…或胤胤2基因更進—步與多重控制程度比較，此多重㈣ =度由多個參考樣本所確認。較佳使用來自類似患者生物仏本的組織型態所得的參考樣本，所確認的控制程度。而且’較佳使用ΡΠΒ或NAA魔2基因的表現量在已知疾病狀態的群體中的標準值。此標準值可由任何習知方法獲例如平均標準差±2SD•、或平均標準差挪上可作為標準差。本發明中，由已知㈣症狀態的生物樣本所確認的控制程度，稱為”常態控制程度，，。另一方面，如果此控制程度是由癌症生物樣本所確認，則稱為”隸控制程度。 «相較於申態控制程度或相似於癌症控制程度相比，或NAALADL2基因的表現量增加，則該個體被診斷為正罹患癌症或為危險群。再者，#比較多重癌症相關基因的表現里％ ’樣本與癌症參考物的基因表現型態相似時，表不該樣本正罹患癌症或為危險群。測4生物樣本的表現量與控制程度間的差異，可常熊化成控制核酸的表現量，例如基本基因的表現量已知在：症或非癌症狀態的細胞中不會有差異。控制基因列如石、肌動蛋白、甘油醛3磷酸脫氫酶、及核糖體蛋白ρι 限於此。不抗前列腺癌化合物的篩選 2125-9924-PF;Susan 50 200920405 為任何包括:：:S忍的试劑’透過目前的篩選方法，可發明筛選方法，暴：合物或組合物。而1，根據本 .^ 暴路於細胞或蛋白質的試劑，可A& 合物或組合的 2 了為早劑化口的化合物。當本方法使用化合物可A分，=— 』化〇物時，此為依順序接觸或同時接觸。任何試劑，例如細胞萃取、細胞峰物甚札 > 食上’貧，夜、發酵微、海洋微生物萃取物、植物萃取物糙蛋白皙、日4 U u ，电化的或粗、肽、非胜肽化合物、合成的微分子化合物（勺括核酸建構物，例如反意義股_、祕、核酶等）、：及天然化合物，可用於本發明的筛選方法。本發明的試劑也可獲自任何多種方法與習知資料庫方法組合，包括⑴ 生物資料庫、（2)可網址搜尋、並行的固體或液體資料庫、 (3)需要不旋轉的合成資料庫、（4)” 一珠一化合物，，資料庫、及（5)使用親和性化學分析法選擇的合成資料庫。使用親和性化學分析法選擇的生物資料庫，限於胜肽資料庫，其他四種方法則皆可用於胜肽、非胜肽寡體、或化合物的小分子庫（Lam, An tic an cer Drug Des 1997，12:145-67)。分子資料庫的合成方法例可由先前文獻中找到（DeWi al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13; Erb et al·， Proc Natl Acad Sci USA 1994， 91:11422-6；

Zuckermann et al., J Med Chem 37:2678-85, 1994； Cho et al., Science 1993, 261:1303-5; Carell etal., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33:2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33:2061; Gallop et al., J Med 2125-9924-PF;Susan 51 200920405 ' Chem 1 994，37 : j 23J3-51)。化合物資料庫可存在溶液（見

Houghten，Bio/Techniques 1 992，13:412-21)或存在珠中 (Lam, Nature 1991， 354:82-4)，存在晶片中（Fodor， Natyre 1 993, 364:55-6) ’ 存在細菌中（US Pat. No. 5,233,409 ) ’ 存在孢子中（US Pat. No. 5, 571, 698; 5, 403, 484，及 5, 223, 409)，存在質體中（Cull etal.， Proc Natl Acad Sci USA 1992，89:1865-9)或噬菌體中 , (Scott and Smith, Science 1990, 249:386-90; Devlin, Science 1 990, 249:404-6； Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87:6378-82: Felici, J Mol Biol 1991, 222:301-10;美國專利申請案 2002103360)。由本發明篩選方法所篩選的一部分化合結構，由增加、缺少及/或取代而轉變，此化合物也包括於本發明篩選方法所確認的試劑。而且當測試試劑為蛋白質，為獲得DNA編碼蛋白質，可確抑整個蛋白貝胺基酸序列以追溯編碼此蛋白質的核酸序列，或分析所得蛋白質的部分胺基酸序列，以根據該序列製造募DNA探針，並以此探針篩選cDM基因庫，獲得編碼此蛋白質的DNA。Λ制、A -r & 在I 可治療或預防癌症的候選試劑中，確認所得DNA。、可用於此述篩選的試劑也可為抗體’特定連接於PKIf 或NAALADL2蛋白當$甘★ 男戍其。P分胜肽，此蛋白質或其部分胜肽在生體内缺少原始蛋白質的生物活性。雖…"式^建構物為習知，以下提供確認試劑及在本發 2125-9924-PF;Susan 52 200920405 明篩選方法中此試劑資料座科厍的建構的額外指導。 (i )分子模型由已知性質搜尋的化合物 J 77于結構知識，及/或欲拙制的目標分子結構，即ρΚίΒ 戈人抑 NAALAJ)L2 ’有助於試劑資料庫的建構。預先篩選的試劍、& ' 幻A劑適合進一步評估的方法為雷月模擬試劑與目標間的作用。 ” ' 電腦模擬技術使選擇分早& _ 疋禪刀子的二度空間原子結構及新化合物的空間設計變成可見的，鉍几人& & _ 兄的，新化合物的空間設計會與該分子作用。三度空間構造通當县 ' 丹k m Τ疋根據選擇分子的χ射士晶分析或麵圖形。此分子動態需要力場數據。電腦製'圖糸統可預測新化合物如何遠技.於曰碎八工又1 !遷接於目私分子，以及試驗性調整化合物的結構與目標分子以進行連接專—性。當分子— 化合物的其一或兩者有小改變，需要分子機制軟體及計算強度電腦，預測分子-化合物如何交互作用通常與分子設計程式及使用者間有利於使用者、選單驅動界面有關。上述分子模擬系統例如包括CHARMm及QUANTA程式 (Polygen Corporation, Waltham, Mass.)。CHARMm 進行说量最小化及分子動態功能。qUANTA進行分子結構的建構、圖形模擬及分析。qUANTA允許分子監彼此行為的交互作用的建構、修飾、可見化、及分析。許多文章閱覽藥劑與特定蛋白質的交互作用的電腦模 Μ(例如 Rotivinen et al·, Acta Pharmaceutica Fennica !988, 97:159-66； Ripka, New Scientist 1988, 54-8； ^cKlinlay & Rossmann, Ann Rev Phamacol Toxiciol 1989, 2l25-9924-PF;Susan 53 200920405 29:1 1 1 -22； Perry & Dav i es,.. Prog Clin Biol Res 1 989, 291:1 89-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1 989, 236: 1 25-40， 141-62)以及關於核酸成分的模型受器 (Askew et al.， J Am Chem Soc 1989， 111:1082-90)。其他電腦程式篩選或圖示化學物者，可獲自公司（例如 BioDes ign, Inc., Pasadena, Calif.，A1leiix，Inc,

Mississauga, Ontario, Canada,以及 Hypercube，Inc.， Cambridge，Ontario)(見 DesJarlais et al.，J Med Chem 1988, 31:722-9; Meng et al., J Computer Chem 1992, 13:505-24； Meng et al., Proteins 1993, 17:266-78;

Schoichet et al·， Science 1993， 259:1445-50)。 (ii)组合的化學物合成試劑的組合資料庫可作為部分藥劑設計程式，關於已知化合中存在的核結構知識。此方法允許此資料庫維持在

合化學物資料庫。

2125-9924-PF;Susan et al_， 54 200920405 ' Nature 1991，354 : 84-6)，但不限於此。其他化學品形成化學傳輸資料庫也可使用。此化學品例如胜肽（如PCT公開案W0 91/1 9735)、編碼的胜肽（如w〇 93/20242 )、不規則的生物募聚物（W092/00091 )、苯i’氮基鹽 (benzodiazepines)(美國專利案5,288, 514)、轉向異構物 (diversomers)例如乙内醯（hydantoins)、苯重氮基鹽 (benzodiazepines)及二胜肽（DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90:6909-13)、類乙稀基（vinylogous) 多胜肽（Hagihara et al.， J Amer Chem Soc 1 992, 1 14:6568)、具有葡糖架構的非胜肽類胜肽物 (peptidomimetics)(Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1 992，114: 9217-8)、小化合物資料庫的類似物有機合成 (Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994， 116:2661)、寡氨甲酸（Cho et al.，Science 1993，261:1303)、及 / 或磷酸胜肽（Campbell et al.，J Org Chem 1 994，59:658)、核酸資料庫（Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989， Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA)、胜肽核酸資料庫（US Patent 5, 539, 083)、抗體資料庫（Vaughan et al.，Nature Biotechnology 1996, 14(3):309-14 > PCT/US96/10287) > 碳氫化物資料庫（Liang et a 1 ·， Science 1 996， 274:1520-22 ; US Patent 5, 5 93, 853)、以及小有機分子資料庫（苯併二雜呼（benzodiazepines), Gordon EM. Curr 2125-9924-PF;Susan 55 200920405

Opin Biotechnol. 1 995 Dec 1; 6(6):§24-31);異普林諾 !> 德（i soprenoids), 美國專利案5, 569，588;噻。坐咬調 (thiazolidinones)及麥塔唾咬酮（metathiazanones)， • · 美國專利案5, 549, 974; °比0各琳（pyrrolidines),美國專利案 5,525,735 及 5,519,134;嗎琳化合物（morpholino compounds), 美國專利案 5, 506, 337; 苯併二雜〇乎 (benzodiazepines),美國專利案 5, 288, 514 等）。 (iii)噬菌體顯示其他方法使用重組噬菌體形成資料庫。使用”噬菌體方法 ” （Scott &Smith， Science 1990， 249:386-90；

Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1 990，87:6378-82; Devlin et al.，Science 1 990，249:404-6)，可建構成非

常大資料庫（例如1 〇 6 -1 0 8個化學品）。第二方法使用基本化學品方法，例如 Geysen 方法（Geysen et al.，Molecular Immunology 1986, 23:709-15; Geysen et al., J

Immunologic Method 1 987，1 02:259-74);以及 Fodor 等人的方法（Science 1991，25 1:767-73 ) °Furka 等人（14th Inetrnational Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR：013； Furka, Int J Peptide Protein Res 1991， 37:487-93) 、 Houghten (US Ptent 4,631，211)以及Rutter等人（美國專利案5, 〇1〇，175)說明形成胜肽混合物的方法，此胜肽可測試作為激動劑或拮抗劑。製造組合的貢料庫的裝置為商業可獲得（例如35? Mps， 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisvi11e KY, Symphony, 2125-9924-PF;Susan 56 200920405

Rainin, Woburn, ΜΑ, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。而且多種組合的資料庫本身可商業獲得（例如ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc., St. Louis, M0,

Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Colubia, MD,等）。 PKIB或NAALADL2連接化合物的篩選方法本發明中，偵測前列腺癌中的pKIB或NAALAI)L2的過度表現，但其在正常器官中沒有表現（第丨、2圖因此，使用PKIB或NAALADL2基因、或此基因編碼的蛋白質、或此基因的轉錄調節區域，可_選改變此基因表現或此基因編碼胜肽的生物活性之化合物。此化合物作為治療或預防前列腺癌的醫藥。本發明提供篩選試劑的方、本 W的万法，此試劑連接於PKIB或 NAALADL2。由於 ΡΠΒ 或 NAAT Am 〇 + 1 LADL2在剛列腺中表現，連接於PKIB或NAALADL2的續丨古m Λ Μ有效抑制前列腺癌細胞的增殖，也因此有效於治療或預防 a跟癌。因此，本發明也提供一種篩選試劑的方法，此式劑抑制前列腺細胞的增殖，以及提供一種篩選試劑的 ,,A ^ ^ $幻的方法，使用PKIB或NAALADL2 包括以下步驟： ‘，此筛選方法的實施例多核苷酸的 a )使測試化合物與多肽接觸；編石馬PKIB或NAALADL2 b )偵測此多肽與測試化合物間的連接活性以及 2125-9924-PF;Susan 200920405 C )碎選連接於此多肽的測試化合物。本發明此方法將詳述於下。 β 献用於_選的ΡΚΙΒ或NAALADL2多肽可為重組多狀或天 '''質或其。卩分胜肽。與測試化合物接觸的多肽可為，例如純化多肽、可溶解蛋白f、連接於載劑的型態、或與其他多肽融合的融合蛋白。關於_選蛋白質的方法，例如，使用PKIB或NAALADL2 夕肽使此蛋白質連接到PKIB或NAALADL2多肽的方法，可使用此技術領域中所熟知的許多方法。此篩選可為免疫沉澱方法（例如以下[實施例1]的” 方戽的爻互作厉”），特別是以下的方式。編碼冗^或NAALADL2多肽的基因在宿主（如動物）細胞中表現，經由將此基因插入表現載體作為外來基因，例如pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3. 1、 pCAGGS、及PCD8。用於此表現的啟動子可為任何通常使用的啟動子’包括例如SV40初期啟動子（Rigby in Williamson (ed. ), Genetic Engineering, vol. 3·

Academic Press，London, 83-141 ( 1 982))、EF-a 啟動子 (Kim ei: al.，Gene 91 : 21 7-23( 1 990)) ' CAG 啟動子（Niwa et al.，Genen 1 08:1 93 ( 1 99 1 ))、RSV LTR 啟動子（Cullen, Methods in Enzymology 1 52:684-704( 1 987 ))、SRa;啟動子（Takebe et al·， Mol Cell Biol 8:466(1988)) 、 CMV 立即初期啟動子（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9( 1 987))、SV40 晚期啟動子（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1:385-94(1982))、腺病毒晚期 2125-9924-PF;Susan 58 200920405 / 啟動子/ilaufman et al. , Mol Cel 1 Biol 9: 946( 1 989))、 HSV TK啟動子等。將此基因插入宿主細胞以表現外來基因的插入過程，可根據任何此技術領域中熟知的方法進行，例如電穿孔法（electroporation method) (Chu et al.， Nucleic Acids Res 15: 131卜26(1 987))、磷酸鈣方法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-52(1987)) ' DEAE 葡聚糖方法（Lopata et al.， Nucleic Acids Res 12:5707-17(1984) ； Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4.1641-3(1984))、脂感染素（lip〇fectin)法（Deri jard B.，

Cell 76:1025-37(1994) ； Lamb et al., Nature Gentics 5:22-30(1993); Rabindran et al., Science 259:230-4 (1993))等。PKIB或NAALADL2編碼的多肽可以融合蛋白表現’此融合蛋白包括一單株抗體的重組區域（抗原決定區域）、藉由此單株抗體的專一性顯現的抗原決定區域，插入此多狀的N-端或C-端。可使用商業上可獲得抗原決定區域 -抗體系統（Experimental Medicine 1 3:85-90( 1 995))。可表現融合蛋白與，例如，沒—半乳糖苷酶、麥芽糖連接蛋白、威光苷肽S-轉移酶、及使用其多重選殖位的綠螢光蛋白 (GFP)的載體，可商業上獲得。而且，只導入小的抗原決定部位而製造的融合蛋白，此抗原決定部位由數個到十數個胺基酸所構成，只要在融合過程不改變pKIB或NAAUDL2 夕肽（·生質，皆可使用。抗原決定部位，例如多組織胺酸 (Hi s tag)、流感聚集ha、人類c-myc、flag、水疮性口炎病毒糖蛋白（VSV-GP)、T7基因1〇蛋白（T7_tag)、人類疱 53 2125-9924-PF；Susan 200920405 療病毒糖蛋白（HSV-tag)、E-tag(單株噬菌體的抗原決定部位）等，以及可辨識此等抗原決定部位的單株抗體，皆可作為抗原決定部位-抗體系統，用以篩選連接p KI b或 NAALADL2 多肽的蛋“質（Experimentai Medicine 13:85-90(1995))。在免疫沉澱法中，在使用適當清潔劑製造的細胞胞溶產物中，加入這些抗體，形成免疫複合物。此免疫複合物由PKIB或NAALADL2多肽、具有與此多肽連接活性的一多肽、及一抗體所構成。亦可使用抗PKIB或NAALADL2多肽的抗體導入免疫沉澱法’使用抗體對抗上述抗原決定部位’此抗體可如下製造。一免疫複合物可由例如蛋白A賽弗洛斯（sepharose)或蛋白G賽弗洛斯（sepharose)沉澱，當此抗體為小鼠IgG抗體。如果PKIB或NAALADL2基因編碼的多肽由具有抗原決定部位的融合蛋白製造時，例如 GST，可如同抗PKIB或NAALADL2多肽的抗體使用方式，形成免疫複合物’使用一物質專一連接於這些抗原決定部位’此物質例如榖光苷肽-賽弗洛斯（sepharose) 4B。免疫沉殿法可根據文獻方法進行（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))。 SDS-PAGE通常用於免疫沉澱的蛋白分析，此連接蛋白可以適當濃度的膠得知此蛋白質的分子量而分析此連接蛋白。由於連接於PKIB或NAALADL2多肽的蛋白質難以由一身又染色方法被债測到，例如考馬斯染色（Coomassie 2125-9924-PF;Susan 60 200920405 staining)或銀染/此蛋白質的偵測敏感度可經培養細胞於含有放射活性的同位素中而改善，此同位素例如35s-甲硫胺酸或35S-半胱胺酸，標記細胞中的蛋白，然後偵測蛋白。當此蛋白質的分子量已顯示後，此目標蛋白可直接由sds_ 聚丙稀醯胺膠中純化，並確認其序列。使用此多肽篩選連接於ΡΚΪΒ或NAALADL2多肽的蛋白質的方法’例如西方點潰分析（West_Western bl〇tting analysis; Skolink et al., Cell 65:83-90(1991))。特別是連接於PKIB或NAALADL2多肽的蛋白質可獲自，由培養細胞（如 LNCaP、22Rvl、PC-3 M-145、及 C4-2B)中製造一 cDNA基因庫’此培養細胞預期表現連接pKIB或NAAUDL2 多態的蛋白質’使用一噬菌體載體（如ZAP)，在LB-洋菜膠上表現此蛋白’此蛋白表現於濾器上而被固定，在此濾器上純化及標示此PK IB或NAALADL2多肽，然後根據上述標示’偵測表現連接於pKIB或NAALADL2多肽的蛋白質的嗟. 菌斑。本發明的多肽可利用生物素（bi〇tin)與卵白素 (avidin)間的連接而標示，或利用專一連接於PKIb或 NAALADL2多肽的抗體而標示、或利用融合於PKIB或 NAALADL2多肽的胜肽或多肽（如GST)而標示。也可使用放射線同位素或螢光的方法。或者’在本發明另一實施例的篩選方法中，可使用二雜父系統使用細胞（“MATCHMAKER Two-Hybrid system”， l< Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”， MATCHMAKER 〇ne-Hybrid system” (Clontech); ” 2125-9924-PF;Susan 61 200920405

HybriZAP Two-Hybrid Vector System” （Stratagene); the references Dalton and Treisman, Cell 68:597-612 (1992) ， “fields and Sternglanz， Trends Genet 1 0:286-92(1994)”）。 ·· 在二雜交系統中，本發明多肽融合於SRF_連接區域或 GAL4-連接區域，在酵母菌中表現。從預期表現連接於本發明多肽的蛋白質的細胞中製造cDNA基因庫，當表現時，此

基因庫融合於me或gal4轉錄活性區域。然後將此cDNA 基因庫導入上述的酵母菌，來自此基因庫的cDNA由偵測到的正形選殖株中分離(當連接於本發明多肽的蛋白質在酵母菌中表現’此兩者的連接活化報導基因，使正形選殖株可被偵須Ο。由此c驗編碼的蛋白質可由上述分離的截導入E. c〇li並表現此蛋白質而製造。報導基因，例如Μ" 土 iacZ基因、CAT基因、蟲螢光素酶基因、his3基因及類似基因。連接於ΡΠΒ或NAALADL2基因編瑪的多狀的化合物，也可使用親和性層析法筛選。例如，固定本發明的多狀在親和性柱的載體上，將包含的測試化合物加入此柱中Λ 本發明多狀的蛋白質此測5式化合物例如細胞萃取物、細胞溶菌產物等。名如 _^制㈣纟加入此測試化合物後，清洗此柱，可以製造連接於本發明多蛋白質時，分析此蛋白:物。當此測試化合物為客_ 貝的胺基酸序列，基於此序列合成养DNA，使用此寡dna j 口成

休計師選cDNA基因座，獾锃ηΜΛ 編碼的蛋白質。土口厍獲付DNA 2125-9924-PF;Susan 62 200920405 使用表面質粒基因組今振現象的生物感測器也可作為偵測或鑑定本發明中的連接化合物的工具。當使用此生物感測器時’使用少量的多肽且不用標記（例如BIAcore, Pharmacia) ’可即時觀察本發明多肽與測試化合物間的交互作用為表面質粒基因組共振訊號。因此，使用生物感測器如BIAcore評估本發明多肽與測試化合物間的連接是可能的。 ,口双 Ίϋ 甲 1G 令、物、或天然物質庫、或不規則的噬菌斑胜肽顯示庫時，篩選連接分子的方法’以及基於重組化學技術使用高輸出的篩選方法（Wrighton et al·，Science 273:458_64(1996);

Verdme, Nature 384:1 1-1 3( 1 996)； Hogan, Nature 384:Π-9 ( 1 996 ))以分離蛋白質及連接於pKiB或職飢2 蛋白質（包括激動劑及拮抗劑)的化學化合物，是此域中所熟知。在較佳實施例中，由本發明方法筛選的測試化合物可為候選物’做進—步篩選’以評估其治療效應。抑制㈣或NAA舰2生物活性的化合物的筛選方、去二本發明中，㈣或舰和蛋白質已顯示呈有則列腺癌症細胞增殖的活性（如第3c 進已顯示具有脱性㈣、5Effl)^=⑽ ΡΚΑ-Γ ^ ^ t M ^ 在本發明中， ❹ 制PKA-C自核輸出或加迷m-c· 到核。使用此生物活性，可篩選抑制轉各物’且此化合物可用於治療或預白…的化合 J幻腺癌。因此，本發 2125-9924-PF;Susan 幻 200920405 明：提供篩選抑制前列腺癌細胞增殖的化合物之方法，以及篩選治療或預防前列腺癌的化合物之方法。因此，本發明提供篩選治療或預防前列腺癌的化合物之方法，使用 ΡΠΒ或NAALADL2編碼多肽，此方法包括不列•步驟·· 3)使測試化合物與刪或NAALADL2多核普酸編碼的多胜肽接觸； b) 偵測上述多胜肽的生物活性的步驟，·以及 c) 篩選抑制PKIB或NAALADL2多核苷酸編碼的多胜肽生物活性的測試化合物’此抑制是相對於測試化合物不存在時的上述多胜肽的生物活性。本發明方法將更詳細說明如下。任何多胜肽皆可用於篩選’只要該多胜肽包括ρκΐβ或 NAALADL2蛋白質的生物活性即可。例如可使用ρκΐβ或 NAALADL2蛋白質以及功能上等同於此等蛋白質的多胜狀。此多胜肽可為細胞内源性表現或外源性表現。而且，此生物活性包括ΗΠΒ或NAALADL2蛋白質的細胞增殖活性或者 PKIB蛋白質的PKA-C核聚集活性。由此薛選方法分離的化合物為PKIB或naaudl2基因編碼的多胜狀的括抗物的候選物。，，拮抗物，，是指抑制連接於該多胜狀的功能的分子。”拮抗物，，也可以是指減少或抑制編碼PKIB或NAALADL2的基因表現的分子。而且，由此篩選方法分離的化合物為生體内抑制ρκΐΒ或 NAALADL2多胜肽與分子（包括DNA與蛋白質）作用的化合物的候選物。 2125-9924-PF;Susan 64 200920405 田本發明偵測的生物活性為細胞。地殖時，例如可藉由製備表現PKIB或NAALADL2多胜肽的細胞，在有測試化八物存•在下培養該細胞，以及確認細胞增殖的速度，測量其細胞周期，以及測量細胞群形成活性而偵測，例如第 4C圖。這裡定義抑制生物活性，，較佳為pkib或NAALADU 生物活性的至少10%抑制率，相較於沒有該化合物的情形下，更佳為至少25%、50%或75%抑制率，最佳為9〇%抑制率〇當本發明所偵測的生物活性為PKA-C核聚集時，例如可藉由製備表現PKIB多胜肽的細胞，在有測試化合物存在下培養該細胞，以及確認核内的PKA-C蛋白質的量，使用免疫細胞化學術或西方點潰分析偵測，例如第5D及5£圖。這裡定義”抑制生物活性，’較佳為PKIB生物活性的至少 10%抑制率，相較於沒有該化合物的情形下，更佳為至少 25%、50%或75%抑制率’最佳為9〇%抑制率。在一較佳實施例中，由本發明方法篩選的測試化合物可為候選物，進而用於篩選，以評估其治療效果。改變PKIB或NAALADL2表現的化合物的_選方法本發明中，因S1RNA導致PKIB或NAALADL2的表現減少’顯示抑制腫瘤細胞增殖（如第3、4圖）。因此，本發明提供一種篩選抑制PKIB或NAALADL2表現的藥劑的方法。抑制PKIB或NAALADL2表現的藥劑有效於抑制前列腺癌細胞的增殖，因此有效於治療或預防前列腺癌。因此，本發明也k供一種師選抑制前列腺癌細胞增殖的的藥劑的方 2125-9924-PF;Susan 65 200920405 法’以及一種篩選治療或預防前列腺癌的藥劑的方法。本發明說明中，此篩選方法包括例如以下步驟： a)使測试化合物與表現pkib或NAALADL2的細胞接觸；以及 ·· b)篩選減少PKIB或NAALADL2表現量的候選化合物，相較於控制組而言。本發明方法將更詳細說明如下。表現PKIB或NAALADL2的細胞包括，例如前列腺癌的細胞株，此細胞可用於上述本發明的篩選方法中（LNCap， 22Rvl，PC-3, DU_145，及C4_2B)。表現量可以此技術領域中熟知的方法評估，例如RT_pcR、北方點潰分析法、西方點潰分析法、免疫染色法及流式細胞分析法。，，表現量減少”意指較佳4㈣或NAALADL2的表現量的至少1〇% 的減少，相較於此化合物不存在時的表現量，更佳為至少㈣、5_ 75%的減少量’最佳為_的減少量。此述的化合物包括化學化合物、雙股核芽酸等。雙股核普酸的製造 = = 法中，減少ρΠβ或腿飢2 現里的化合物可篩選為候、^ ^ ^ 列腺癌。、、㈣用以治療或預防前以下步驟： ’此載體包此報導基因在另-實施例中，本發明的篩選方法包括 a)使候選化合物與具有_載體的細胞接觸括㈣或NAALADL2轉錄調節區與報導基因，在轉錄S周節區的控制下表現； b)測量此報導基因的表現或活性以及 2l25~9924-PF;Susan 200920405 C)篩選該報導基因表現或活性減少的候選化。合物。 a

適當的報導基因及宿主細胞為習知。例如報導基因為冷光酶（iUCiferase)、綠螢光蛋白（GFP)、原盤海葵 (Discosoma sp.)紅螢光蛋白（DsRed) 、 CAT (ChrolamphenicolAcetyltransferase)、lacZ 與 /5-葡糖苷酸酶（GUS)、以及宿主細胞是C0S7、HEK293、HeLa等。此篩選方法所需的報導物質可經由使報導基因序列連接至 PKIB或NAALADL2的轉錄調節區域而製造。此述ρκΐβ或 NAALADL2的轉錄調節區域為從起始密碼子開始上游至少 5〇〇bp的區域，較佳為上游1〇〇〇bp，更佳為5〇〇〇沖、 10, OOObp的區域。包含此轉錄調節區域的核苷酸片段可由基因庫中分離出來或以PCR製造。鑑定轉錄調節區域的方法以及分析的實驗流程為習知者（M〇lecular clc)ning third edition chapter 17, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory press)。以習知方法，將包含此報導物質的載體感染至宿主細胞，偵測此報導基因的表現或活性（例如使用冷光儀（luminometer)、吸光器（abs〇rpti〇n spectr⑽eter)、流式細胞分選儀（fl〇w cyt〇mete〇等卜此述”降低表現或活性”為在未添加此化合物的條件相比之下，此報導基因的表現或活性較佳減少至少1〇%，更佳為減少至少25%、50%或75%，最佳為減少95%。本發明之較佳實施例中，以本發明方法筛選的測試化合物可為將來篩選評估其治療效果的候選物。篩選減少PKIB與PKA-C連接的化合物 2125-9924-PF;Susan 67 200920405 气發明中，PKIB與ΡΚΑ-C間的作用以免疫沉澱法呈現 (如第5C圖）。而且在無Ρ]Πβ存在時，pKA_c由細胞核内移到細胞質（如第5D圖）。本發明提供一種篩選抑制π 與PKA-C連接的化合物的方法。抑制ρπβ與pKA_c連接的化合物有效於抑制前列腺癌細胞的增殖，因此有效於治療或預防前列腺癌。因此，本發明亦提供一種篩選抑制前列腺癌細胞增殖的化合物的方法，以及一種篩選治療或預防前列腺癌的化合物的方法。更具體地說，本發明包括以下步驟： a) 在測試化合物存在下，使ρκΐΒ多胜肽或其功能等同物與PKA-C多胜肽或其功能等同物接觸； b) 偵測兩多胜肽間的連接；以及 c) 篩選抑制兩多胜肽連接的測試化合物。此述“PKIB多胜肽的功能等同物”為包含有卩^乂連接區域的胺基酸序列之多胜肽（偽物質結構 (pSeud〇SUbStrate motif; RRNA:SEQ idn〇:3i))。同樣地，此述“PKA-C多胜肽的功能等同物，’為包含有ρκΐβ連接區域的胺基酸序列之多胜肽。本發明方法將於以下詳述。筛選抑制ΡΚΙΒ與PKA-C連接的化合物之方法可使用多種此技術領域中周知的方法。此筛選方法可在試管内分析系統中進仃。更具體而言，首先，ρκΐΒ或ρκΑ —c多胜狀連接於-載體，其他多胜肽與測試化合物_起加人。之後， °養 δ物e洗及偵測及/或測量連接於此載體的其他 2125-9924-PF;Susan 68 200920405 多胜肽。有潛力的候選化合物可減少庙、目,丨^ 」减^摘測到的其他多胜肽的量。此述PKIB或PKA-C的多胜壯环盔$址夕胜肽可為天然蛋白質或基因重組技術獲得的重組蛋白質。天麸Iώ哲 .男Α然蛋白質可例如由親和性柱層析法製造。重組蛋白質可由土立差，、；祕貝J由培養以編碼PKA_C的ΜΑ 轉換的細胞’以表現該蛋白且使其復原。可用於連接蛋白質的费號，在丨1 a , 貝耵戰體，例如非水溶性多醣，如瓊脂、纖維素、葡聚糖；及合虚谢久》成樹知，如聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、矽膠；較佳為以上述妍粗制边材枓製造的商業可獲得的珠及盤（如多孔盤、生物偵測晶片笙曰曰月荨）亦可使用。當使用珠時，可填充於柱内。或者使用習4n & # u _ 可忧用^知的磁性珠可藉由磁性使分離的蛋白輕易地連接於珠。使蛋白質連接於載體可由慣例方法進行，例如化學鍵結及物理吸收。或者蛋占傲者蛋白質可藉由專一辨識此蛋白質的抗體連接於載體上。而且，疋&新，蛋白質也可由卵白素（avidin)與生物素（b1〇tln)的方法’連接於載體上。蛋白質間的連接在緩衝液中進行’例如碟酸緩衝液及Th緩衝液，只要此緩衝液不抑制蛋白暂n ^ 貝間的連接即可，沒有特別限制。本發明中，可· # τ 更用表面電漿共振現象的生物偵測器，作為偵測或定量遠| & 連接的蛋白質的方法。當使用此種生物偵測1§時，蛋白皙門& 、Β的作用可由表面電漿共振訊號即時被觀备，不需標記且僅 m而要）Ϊ的多胜肽（例如BIAcore，

Pharmacia) 〇因土卜 PKIB與PIcmZ使用如白勺生物偵測器評估，可以軚記PKIB或PKA-C，該多胜肽的標藏可用 2125-9924-PF；sUsan 69 200920405 於積測或測量連接泽性。特定地說，在預先標記其中一個多胜肽後，在測試化合物存在下，使該標記的多胜肤與其他多胜肽接觸，然後根據清洗後的標籤，偵測或測量連接的多胜肽。標記物質例如放射性同位素（例如3h、hc、犯p、 3m25I、13⑴、酵素（如㈣碟酸酶、焊菜過氧化酶、b-半乳糖苷酶、b_苦酶）、螢光物質(如螢光異酸丙浠醋⑽c)、rhodaiDlnek生物素（bi〇tin)/^素 (_⑷，皆可用於本發明中蛋白質的標籤。當蛋白質以放射線同位素標記時，可使用液體問爍計數器進行偵測或測量。或者當以酵素標記時，藉由加入酵素基質偵測基質的酵素變化（例如產+ @ & _ , 產生顏色，而以吸光器價測）而谓測或測量標記的蛋白質。又如果以螢光物質標記時，可使用螢光照相器摘測或測量連接的蛋白質。再者，ΡΚΙβ與PKA —C的連接可使用抗PKA-C或PKIB 的抗體债測或測量。例如使PKA_C多胜肽固定於載體後，與測試化合物及㈣接觸，培養此混合物後清洗 PKIB，體進行偵測或測量。或者將ρκΐβ固定於載體上，制抗抗體作為抗體。在使用抗體進行本篩選方法 :二抗體較佳以上述的—種標記物質標記，根據該標記或測量。或者’使用抗pKA —c_b的抗體作為明的“方己有標記物f的次級抗體。再者，本發連接於蛋白質的抗體可使用蛋白G或蛋白 A柱偵測或測量。 $ β 或者’在本發明筛選方法的另一較佳實施例中，使用 2125-9924-PF;Susan 70 200920405 利用雙雜交系統的細胞（“MATCHMAKER Tw〇_Hybrid system”、’’ Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Vector system”（Stratagene);參考資料 Dalt〇n and Treisman，

Cell 68:597-612(1992), Fields and Sternglanz, Trend Gene 10:286-92(1994))。雙雜父系統中，例如使PKA-C多胜肽融合於srf-連接區域或GAL4-連接區域，在酵母菌細胞中表現。連接於 PKA-C多胜肽的pkib多胜肽，融合於vpi6或GAU4轉錄活性區域，在測試化合物存在下表現於酵母菌細胞。或者，使PKIB多胜肽融合於SRF-連接區域或GAL4_連接區域，及 PKA-C多胜肽融合於VP16或GAU4轉錄活性區域。兩者的連接活化報導基因，使正形選殖株可被偵測。此報導基因可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光酶基因，除HIS3基因以外。而且’本發明的篩選方法是偵測pKA_c的細胞核内位置，因為PKA-C在PKIB存在時是在核内，但是ρΚΙβ不存在日寸’ PKA-C位於細胞質内。例如當同時表現pKA_c與ρκΐΒ 的細胞與測試化合物接觸、清洗後，將該細胞固定在例如

70%酒精或 4%二聚甲备（paraformaldehyde)，以抗 PKA-C 抗體偵測。當PKA-C多數被偵測在細胞質内時，該測試化 &物被用於預防前列腺癌。在此，PKA-C與ΡΚΙβ可以周知方法強迫表現於細胞内。因此，表現ΡΚΑ — C與ρκΐΒ的細胞與測忒化合物接觸，而該細胞的核萃取物以周知方法準備 (例如使用次細胞蛋白萃取套組（s_pEK) ; Merck 2125-9924-PF；Susan 71 200920405 .Bi〇SCience)。PKA一c在核今取物中的量以西方點潰分析法偵測。 . 纟發明的較佳實施例中，以本發明方法ϋ選的測試化合物可作為進-步筛選以評估其治療效果的候選物。此筛選方法進一步包括以下步驟： d) 使篩選自步驟c)的候選化合物與表現pKA_c舆的細胞接觸；以及 e) 與/又有候選化合物存在下的表現量相比，篩選'Η 磷酸化程度減少的候選化合物。

Akt磷酸化的偵測方法為此技術領域中所周知。例如可使用以下實施例部分所使用的西方點潰分析。更佳偵測在473 ser殘基的Akt的磷酸化程度（SEQ Π) N0: 35)。師選因抑制PKIB功能而減少Akt磷酸化的化合物本發明中’ Akt磷酸化因為PKIB siRNA而減少（第7A 圖）。而且，Akt磷酸化由PKIB及/或PKA-C過度表現而促進（第7B、7C圖）。本發明提供一種篩選抑制PKIb與pka-C 連接的化合物。Akt磷酸化類似在HRPC進程及其惡性表型中扮演關鍵角色（Sellers, W. R. & Sawyers, C.L. (2002 ) in Somatic Genetics of Prostate Cancer:Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantoff, P. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia), Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM. , Curr Cancer Drug Targets. 2007 Sep:7(6):591-604, Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci USA 200 1 ; 98 ( 1 3): 7200-5, Feldman BJ, 2125-9924-PF;Susan 72 200920405

Feldman D, Nat Rev Cancer 2001;1(1)：34-45, Malik SN, Brattain M, Ghosh PM, Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R， Kreisberg Ji·， ciin Cancer Res.2002;8(4):1168- 71) ’因此’經由抑制pK丨B功能而減少Akt磷酸化的化合物，預期會抑制前列腺癌細胞增殖，也因此有效於治療或預防削列腺癌。因此，本發明亦提供一種篩選抑制前列腺癌細胞增殖的化合物的方法’以及一種筛選治療或預防前列腺癌（較佳為HRPC)的化合物的方法。更具體地說，本方法包括以下步驟： a) 使候選化合物與表現pKIB與pKA_c的細胞接觸；以及 b) 與沒有候選化合物存在時的表現量相比，篩選Akt 磷酸化量減少的候選化合物。或者’適合於治療及/或預防前列腺癌的候選化合物可由本發明鑑定。此方法包括以下步驟： (a)在適合以pKIB使Akt磷酸化的條件下，在測試化合物存在下，培養pKIB或其功能等同物以及帶有pKA —c或其功能等同物的Akt，其中Akt為選自以下多胜肽所構成之族群： 1· 一包括胺基酸序列SEQ ID N〇:35(Akt)的多胜肽； 11· 一包括胺基酸序列SEQ ID N〇:35的多胜肽，其中有一或一個以上胺基酸經取代、缺失、或插入，但前提是該多胜肽具有相等於胺基酸序列SEQID NO:35所構成之多胜肽的生物活性； 2125-9924-PF;Susan 73 200920405 » 工11. 一由核苷酸序列SEQ ID NO:#身成之多嚴謹條件下雜交才〆音心在雜乂之夕核苷酸所編碼的多胜肽，胜肽具有相等於脸I &疋該多 • 才等於私基酸序列卿IDNC):35所構成的生物活性；夕胜狀 (b )偵測Ak t的碟酸化量； (c)比較步驟（b)中測量的Akt磷酸化量與控制量；以 (d)比較控制量，篩選Akt磷酸化量減少的化合物。本發明之較佳實施例中’本發明方法篩選的测試化合物可進一步篩選為評估其治療效果的候選物。

Akt磷酸化量較佳可偵測胺基酸序列SEQ no.%的第473位的絲胺酸殘基，或者此多胜肽的同質位置。·偵測 Akt磷酸化的方法可使用此技術領域中周知的方法。例2 可使用以下貫施例所使用的西方點潰分析法。本發明内容中，適合以PKIB磷酸化Α1α的條件可為有、磷酸供應者存在下培養Akt與ΡΚΙΒ及PKA-C的前提，例如 ATP。適合以PKIB磷酸化Akt的條件也包括培養細胞表現 PKIB、PKA-C及該多胜肽。例如該細胞可能是一轉形細胞包含一含有編碼該多胜肽的多核苷酸的表現載體。培養後，以辨識磷酸化Akt的抗體偵測Akt的磷酸化量。在偵測磷酸化Akt之前’ Akt可自其他成份、或Akt 表現細胞的細胞溶胞物質中分離。例如，可使用膠電永去將Akt自剩餘的組成中分離。或者，使Akt與具有抗Akt 抗體的載體接觸，捕捉Akt。當使用標記的磷酸供應者時， 2125-9924-PF;Susan 74 200920405 - ·.可追縱該標藏彳貞測Akt的碟酸化量。例如，當使用放射線標記的ATP(如32p-ATP)作為磷酸供應者，分離出的Α1α放射活性量與Akt磷酸化量相關。或者可使用專一辨識鱗酸化Akt而不辨識非磷酸化的Akt的抗體，來偵測碟酸化^ Akt。該抗體較佳辨識磷酸化Akt的Ser-473殘基。對特定蛋白質製造多胜肽功能等同物的方法為此技術領域中所周知，包括導入蛋白質變異的周知方法。通常來說’已知蛋白質中一個或以上的胺基酸修飾不會影響該蛋白質功能（Mark DF et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1 984, 81:5662-6; Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982 10:6487-500； Wang A etal., Science 1984, 224:1431-3； Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982，79:6409-13)。事實上，變異的或修飾的蛋白質，或蛋白質具有胺基酸序列以特定胺基酸序列的一個或以上的胺基酸殘基被取代、缺失、插入及/或增加，已知仍保留原始的生物活性（Mark DF et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500； Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982， 79:6409-13)。因此，此技術領域中熟知該技術者可了解，單一的增加、缺失、插入、或取代一胺基酸序列，改變了單一胺基酸或小部分的胺基酸，被認為是”保留的修飾”，其中蛋白質的改變造成聚相似功能的蛋白質，是本發明内容所考量的蛋白質。例如此技術領域中熟知該技術者可製造Akt、PKA-C或 2125-9924-PF；Susan 75 200920405 - PK IB的多胜肽功能等同物，藉由在這些蛋白質之7的胺基酸序列中導入適當的變異，使用例如定點突變 (Hashimoto-Gotoh et al., Gene 12:271-5(1995); Zoller • · and Smith, Mehtods Enzymol 100:468-500(1983); Kramer et al. , Nucleic Acids Res. 12:9441-56(1984); Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154:350-67(1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488-92( 1 985); Kunkel TA, et al.，Methods Enzymol. 1991;204:125-39)。本發明的多胜肽包括具有Akt、PKA-C、或PKIB的胺基酸序列的多胜肽’其中有一個或以上的胺基酸變異，但前提是變異的多胜肽為功能等同於Akt、PKA-C、或PKIB。只要維持該蛋白質的活性’胺基酸變異的數量沒有特別限制。然而，通常較佳為改變5 %或以下的胺基酸序列。因此，較佳實施例中，胺基酸變異數罝通常為30個胺基酸或以下，典型為2〇個胺基酸或以下’更經典為1〇個胺基酸或以下，較佳為5_6 個胺基酸或以下，更佳為1 _3個胺基酸。變異的胺基酸殘基較佳突變為不同胺基酸，但該胺基酸側鏈的性質還是保留（已知為保留型胺基酸取代）。胺基酸側鏈的性質，例如疏水性胺基酸（A、I、L、Μ、F、W、Y、 V)、親水性胺基酸（r、d、N、C、E、Q、G、Η、K、S、Τ)、及側鏈具有以下官能基或共同特徵者：脂族側鏈（G、A、V、 L、I、P);含經基的側鏈（S、T、Y);含硫原子的側鏈（c、 1^);含羧酸及醯胺的側鏈（1)、^£1);含側鏈的鹼“、£、 Η)，及含芳族的側鏈（η、F、γ、w)。應注意縮寫字母為胺 2125-9924-PF;Susan 76 200920405 • 基酸的·•字《•母代號。再者’保留型取代表提供功能相似的胺基酸為此技術領域中所周知者。例如，以下八個族群各包含以另一個保留型取代的胺基酸： 1) 丙胺酸（A)，甘胺酸（G); 2) 天冬胺酸（D)，麩胺酸（E); 3) 天冬酿胺酸（N)，麵醯胺酸（q); 4) 精胺酸（R)，賴胺酸（JQ ; , 5)異白胺酸（I)，白胺酸（L)’甲硫胺酸（M)，纈胺酸 (V); 6) 笨丙胺酸（F)，酪胺酸（γ)，色胺酸（w); 7) 絲胺酸（S )，蘇胺酸（τ );及 8)半胱胺酸（〇，甲硫胺酸（M)(見Creight〇n，

Proteins 1 984)。此保留型修飾的多胜肽皆包含於Akt、pKA_c、或pKIB 的蛋白質。然而，本發明不限於此，且尬卜pKA_c、及ρκΐβ 的蛋白質包含非保留型修飾，只要是保留原始蛋白質的連接活性即可。再者，該修飾蛋白質包括多型性變異體、種間同質物（interspecies homol〇gues)、以及此等蛋白質的對偶基因所編碼的蛋白質。有一個或以上胺基酸殘基增加到Akt、PKA-C、或PKIB 的胺基酸序列的多胜肽，例如一融合蛋白包含Akt、pKA_c、或PKIB。因此本發明包括融合Akt、pKA_c、或PUB與其他胜肽或蛋白質的融合蛋白。融合蛋白可以此技術領域中周知的方法製造，例如藉由連接DNA編碼的Akt、pKA_c、 2125-9924-PF;Susan 200920405 或PKIB與DNA編碼的其他胜肽或蛋白質，因此，結構吻合 (frame match)，將融合的ΜΑ插入表現載體，在宿主細胞中表現。融合於本發明蛋白質的胜肽或蛋白質沒有限制。已知可融合於Akt、kA-C、或PKIB蛋白質的胜肽包括例如 FLAG(Hopp TP et al .，Biotechnology 1988 6:1 204-1 0)、6xHis 包含 6 個 His(組胺酸）殘基、1〇xHis、流感凝集素（HA)、人c~myC片段、VSp_Gp片段、V片段、T7-標籤、HSV-標籤、E_標籤、SV40T抗體片段、lck 標籤、α -球蛋白片段、B_標籤、蛋白c片段等。可融合至本發明蛋白質的蛋白質包括GST(榖胱苷肽_s_轉移酶）、流感凝集素（HA)、免疫球蛋白保留區、冷_半乳糠苷酶、(麥芽糖連接蛋白）等。融合蛋白可使商業可獲得的DNA、編碼上述融合胜肽或蛋白質，與編碼Akt、pKA_c、或pKIB蛋白質的DNA融合而表現融合的DNA來製造。另一此技術領域周知的方法，分離功能上等同的多胜肽· ’關於例如雜交技術（Sambrook et al.，Molecular Cloning 2 ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press(l 989 ))。此技術領域中熟知此技術者可輕易分離具有與Akt、PKA-C、或PKIB高同質性的DNA(與Akt高同質性的DNA為SEQ ID N0:36)，以及從此單離的DNA中分離出功能等同於Akt、PKA-C、或PKIB的多胜肽。本發明蛋白質包括與編碼Akt、PKA-C、或PKIB的DNA序列的整段或片段雜交的DNA所編碼的蛋白質，其功能等同於Akt、 2125-9924-PF；Susan 200920405 PKA -C、或PKIB〇這此户 ό Is。—夕匕括哺乳類同質物，對應來自人的蛋白質（如擦、女& ,兔' 牛基因編碼的多胜肽）。在分離咼度同質於來自叙私& 的編碼 Akt、PKA-c、或 ΡΚΙΒ 的DNA的cDNA中，較佳播用&幻沾产权佳使用則列腺癌組織。分離編鹤蛋白質工六A(= 够η 白質功此上#同於人Akt、pKA_c、或ρκΙβ 蛋白質的DNA的雜交條杜，· 〃了由此技術領域中熟知此技術的人以慣例進行。此述，’嚴謹(雜交)條件，，是指在合酸分子將與其目標序列雜交時的條件，典型為核酸複合混合物’但不被其他序列所㈣。嚴謹條件需根據序列決定（序列依幻，不同進行環境而有不同。較長的序列特定地雜交於較高的溫度。更深入的核酸雜交可I Tijssen， TeChniQU6S in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，” Overview of Principles of hybridization and strategy of nucleic acid assays» (1 993)。本發明内容中，適當的雜交條件可為此技術領域中熟知此技術者以慣例選擇。通常’嚴謹條件選擇對特定序列在低於其溶點（)約 5 - 10°C、一定義的離子強度及pH<>Tm為在平衡時互補於目標序列的探針有50%雜交於該目標序列時的溫度（在定義的離子強度、pH、及核酸濃度下）’當目標序列過量存在時，在Tm平衡時’有50%的探針被使用。嚴謹條件也可以在不穩定劑添加時達到，例如甲醯胺。為了選擇性的或特定的雜交，正形訊號較佳為背景雜交的至少兩倍，較佳為1 〇倍。嚴謹雜交條件包括以下例如.50%曱醯胺，5xSSC，及 2125-9924-PF；Susan 79 200920405 1%SDS ’ 在 42°C 培養；或者以 5x SSC，1% SDS 在 65。「立 L培養；再以0. 2x SSC及0. 1%SDS在5(TC清洗。適當的拙丄 j濰父條件也可以包括預先雜交在68。(：、30分鐘以上，倭用，，^ .. 災用快速雜交缓衝’’（Amersham LIFE SCIENCE^)·，加入標記探針，在 68°C保溫1小時以上。清洗步驟可在例如低嚴謹條件下進行。因此，。嚴謹條件可包括例如在42°c、2x SSC、0. 1%SDS，或較佳在5(rc、 2x SSC、〇· 1%SDS。或者咼嚴謹條件包括例如以2X s%、 0. 01%SDS、在室溫下清洗3次、20分鐘，然後在37t、1χ SSC、0. 1%SDS 清洗 3 次、20 分鐘，以及在 5〇°c、1X ssc、 0.1%SDS，清洗2次、20分鐘。然而，多種因素例如溫度及鹽濃度會影響雜交的嚴謹度，此技術領域中熟知此技術者可適當選擇這些因素以達到所需要的嚴謹度。功能上等同的多胜肽較佳具有與此述原始的Akt、 PKA-C、或PKIB序列至少約80%同質性的胺基酸序列（也稱為序列相同度），較佳為至少約85%、9〇%、95%、96%、97%、 98%、或99%同質性。多胜肽的同質性可由” WUbur and Lipman， Proc Natl Acad Sci USA 8〇:726_3〇(i983)” 揭露的級數確認。在其他實施例中，此功能等同多胜肽可由在嚴謹條件（如下定義）下與編碼功能上等同多胜肽的多核普酸雜交的多核苷酸編碼。示了雜乂以外，基因放大方法，例如聚合酶鏈反應（MR ) 方去可用於分離編碼功能上等同於Akt、PKA-C、或PKIB 多胜肽的DNA’使用以Akt或PKIB序列資訊所合成的引子。 2125-9924-PF;Susan 80 200920405 本發明中有用的Akt、ePjCA-C、或PKIB功能等同物在胺基酸序列、分子量、等位點、有無糖鏈、或型態上可具有差異，根據使用的細胞或宿主或使用的純化方法決定。然而’只要是其功能上等同於Akt、PKA-C、或ΡΚΙΒ任一種多胜肽，則包括在本發明範圍内。篩選連接於NAALADL2的抗體

NAALDAL2是新穎第Π型膜蛋白，屬於榖胺酸胜肽酶 11(00?11)族。前列腺專一膜抗原（？31^)是著名的前列腺癌標記’也是屬於 GCPII 族（Rajasekaran AK et al.，Am J Physiol Cell Physiol 2005 288:C975-81, and Murphy GP

et al.，Prostate 2000 42:145-9)。NAALDAL2 呈現與 PSMA 的同質性’且具有穿透細胞膜、位於細胞質膜（如第5B 圖）。PMSA是FDA-許可的前列腺癌造影劑111 ιη-標記的7E11 單株抗體的目標，PMSA為單株抗體如J591的標靶，為臨床試驗中對PMSA-表現細胞的造影劑或治療劑的特定傳輸 (Murphy GP et al., Prostate 2000 42:145-9, and Holmes EH， Expert Opin Investig Drugs 2001 10:511-9)。因此，可用於診斷或預防前列腺癌的抗NAALDAL2抗體，可經由篩選在細胞表現使用NAALDAL2連接活性作為指標而鑑定。此篩選方法的較佳實施例包括以下步驟： a) 使候選抗體與表現NAALDAL2的細胞接觸； b) 篩選連接至細胞表面的NAALDAL2的測試抗體。本發明方法將詳細說明如下。或者，NAALDAL2的推定細胞外區域為SEQ ID NO:32。 2125-9924-PF;Susan 81 200920405 ’ 因此此篩選連接於細胞外NAALDAL2的抗體的方法包括以下步驟： a) 使候選抗體與SEQ ID N0: 32組成的多胜肽接觸； b) 篩選連接於該多胜肽的測試抗體。 ·· 藉由偵測與NAALDAL2表現細胞（如前列腺癌細胞）的親和度，選擇該抗體或抗體片段或如下說明的非抗體連接蛋白。對此等細胞非特異性的連接在室溫下含3%BSA的pBs 處理30分鐘後阻止。然後將細胞在室溫下與候選抗體或抗體片^又培養60分鐘。以PBS清洗後，將細胞以F丨TC_共軛的次級抗體在室溫下染色60分鐘，以螢光器债測。或者使用利用表面電漿共振現象的生物偵測器，偵測或定量本發明中的抗體或抗體片段。可偵測細胞表面上的NAALDAL2胜肽的抗體或抗體片段被選擇於本發明中。在較佳實施例中，以本發明方法選擇的測試化合物可為進一步篩選以評估其治療效果的候選物。抗體

此述抗體”代表包括制· M 丨、取L祜對S又a十之蛋白質或胜肽具有』一反應的免疫球蛋白及其#踣。^ 入，、丰又。抗體可包括人類抗體、g 長類抗體、鑲後抗體、雙專—性抗體、人型化抗體、融1 至其他蛋白或放射線標籤的抗體、及抗體片段。而且此^ 抗體為最廣義解釋，特別涵芸盾。乃」涵盍原始的早株抗體、多株抗體由至少兩種原始抗體所形# 肢W小成的多專一性抗體（如雙專—，丨抗體）、以及抗體片段，〇 ” ^要可顯不所希望的生物活性£

可。彳几體表不所有稀Si f Τ Λ T 楂頰（如1gA、IgD、IgE、IgG 及 IgM) 2125-9924-PF;Susan 82 200920405 本發明使用抗PKIB或NAALADL2步抗體。更佳為對抗包括胺基酸序列SEQ ID Ν0: 33或34的蛋白質的抗體作為抗PKIB的抗體’而對抗包括胺基酸序列SEQ ID N0: 32的 • · 蛋白質的抗體作為抗NAALADL2的抗體。這些抗體可由已知方法提供。製造這些本發明使用的抗體由以下說明例示。 (i)多株抗體多株抗體較佳來自動物經皮（sc)或腹膜内（ip)注射相關抗原及佐藥。使此相關抗原與在此動物具有免疫性的蛋白質連接而引起免疫，例如孔穴帽貝血清素（keyh〇le 1 impet hemocyanin)、血清蛋白、牛型曱狀腺球蛋白、或大豆酪胺酸抑制劑，使用雙功能或衍生劑（derivatizing agent)，例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基硫化琥珀醯亞胺酯（經由半胱胺酸殘基連接）、F羥基琥珀醯亞胺（經絲胺酸殘基）、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12、或r’ N = C=NR，其中R 與R為不同烷基。使動物引起免疫對抗該抗原、免疫原共輕物、或衍生物’經由組合例如1 〇〇 # g或5 // g的該蛋白質或共輕物（給予兔或鼠）以及3倍體積的弗氏完全輔劑（Freund，s complete adjuvant) ’在多處部位皮下注射此溶液。一個月後’動物以1/5或1/10的原體積胜肽或共軛物於弗氏完全輔劑（Freund, s complete adjuvant)中，經皮注射多處部位’引起免疫。7-14天後取血，以抗體滴定器分析血清。使動物引起免疫直到滴定到達高原濃度。較佳以相同抗原的共軛物引起動物免疫，但連接至不同蛋白質及/哎不同交 2125-9924-PF;Susan 83 200920405 • <聯劑。共軛物也可以由重組細胞培養以蛋白融合來繁造。如明礬的凝集劑也適合用於促進免疫反應。 (i i)單株抗體 * · 單株抗體獲自實質同源的抗體群’亦即包括該群的相同個別抗體’除了可能自然發生的突變以外，此突變微量存在。因此’修飾”單株”是指抗體特性，並非抽象的抗體混合物。例如單株抗體可使用融合瘤方法製造，如K〇hler et al·’ Nature，256:495(1975)所述，或使用重組 DNA 方法製造（USP No. 4, 81 6, 567)。在融合瘤方法中’如前述方法使小鼠或其他適當宿主動物如豚鼠引起免疫，使產生或可產生與該蛋白質專一性連接的抗體的淋巴球用於免疫。或者，淋巴球可在試管内被引起免疫。然後使用適當融合劑（如聚乙二醇）使淋巴球與骨髓瘤細胞融合’形成融合瘤（Goding, Monelonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))。如此製造的融合瘤接種並生長於適當培養基中，該典養基較佳含有一或多種抑制未融合、親代的脊髓瘤細胞生長或存活的物質。例如’如果親代的脊髓瘤細胞缺乏酵素次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶（HGPRT或HPRT)，該融合瘤的培養基通常包括黃嘌呤、氨基喋呤、及腺苷（Η AT培養基），這些物質避免缺少HGPRT的細胞生長。 2125-9924-PF;Susan 84 200920405 較佳的脊驗瘤細胞為有效融合、以選擇過的來體產生 6' 細胞支持抗體穩定高量產物者’以及對培養基hat培養基敏感者。較佳的脊髓瘤細胞株為鼠科脊髓瘤，例如來自 M0PC-21 及 MPC-11 小鼠腫瘤（可獲自 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego，California USA)以及 SP-2、X63-Ag8-653 細胞（獲自 American Type Culture Collection，Manassas，Virginia, USA)。人脊趙瘤及小鼠-人異質脊髓瘤細胞株也可用於人單株抗體的製造 (Kozbor, J. Immunol., 1 33:300 1 ( 1 984); Brodeur et al., Monoclonal Ant i body Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。分析融合瘤生長的培養基’以製造直接抗該抗原的單株抗體。以融合瘤細胞製造的單株抗體的連接專一性由免疫沉澱法確認’或由試管内連接分析確認，如放射線免疫分析（RIA)或酵素連接免疫吸光度分析（ELISA)。單株抗體的連接親和度例如可由Munson等人的30

Scatchard 分析法（Munson et al.， Anal. Bic)chem.， 1 07:220 ( 1 980 ))確認。在融合瘤細胞確認產生所希望的專一性、親和性、及/ 或活性的抗體後’該選殖株可經由限制稀釋步驟次選殖，以標準方法生長（Goding， Mon〇cl〇nal Antib〇dies:

Principles and Practice, PP. 5-1〇3(Academic Press, 1 986 ))。此目的的適當培養基包括例如D_MEN或RpML_164〇 2125-9924-PF;Susan 85 200920405 培養基，而且，此融合瘤會以腹水腫瘤在動物體内生長。由此次選殖株分泌的單株抗體適合由培養基、腹水、或血清中分離’以習知的免疫球蛋白純化過程，例如蛋白 -A-賽弗洛斯（sepharose)、氫氧化磷灰石層析法、膠電泳法、透析法或親和性柱層析法。使用習知方法可輕易分離及定序編碼該單株抗體的 DNA (如使用可專一性連接編碼鼠科抗體的重鏈與輕鏈的美因的寡核苷酸探針）。此融合瘤細胞作為較佳的DNA來源。一旦分離’該DNA可放置在表現載體，然後將此載體轉移感染至宿主細胞’如E. col i細胞、類人猿c〇S細胞、中國勝鼠卵巢（CH0)細胞、或不另外產生免疫球蛋白的脊髓瘤細胞’在該重組宿主細胞中獲得單株抗體的合成。編碼抗體的細菌DNA的重組表現可見於文獻（Skerraetal.，Cuiri·

Opinion in Immunol·， 5:256-262(1993)及 Pluckthun， Immunol. Revs·， 130:151-188(1992))。其他產生特定抗體或抗體片段、反應性對抗pKIB或 NAALADL2的方法，為篩選編碼免疫球蛋白或其部分的表現基因庫，在具有PKIB或NAALADL2蛋白質或胜肽的細菌中表現。更佳為，包括胺基酸序列SEQ ID N0: 33或34的PKIB 片段可代替PKIB，以及包括胺基酸序列編號SEQ ID N(h32 的NAALADL2片段可代替NAALADL2。例如，使用噬菌體表現基因庫使完整的Fab片段、VH區域及Fv區域在細菌中表現（Ward et al.，Nature 341:544-546( 1 989); Huse et al., Science 246:1275-1281(1989); McCafferty et al., 2125-9924-PF;Susan 86 200920405

Nature 348:552-554 ( 1 990 ))。藉由如包括胺基酸序列SEQ ID NO: 33或34的PK IB片段以及包括胺基酸序列編號SEQ ID NO: 32的NAALADL2片段篩選該基因庫，可確認免疫球蛋白片段與PKIB、PKIB k段、NAALADL2或NAALADL2片段的反應。或者，使用SCID-hu小鼠（獲自Genpharm)產生抗體或其片段。在一實施例中，可由抗體噬菌體庫中分離抗體或抗體片段（McCaffertyetal.， Nature， 348:552-554(1990))。已知從噬菌體庫中分離鼠科及人抗體（Clackson et al.,

Nature，352:624-628( 1 991 )及 Marks etal·，J Mol Biol， 222:581 -597( 1 991 ))。以下的公開文獻記載使用鏈緩慢 (chain shuffling)產生高親和度（nM範圍）的人抗體（Mark etal.，BiolTechnology，1 0:779-783( 1 992))，以及以組合式感染及體内重組建構非常大噬菌體庫（Waterhouse et al·， Nuc. Acids. Res·， 21:2265-2266(1993))。因此，除了傳統的單株抗體融合瘤技術分離單株抗體外，這些技術是可行的。 DNA也可以修飾，例如藉由人重鏈及輕鏈怪定區的編碼序列取代同源的鼠科序列（USP No. 4, 81 6, 567; Morrison et al·， Proc. Natl Acad. Scl USA， 81:6851(1984))或藉由共價連接免疫球蛋白編碼序列與整段或部份的該編碼序列’形成非免疫球蛋白多胜肽。通常’該非免疫球蛋白多胜肽取代抗體的恆定區，或者取代抗體的一抗原連接區域的變異區，形成鑲嵌雙價抗 2125-9924-PF;Susan 87 200920405 體’此抗體包括了對抗原專一性的抗原連接區域以及對不同抗原具有專一性的另一抗原連接區域。 (i i i)人型化抗體人型化非人抗體的方法為此技術領域中已知。人型化抗體較佳具有一個或以上的胺基酸殘基導入該抗體，而該抗體來自非人生物。這些非人胺基酸殘基通常指為”輪入”的殘基’通常取自於”輸入”的變異區。人型化為藉由取代對應的人抗體序列的高度變異區序列（jones et al> Nature, 321:522-525(1 986); Reichmann et ak. , Nature 332:323-327( 1 988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988))。因此，此述”人型化”抗體為镶嵌抗體（USP No· 4, 816, 567)，實質上少於原始的人變異區，被來自非人物種的對應序列所取代。操作上，人型化抗體通常為人抗體’其中一些高度變異區域殘基與可能的一些FR殘基被來自嚅齒類抗體的同源位的殘基所取代。人變異區的輕鏈與重鏈，選擇作為製造人型化抗體是非常重要以減少抗原性。根據所謂，，最佳符合”方法，篩選嚅齒類抗體的變異區序列’以對抗已知的人變異區序列的整#又基因庫。之後接受最接近嚅齒類序列的人序列作為人的骨架區（FR)形成人化抗體（Sunetal.，j. Immun〇1.， 11:2296(1993); Chothia et al·， J. Mol. Biol, 196:901 (1987))。其他方法使用來自一特定次族群的輕鏈或重鏈之所有人抗體的相同序列之特定骨架區。相同的骨架可以用於多種不同的人型化抗體（Carteretal, Pr〇c. Natl. 2125-9924-PF;Susan 88 200920405

Acad. Sci. USA, 89:4285( 1 992 ) ； Presta et ai j

Immunol·，1 51 :2623(1 993))。更重要的是’人型化抗體保留該抗體的高親和性以及其他所欲的生物性質。為達到這個目的，根據—較佳方法，使用親代序列與人型化序列的三度空間模型分析親代序列及不同概念的人型化產物’製造人型化抗體。三度空間免疫球蛋白模型通常可獲得，為熟知此技術領域之人所熟悉。當說明及顯示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的二度空間結構時，可使用電腦程式。觀察這些顯示可分析該殘基在候選免疫球蛋白序列的功能上的的可能角色，亦即分析該殘基影響候選免疫球蛋白連接至其抗原的能力。這樣，可篩選FR殘基，並結合接受者與輪入序列，因而達到所希望的抗體特性，例如增加對目標抗原的親和度。通常來看’南度變異區域殘基直接且最實質涉及影響抗原的連接。 (i v)人抗體除人型化以外，可形成人抗體。例如目前可以產生基因轉殖動物（如小鼠），其可以在無内源性免疫球蛋白的生成下’在免疫發生以外，產生全人抗體。例如，已知在讓嵌及生殖株的突變鼠中的抗體重鏈連接區域（JH)基因的同源缺失’會導致完全地抑制内源性抗體形成。在此種生瘦株突變鼠中轉移人的生殖株免疫球蛋白基因排列，將造成在抗原刺激以外的人抗體生成（jak〇b〇vits et al.，Proc Med. Acad. Sci. USA, 90:255 1 ( 1 993)； USP Nos. 2125-9924-PF;Susan 89 200920405 5,591，669，5,589,369，5,5彡 5,807)。 a' 或者可使用噬菌體顯示（phage display)技術 (McCafferty ei: al.，Nature 348:552-553(1 990))試管内製造人抗體及抗體片段’使用來自非免疫提供者的免疫球蛋白變異（V)區基因。根據此技術，抗體v區基因經框内 (in-frame)選殖於線形噬菌體的主要或次要包覆蛋白基因’例如M13或fd’且該抗體V區基因在該噬菌體顆粒表面呈現如功能性的抗體片段。由於該線形顆粒包含該噬菌體基因組的單股DNA副本，根據該抗體的功能性質所進行的篩選也會造成編碼呈現此性質的抗體的基因的筛選。因此，此噬菌體模擬某些B細胞的性質。噬菌體可有多種型式呈現（Johnson， Kevin S. nad Chiswell， David J.， Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993))。有多種V-基因片段的來源可用於噬菌體的呈現。

Clackson專人分離出抗〇惡0坐酮（〇xaz〇i〇ne)抗體的多變異的排列，該抗體來自免疫鼠的脾之V基因的小任意組合庫（Clackson et al.’ Nature, 352:624-628 ( 1 99 1 ))。可建構來自未免疫的人提供者的V基因，且可分離對抗原 (包括自體抗原）多變排列的抗體（Marketal , j. M〇1.

Biol， 222:581-597(1991); Griffith et al·， ΕΜΒ0 J. 12:725-734( 1 993 ); USP N〇s. 5,565,323，5,573,905 )。人抗體亦可由試管内活化的B細胞產生（usp Nos. 5’567’610’ 5, 229’275 )。使用SCID鼠產生人抗體的較佳方法揭露於共同擁有的專利申請案中。 21^5-9924-PF;Susan 90 200920405 • (V)抗體片段製造抗體片段已發展出多種技術。這些片段傳統來自原始抗體的蛋白水解消化（Morimoto et al.，Journal of • ·

Biochemical and Biophysical Mehtods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al.， Science, 229:81(1985))。然而這些片段可直接由重組宿主細胞製造。例如，自上述的抗體噬菌體基因庫中分離抗體片段。或者，Fab’ -SH片段可直接從E. coli回復’並化學連接形成F(ab’ ）2片段（Carter et al·，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根據其他方法，F(ab’ ）2片段可直接從重組宿主細胞培養分離出來。其他製造抗體片段的技術為熟知此技術者所知悉。另一較佳實施例中，選擇的抗體為單鏈Fv片段（scFv)(W0 93/1 6 1 85; USP Nos. 5,571，894，5,587, 458)。此抗體片段也可為直線抗體（USPNo. 5,641，870)。此直線抗體片段可為單專一性或雙專一性。 (vi)非抗體連接蛋白 “非抗體連接蛋白”或，’非抗體配位體”或”抗原連接蛋白’’皆指抗體模擬物，使用非免疫球蛋白的蛋白質骨架（scaffold)’包括網蛋白（adnecti〇、艾非黙爾Uvimer) 蛋白、單鏈多胜肽連接分子、及類抗體連接胜肽擬物，以下將詳細說明。已發展其他化合物以類似抗體方式標的及連接標靶物。這些”抗體模擬物，’兑φ 此吴中一些使用非免疫球蛋白骨架作為抗體變異區的替代蛋白質骨架。 2125-9924-PF;Susan 91 200920405 • 例如Ladner等人（USP No. 5,26/), 203)描述具有連接專一性的單一多胜肽鏈連接分子，類似聚集但分子分離的抗體的輕鏈與重鏈的變異區。此單鏈連接分子包含以胜肽 • * 連接劑連接抗體的輕鏈與重鏈變異區的抗原連接位，此單键連接分子將摺疊成類似雙胜肽抗體的結構。此單鏈連接刀子呈現較傳統抗體更多的優點，包括較小體積、較佳穩定度、及容易修飾。

Ku 等人（proc Natl Acad Sci USA 92( 14):6552-6556 ( 1 995))討論以細胞色素（cyt〇chr〇me) b562取代抗體。l 等人（1995)製造一基因庫包括細胞色素b562的環結構中的兩個環任意排列，並選擇連接對抗牛型血清蛋白。已知個別突變選擇性連接於BAS與連接於抗BAS抗體相似。

Lipovsek 等人（美國專利案 6818,418，7，1 15,396) 揭露一種抗體模擬物，具有纖維網蛋白或類似纖維網蛋白 (f ibr〇nectin)骨架以及至少一個可變異環的特徵。如網蛋白（adnectin)—樣，纖維網蛋白為主結構的抗體模擬物展現多種天然或基因工程後的抗體的相同特性，包括對任何標把配位體具有高親和性及專一性。任何發展新的或改良的連接蛋白的技術皆可用於這些抗體模擬物。這些纖維網蛋白為主結構的抗體模擬物的結構類似於 IgG重鏈變異區的結構。因此這些模擬物呈現類似天然的抗原連接性質及對原始抗體的親和性。再者，這些纖維網蛋白為主結構的抗體模擬物展現一些優於抗體或抗體片段的優點。例如，這些抗體模擬物不依賴雙硫鍵而可達到自 2125-9924-PF；Susan 200920405 然的權疊穩定度，因此’可穩定存在通常使抗體斷裂的環境下。而且，由於這些纖維網蛋白為主結構的抗體模擬物的結構類似IgG重鏈的結構’可採用試管中任意排列環及缓慢移動的過程，與生體内抗體親和性成熟的過程相似\

Beste 等人（Proc Natl Acad Sci USA 96(5):1898-1903 ( 1 999))揭露一種抗體模擬物具有脂鈣素（Up〇caHn)骨架 (Anticalin®)。脂鈣素是由万_貝洛蛋白（万—barrei)構成，貝洛蛋白（万-barrel)在其末端具有四個高度變異環。Beste(l 999)將此環進行任意突變，選擇連接於例如螢光素。三種變異體展現與螢光素連接專一性，其一變異體顯現類似抗榮光素抗體的連接。進一步研究顯示所有任意排列的位置疋可變的，指出該抗體模擬物111<5>)適合作為抗體的代替物。該抗體模擬物（Anticalin®)為小 1 60-1 80個殘基’提供多種優於抗體的優點，包括降低生產成本、增加儲存穩定性、及降低免疫反應。

Hamilton 專人（usp No 5 77n ’380)揭路一種合成抗體模擬物，使用@麻& ηΑ 用堅硬非胜肽有機摺疊的環芳烴 (calixarene)，附著於多孿 ^ ^ ± 二可、夕變異胜肽裱，作為連接位。肽環彼此皆突出於璟芸柄^ . 衣方烴（callxarene)幾何結構的側。因為這種幾何構造 ^ ^所有％皆可連接，增加對配位體的連接親和度。铁而知4J_ ,^ …、而相較於其他抗體模擬物，環芳炉 (calixarene)為主的枋俨 : ◎㈣‘ 的構成並不排除胜肽，因此較難抵擒蛋白酶的攻整。、* ^ & 這二抗體模擬物在極度環境下 2125-9924-PF;Susan 93 200920405 較為穩定且具有較長的存化度，也是完全由胜肽DNA或 4? * RNA所構成的骨架不具有的。再者，因為環芳烴（cal ixarene) 為主的抗體模擬物較小，較不易產生免疫反應。 » >

Murali 等人（Cell Mol Biol· 49 ( 2 ):209-21 6(2003)) s寸論減少抗體使用較小胜肽模擬物的方法，聲稱”類似抗體連接的胜肽模擬物（ABiP)，’可有效作為抗體替代物。

Silverman 等人（Nat Biotechnol. (2005) 23:1 556- 1561)揭露單鏈多胜肽的接和蛋白，包括多各區域稱為，，艾非黙爾（avimer)，，。從人類細胞外受體區經試管内表現序列拖行及噬菌體發展，顯示艾非黙爾（avimer)是一群連接蛋白，某種程度類似抗體對各種標靶分子的親和性及專一性。所得的多區蛋白可包括多種獨立連接區，相較於單一抗原決定部位的連接蛋白，此連接區展現改良的親和度（某些例子為次奈米莫耳（nan⑽olar))及專一性。關於構成方法及艾非黙爾（avimer)的使用額外詳細說明於美國專利申請案公開號 200401 75756、20050048512、2005005⑽以、 20050089932 及 20050221384 。除了非免疫球蛋白骨架外，抗體性質也被化合物模擬’此化合物包括RNA分子及非自，然存在的寡聚物（例如蛋白酶抑㈣卜苯并二氮呼——⑽以小嗓呤衍生物及/5 -彎模擬物），皆適合用於本發明。雖然試劑庫的建構為習知，以下提供用於本發明篩選方法的額外規範以確認試劑及其建構庫。 (v i i )抗體共軛物及其他修飾 94 2125-9924-PF;Susan 200920405 此，方·.法所使用的抗體或包含於本文的製造方法中的抗體，可選擇性與細胞毒性或治療劑共輛。抗體與一個或以上的小分子毒素（例如卡利西明辛 (calicheamicin)、美塔辛（maytansine) (USP Ν〇· 5’208,020)、崔可三辛（tric〇thecence)、^ ι〇65)共軛皆被考量。本發明之一較佳實施例中’抗體與一個或以上的美塔辛（11^71&113：[1^)分子（例如每個抗體分子有約1-1〇個美塔辛（maytansine)分子）共輛。例如，美塔辛（maytansine) 可轉換成May SS-Me ’可還原成May-SH33，而與修飾過抗體反應（Chari et al·， Cancer Research 52:127-131 ( 1 992)) ’而產生美塔辛（maytansinoid)-抗體共輛物。或者’抗體可與一個或以上的卡利西明辛（ca 1 i cheami ciη) 分子共辆。抗生物性的卡利西明辛（ca 1 i cheam i c i η)族可以產生在次微莫耳（picom〇lar)濃度下的雙股DNA斷裂。卡利西明辛（calicheamicin)的結構類似物可包括 τι1、《21、 α 3、N -乙酿基-τ"丨1、PSAG及θ I1，但不限於此（Hinman et al. Cance Research 3:3336-3342(1993) and Lode et al, Cancer Research 58:2925-2928(1998))。可使用的酵素活性的毒素及其片段包括白喉毒素A 鏈、白喉毒素的非連接的活性片段、外毒素A鏈（來自 Pseudo 7nonas綠膿桿菌）、篦麻毒素A鏈、雞母珠毒蛋白A 鏈、莫迪素（modeccin)A鍵、α次黃嘌吟、油桐蛋白、丁香蛋白（dianthin)、北美商陸木蛋白（Phytolaca Americana protein; PAPI、PAPII、PAP-S)、苦瓜（momordica 2125-9924-PF;Susan 95 200920405 charant ia)抑制劑、核糖體去活化蛋白（curcin)、巴豆毒素（cro_t：in)、石驗草（sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹仔蛋白（gelcmin) '麥托結林（mitogellin)、麴菌素 (restrictocin)、盼黴素（phenomycin)、伊諾黴素 (enomycin)、及崔可三辛（tric〇thecence)(例如 w〇 93/21232)。本發明更考量與多種放射性同位素共軛的抗體。例如 2nAt、1311、]251、，、mRe、mRe、nSm、，卜 32p 及镏（Lu) 的放射線同位素。可使用多種雙功能蛋白偶合劑，例如N_琥珀醯亞胺 -3-(2-吼咬二硫基）丙酯（spj)p)、琥珀醯亞胺_4_(n_順丁醯二酿亞胺基曱基）環己烷―卜羧酸酯、亞胺硫烷（IT)、亞胺酉曰的雙功能竹生物（例如dimethyl adipimidate HCL)、活性 S日（例如 disuccinimidyl suberate)、酸類（例如戊二路）、雙疊氮化合物（例如雙（p_疊氮笨甲醯基）己烷二胺）、雙重ll衍生物（例如雙（p_重氮苯甲醯基乙二胺）、二異氰酸酉旨（例如曱苯2, 6-二異氰酸酯）、及雙活性氟化合物（例如1’5 —氟2,4 - 一氮苯）’製造抗體與細胞毒素劑共輕。例如’可依 Vitetta 等人（Science 238:1 098(1 987))製造 I麻毒素免疫毒素。碳14標記的1異硫氰并苯—3_甲基二乙稀—胺五乙酸（MX-DTPA)為一種例示螯合劑，用於放射性核苦酸與抗體的共軛作用（W〇 94/11 〇26)。此連接可為，，玎斷的連接”，加速細胞毒素劑在細胞内釋放。例如可使用酸不穩定連接劑、胜肽酶敏感連接劑、二甲基連接劑或含 2125-9924-PF;Susan 96 200920405 雙硫的連接劑（Cbrm et al.，Cnacre Research 131(1992))。或者’包括抗體與細胞毒素劑的融合蛋白可由例如重組技術或胜肽合成來製造。在另一實施例中，抗體可與” 受體”（如streptavidin)共輛，利用於腫瘤預先標靶，將抗體受體共耗物技予患者，之後以清除劑從血液中移除未連接的共軛物，然後投予，，配位體”（如avidin)，此配位體與細胞毒素劑（例如放射性核苷酸）共軛。本發明的抗體也可與前驅藥物（pr〇drug)活化酵素共軛，該前驅藥物活化酵素可轉變前驅藥物（例如胜肽基化療劑，W081/01 145)為活性抗癌劑（w〇88/〇7378 ; usp No. 4, 975, 278)。這些共軛物的酵素化合物包括任何可作用前驅藥物的酵素，轉變該前驅藥物成更具活性、細胞毒性的形式。可用於本發明方法之酵素包括（但不限於此）：鹼性磷酸酶， 1有效於轉換含磷酸的前驅藥物為自由藥劑；芳基硫酸酶，有效於轉換含硫酸的前,驅藥物為自㈣齊卜胞㈣脫胺酶，有效於轉換無毒-5-氟化胞嘲啶為抗癌藥劑 (fiu〇r〇uracil);蛋白酶，例如沙雷氏菌（serratia)蛋白酶、熱分解素Uhenn〇lysin)、薩巴提里素（subtUisin)、叛基胜肽酶及組織蛋白酶（cathepsin)(例如組織蛋白酶β 及L)’有效於轉換含胜肽的前驅藥物為自由藥劑；卜甘胺酸緩基胜肽酶’有效於轉換含卜胺基酸取代物的前驅藥物；石炭水化合物斷裂酵素，例如13 —半乳糖酶及神經胺酸 2125-9924-PF;Susan 97 200920405 只，月予寻俠糖化前驅華抽I盔&丄—命，衆物為自由樂劑；1 3 -乳胺酶，有效於轉換衍生自13一朝胗醢 a 礼的前驅藥物為自由藥劑；盤尼西林酿私，例如盤尼而 ^ 盤尼西林7醯胺酶或盤尼西林G醯胺酶’有效於轉換以苯氧基乙M A · # 乙®"1基或本基乙醯基衍生其胺氮原子的藥劑為自由藥劑。岑去 4考，具有酵素活性的抗體，已知稱為”酵素抗體（adZVmp V， -T- m ± yme) ’可用於轉換本發明之前驅藥物為自由，舌性藥物（Massey， Nature 328:457458 (1 987))。抗體-酵素抗體共軛物可如此述製造，用以將此酵素抗體傳送製腫瘤細胞群。本發明的酵素可以習知方法與抗體共價鍵結，例如使用上述的異雙功能交聯試劑。或者’包括本發明抗體的至少一抗原連接區連接於本發明酵素的至少一官能活性部位的融σ蛋白了使用習知的重組DNA技術製造（Neuberger etal·’ Nature，312:604-608(1984))。其他抗體修飾也在此考量。例如可連接至多種非蛋白類聚合物 (nonproteinaceous polymer)之一的抗體，該非蛋白類聚 5物例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚醚（p〇iy〇Xyaiky ienes)、或聚乙二醇與聚丙二醇共聚物。此述的抗體也可被調配成微脂體。包含抗體的微脂體由習知方法製造（例如 Epsteinetal., ProcNatl AcadSci USA, 82:3688( 1985) ； Hwang et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030 ( 1 980 )； USPNos. 4,485,045, 4,544,545； W097/38731 (公開於1 997年i〇月23日））。具有加強循環時間的微脂體揭露於美國專利案5, 013, 5 5 6。 2125-9924-PF;Susan 98 i 200920405 特別有用的微脂體可¥及相蒸發法處理脂質組合物來製造，該脂質組合物包括卵磷脂、膽固醇舆 PEG衍生的磷脂醯乙醇胺（PEG-PE)。以一定孔徑的過濾器擠出微脂體，產生具有期望直徑的微脂體。本發明抗體的Fab’片段可經雙硫交換反應與微脂體共軛（Martin et al·，Biol· Chem. 257:286-288( 1 982))。該微脂體可選擇性含有一化療劑（Gabizon et al.，ANational Cancer Insrt. 81(19) 1484(1989))。考慮此述抗體的胺基酸序列之修飾。例如期望改善該抗體的連接親和性及/或其他生物性質。該抗體的胺基酸序列變異物，藉由使適當核苷酸改變導入編碼該抗體的核酸或藉由胜肽合成而製造。此修飾包括，例如該抗體胺基酸序列中缺失及/或插入及/或取代殘基。任何缺失、插入、及取代的組合是為了達成最後建構物，是該最後建構物具有所欲的特|生。該胺基酸改變也可以？文變該抗體的後轉譯過程’例如改變糖基位的數目或位置。鑑定該抗體徵具有較佳突變位置的特定殘基或區域的有效方法稱為，’丙胺酸掃描突變”（c_ingh⑽仙化山

Science，244:1 08卜1 ()85( 1 989))。目標殘基的一個殘基或 -群殘基已被確定(例如帶正電的殘基，例如响、二： his、lys、glu)及以天芦或帶t蕾呈、次T負電胺基酸取代（最佳為丙胺酸或多丙胺酸進而影響胺基酸與抗原的作用。聲取代具有功能上敏感性的這些胺基酸位置，之制代位置進-步被導入或導入其他變異物而被精製。因此， 2125-9924-PF;Susan 99 200920405 田導入胺基酸序列變異的位置已被確定，該突變物的本質不而要確疋。例如，為了分析在固定位置上突變的表現，在目“雄碼子或區域上進行丙胺酸掃描或隨意突變，以所而要的活性篩選表現的抗體變異物。胺基酸g列的插入包括胺基S欠及/或羧基端的融合，長度範圍由1個殘基至具有百個或以上殘基的多胜肽，以及單一或多個胺基酸殘基的序列間插入。末端插入例如具有.端甲硫胺醯殘基的抗體，或與細胞毒素多胜肽融合的抗體。其它抗體分子的插入變異物包括酵素或多胜肽與抗體的N_端或^端融合，與多胜肽融合可增加該抗體的血清半生期。其他型態的變異物為胺基酸取代變異物。這些變異物具有該抗體分子中的至少一個胺基酸殘基被不同殘基取代。抗體取代突變物的最佳位置包括高度變異區，但FR改變也考慮在内。該抗體生物性質中的取代修飾藉由選擇效應明顯不同的取代，維持（a)該多胜肽在取代區域的骨架結構所形成’例如片狀或螺旋狀結構；（b)目標位置的分子帶電性及疏水性；或者（c)侧鍵。根據通常側鏈性質將天然發生的殘基分為以下群組： (1 )疏水性：正亮胺酸、甲硫胺酸（met)、丙胺酸（ala)、绳胺酸（val)、亮胺酸（leu)、異亮胺酸（ile); (2 )天然親水性.半脱胺酸（C y S )、絲胺酸（s e『）、蘇胺酸（thr); (3) 酸性：天門冬胺酸（asp)、榖胺酸（giu); (4) 鹼性：天門冬醯胺酸（asn)、榖胺醯酸（g 1 n)、組胺 2l25-9924-PF；Susan 100 200920405 ' 酸（hls)、賴胺酸（lys)、精胺酸（arg)·; φ (5) 影響鏈排列的殘基：甘胺酸（gly)、脯胺酸（pr〇); 及 9 < (6) 芳香族：色胺酸（ΪΓρ)、酪胺酸、苯丙胺酸 (phe) ° 非保留性的取代將繼續使上列群組之一中的一殘基與另一群組者交換。未涉及維持抗體適當的型態結構的半胱胺酸殘基，也可被取代，通常是以絲胺酸取代，以改善分子氧化穩定性及預防異常的交聯。相反地，半胱胺酸鍵可加到抗體中，以改善其穩定度（特別是當該抗體是片段如Fv片段）。取代的變異物特別較佳型態為取代親代抗體（例如人型化或人抗體）的一個或以上的高度區域殘基。通常被選擇進一步發展的變異物，具有與產生其的親代抗體相關的改良生物性質。產生該取代變異物的一簡便方法是使用噬菌、體顯現（phage display)進行親和性成熟化。簡單地說，使數個高度變異區域（例如6_7個區域）突變，在每個位上產生所有可能的胺基取代物。因此產生的抗體變異物，當與包於線形噬菌體顆粒中的M13基因丨丨〗產物融合，以單價形式（monovalent fashion)由線形噬菌體顆粒顯現。然後篩選此噬菌體-顯現變異物的此述生物活性（例如連接親和性）。為了確定修飾用的候選的高度變異區域，進行丙胺酸掃描突變，以確認明顯對抗原連接有關的高度變異區域殘基。或者，或額外加上，分析該抗原_抗體複合物的結晶結 2125-9924-PF;Susan 101 200920405 構’確認抗體與抗原的接觸點。根據此述技術，此接觸殘基與相鄰殘基皆為取代作用的候選者。一旦形成此變異物後’將此變異物的調查對象進行如上述㈣選，在一或以上相關分析中，I有最純質的抗體被選做進一步發▲。該抗體的胺基酸變異體的其他型態，改變該抗體的原始糖基化型態。改變意指該抗體中缺少一個或以上碳水化合物部份’及/或增加—個或以上不位於該抗體上的糖基位置。多胜肽的糖基化通常為.連接或〇 —連接。N —連接表示該碳水化合物部份附著於天門冬胺酸殘基的側鏈。天門冬胺酸-X-絲胺酸及天門冬胺酸_χ_蘇胺酸的三胜肽序列，其中X為任何胺基酸（除脯胺酸以外），為該碳水化合物部份附著於天門冬胺酸側鏈的酵素化附著的辨識序列。因此，多胜肽中這些三胜肽序列任一個的存在’產生一潛在的糖基化位。0-連接糖基化表示至少一個Ν_乙醯基半乳糖胺、半礼糖、或木糖醇附著於羥基胺基酸、通常的絲胺酸或蘇胺酸的附著，也可使用5_羥基脯胺酸或5_羥基賴胺酸。抗體糖基化位置的增加由改變胺基酸序列以習知方法 70成，該胺基酸序列包含一個或以上上述的三胜肽序列（對 Ν-連接糖基化位置）。此改變也可由一個或以上的絲胺酸或蘇胺酸殘基增加、或取代原始抗體的序列（對〇_連接糖基化位置）。編碼該抗體胺基酸序列變異物的核苷酸分子，可由多種習知方法製造。這些方法包括自天然來源分離（當其為天然發生的胺基酸序列變異物）或由寡核苷酸媒介（或位 2125-9924-PF;Susan 102 200920405 置導入）的突變、PCR突變、及一早期製造的變养物或該抗體非變異型態的卡匿式突變。本發明中較佳修飾抗體以改善效應物功能，例如促進 • · 該抗體的抗原依賴細胞媒介的細胞毒性（ADCC )及/或補體依賴細胞毒性（CDC )。可藉由使一個或以上胺基酸取代物導入抗體的Fc區域。或者或額外地，將半胱胺酸殘基導入 Fc區域’因此使此區域形成雙硫鍵。因此產生的同二聚體 (homodi meric)抗體，可改良内在化能力及/或增加的補體_ 媒介細胞殺手及抗體依賴的細胞毒素（ADCC)(Caron et al., J. Exp Med 176:1191-119591992) and Shopes, B. J Linmunol 148:2918-2922(1992))。具有加強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體可使用異雙功能（heterobifunctional)交聯劑製造（Wolff et al.， Cancer Research 53:2560-2565(1993))。或者，以基因工程製造具有二元Fc區域的抗體，且因此具有加強的補體胞溶及 ADCC 能力（Stevenson et al.， Anti-

CancerDrugDesign 3:2 19-230(1989))。為了增加該抗體的血清半生期，可使救助受體 (salvage receptor)連接抗原決定區連接於抗體（特別是抗體片段）（USP No. 5, 739, 277)。此述”救助受體連接抗原決定區”為IgG分子（如IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4) 的Fc區域的抗原決定區域’I gG分子負責增加生體内的IgG 分子的血清半生期。本發明將於以下實施例說明本發明各方面，並不限制 2125-9924-PF;Susan 103 200920405

的方法與材料如下所述。此述的所有技術及科學用語為此發明知識者通常了解者。雖然相似或等同可用於本發明的實施或測試，但適當本發明將進一步說明於不限於申請專利範圍。實施例步說明於以下實施例中，本發明範圍並本發明將進一步說明於以下實施例中，本發明範圍並不限於申請專利範圍。 [實施例1 ]通用方法細胞株 C0S7 細胞株、及 pc 細胞株 LNCaP、22Rvl、PC-3、 DU-145 、 C4-2B 皆購自 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville，MD)，LNCaP 衍生的 HRPC 細胞株 C4-2B 購自 ViroMed 實驗室（Minnetonka，MN)。通過超過 30 次的 LNCaP 定義為 LNCaP(HP)，LNCaP(HP)與 LNCaP 不同在於低通道型態及基因表現型態。兩者皆生長於dmem培養基（Delbecco， s modified Eagle’ s medium)(Invitrogen

Carlsbad，CA) ’此培養基中添加 10%胎牛血清（Gemini Bio-Products, West Sacramento，CA)及 1%抗生素/抗黴素溶液（Sigma-Aldrich，St. Louis, M0)。細胞維持在 37°C 5%C〇2 濕氣中。半定量RT-PCR 2125-9924-PF;Susan 104 200920405 從前述冷;東pc組編φ έ± Dr 巧〒純化PC細胞與正常前列腺上皮細胞（Tamura K et al η * ι，Cancer Res 2007 67:5117-25)。經HRPC患者告知同意辆讲者s，丨& μ / , 、·工k月歹_J腺針組織切片檢查、骨組織切片檢查、TUR-P(前列^的穿尿道切片）、及，，溫，，體解剖，獲得組織樣本。無荷爾蒙的前列腺癌（HNPC)樣本獲自未治療可手術案例，進行放射性前列腺切片，正常的前列腺上皮細胞（NPEC)獲自良性前列腺增殖（BpH)患者及膀胱癌患者，这些患者已確認未顯現前列腺癌或piN組織病理。如上述方法微解剖HRPC細胞、荷爾蒙治療無效的前列腺癌細胞及正常前列腺上皮細胞（Tamura κ et ai.，cancer

Res 2007 67:51 1 7-25)。從此等樣本中獲得的RNA被注入於T7為主的RNA放大作用兩回（Epicentre Technologies, Madison, WI)，隨後分析單股cDNA。使用RNeasy套組 (QIAGEN，Valencia，CA)根據生產者建議萃取人HRPC細胞株的整體RNA。被萃取的RNA以無RNA酶的DNA酶組（QIAGEN) 處理’使用d(T)12-18引子及超轉錄本（Superscript)II 反轉錄酶（Invitrogen)反轉錄成單股cDNA。使用以下引子序列。召-肌動蛋白（ACTB) 順向：TTGGCTTGACTCAGGATTTA (SEQ ID N0.6) /3 -肌動蛋白（ACTB) 反向：ATGCTATCACCTCCCCTGTG (SEQ ID N0.7) PKIB 順向：GGCACATACTAGAAGCAAAATACG (SEQ ID NO. 8) PKIB 反向：GATGGGCAAATCATTCTTGGTA (SEQ ID N0.9) 2125-9924-PF;Susan 105 200920405 NAALADL2 β. e> 順向：GAAAGCATCTCACATTGGTTTTC(SEQ ID ΝΟ.ΙΟ) NAALADL2 反向：GGGTTTCAAAGAGAAACTCTGCTCSEQ ID NO. 11) NAALADL2-2 順向：GAAGCAAAATGCCAGATGGT(SEQ ID N0.12) NAALADL2-2 反向：TCCTGCACAGTGTTCTAGAAAGG(SEQ ID N0.13) EST與NAALADL2基因間的連接以RT-PCR確認。確定 RT-PCR指數相，使半定量比較來自相同反應的各cDNA。每一 PCR操作流程為起始變性步驟98°C、30秒，進行22回（對 ACTB)或 23 回（對 PKIB、NAALADL2)，之後，98°C、10 秒； 55°C、5秒；721、30秒，使用基因放大PCR系統9600(PE Applied Biosystems, Foster, CA) ° 北方點潰分析來自7個PC細胞株的所有RNA以RNeasy套組（QIAGEN, Valencia, CA)萃取，進行北方點潰分析。使用mRNA純化套組（GE Healthcare)根據操作手冊純化mRNA。在1%變性瓊脂膠上分離1 A g系列稀釋、來自PC細胞株、及分離自正常人心、肺、肝、腎、腦、及前列腺（BD Bioscience, Palo Alto, CA)的mRNA，再轉印到奈隆膜上。使用上述引子以 PCR製作一針對PKIB的261bp探針。使用以下引子以PCR 製作一針對NAALADL2的700bp探針，該引子為：順向 5’ -ccagtgcccagaaaccaata-3 (SEQ ID NO· 14)及反向 2125-9924-PF;Susan 106 200920405 5( -tcaattcttcccatccaagaca-3' (SEQ ID NO. 1 5)。根據

Megaprime DNA 標記系統（GE bioscience, UK)的指示，進行與自由引子的 α 32P-dCTP-標記探針雜交。預先雜交、 • · 雜交及清洗皆根據供應者建議操作。該點潰以-80°C強化掃描7天而被自動放射照相。小干擾RNA(siRNA)-表現建構物及轉移感染剔除PC細胞中内源性PKIB及NAALADL2表現，使用 psiU6BX3. 0載體表現短髮夾形RNA對抗前述的目標基因 (Tamura K et al·， Cancer Res 2007 67:5117-25)。對 PKIB的siRNA的合成寡核苷酸之目標序列如下： sil ： GCCCTAAGCAGCATGTGTA (SEQ ID NO.16)； si 12 ： GCAGTAGGCACTTAAGCATCSEQ ID NO. 17)； sil3: GATGCAAAAGAGAAAGATG(SEQ ID N0.18)。對NAALADL2的s i RNA的合成寡核苦酸之目標序列如下： si#690 ： GACTCAGTGGACCTCTTTG(SEQ ID NO.19)； si#913： GTCATCGATGTGAGTTATGCSEQ ID NO.20)； si#1328 ： GAGTCGTCAGCTGCAAGTCSEQ ID NO.21)； &siEGFP:GAAGCAGCACGACTTCTTC(SEQIDN0.22)Gt 為負控制）。將PC細胞株22Rvl及LNCaP(HP)或C4-2B細胞塗舖於 10公分直徑盤或6孔位盤，以設計對PKIB或NAALADL2表現 siRNA 的質體（8// g/盤、3// g/孔位），使用 FuGENE6(Roche)根據操作手冊進行轉移感染。7天後以 2125-9924-PF;Susan 107 200920405

GeneticirUSigma-AldricyoJmg/ml 篩選細胞，然後收集細胞，分析在PKIB或NAALADL2表現上的剔除效應。使= 上述引子進行PKIB或NAALADL2的RT-PCR。關於細胞群形成分析’將表現siRNA的轉移感染物在含有Geneticin的培養基中生長20天’然後以100%甲醇固定，以〇1%結晶紫-H20染色轉移感染的細胞，達到細胞群形成。使用細胞計數器套組-8(DOJINDO，Kumamoto, Japan)計算細胞存活率。在含有Geneticin培養基中培養20天後，加入溶液使最終濃度為1 0%。繼續在37。(：培養2小時，以微盤讀數器 5 50 (Bio-Rad，Hercules，CA)測量 49Onm 及 630nm 的吸光度。本發明亦根據si#90合成雙股RNA為 5’ -GACUCAGUGGACCUCUUUGGG-3’ （SEQ ID NO· 23); 及 5’ -CAAAGAGGUCCACUGAGUCUU-3，（SEQ ID NO. 24); 或者形成負控制組siRNA雙股 (GCAGCACGACUUCTUUCAAGTT) (SEQ ID NO. 25)及 (CUUGAAGAAGUCGUGCUGCTT) (SEQ ID NO. 26)；皆轉移感染到另一表現NAALADL2的PC細胞株，即 C4-2B細胞。免疫細胞化學

編碼PKIB或NAALADL2開放閱讀框架的cDNA，以PCR 放大，將此PCR-放大產物選殖到pcDNA3.1( + )/niyc-HisA 載體（Invitrogen) 或 pIRES/HA(Clontech/BD 2125-9924-PF;Susan 108 200920405

Bioscience)。將此質體塗舖於玻璃蓋玻片（Bect〇n Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)，使用 FuGENE6(Roche)根據操作手冊進行轉移感染到C0S7。經過 48小時培養後’以4%三聚甲搭（paraformaldehyde)固定此細胞，並在在室溫下以溶於PBS的0. 1% Triton X-100處理1分鐘，使此細胞具有通透性。以含有3% BSA的PBS在室溫下處理3 0分鐘，阻斷非專一性的連接。在室溫下以含有41% BSA的PBS稀釋的抗-Myc抗體（Santa Cruz)或抗-HA 抗體（S i gma)培養細胞6 0分鐘。以PBS清洗後，室溫下以 FITC-共輛的次級抗體（Santa Cruz)染色細胞60分鐘。以 PBS清洗後，以含有4’ ，6’ -二-2’ -苯基引躲醯基二鹽酸 (DAPI)的 VECTASHIELD (VECTOR Laboratories, Inc, Burlingame，CA)包埋此樣本，以光譜共焦掃描系統（Leica， Bensheim，Germany)觀察。 PKIB與PKA-C間的作用將PKIB-Myc與HA-PKA-C表現載體共轉移感染到22Rvl 細胞中’經過 48 小時後，以溶胞缓衝液[50mM Tris-HCL(pH7. 0)、25 0mM 嚴糖、lmM DTT、l〇mM EDTA、ImM EGTA、5mM MgCl 2 ] ’ 胞溶此細胞。以抗-Myc 抗體（Santa Cruz) 或抗-HA抗體（S i gma)免疫沉澱此細胞溶解物，將此免疫沉殿物進行以抗-M y c抗體或抗-Η A抗體的西方點潰分析。 PKA-C定位本發明根據序列 sil (5’ -GCCCUAAGCAGCAUGUGUAUA-3’ ）（SEQ ID NO. 27)及 2125-9924-PF;Susan 109 200920405 (5，-UACACAUGCUGCUUAGGGCUU-3’ ）j：SEQ ID NO. 28)更有效地剔除内源的PKIB，而合成RNA雙股。此RNA雙股使用脂轉移感染素（Lipofectamin 2000 ) (Invitrogen)根據操 • ·

作指示，轉移感染到PC-3細胞。經過48小時培養後，以 4%三聚甲齡（paraformaldehyde)固定此細胞，並在在室溫下以溶於PBS的0. 1% Triton X-100處理1分鐘，使此細胞具有通透性。以含有3% BSA的PBS在室溫下處理30分鐘’阻斷非專一性的連接。此細胞在室溫下與含有1 %BSA 的 PBS 以 1:200 稀釋的抗-PKA-C 抗體（C-20, Santa Cruz) 培養60分鐘。在以PBS清洗後，室溫下以FITC-共軛的次級抗體（Santa Cruz)染色細胞60分鐘，以光譜共焦掃描系統觀察。為使細胞溶解物分層’使用脂轉移感染素 (Lipofectamin 2000 ) (Invitrogen)根據操作指示，將此 RNA雙股轉移感染到LNCaP(HP)細胞。經過48小時培養後，收集細胞，以NE-PER核與質萃取試劑（pierce)分層此細胞溶解物。取此分層的細胞溶解物30从g蛋白質，使用抗 -PKA-C抗體及抗-iaminB抗體（Caibiochem)作為裝料及核分層控制’進行西方點潰分析。 PKIB-過度表現細胞的產生及試管内/生體内生長分析編碼PKIB的開放閱讀框架的cDNA，以PCR放大，將此PCR-放大產物選殖到pIRES/HA(Cl〇nteCh/BD Bioscience)。使用FuGENE6(R〇che)根據操作手冊，將此質體轉移感染到無PKIB的PC細胞株Din45。以〇 6mg/ffli 的Geneticin(Invitr〇gen)蒒選細胞群，經限制稀釋次選 2125-9924-pf；Susan 110 200920405 *〆.殖選殖株DU145。由上述rt-Pcr確認PKIb的表現，建立表現PKIB的三選殖株。以空的pIRES/HA載體轉移感染控制組DU 14 5細胞，也建立如Mock細胞。這些建立的選殖株的生長曲線以細胞計數套組-8(D0JIND0)測量。 ·_ 關於生物體内的生長分析，取兩個穩定選殖株與兩個 Mock選殖株各2x 1 06細胞，分別培養於左雄裸鼠的右側及左側。抗體的生成與免疫組織化學取來自人 PKIB 的兩胜肽（SARAGRRNALPDIQSSAATD(SEQ ID N0:33);及 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEKCSEQ ID NO:34))，使兔免疫’免疫血清根據基本方法學在與每一胜肽抗原共輛而以Affi-Gel 1〇活化的親和性培養基（Bi〇_Rad

Laboratories’ Hercules, CA)包裹的親和性柱上純化。來自PC組織的習知切片由手術切片樣本獲得，hRPC組織獲自切片及 TUR-P(Tamura et al. Cancer res 67，5117-25, 4 2〇〇7)。將此切片去除石蠟’在l〇8t下培養於Dako細胞形成標的復原溶液高pH(Dak〇，Carpinteria，CA)15分鐘。在阻斷内源性過氧化酶及蛋白質後，此切片室溫下培養於抗-PKIB抗體（1:100稀釋）60分鐘。以pBS清洗後，以標s己抗兔免疫球蛋白（Envisi〇r] kit，Dak〇)的過氧化酶進行免疫偵測。最後，以3, 3，-二胺聯苯胺（Dako)使此反應物進展。使用蘇木素計數染色。

Akt磷酸化根據上述的序列sil或PKIB表現載體（pcDNA3.1/ 2l25~9924-PF;Susan 111 200920405 HA-PKIB) ’使22Rv卜LNCaP或PC-3細胞轉移感费PKIB募 s 1RNA ’ 48小時或24小時後收集細胞。接著以含有蛋白酶抑制劑（蛋白酶抑制劑雞尾酒組π丨；CALBI0CHEM)的RIPA 緩衝液（50mM Tris-HCl [ρΗ8. 0]、150mM NaCl、UNP-40、〇· 5%deoxyCh〇rate-Na、〇. 1%十二烷基硫酸鈉[SDS])，使該細胞胞溶。以SDS-聚乙醯胺膠分離該蛋白質樣本，並經過電點潰將該蛋白質樣本轉到PVDF轉移膜（GE Healthcare

Bio-sciences)上。以兔單株抗—磷酸-Aktl(Ser473)抗體 (Cell signaling)、兔單株抗-Aktl 抗體（Cell signaling)、或鼠單株冷―肌動蛋白（ACTB)抗體（Sigma)培養上述點潰物。經過加強的化學螢光（ECL)西方點潰偵測試劑（GE Healthcare Bio-sciences)，使蛋白質帶顯現可目視。基質膠（Matr igel)侵入分析以表現 PKIB 的質體（PcDNA3.1/HA-PKIB)或模擬（mock) 貝體轉移感染得NIH3T3細胞’接近匯集生長於含有1 〇%j?BS 的DMEM培養基中。以胰蛋白酶收集此細胞，在不添加血清或蛋白酶抑制劑下以DMEM清洗細胞，並將此細胞以濃度 5x1 0 /ml懸浮於DMEM中。在使細胞懸浮前，室溫下以j)MEM 再水解基質膠（Matrigel)基質（Becton Dickinson Labware) 的乾燥層2小時。每一較低腔室加入含有1 的 DMEM(0· 75ml )，經過基質膠（Matr igel)入侵的細胞如上述以Gimsa固定、染色。 [實施例2] PKIB與NAALADL2在PC細胞中過度表現 2125-9924-PF;Susan 112 200920405 ♦ 4 :气全基因cDNA微陣列分析HRPC細胞（Tamura et al. CanCer res 67，5117-25，2007)，篩選數個反活化基因，本發明專注在PK1B與NAALADL2。在九種微解剖HRPC細胞群中，以RT-PCR確認pKIB過度表現有五種（第丨人圖），在九種微解剖HRPC細胞群中，以RT_pcR碹認naaladl2過度表現有五種（第2A圖）。 =匕括^肺、肝及腎的正常器官中，此二基因的表現最低而相較於荷爾蒙敏感或無荷爾蒙敏感的pC細胞， HRPC細月已呈現此二基因較高表現。使用π I b的片段作為探針進仃北方點潰法，確認專—於胎盤及^細胞株的 =1.3-kb轉錄本，但在包括心、肺、肝、腎及腦的任何器中都’又有表現（第1β圖）。使用NAALADL2的π·片段作為探針進行北方點潰法，確認專一於pc細胞株的約 kb 5 kb轉錄本的三條帶，但在包括心、肺、肝、腎及腦的任何器官中都沒有表現(第2B圖據刀析及RT-PCR橫跨的NAALADL2編碼區域，推測這三條帶反應3’ UTR變異。形成人㈣專—的多株抗體、，亚使用41個臨床pc組織（包括⑴固荷爾蒙敏感或無荷爾蒙敏感的PC及9個聽）進行免疫組織化學分才斤，用以明確在PC細胞中沾DlrTt> jp , + 勺PKIB蛋白表現。根據北方點潰分析及 RT-PCR 分析，pin(第士义 Q弟1C圖）及正㊉刖列腺上皮細胞（第^公圖N才曰才不）對Ρκΐβ顯示弱染色⑴，無荷爾蒙敏感的％細胞中32個中有1〇個⑶%)也顯示對ρκΐβ弱或"色 (+)(第1D圖）。另々^ ^ ^ 』另外，無何爾蒙敏感的PC細胞中32個中 2125-9924-PF;Susan 113 200920405 有22個（69°/〇)(第1E圖）及所有6個HRPC(第IF圖）顯示對 ο0 PKIB有強的正染色（+ +或+ + + )，此與來自RT_pCR分析結果相符。而且’所有（9個/9個）無荷爾蒙敏感的PC細胞及 HRPC細胞以格里森（Gleas〇n)等級5(第1E圖）顯示，對pKIB 有強的正染色’且PK IB表現與格里森（Gleason)等級有強的相關性（見表 1，Chi-square test，p = 1. 35xl〇-y，推測 PKIB的表現可指引Pc的惡性表型及差的預後。

表1臨床PC細胞中PKIB表現與格里森級數(gs)的相關性 PKIB的表現 +++ ++ + HRPC 979 - ： HNPC 10/32 12/32 8/32 格里森級數5 7/9 2/9 - 格里森級數4 2/11 7/11 2/11 格里森級數3 1/12 3/12 6/12 (+++及其他：Ρ=1. 35x10, [貫施例3 ] PC細胞株中以s i RNA剔除PKIB 2/32 2/12 為調查PKIB異常表現的潛在生長促進角色，建構數個 siRNA-表現載體，檢查ρκΙΒ_表現的pc細胞株，22Rv丨及 LNCaP(HP)細胞的剔除效應。當sU舆si2建構物轉移感染 22Rv：L細胞（左）及LNCaP(HP)細胞（右）時，以半定量RT_pcR 觀祭到顯著的剔除效應，但#3si及負控制siRNA建構物 siEGFP則無（第3A圖）。在含有Geneticin的培養基中篩選後，進行MTT分析（第3B圖）及細胞群組形成分析（第％圖），涊為sil及Si2導入22Rvl細胞（左）及LNCaP(Hp)細胞（右）時，大量地減少細胞生長或存活率，然而使用其他不影響PKIB表現的siRNA，則不影響細胞生長，顯示 2125-9924-PF；Susan 114 200920405 可能在pc細胞存〆^舌率上扮演重要角色。 [實施例4] PC細胞株中以siRNA剔除NAAUdl2 為調查NAALADL2異常表現的潛在生長促進角色，建構數個siRNA-表現載體，檢查NAALADL2_表現的％細胞株， 22Rvl細胞的剔除效應。當si#69〇建構物細胞時，以半定量™觀察到顯著的剔除上= 建構物則無（第4A圖）。在含有Geneticin的培養基"天後篩選後，進行MTT分析（第4B圖）及細胞群組形成分析（第 4C圖）’認為si#69〇導入22Rvl細胞時，大量地減少細胞生長或存活率，然而使用其他siRNA，則呈現無naaudl2 表現的剔除效應，不影響細胞生長，顯示NAAUDL2可能在 pc細胞存活率上扮演重要角色。對應si#69〇或負控制組 siRNA雙股的合成rna雙股，轉移感染至另一 naalaj)L2_ 表現PC細胞株C4-2B細胞。RT-PCR顯示si#690 RNA雙股清楚剔除C4-2B細胞中内源的NAALADL2表現（第4D圖）， MTT分析顯示si#690 RNA雙股也抑制C4_2B細胞的生長。 [實施例5] PKIB及NAALADL2蛋白的次細胞位置使用建構的哺乳類表現載體，表現標籤化-全長的pKIB 及NAALADL2蛋白，使用抗標蕺抗體進行免疫細胞化學分析’調查其次細胞位置。如第5圖所示，外源性ρκ IB位於細胞質（第5Α圖），外源性NAALADL2蛋白位於細胞膜（第 5Β圖）。NAALADL2具有一穿膜部分，預測其位於細胞膜，如第Π型膜蛋白。此數據支持此論，且支持NAAlaDL2蛋白可能為第II型膜蛋白 2125-9924-PF;Susan 115 200920405 [實施例6] PK〗B與PKA-C間的作用及剔除ρκΐΒ的PKA-C 移位作用 PKIB屬於PKI (蛋白激酶A抑制劑）族，ρκ I a可抑制蛋白激酶A催化次單元（PKA-C)的激^活性，並藉由直接連接至PKA-C經其偽基質結構（RRNA ; SEQ ID N0 : 31)使PKA-C 自細胞核輸出至細胞質（Glass DB et al.，J Biol Chem 1986 261:12166-71 ； Wen W et al., j Biol Chem 1994 269:32214-20)。PKIB也具有偽基質結構（RRNA)，但其抑制活性較 PKIA 更小（Gamm DM et al.，J Bi〇i Chem 1995 270 : 7227-32)，對於細胞内移位pka-C的活性則未知。為調查PKIB是否有關於PKA-C的位置，首先明確pkib與 PKA-C間的作用。ρκΐΒ-Myc與HA-PKA-C表現載體共轉移感染至22Rv 1細胞，其細胞胞溶物以標籤抗體進行免疫沉澱。第5C圖顯示PKIB-Myc與PKA-C共同免疫沉澱，反之亦然’顯示PKIB與PKA-C間有直接作用。其次’以免疫細胞化學分析及細胞分層，檢查剔除PKIB 的PC-3細胞或LNCaP(HP)細胞的内源性PKA-C次細胞位置°免疫細胞化學分析觀察到，當控制組s i DNA轉移感染到PC —3細胞時’多數PKA-C位於細胞質，PKA-C蛋白的一些訊號位於細胞核（第5D圖，左）。另外，當s i RNA剔除 PC-3細胞内的内源性ρκ〗B，免疫細胞化學分析顯示細胞核内無或非常微量的PKA-c訊號（第5D圖，右）。相同情形在其他PKIB-表現的pc細胞株LNCaP(HP)細胞中觀察到。為了定量分析細胞核内的PKA-C，以PKIB siRNA處理的 2125-9924-PF；Susan 116 200920405 LNCaP(HP)細胞的胞溶物進贫分層。如第5E圖所示’細胞核内的PKA-C量在PKIB剔除中明顯減少，相較於控制組S1RNA，但在細胞質中PKA_C量在PKIB剔除中有少許增加。這個發現指丨⑻B可加速 PKA-C進入細胞核或抑制pKA_c移出細胞質，不同於的細胞核移出功能。 [實施例7] ΡΚΙΒ的過度表現促進pc細胞生長為了調查PKIB的致癌功能，從Μ145細胞中上表現外源性⑽的三個選殖株，幾乎不表1 = PKIB，這些選殖株與模擬（M〇ck) DM45細胞比較細胞生長如圖所示，二個選殖株都結構上表現外源性ρκ I b (如第6A 6B圖）’试官内（第6C圖）及生物體内（第圖）都較模擬（Mock)細胞生長較快，推測ρκΐΒ在前列腺癌中的生長促進效應。如呈現的免疫組織化學分析顯示，ρκΐβ的過度表現強烈與高格里森級數有關，顯示，ρκΐΒ與前列腺癌細胞的惡性或侵入潛能有關。再者，在細胞侵入上ρκΐΒ的可能角色以基質膠（Matrigel)侵入分析檢查。如第6Ε圖所示，以ΡΚIΒ表現載體轉移感染的ν IΗ3Τ3細胞明顯促進該細胞移動於基質膠（Matrigel)，相較於以模擬（M〇ck)載體轉移感染的細胞。 [實施例8 ] PKIB與PC細胞中Akt磷酸化有關數個報告推測PTEN的功能及Akt的活性缺少顯然與前列腺癌進程有關’而PTEN-PI3K-Akt路徑可能在HRpc進程及其惡性表型中扮演重要角色（Sellers, W. R, & Sawye;fs> 2125-9924-PF;Susan 117 200920405 C. L. (2002 ) in Somatic Genetics of Prostate Cancer: Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantof f, P. (Lippincott Williams & Williams & Wilkins, Philadelphia), Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM., Curr Cancer Drug Targets. 2007 Sep; 7(6):591-604, Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci USA 200 1; 98(13):7200-5, Feldman BJ, Feldman D, Nav Rev Cancer 2001;1(1):34-45, Malik SN, Brattain M, Ghosh PM, Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI., Clin

Cancer Res. 2002 ;8(4) : 1168-71)。然後調查，PKIB 是否影響Akt磷酸化。首先，以對應Si 1的RNA雙股剔除pc細胞株（LNCaP及PC-3)中PKIB的表現，以西方點潰分析檢查 Akt的Ser 473的Akt磷酸化。以RNA雙股剔除PKIB後以 RT-PCR確認（數據未顯示）。結果，ρικΒ的剔除明顯影響 PC細胞中Akt磷酸化（第7A圖）。再者，如第7B圖所示，也觀察到PC細胞中PKIB過度表現明顯促進Ser 473位置的Akt磷酸化。認為pKIB直接與PKA_C激酶作用，可能影響PKA-C的功能’並確認了 ρκΑ-C激酶的過度表現也促進

Ser 473位置的Akt填酸化（第7A圖）。這些發現顯示ρκΐΒ 關於PC細胞中Akt磷酸化（Ser 473)，可能是經由pKA_c 激酶功能的修飾。其次，如第7 β圖所示，觀察到pC細胞中ρκΐΒ的過度表現促進Akt磷酸化。認為PKIB可直接與與PKA_C激酶作用及改良PKA-C的功能，並確認了 PKA_C激酶的過度表 118 2125-9924-PF；Susan 200920405 f » •現也促進Akt磷酸化（第7C圖）。這些攀現顯示PKIB與Akt 磷酸化有關’可能是經由PKA-C激酶的修飾。而且，為了確認Akt的Ser 473磷酸化是否直接與 • > PKA-C及/或PKIB有關，使用重組pKA_c、ρκΐΒ激酶及Akt 蛋白，進行試管内激酶分析。如第7D圖所示，當PKA-C激酶與重組Akt反應時，磷酸化的Ser473-專一性抗體彳貞測到磷酸化Akt ’ Akt的磷酸化程度（ser)明顯由PKIB的增加而促進。推測以PKIB直接及具影響的pka-C激酶可磷酸化 Akt Ser473 ’與PC細胞的生長促進及進程有關。 [實施例9 ] PC組織中Akt磷酸化與PKIB過度表現最後’在臨床PC細胞中檢查PKIB的表現與Ser473位置上Akt磷酸化的關係。第8圖顯示PC組織的代表圖，比較PC組織面對面玻片中，PKIB與pAkt(Ser473)的染色圖案’顯示PC組織中PKIB的表現與Akt磷酸化的關係。表 2摘要臨床PC組織中PKIB的表現與Akt磷酸化的關係 \ (P=0.0156 ， chi2-test)。表2臨床PC組織中PKIB的表現與Akt在Ser473位置磷酸化的關係 PKIB表現 pAkt(Ser473) ++ + 一 ++(n=22) 8(36%) 10(45%) 4(18%) +(n=20) 2(10%) 11(55%) 7(35%) -(n=8) 0 2(25%) 6(75%) (P=0.0156 ，chi2-test) 討論本發明中，使用臨床 HRPC細胞的整組基因基因表現輪廊’確認前列腺癌的兩組分子目標’特別是針對荷爾蒙治 2125-9924-PF;Susan 119 200920405 '/'療無效的前列腺癌。前列腺癌Sf矛；I；日L . 勝钆貝不相對佳的預後，而荷爾蒙去除治療法有效於多數復發或轉移的κ。缺而一旦出現隱細胞，對PC患者的照顧幾乎沒有選擇。因此，先前文獻已意識到有需要對HRPC患者的新賴分子標以確認，並針對這些新顆分子進行贈c的新額治療的發展。屬於PKI(蛋白激酶a抑制劑）族一員的pkjb與ρκίΑ 可抑制蛋白激酶A化次單元（PKA_C)的激酶活性，並藉由直接連接於PKA-C’而使其由細胞核内移動到細胞質中（Glass DB et al., J Biol Chem 1986 261:12166-71 and Wen W et al· ’ J Biol Chem 1994 269:32214-20)。蛋白激酶 a(PKA) 為cAMP-依賴蛋白激酶A，通常被認為是藉由cMp啟動，媒介大範圍的生理或致病效應’與G蛋白連接，多個配位體與受體系統活化PKA訊號路徑，其活性與控制細胞生長及分化有關（Tasken K et al_， Physol Review 2004 84:137-67, and Stork PJ et al., Trends Cell Biol 2002 12:258-66)。在前列腺癌中’多個報告推測其與非雄激素依賴的生長及神經内分泌分化有關（C〇x ME et al.，J Biol Chem 2000 275:13812-8)，PKA路徑與AR路徑間的交聯通話 (cross-talk)推測與HRPC細胞的非雄激素依賴生長有關 (Stork PJ et al., Trends Cell Biol 2002 12:258-66 and Sadar MD， J Biol Chem 1999 274:7777-83)。本發明中聲稱，PKIB可加速PKA-C的細胞核内定位並促進PC細胞生長，勝於如PKI族成員，抑制PKA-C活性或 2125-9924-PF;Susan 120 200920405 PKA路徑。先前文獻也推測PKIB具有試管内一岑的抑制活性’但其Kin值非常高於PKIA，且加速pKA —c向核内移動或抑制其向核外移動，可能是pc細胞巾ρκΐβ功能的顯性。而且，ΡΚΙΒ強烈與Akt的Ser473磷酸化有關，

Akt的Ser473磷酸化在CRPC的侵略型及惡性表型中扮演關鍵角色。 NAALADL2是新穎第π型膜蛋白，屬於榖胺酸羧基胜肽酶IKGCPII)族。GCPII的前列腺型，又稱為前列腺專一膜抗原（PSMA)在前列腺癌中表現，且PSMA增加程度與pc 進展及 HRPC 有關（Rajasekaran AK ei al.，Am J Physiol

Cell Physiol 2005 288:C975-81, and Murphy GP et al.,

Prostate 2000 42:145-9)。考量 NAALADL2 與 PSMA 的同源性及相似的表現型態’此新穎分子NAALADL2應稱為pSMA2” 。PSMA為FDA證實的前列腺-象徵劑（ιιιιη_ 標籤 7E11 單株抗體（prostascint，Cytogen, Princeton， NJ))的目標’且pSMA為單株抗體如J59i的目標，已在臨床试驗上作為PSMA-表現細胞的象徵劑或治療劑的專一傳輸（Murphy GP et al.，Prostate 2000 42:145-9，and

Holmes EH, Expoert Op i n Investig Drugs 2001 10:511-9)。 PSMA除了性質如腫瘤標記物以外，PMSA具有GPC活性’ PMSA的基質包括聚-7 -榖胺酸化葉酸（Zhou J et al.， Nature Review Drug Disc 2005 41015-26)。PSMA 的酵素活性可利用為前驅藥物的設計，其中該藥的去活化榖胺酸 2l25-9924-PF；Susan 121 200920405 .化形式声擇性被切斷，因此只在表現PSMA的細胞活化 (Denny WA et al·， Eur J Med Chem 2001 36:577-95)。然而PSMA與前列腺癌進展有何關聯，完全未知’目標psMA 的功能或其活性的可能性目前也屬未知。财乩汕12在HRpc 細胞中局度表現，在正常人器官中表現則非常有限，如第 2B圖所示。NAALADL2除了其限制表現像腫瘤標記物以外， NAALADL2可此與pc存活或生長有關，此也由本文中5丨題八實驗支持。因此，對pMSA2專一的單株抗體，藉由阻斷pMSA2 的活性，可應用於pC治療，以及作為腫瘤標記物。產業上可利用性人基因PKIB及NAALADL2表現，相較於正常器官中，在刚列腺癌中顯著增加’特別是在荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。因此，此基因可便於作為前列腺癌的診斷標籤’此基因編碼的蛋白質可用於前列腺癌的診斷分析。本發明人等顯示專一性目標PKIB與NAAUDL2基因的雙股分子抑制該細胞生長。因此，此新穎雙股分子有效於抗癌症藥物的發展。例如阻斷PKIB或NAALADL2蛋白表現或避免其活性的藥劑，具有作為抗癌劑的治療用途，特別疋用於W列腺癌治療的抗癌劑，特別是荷爾蒙治療無效的月’J列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。而且，PKIB或NAALADL2多胜肽為發展抗癌醫藥的有利目標。例如，連接MIB或NAALADL2或阻斷PKIB或 122 2125-9924-PF；Susan 200920405 NAALADL2表現、或避免其活性、或抑制pm與π 的連接、或抑制舆抗韻飢2抗體的連接之藥劑二’ 現作為抗癌劑的有治療用途，特別是用於前列腺癌治療^ 抗癌齊丨肖別是荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪除盔效的前列腺癌。除無 a雖然本發明已詳細說明並附有特定實施例作為參考， i_疋不背離本發明之精神與範圍作改變與改良，對所術領域中具有通常知識者是顯而易見。【圖式簡單說明】第1A圖為半定量RT_pcR確認HRpc細胞（5/5)中mu 過度表現，但不在刪細胞中，相較於正常前列腺上皮細胞(皆被微解剖⑽1X))、所有正常前列腺組織、及重要臟器(心、肺、肝、及腎），用於定量每個。舰内容。第圖A PKIB表現的多組織北方卿點潰分析顯示在成人盗g + ’胎盤出現約h 5_kb帶，但不在重要臟器内 (。肺、肝、及腎）。PKIB表現的北方點潰分析顯示，數個PC細胞株（22Rvl及PC-3)強力表現PKIB，而其他正常成人器官則未表現PKIB。第1C_1F圖說明pc組織的免疫組織分析。帛ic圖的前列腺上皮細胞間瘤（piN)顯示ρπβ 弱染=(+ )。第ID圖的格里森級數3的pc顯示弱染色（+ )，但正常前列腺上皮細胞（N)顯示負染色。第1E圖的格里森級數5的PC顯示仙強正染色（刪。第ιρ圖的紐c顯示PKIB強正染色（+ + + )。 2125-9924~PF；Susan 123 200920405 第2A圖為七.定量rt-PCR確認的HRPC細胞（7/ll)中 NAALADL2過度表現，相較於正常前列腺上皮細胞（皆被微解剖（NPm i X))、所有正常前列腺組織、及重要臟器（心、肺、肝、及腎）。ACTB用於定量每個cMA内容。第2B圖為 NAALADL2表現的MTN點潰分析，顯示在成人器官中，僅在 PC細胞株有三條帶，約1〇 —kb ' 6-kb、及5-kb，但不在重要臟器（心、肺、肝、及腎）。第3圖顯示PKIB-siRNA在PC細胞生長上的效應。第 3A圖的RT-PCR以sil及Si2確認PKIB表現上的剔除效應，但非si3，在22Rvl細胞（左）及LNCaP細胞（HP)(右）的負控制組siEGFP。ACTB用於定量RNA。第3B圖為22Rvl細胞（左）及LNCaP細胞（HP)(右）以siRNA-表現載體轉移感染卩1(^(511、512、513)及負控制組載體（51£〇??)的1〇丁分析。在以Genet i c i η培養20天後，每個平均值以橫槓點出’表示SD(標準差）。Υ轴的ABS代表在490nm的吸光度，在630ηιη的吸光度為參考，以微盤讀器測量。這些實驗皆重複三次。以22Rvl細胞（左）及LNCaP細胞（HP)(右）的 s i 2及s i 3轉移感染，導致存活細胞大量減少，相較於無剔除效應的 si3 及 siEGFP(P<0.01,Student’ s t-test)。第3C圖為22Rvl細胞（左）及LNCaP細胞（HP)(右）由siRNA_ 表現載體轉移感染至PKIB(sil、si2、si3)及負控制載體 (siEGFP)的細胞群落形成分析。在Geneticin培養20天後，以0. 1 %結晶紫染色，可見細胞。第4圖為NAALADL2-siRNA對PC細胞生長的影響。第 2125-9924-PF;Susan 124 200920405 4A圖為RT-PCR確認22Rvl細胞中si#690的NAALADL2表現的剔除效應，但在si#913、si#1 328及負控制組siEGFP 中沒有NAALADL2表現的剔除效應。使用ACTB定量RNA。第4B圖為每個以指標siRNA-表i載體轉移感染的22Rvl 細胞對職入1^0[2(5土#690、51#913、51#1 328)及負控制組載體（siEGFP)的MTT分析。在以Genet icin培養20天後，每個平均值以橫槓點出，表示SD(標準差）。Y軸的ABS代表在490 nm的吸光度，在630nm的吸光度為參考，以微盤讀器測量。這些實驗皆重複三次。在22Rvl細胞中以si#690 轉移感染造成存活細胞大量減少，相較於其他無剔除效應的 siRNA(P〈0.01，Student’ s t-test)。第 4C 圖為每個以指標 siRNA-表現載體轉移感染的22Rvl細胞對 NAALADL2(si#690 、 si#913 、 si#1328)及負控制組載體 (siEGFP)的細胞群落形成分析。在以Genet icin培養20天後，經0. 1 %結晶紫染色可見細胞。第4D圖為藉由對應其他NAALADL2表現的C4-2B細胞的si#690所合成的RNA雙股以RT-PCR確認NAALADL2表現的剔除效應。使用ACTB定量RNA。第4E圖為對應si#690所合成的RNA雙股抑制C4-2B 細胞的細胞存活率，相較於控制的RNA雙股siEGFP(P<〇. 01， Student’ s t-test) ° 第5圖為PKIB(A)NAALADL2(B)蛋白的次細胞定位。使用抗標籤（an 1; i -1ag)抗體進行免疫細胞化學分析，顯示外源的PKIB位於細胞質，外源的NAALADL2蛋白主要位於細胞膜。第5C圖使PKIB-Myc及HA-PKA-C表現載體共同感染 2125-9924-PF;Susan 125 200920405 • * * * 22Rv 1細胞，其細胞溶解物擇由個別標籤的抗體免疫沉澱。 PKIB-Myc與PKA-C共同免疫沉澱，相反亦同，指出ρκΙΒ 與PKA-C間直接交互作用。第5D圖免疫細胞分析觀察到大多數的PKA-C位於細胞質，PKA-C蛋白質的某些訊息位於核内（左）’當控制的siRNA轉殖感染PC-3細胞時。另外，當siRNA剔除PC-3細胞的外源PKIB，免疫細胞化學分析顯示核内無或幾乎非常少的PKA-C訊息（右）。第π圖在 siRNA雙股在PC細胞中處理過後，使該細胞分為核部分及質部分’更量化分析核中的PKA-C。使用抗_PKA_C抗體及抗1 aminB抗體裝料及核部分的控制組，進行西方點潰分析上述破碎的細胞溶胞產物3〇ug蛋白質。核内的pKA_c量以 siRNA分析明顯減少於剔除ΡΚΙβ者，相較於控制的8丨龍八，當在PKIB剔除中，細胞質内的pka-C量幾乎不增加。第6A圖RT-PCR使DU145-衍生細胞株中pKIB構成表現（PKIB#1、#2、#3)清楚。第6B圖西方點潰分析法使m145_ 衍生細胞株中PKIB構成表現（ρΚΙΒ#ι、#2、#3)清楚。第 6C圖為表現高量外源PKIB(選殖株卜3)的1)1]145細胞株的體外生長率，及以模擬（mock)載體（#1、#2、#3的混合物）轉移感染的DU145細胞株的體外生長率。軸及γ_轴代表種下細胞後相關生長率的天數，以第i天的吸光度為控制組，計算吸光度。pkIB-過度表現細胞生長較模擬（m〇ck) 細胞快，推測PKIB在前列腺癌中有生長促進效應。第6乃圖為培養穩定表現PKIB(右）的2xl〇sDUl45細胞或模擬 (mock)細胞（左），給予雄裸鼠。培養15週後，只在右側形 2125-9924-PF;Susan 126 200920405 成腫瘤（PKIB + + ;箭頭），左侧無（模擬（M〇ck))。第6E圖為基質膠（Matrigel)侵入分析，發現在PKIb表現載體轉移感染後NI Η 3 T 3細胞的侵入本質。γ軸代表細胞遷移到基質膠 (Matrigel)塗佈過濾膜的細胞數。該分析進谷三次，每個平均值以橫槓點出’表示SD(標準差）。PKIB過度表現明顯促進NIH3T3細胞的侵入本質（P = 〇. 〇〇52)。第7A圖由LNCaP中siRNA雙股剔除ΡΠΒ (siPKIB)及 PC-3細胞導致Akt的Ser473磷酸化減弱。siEGFP雙股的轉移感染為負控制組。PKIB的剔除由RT-PCR確認，ACTB 為給料控制。第7B圖為PKIB的過度表現促使pc-3及22Rvl 細胞中Akt的Ser473磷酸化。PKIB的過度表現由HA-標蕺抗體以西方點潰分析確認。第7C圖為PKA-C的過度表現由 HA-標藏抗體以西方點潰分析確認，Akt總量為給料控制。第7D圖為使用重組ρκΐΒ與PKA-C蛋白進行試管内Akt激酶分析。Akt-Ser473的磷酸化由抗-磷酸-Akt(Ser473)抗體偵測（細胞訊息），Akt總量由抗- Akt抗體偵測。ρκIB加到PKA-C激酶使試管内Akt-Ser473磷酸化顯著增加。第8圖顯示PKIB表現在臨床PC組織中與Akt磷酸化有關。圖顯示PC組織面對面玻片的免疫組織化學分析，a 為PKIB’ B為破酸化Akt 。【主要元件符號說明】無。 127 2125-9924-PF;Susan 200920405 序列表 <110〉腫瘤治療科學股份有限公司 <120>.以PKIB及NAALADL2作為治療及診斷前列腺癌之目標基因

<130> ONC-A0718P <150> US 60/957, 853 <151〉 2007-08-24 <150> US 61/036,030 <151〉 2008-03-12 <160〉 36 <170〉專利版本3. 4

<210> 1 <211> 1909 <212〉 DNA <213〉人（Homo sapiens) <400> 1 60 120 180 240 300 360 ggaaaaaagc taccgtggca cgtgccccgg ggagtgatgc ggtggcccgg tttgcacgga gagcgggaca ccgcctgggg agccgcgctc gtagcctggg ggcgggacgc ggcggccgct ccctccgccc ccgagtagct gccaccgcct ggctgcgccc cagcccagta gctcagacgc ggccgcatcc cggtggactg tagaggcggc agcgagctag agcccgagtc gcagctccgg gccgcagagc gctgggcgag cgcgagcgcc agggcaccgg cagggcaggc agctgcgcgc ggctggagtc atgctatact gaaaagacac ttcatcaaga taactctggg agaagcagaa aaccctgtgc cagggacagg aaagatagga gaaagaaagt ttatcagaat tttttaaacc 420 1 200920405 ^ tgtctcagaa ataacaacat attttaatca gagatttatg ttgctatgag gacagattca 480 tcaaaaatga ctgacgtgga gtctggggtc gccaattttg catcttcagc aagggcaggc 540 cgccggaatg ccttaccaga catccagagt tcagctgcca cagacggaac ctcagatttg 6Q0 cccctcaaac tggaggctct ctccgtgaag gaagatgcaa aagagaaaga tgaaaaaaca 660 acacaagacc aattggaaaa gcctcaaaat gaagaaaaat gaaggctcat aatctatcaa 720 gagtgctgaa tttctgcatg ttgaaagact tagtggttct gttttcttga gacatttaat 780 ctggtggtaa ctgtggtaac attgcagccc taagcagcat gtgtatatta gataattgtg 840 ttgtgatgct actcactttg attgcaatga tgatgtccaa ggtaagctat taaaaggcag 900 gttacttcca aatcgcactg aaggaaaagg ttaagaataa tacatgatca cagaaatgca 960 taccactgtc tgtaaaccca acaaaattca ctgttctctt ttggatttat ttagcctgat 1020 gtatttttaa ttcaattttt atggtgatgg gcaaatcatt cttggtaaat gtaaatcaaa 1080 catgattgat ttaaaacttc atggaatttg tagaaaatta tggacatttt tggtgagaaa 1140 gaacaatagt caaaactcac atggatagag tgtgtttgtt ttttgccaaa aatgccccag 1200 actttttccc aaacctcaaa aacgtcttgg aaaaattgta aaagtttgat aacagaaaca 1260 tctttaggat atttttgtct gacatatttt gcttctagta tgtgcctact gtgatttttt 1320 tcatgtggaa aatgcaaaat ttgtaacaaa atggttatat ggaacatgcc tattaaatga 1380 attttactat cttccctaac tttggtctgt gtatgtgtgt gtgttttact ttaatatgaa 1440 ttatacaaaa tactagttgt tttacactct cttttcttat tcttagggct tttgtgtatg 1500 tctgacttgt ttttaaataa cttcctcagc aatgcagacc ttaattttta tattttttta 1560 200920405 1620 1680 1740 1800 1860 1909 aagtagctaa catagcagta ggcacttaag catttagtca atgatattgg tagaaatagt aaaatacatc ctttaaatat atatctaagc atatatttta aaaggagcaa aaataaaacc aaagtgttag taaattttga tttattagat attttagaaa aataatagaa ttctgaagtt ttaaaaatgt cagtaattaa tttattttca ttttcagaaa tatatgcatg cagttatgtt ttatttgatt gttgacttag gctatgtctg tatacagtaa ccaaataaac tctttcacta tiaaagagat t1:ct1:actga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa

<210> 2 <211> 78 〈212〉 PRT <213> 人(Homo sapiens) <400〉 2

Met Arg Thr Asp Ser Ser Lys Met Thr Asp Val Glu Ser Gly Val Ala 15 10 15

Asn Phe Ala Ser Ser Ala Arg Ala Gly Arg Arg Asn Ala Leu Pro Asp 20 25 30 lie Gin Ser Ser Ala Ala Thr Asp Gly Thr Ser Asp Leu Pro Leu Lys 35 40 45

Leu Glu Ala Leu Ser Val Lys Glu Asp Ala Lys Glu Lys Asp Glu Lys 50 55 60

Thr Thr Gin Asp Gin Leu Glu Lys Pro Gin Asn Glu Glu Lys 65 70 75 200920405

<210〉 3 <211> 4912 <212〉 DNA <213〉人（Homo sapiens) <400〉 3 acagtagaaa gtcagaaggt cacaaagctt gcagggtaag tgacacaact tgaaactgct 60 tggccctctt taaaaagaaa taataaaatg ggagagaatg aagcaagttt acctaacacg 120 tctttgcaag gtaaaaagat ggcctatcag aaggtccatg cagatcaaag agctccagga 180 cactcacagt acttagacaa tgatgacctt caagccactg cccttgactt agagtgggac 240 atggagaagg aactagagga gtctggtttt gaccaattcc agctagacgg tgctgagaat 300 cagaacctag ggcattcaga gactatagac ctcaatcttg attccattca accagcaact 360 tcacccaaag gaaggttcca gagacttcaa gaagaatctg actacattac ccattataca 420 cgatctgcac caaagagcaa tcgctgcaac ttttgccacg tcttaaaaat actttgcaca 480 gccaccattt tatttatttt tgggattttg ataggttatt atgtacatac aaattgccct 540 tcagatgctc catcttcagg aacagttgat cctcagttat atcaagagat tctcaagaca 600 atccaggcag aagatattaa gaagtctttc agaaatttgg tacaactata taaaaatgaa 660 gatgacatgg aaatttcaaa gaagattaag actcagtgga cctctttggg cctagaagat 720 gtacagtttg taaattactc tgtgctgctt gatctgccag gcccttctcc cagcactgtg 780 actctgagca gcagtggtca atgctttcat cctaatggcc agccttgcag tgaagaagcc 840 agaaaagata gcagccaaga cctgctctat tcatatgcag cctattctgc caaaggaact 900 4 200920405 ctcaaggctg aaaataaaaa tataagcttt tgtgatttgc ggaggagacc tcaaacctca tcttcgccaa gaaataagag gttgttggat catcacactg gcgtttatcc gttttctgtt gatttcaaga agggggaact aaaaataatt cagatacaag gcttacgagg acacgagcaa aagtcatcga acgtaacaaa cctcattgga caaagactgt cttctacgcc cctctctatt aagctagaac tcgtcagcat ttgtaatggg cacacagtta gtgccttgat cttggggagg aggttcttca ctagtctgta tcaactgtac gtgatgctga acatcaaaac caaaaattga tgtgagttat tcagatcgca aaaggctgga gaatcctagc tggttaccca agtgcagccc caaaaatgaa gcaagttcag cttgacatct taatggacaa gtcaaaagtt aacagctttt gaaaaatgtt tcctgtagca cagaagagcc ttatttcatc attagagggt agaaatggat ggaatggcag ctcctgaaat tttggaggtg catgatacct agtgtcgatg atctctgcac gcgtgtagct acagtcacaa ccagaccggt gaatgggcca aagagagggt ggcaatattg gtggcttata tcaccatctc cagtgcccag aaccatcttg ccaagttttc ccctctttca atgatttaaa taggaaaatt ttcttctgta tcatggtgtc aaagttttag ccctcgttgc ctctagagct aattgaaaac atatcatagt gtagtactgc ggagaccaga gctcatatga ttagcctcca ttcagcaact aaaccaatat gagttcccat tctccgaggc accttcatga aaggattagg gccactgctt tatcgatcct actgaatcca acaaagccga aaaactgatc tccaaataat agttactaat tggcagccat aataatcaca ccgaactatt atggggagag cagtcccata ggtagtagag cagttctata cgtgcagttt ccgtttttct aaccattact 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 aagctctcag gagaagtgat tttgcaaatt gccaacgaac ctgttctgcc ctttaatgca 2040 200920405 cttgatatag ctttagaagt .tcaaaacaac cttaaaggtg atcaacccaa cactcatcaa ctgttagcca tggcgttacg cctgcgggag agtgctgaac tttttcagtc tgatgagatg cgacctgcta atgatcccaa ggagagagca cccatccgca tccggatgct gaatgacatt ctccaagaca tggagaaaag ctttctggta aagcaggcac caccaggttt ttatagaaac atcctctacc accttgatga aaagacaagc cggttttcaa tacttataga ggcttgggaa cactgcaaac cccttgcatc aaatgagacc cttcaagaag ccctgtcaga ggtgttgaac agcattaatt cagctcaggt ttacttcaaa gcaggacttg atgtgttcaa gagtgtcttg gatgggaaga attgagaaaa ctctgagcat ttttaaaagt ttgtttacaa 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tttgtttgca aacatttgcc atgttgaaga gtgtgtatag gaaaggtcta gaaataaata ggcttgtgca tacctaggca ttcatgctct ttcttcctct 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 200920405 tcagagatca tcagaaaaga ggtgggaata cacaagcagg tgcatgtaag cccaaaagct agaaagcctt atatttaacc aaaggttgat gtgttcattc cagttattca cttacagatg aaactaaaac aaataaaggc aagctattat cagtttggta gttcattatt ttagaacaaa tttctaaatt aatttattcc cataacctac aatagcactg agaacagaaa acatgtttct tcttcatttt gtttaaagat tgcgtaccta ggtaagtcac actgtataga taaaaacctt cttctgtatt cctcacctct aaattatatg ttatttgcta tttgaaaact gtagttaact atggtttttt attagtctat taaaagatac gtggagatat taaattatac ctaaagcaga cgtccaacaa attctgtaca tgctgcttta catctttgca acaaacctct taactagcag cattatttct atagtgtgat tacctgaggg tgcctccaaa tgtatatcat ttcactcccc tcccctcccc acccccaata gattcaaata aataaaatcc tgagcaaatt aa

<210> 4 <211〉 795 <212〉 PRT <213> 人(Homo sapiens) <400〉 4

Met Gly Glu Asn Glu Ala Ser Leu Pro Asn Thr Ser Leu Gin Gly Lys 15 10 15

Lys Met Ala Tyr Gin Lys Val His Ala Asp Gin Arg Ala Pro Gly His 20 25 30

Ser Gin Tyr Leu Asp Asn Asp Asp Leu Gin Ala Thr Ala Leu Asp Leu 35 40 45 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4912 200920405

Glu Trp Asp Met Glu Lys Glu Leu Glu Glu Ser Gly Phe Asp Gin Phe 50 55 60

Gin Leu Asp Gly Ala Glu Asn Gin Asn Leu Gly His Ser Glu Thr lie 65 70 75 80

Asp Leu Asn Leu Asp Ser lie Gin Pro Ala Thr Ser Pro Lys Gly Arg 85 90 95

Phe Gin Arg Leu Gin Glu Glu Ser Asp Tyr lie Thr His Tyr Thr Arg 100 105 110

Ser Ala Pro Lys Ser Asn Arg Cys Asn Phe Cys His Val Leu Lys He 115 120 125

Leu Cys Thr Ala Thr lie Leu Phe lie Phe Gly lie Leu lie Gly Tyr 130 135 140

Tyr Val His Thr Asn Cys Pro Ser Asp Ala Pro Ser Ser Gly Thr Val 145 150 155 160

Asp Pro Gin Leu Tyr Gin Glu lie Leu Lys Thr lie Gin Ala Glu Asp 165 170 175 lie Lys Lys Ser Phe Arg Asn Leu Val Gin Leu Tyr Lys Asn Glu Asp 180 185 190 200920405

Asp Met Glu lie Ser Lys Lys lie Lys Thr Gin Trp Jhr Ser Leu Gly 195 200 205

Leu .Glu Asp Val Gin Phe Val Asn Tyr Ser Val Leu Leu Asp Leu Pro 210 215 220

Gly Pro Ser Pro Ser Thr Val Thr Leu Ser Ser Ser Gly Gin Cys Phe 225 230 235 240

His Pro Asn Gly Gin Pro Cys Ser Glu Glu Ala Arg Lys Asp Ser Ser 245 250 255

Gin Asp Leu Leu Tyr Ser Tyr Ala Ala Tyr Ser Ala Lys Gly Thr Leu 260 265 270

Lys Ala Glu Val lie Asp Val Ser Tyr Gly Met Ala Asp Asp Leu Lys 275 280 285

Arg lie Arg Lys lie Lys Asn Val Thr Asn Gin lie Ala Leu Leu Lys 290 295 300

Leu Gly Lys Leu Pro Leu Leu Tyr Lys Leu Ser Ser Leu Glu Lys Ala 305 310 315 320

Gly Phe Gly Gly Val Leu Leu Tyr lie Asp Pro Cys Asp Leu Pro Lys 325 330 335

Thr Val Asn Pro Ser His Asp Thr Phe Met Val Ser Leu Asn Pro Gly 340 345 350 10 200920405

Gly Asp Pro Ser Thr Pro Gly Tyr Pro Ser Val Asp Glu Ser Phe Arg 355 360 365

Gin Ser Arg Ser Asn Leu Thr Ser Leu Leu Val Gin Pro lie Ser Ala 370 375 380

Pro Leu Val Ala Lys Leu lie Ser Ser Pro Lys Ala Arg Thr Lys Asn 385 390 395 400

Glu Ala Cys Ser Ser Leu Glu Leu Pro Asn Asn Glu lie Arg Val Val 405 410 415

Ser Met Gin Val Gin Thr Val Thr Lys Leu Lys Thr Val Thr Asn Val 420 425 430

Val Gly Phe Val Met Gly Leu Thr Ser Pro Asp Arg Tyr lie lie Val 435 440 445

Gly Ser His His His Thr Ala His Ser Tyr Asn Gly Gin Glu Trp Ala 450 455 460

Ser Ser Thr Ala lie lie Thr Ala Phe lie Arg Ala Leu Met Ser Lys 465 470 475 480

Val Lys Arg Gly Trp Arg Pro Asp Arg Thr lie Val Phe Cys Ser Trp 485 490 495 11 200920405

Gly Gly Thr Ala Phe Gly Asn lie Gly Ser Tyr Glu Trp Gly Glu Aep 500 505 510

Phe Lys Lys Val Leu Gin Lys Asn Val Val Ala Tyr lie Ser Leu His 515 520 525

Ser Pro lie Arg Gly Asn Ser Ser Leu Tyr Pro Val Ala Ser Pro Ser 530 535 540

Leu Gin Gin Leu Val Val Glu Lys Asn Asn Phe Asn Cys Thr Arg Arg 545 550 555 560

Ala Gin Cys Pro Glu Thr Asn lie Ser Ser lie Gin lie Gin Gly Asp 565 570 575

Ala Asp Tyr Phe lie Asn His Leu Gly Val Pro lie Val Gin Phe Ala 580 585 590

Tyr Glu Asp lie Lys Thr Leu Glu Gly Pro Ser Phe Leu Ser Glu Ala 595 600 605

Arg Phe Ser Thr Arg Ala Thr Lys lie Glu Glu Met Asp Pro Ser Phe 610 615 620

Asn Leu His Glu Thr He Thr Lys Leu Ser Gly Glu Val lie Leu Gin 625 630 635 640

He Ala Asn Glu Pro Val Leu Pro Phe Asn Ala Leu Asp lie Ala Leu 645 650 655 12 200920405

Glu Val Gin Asn Asn Leu Lys Gly Asp Gin Pro Asn Thr His Gin Leu 660 665 670

Leu Ala Met Ala Leu Arg Leu Arg Glu Ser Ala Glu Leu Phe Gin Ser 675 680 685

Asp Glu Met Arg Pro Ala Asn Asp Pro Lys Glu Arg Ala Pro lie Arg 690 695 700 lie Arg Met Leu Asn Asp lie Leu Gin Asp Met Glu Lys Ser Phe Leu 705 710 715 720

Val Lys Gin Ala Pro Pro Gly Phe Tyr Arg Asn lie Leu Tyr His Leu 725 730 735

Asp Glu Lys Thr Ser Arg Phe Ser lie Leu lie Glu Ala Trp Glu His 740 745 750

Cys Lys Pro Leu Ala Ser Asn Glu Thr Leu Gin Glu Ala Leu Ser Glu 755 760 765

Val Leu Asn Ser lie Asn Ser Ala Gin Val Tyr Phe Lys Ala Gly Leu 770 775 780

Asp Val Phe Lys Ser Val Leu Asp Gly Lys Asn 785 790 795 13 200920405

<210〉 5 <211> 1724 <212> DNA <213〉人（Homo sapiens) • <400〉 5 ttaaaaaagc ctcgttagaa tttgctattc gaaaagacct taaaaaccct cacagagttc 60 taaacatccc attcattgaa aatacttttc agttaagtag atttgttttg tgcacttcac 120 aacttttagg tgacatgaat ttgaagcgta gcaaaagaaa tgtataaaga tagccttttc 180 tggtcattac catgtctact caagtttctg ttttctaggt acactctagc attgtaactt 240 tttccccctg agaagtaatt ttaagatcta tcagtctcaa tttaaatgat ctgttaatca 300 gccagagttt tagtttcata atatcgttcc attgcctgac aaagatatac acactgaagt 360 gcctttagca gacctgggac cgtcaagaat cttgttaccc tgattattgc aagatgacat 420 atttcttaag ccatttataa tctcatattc gggttgaatc tgtatttaca aataaaaggg 480 ttaaattgag gcagtttcaa gcagcattta ggaaaatgaa gtggcttcaa attttagtgt 540 ttctggttac attattttgt ttgaattata caattacata attttctgta accaaaatgg 600 taattttgat ggatttttta aatgccaaaa tccaatcatc aaggccaaag aaatgcatga 660 ttactctgat ttcttatgca ccattcagtc aagacttaac tcagaggcag ttgattcagt 720 gcttacatct agacaaagct ttaatgagtg cagacccagc ctaacagtat ttcatctaat 780 ttctttgatg gcttaagcca ataagcactg aggtagcttt tctcagaagg aaacagattt 840 tattttccag gggctaatta atatgcacca cctaagtccc caaaggatca cacaggtgcc 900 tgtatcatgc catatgtcat gtgctatatt cctgcaagct caagagatta atatacaatc 960 14 1020 200920405 attattatga attattatgt tgcattgaag ttaatgtcgg tcttttgttc taattaaagt acaaacgtgg catctgaata gaagcttagc tagagaagtg gagttagagt ccctatttta atgaactaca tatatttttc aatcaaaatg tgtaattatt taattatcta gcctgctcag taatcataac tctccaactt cttcaaaggg cctttattca atatgttacc actcatatgg tcattacttg gtaagtgttt tatattttga atttcttaga tgctttcagt gtatgtgcta gtgttttatt aatattaaaa atttttgttt acttatatat caagctgctg caaatggact accttatttt aaaagttaga ataaaatgct attactctct aaacagaact ttagcatatc tgtttgataa gaaatacaca aacaaaatat ttttctatgc tattgcaaat tgtccgcagg aagcaaaatg ccagatggtl; aagtgtagct cacataatta tattccaaag gtgtiataaa caattctatt tagcatctga gataggtcta tattaggcaa tttcatgttt acatttctaa cagaaaggtt taatggcaaa tattccttat attctaactt gctacttgga gaatatggat attctgaaaa gaaaaaccct ttctagaaca ctgtgcagga ctaatttttt tttaatagac atccagaaaa tagcctgggc aacaaagtga gaccctgtct ctct

<210> 6 <211〉 20 <212> DNA <213〉PCR用的人造合成引子 <400〉 6 ttggcttgac tcaggattta <210> 7 <211> 20 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1724 15 200920405

<212〉 DNA <213〉PCR用的人造合成引子 <400> 7 atgctatcac ctcccctgtg .. 20

<210〉 8 <211〉 24 <212> DNA <213〉PCR用的人造合成引子 <400> 8 24 22 ggcacatact agaagcaaaa tacg

<210〉 9 <211> 22 <212〉 DNA <213〉PCR用的人造合成引子 <400〉 9 gatgggcaaa tcattcttgg ta <210〉 10 <211> 23 <212> DNA <213〉 PCR用的人造合成引子 <400〉 10 gaaagcatct cacattggtt ttc

<210> 11 <211> 23 〈212〉 DNA <213〉PCR用的人造合成引子 16 23 200920405 <400> 11 gggtttcaaa gagaaactct get 23 <210〉 12 <211〉 20 <212> DNA <213〉PCR用的人造合成引子 <400> 12 gaagcaaaat gccagatggt 20 <210〉 13 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉PCR用的人造合成引子 <400> 13 tcctgcacag tgttctagaa agg 23 <210〉 14 <211〉 20 <212> DNA <213〉北分點潰分析法用的人造合成引子 <400〉 14 ccagtgccca gaaaccaata 20 <210〉 15 <211> 22 <212> DNA <213〉北分點潰分析法用的人造合成引子 <400> 15 17 200920405 tcaattcttc ccatccaaga ca 22 <210> 16 <211> 19 <212〉 DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400〉 16 gccctaagca gcatgtgta 19 <210> 17 <211〉 19 <212〉 DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 17 gcagtaggca cttaagcat 19 <210〉 18 <211> 19 <212〉 DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 18 gatgcaaaag agaaagatg 19 <210〉 19 <211〉 19 <212> DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 19 gactcagtgg acctctttg 18 19 200920405 <210> 20 <211〉 19 <212> DNA <U3> siRNA用的人造合成目標序列 <400> 20 gtcatcgatg tgagttatg 19 <210〉〈211> <212> <213> 21 19 DNA siRNA用的人造合成目標序列 <400> 21 gagtcgtcag catgcaagt 19 <210〉 22 <211> 19 <212> DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 22 gaagcagcac gacttcttc 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400〉 23 gacucagugg accucuuug <210> 24 19 19 200920405

<211〉 21 <212> DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 24 .. caaagagguc cacugagucu u 21

<210> 25 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 25 22 21 gcagcacgac uuctuucaag tt

<210〉 26 <211> 21 <212> DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 26 cuugaagaag ucgugcugct t

<210〉 27 <211> 21 <212> DNA <213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400> 27 gcccuaagca gcauguguau a

<210> 28 <211〉 21 <212> DNA 20 21 200920405 〈213〉siRNA用的人造合成目標序列 <400〉 28 uacacaugcu gcuuagggcu u 21 • ·

<210〉 29 <211〉 2689 <212> DNA <213〉人（Homo sapiens) <400〉 29 gatcttgggc tgaggttccc gggcgggcgg gcgcggagag acgcgggaag caggggctgg 60 gcgggggtcg cggcgccgca gctagcgcag ccagcccgag ggccgccgcc gccgccgccc 120 agcgcgctcc ggggccgccg gccgcagcca gcacccgccg cgccgcagct ccgggaccgg 180 ccccggccgc cgccgccgcg atgggcaacg ccgccgccgc caagaagggc agcgagcagg 240 agagcgtgaa agaattctta gccaaagcca aagaagattt tcttaaaaaa tgggaaagtc 300 ccgctcagaa cacagcccac ttggatcagt ttgaacgaat caagaccctc ggcacgggct 360 ccttcgggcg ggtgatgctg gtgaaacaca aggagaccgg gaaccactat gccatgaaga 420 tcctcgacaa acagaaggtg gtgaaactga aacagatcga acacaccctg aatgaaaagc 480 gcatcctgca agctgtcaac tttccgttcc tcgtcaaact cgagttctcc ttcaaggaca 540 actcaaactt atacatggtc atggagtacg tgcccggcgg ggagatgttc tcacacctac 600 ggcggatcgg aaggttcagt gagccccatg cccgtttcta cgcggcccag atcgtcctga 660 cctttgagta tctgcactcg ctggatctca tctacaggga cctgaagccg gagaatctgc 720 tcattgacca gcagggctac attcaggtga cagacttcgg tttcgccaag cgcgtgaagg 780 21 840 200920405 gccgcacttg gaccttgtgc ggcacccctg agtacctggc ccctgagatt atcctgagca aaggctacaa caaggccgtg gactggtggg ccctgggggt tcttatctat gaaatggccg ctggctaccc gcccttcttc gcagaccagc ccatccagat ctatgagaag atcgtctctg ggaaggtgcg cttcccttcc cacttcagct ctgacttgaa ggacctgctg cggaacctcc tgcaggtaga tctcaccaag cgctttggga acctcaagaa tggggtcaac gatatcaaga accacaagtg gtttgccaca actgactgga ttgccatcta ccagaggaag gtggaagctc ccttcatacc aaagtttaaa ggccctgggg atacgagtaa ctttgacgac tatgaggaag aagaaatccg ggtctccatc aatgagaagt gtggcaagga gttttctgag ttttaggggc atgcctgtgc ccccatgggt tttctttttt cttttttctt ttttttggtc gggggggtgg gagggttgga ttgaacagcc agagggcccc agagttcctt gcatctaatt tcacccccac cccaccctcc agggttaggg ggagcaggaa gcccagataa tcagagggac agaaacacca gctgctcccc ctcatcccct tcaccctcct gccccctctc ccacttttcc cttcctcttt ccccacagcc ccccagcccc tcagccctcc cagcccactt ctgcctgttt taaacgagtt tctcaactcc agtcagacca ggtcttgctg gtgtatccag ggacagggta tggaaagagg ggctcacgct taactccagc ccccacccac acccccatcc cacccaacca caggccccac ttgctaaggg caaatgaacg aagcgccaac ctticctttcg gagtaatcct gcctgggaag gagagatttt tagtgacatg ttcagtgggt tgcttgctag aattttttta aaaaaacaac aatttaaaat cttatttaag ttccaccagt gcctccctcc ctccttcctc tactcccacc cctcccatgt ccccccattc ctcaaatcca ttttaaagag aagcagactg actttggaaa 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 22 200920405 gggaggcgct ggggtttgaa cctccccgct gctaatctcc cctgggcccc tccccgggga atcctctctg ccaatcctgc gagggtctag gcccctttag gaagcctccg ctctcttttt ccccaacaga cctgtcttca cccttgggct ttgaaagcca gacaaagcag ctgcccctct ccctgccaaa gaggagtcat cccccaaaaa gacagagggg gagccccaag cccaagtctt tcctcccagc agcgtttccc cccaactcct taattttatt ctccgctaga ttttaacgtc cagccttccc tcagctgagt ggggagggca tccctgcaaa agggaacaga agaggccaag tccccccaag ccacggcccg gggttcaagg ctagagctgc tggggagggg ctgcctgttt tactcaccca ccagcttccg cctcccccat cctgggcgcc cctcctccag cttagctgtc agctgtccat cacctctccc ccactttctc atttgtgctt ttttctctcg taatagaaaa gtggggagcc gctggggagc caccccattc atccccgtat ttccccctct cataacttct ccccatccca ggaggagttc tcaggcctgg ggtggggccc cgggtgggtg cgggggcgat tcaacctgtg tgctgcgaag gacgagactt cctcttgaac agtgtgctgt tgtaaacata tttgaaaact attaccaata aagttttgtt taaaaaaaaa aaaaaaaaa

<210〉 30 <211〉 351 <212〉 PRT <213〉人（Homo sapiens) <400> 30

Met Gly Asn Ala Ala Ala Ala Lys Lys Gly Ser Glu Gin Glu Ser Val 15 10 15 1980 2040 2100 • · 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2689 23 200920405

Lys Glu Phe Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asp Phe Leu Lys Lys Trp,.Glu 20 25 30

Ser Pro Ala Glo.Asn Thr Ala His Leu Asp Gin Phe Glu Arg lie Lys 35 40 45

Thr Leu Gly Thr Gly Ser Phe Gly Arg Val Met Leu Val Lys His Lys 50 55 60

Glu Thr Gly Asn His Tyr Ala Met Lys lie Leu Asp Lys Gin Lys Val 65 70 75 80

Val Lys Leu Lys Gin lie Glu His Thr Leu Asn Glu Lys Arg lie Leu 85 90 95

Gin Ala Val Asn Phe Pro Phe Leu Val Lys Leu Glu Phe Ser Phe Lys 100 105 110

Asp Asn Ser Asn Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Val Pro Gly Gly Glu 115 120 125

Met Phe Ser His Leu Arg Arg lie Gly Arg Phe Ser Glu Pro His Ala 130 135 140

Arg Phe Tyr Ala Ala Gin He Val Leu Thr Phe Glu Tyr Leu His Ser 145 150 155 160

Leu Asp Leu lie Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu lie Asp 165 170 175 24 200920405

Gin Gin Gly Tyr lie Gin Val Thr Asp Phe Gly Phe Ala Lys Arg Val 180 185 190

Lys Gly Arg Thr Trp Thr Leu Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro 195 200 205

Glu lie lie Leu Ser Lys Gly Tyr Asn Lys Ala Val Asp Trp Trp Ala 210 215 220

Leu Gly Val Leu lie Tyr Glu Met Ala Ala Gly Tyr Pro Pro Phe Phe 225 230 235 240

Ala Asp Gin Pro lie Gin lie Tyr Glu Lys lie Val Ser Gly Lys Val 245 250 255

Arg Phe Pro Ser His Phe Ser Ser Asp Leu Lys Asp Leu Leu Arg Asn 260 265 270

Leu Leu Gin Val Asp Leu Thr Lys Arg Phe Gly Asn Leu Lys Asn Gly 275 280 285

Val Asn Asp lie Lys Asn His Lys Trp Phe Ala Thr Thr Asp Trp lie 290 295 300

Ala lie Tyr Gin Arg Lys Val Glu Ala Pro Phe lie Pro Lys Phe Lys 305 310 315 320 25 200920405

Gly Pro Gly Asp Thr Ser Asn Phe Asp Asp Tyr Glu Glu Glu Glu lie 325 330 335

Arg Val Ser lie Asn Glu Lys.Cys Gly Lys Glu Phe Ser Glu Phe 340 345 350

<210〉 31 <211〉 4 <212〉 PRT <213〉PKIB中連接PKA-C的序列 <400〉 31

Arg Arg Asn Ala <210〉 32 <211〉 649 <212〉 PRT <213〉細胞外區域 <400> 32

His Thr Asn Cys Pro Ser Asp Ala Pro Ser Ser Gly Thr Val Asp Pro 15 10 15

Gin Leu Tyr Gin Glu lie Leu Lys Thr lie Gin Ala Glu Asp lie Lys 20 25 30

Lys Ser Phe Arg Asn Leu Val Gin Leu Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Thr 35 40 45 26 200920405

Glu lie Ser Lys Lys-Ile Lys Thr Gin Trp Thr Ser Leu Gly Leu Glu 50 55 60

Asp Val Gin Phe Val Asn Tyr Ser Val Leu Leu Asp Leu Pro Gly Pro 65 70 75 80

Ser Pro Ser Thr Val Thr Leu Ser Ser Ser Gly Gin Cys Phe His Pro 85 90 95

Asn Gly Gin Pro Cys Ser Glu Glu Ala Arg Lys Asp Ser Ser Gin Asp 100 105 110

Leu Leu Tyr Ser Tyr Ala Ala Tyr Ser Ala Lys Gly Thr Leu Lys Ala 115 120 125

Glu Val lie Asp Val Ser Tyr Gly Met Ala Asp Asp Leu Lys Arg He 130 135 140

Arg Lys lie Lys Asn Val Thr Asn Gin lie Ala Leu Leu Lys Leu Gly 145 150 155 160

Lys Leu Pro Leu Leu Tyr Lys Leu Ser Ser Leu Glu Lys Ala Gly Phe 165 170 175

Gly Gly Val Leu Leu Tyr lie Asp Pro Cys Asp Leu Pro Lys Thr Val 180 185 190

Asn Pro Ser His Asp Thr Phe Met Val Ser Leu Asn Pro Gly Gly Asp 195 200 205 27 200920405

Pro Ser Thr Pro Gly Tyr Pro Ser Yal Asp Glu Ser Phe Arg Gin Ser 210 215 220

Arg Ser Asn Leu Thr Ser Leu Leu Val Gin Pro lie Ser Ala Ser Leu 225 230 235 240

Val Ala Lys Leu lie Ser Ser Pro Lys Ala Arg Thr Lys Asn Glu Ala 245 250 255

Cys Ser Ser Leu Glu Leu Pro Asn Asn Glu lie Arg Val Val Ser Met 260 265 270

Gin Val Gin Thr Val Thr Lys Leu Lys Thr Val Thr Asn Val Val Gly 275 280 285

Phe Val Met Gly Leu Thr Ser Pro Asp Arg Tyr lie lie Val Gly Ser 290 295 300

His His His Thr Ala His Ser Tyr Asn Gly Gin Glu Trp Ala Ser Ser 305 310 315 320

Thr Ala lie lie Thr Ala Phe lie Arg Ala Leu Met Ser Lys Val Lys 325 330 335

Arg Gly Trp Arg Pro Asp Arg Thr lie Val Phe Cys Ser Trp Gly Gly 340 345 350 28 200920405

Thr Ala Phe Gly Asn lie Gly Ser Xyr Glu Trp Gly Glu Asp Phe Lys 355 360 365

Lys Val Leu Gin Lys Asn Val Val Ala Tyr lie Ser Leu His Ser Pro 370 375 380 lie Arg Gly Asn Ser Ser Leu Tyr Pro Val Ala Ser Pro Ser Leu Gin 385 390 395 400

Gin Leu Val Val Glu Lys Asn Asn Phe Asn Cys Thr Arg Arg Ala Gin 405 410 415

Cys Pro Glu Thr Asn lie Ser Ser lie Gin lie Gin Gly Asp Ala Asp 420 425 430

Tyr Phe He Asn His Leu Gly Val Pro lie Val Gin Phe Ala Tyr Glu 435 440 445

Asp lie Lys Thr Leu Glu Gly Pro Ser Phe Leu Ser Glu Ala Arg Phe 450 455 460

Ser Thr Arg Ala Thr Lys lie Glu Glu Met Asp Arg Ser Phe Asn Leu 465 470 475 480

His Glu Thr lie Thr Lys Leu Ser Gly Glu Val lie Leu Gin He Ala 485 490 495

Asn Glu Pro Val Leu Pro Phe Asn Ala Leu Asp lie Ala Leu Glu Val 500 505 510 29 200920405

Gin Asn Asn Leu Lys Gly Asp Gin Pro Asn Thr His Gin Leu Leu Ala 515 520 525

Met Ala Ser Arg Leu Arg Glu Ser Ala Glu Leu Phe Gin Ser Asp Glu 530 535 540

Met Arg Pro Ala Asn Asp Pro Lys Glu Arg Ala Pro lie Arg lie Arg 545 550 555 560

Met Leu Asn Asp lie Leu Gin Asp Met Glu Lys Ser Phe Leu Val Lys 565 570 575

Gin Ala Pro Pro Gly Phe Tyr Arg Asn lie Leu Tyr His Leu Asp Glu 580 585 590

Lys Thr Ser Arg Phe Ser lie Leu lie Glu Ala Trp Glu His Cys Lys 595 600 605

Pro Leu Ala Ser Asn Glu Thr Leu Gin Glu Ala Leu Ser Glu Val Leu 610 615 620

Asn Ser lie Asn Ser Ala Gin Val Tyr Phe Lys Ala Gly Leu Asp Val 625 630 635 640

Phe Lys Ser Val Leu Asp Gly Lys Asn 645 30 200920405 <210〉 <211> <212〉 <213〉 <400> 33 20

PRT 製備抗體用的人造抗原決定區域胜肽 33

Ser Ala Arg Ala Gly Arg Arg Asn Ala Leu Pro Asp lie Gin Ser Ser 15 10 15

Ala Ala Thr Asp 20

<210> 34 <211〉 20 <212〉 PRT <213〉製備抗體用的人造抗原決定區域胜肽 <400> 34

Lys Glu Lys Asp Glu Lys Thr Thr Gin Asp Gin Leu Glu Lys Pro Gin 15 10 15

Asn Glu Glu Lys 20

〈210〉 35 <211> 480 <212> PRT <213> 人(Homo sapiens) <400> 35

Met Ser Asp Val Ala lie Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 15 10 15 31 200920405

Glu Tyr lie Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30

Gly Thr Phe lie Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gin Asp Val Asp Gin Arg 35 40 45

Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gin Cys Gin Leu Met Lys 50 55 60

Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe lie lie Arg Cys Leu Gin Trp 65 70 75 80

Thr Thr Val lie Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95

Glu Glu Trp Thr Thr Ala lie Gin Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110

Gin Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125

Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140

Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 32 200920405

Phe Gly Lys Val He Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Jyr 165 170 175

Ala Met Lys lie Xeu Lys Lys Glu Val lie Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190

Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gin Asn Ser Arg His Pro 195 200 205

Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gin Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220

Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240

Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255

He Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270

Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His lie 275 280 285

Lys lie Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly lie Lys Asp Gly Ala 290 295 300

Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 33 200920405

Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335

Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gin 340 345 350

Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu lie Leu Met Glu Glu lie Arg Phe 355 360 365

Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380

Lys Lys Asp Pro Lys Gin Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400

Glu lie Met Gin His Arg Phe Phe Ala Gly lie Val Trp Gin His Val 405 410 415

Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gin Val Thr Ser Glu 420 425 430

Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gin Met lie Thr 435 440 445 lie Thr Pro Pro Asp Gin Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460 34 200920405

Arg Arg Pro His Phe Pro Gin Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480 <210> 36 ··

<211> 3008 <212〉 DNA <213〉人（Homo sapiens) <400> 36 taattatggg tctgtaacca ccctggactg ggtgctcctc actgacggac ttgtctgaac 60 ctctctttgt ctccagcgcc cagcactggg cctggcaaaa cctgagacgc ccggtacatg 120 ttggccaaat gaatgaacca gattcagacc ggcaggggcg ctgtggttta ggaggggcct 180 ggggtttctc ccaggaggtt tttgggcttg cgctggaggg ctctggactc ccgtttgcgc 240 cagtggcctg catcctggtc ctgtcttcct catgtttgaa tttctttgct ttcctagtct 300 ggggagcagg gaggagccct gtgccctgtc ccaggatcca tgggtaggaa caccatggac 360 agggagagca aacggggcca tctgtcacca ggggcttagg gaaggccgag ccagcctggg 420 tcaaagaagt caaaggggct gcctggagga ggcagcctgt cagctggtgc atcagaggct 480 gtggccaggc cagctgggct cggggagcgc cagcctgaga ggagcgcgtg agcgtcgcgg 540 gagcctcggg caccatgagc gacgtggcta ttgtgaagga gggttggctg cacaaacgag 600 gggagtacat caagacctgg cggccacgct acttcctcct caagaatgat ggcaccttca 660 ttggctacaa ggagcggccg caggatgtgg accaacgtga ggctcccctc aacaacttct 720 ctgtggcgca gtgccagctg atgaagacgg agcggccccg gcccaacacc ttcatcatcc 780 gctgcctgca gtggaccact gtcatcgaac gcaccttcca tgtggagact cctgaggagc 840 35 900 200920405 gggaggagtg gacaaccgqc atccagactg tggctgacgg cctcaagaag caggaggagg aggagatgga cttccggtcg ggctcaccca gtgacaactc aggggctgaa gagatggagg tgtccctggc caagcccaag caccgcgtga ccatgaacga gtttgagtac ctgaagctgc tgggcaaggg cactttcggc aaggtgatcc tggtgaagga gaaggccaca ggccgctact acgccatgaa gatcctcaag aaggaagtca tcgtggccaa ggacgaggtg gcccacacac tcaccgagaa ccgcgtcctg cagaactcca ggcacccctt cctcacagcc ctgaagtact ctttccagac ccacgaccgc ctctgctttg tcatggagta cgccaacggg ggcgagctgt tcttccacct gtcccgggag cgtgtgttct ccgaggaccg ggcccgcttc tatggcgctg agattgtgtc agccctggac tacctgcact cggagaagaa cgtggtgtac cgggacctca agctggagaa cctcatgctg gacaaggacg ggcacattaa gatcacagac ttcgggctgt gcaaggaggg gatcaaggac ggtgccacca tgaagacctt ttgcggcaca cctgagtacc tggcccccga ggtgctggag gacaatgact acggccgtgc agtggactgg tgggggctgg gcgtggtcat gtacgagatg atgtgcggtc gcctgccctt ctacaaccag gaccatgaga agctttttga gctcatcctc atggaggaga tccgcttccc gcgcacgctt ggtcccgagg ccaagtcctt gctttcaggg ctgctcaaga aggaccccaa gcagaggctt ggcgggggct ccgaggacgc caaggagatc atgcagcatc gcttctttgc cggtatcgtg tggcagcacg tgtacgagaa gaagctcagc ccacccttca agccccaggt cacgtcggag actgacacca ggtattttga tgaggagttc acggcccaga tgatcaccat cacaccacct gaccaagatg acagcatgga gtgtgtggac agcgagcgca ggccccactt cccccagttc tcctactcgg 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 36 200920405 ccagcggcac ggcctgaggc ggcggtggac tgcgctggac gatagcttgg agggatggag aggcggcctc gtgccatgat ctgtatttaa tggtttttat ttctcgggtg catttgagag aagccacgct gtcctctcga gcccagatgg aaagacgttt ttgtgctgtg ggcagcaccc tcccccgcag cggggtaggg aagaaaacta tcctgcgggt tttaatttat ttcatccagt ttgttctccg ggtgtggcct cagccctcag aacaatccga ttcacgtagg gaaatgttaa ggacttctgc agctatgcgc aatgtggcat tggggggccg ggcaggtcct gcccatgtgt cccctcactc tgtcagccag ccgccctggg ctgtctgtca ccagctatct gtcatctctc tggggccctg ggcctcagtt caacctggtg gcaccagatg caacctcact atggtatgct ggccagcacc ctctcctggg ggtggcaggc acacagcagc cccccagcac taaggccgtg tctctgagga cgtcatcgga ggctgggccc ctgggatggg accagggatg ggggatgggc cagggtttac ccagtgggac agaggagcaa ggtttaaatt tgttattgtg tattatgttg ttcaaatgca ttttgggggt ttttaatctt tgtgacagga aagccctccc ccttcccctt ctgtgtcaca gttcttggtg actgtcccac cgggagcctc cccctcagat gatctctcca cggtagcact tgaccttttc gacgcttaac ctttccgctg tcgccccagg ccctccctga ctccctgtgg gggtggccat ccctgggccc ctccacgcct cctggccaga cgctgccgct gccgctgcac cacggcgttt ttttacaaca ttcaacttta gtatttttac tattataata taatatggaa ccttccctcc aaattcttca ataaaagttg cttttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3008 37

Claims

200920405 十、申請專利範圍： < 1. 一種單離的雙股分子，包括一意義股及其互補的反意義股，彼此雜交形成雙股分子，當導入細胞時，抑制ρκίβ 或NAALADL2在生物體内表現及細胞增殖。 2. 如申請專利範圍第1項之單離的雙股分子，其中上述意義股包括-目標序列，其擇自下列所組成之族群：_ ID NO:16、1 7、及 19。 3. 如申請專利範圍帛2項之單離的雙股分子，具有約 1 9 -約2 5個核芽酸長度。 /如申請專利範圍第2項之單離的雙股分子，係由一單一多核普酸構成，此多核苦酸句枯p、七立μ μ讀包括上述意義股及反意義股，以一插入單股連接。 5 ·如申請專利範圍篦4 ：cs «私，固弟4項之早離的雙股分子，具有— :式5、⑷讲〜’其中⑷為-意義股，、其擇二;7所二成之族群：卿^6、17、及19的序列； [B]為-由3-23個核*酸組成的插入單股; 含[A]互補序列的反意義股。 ]為已分子6;—種載體，表現申請專利範圍第1項之單離的雙股且”請專利範圍第6項之載體，其中上述雙股分子通…[A]，]，，]-3,，其中U]為立I 股，其擇自下列所組成之為思義的序列：⑻為__由3 iD N0:16、17、及19 [A，]為包含U]互C酸組成的插入單股；以及」補序列的反意義股。 2l25-9924-PF；Susan 1 200920405 8. —種癌症的治療方法，包括〇π 分子，此雙股分子在過度表^ 夕一早離的雙股的細的由女制纺、土因或NAALADL2基因 …卩〜目表現，此雙股分子包括— 互補的反意義股，彼此雜交形成該雙股分士。、、9.如申請專利範圍第8項之癌症的治療方法述意義股包括一目標序列，i IDN0：16M7^19〇 ^下列所組成之族群：SEQ 10如申請專利範圍帛9項之癌症的上述雙股分子具有約19-約25個核苦酸長2〉，其中 11. 如申請專利範圍第8項之癌症的治療上述雙股分子係由-單一多核脊 ’、上述意義股及反意義股，以一插入單股連=核錢包括 12. 如申請專利範圍第n項之癌症 -通式5’ -UHBHA，]-3,，其中[A]為：法，具有擇自下列所組成之族群：SEQIDN〇:16、n、二義股，其 [B]為一由3-23個核普酸組成的插入單股;的序列；含[A]互補序列的反意義股。 ]為包 13·如巾請專利範圍第8項之癌症的治雙股分子由一載體編碼。，，其中 ",如申請專利範圍帛13項之癌症的治由上述載體編碼的上述雙股分子具八中 5’七ΗβΗΑ，R，其中⑷為—意義股^通式列所組成之族群：SEQ ID N〇:16、17、及19的"擇自τ 為一由3-23個核苷酸組成的插入單列，[β] 及以]為包含 2125-9924-PF;Susan ? 200920405 [A ]互補序列的反意義股。 15. 如申請專利範圍第8項之癌症的治療方法，其中上述癌症為前列腺癌、荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。 16. —種治療癌症的組合物，包括至少—種抑制ρκΐβ 或NAALADL2表現的單離的雙股分子，包括—意義股及其互補的反意義股，彼此雜交形成雙股分子。 17. 如申請專利範圍第16項之治療癌症的組合物，其中上述意義股包括-目標序列，其擇自下列所組成之族群：SEQ ID Ν0:16 、 17 、及 19 。 18·如申請專利範圍第17項之治療癌症的組合物，其中上述雙股分子具有約i9-約25個核苷酸長度。 19.如中請專利範圍第16項之治療癌^組合物，其中上述雙股分子係由—單一多核普酸構成，此多核苦酸包括上述意義股及反意義股，以—插入單股連接。如申咕專利範圍第19項之治療癌症的組合物，豆中上述雙股分子具有-通式5’ _[AHb]_u，]_3，，：中[A]為一意義股，其擇自伴目下列所組成之族群：SEQ ID N0:16、17、及19的序列.「只1丸 ^ ^ ’ LB]為一由3-23個核苷酸組成白、入早股’以及[A ]為包含[A]互補序列的反意義股。 21.如中請專利範㈣16項之治療癌症的組合物，其中上述雙股分子編碼於—載體由戰遐中’並包含於此組合物中。 2125-9924-PF/Susan 3 200920405 中[A]為一意義股，其 N〇:16> 17^ 19 列所組成之夢群：SEQ ID 的插入單股；以及U, 為一由3—23個核苦酸組成 23如申，：]為包含[幻互補序列的反意義股。 •如申凊專利範圍笛中上述癌症為前列腺、::：癌症的組合杨’其丸切除無效的前列腺癌。W療無效的前列腺癌或筆包括以下步驟：方法確認來自個體的 24.種鈾列腺癌的診斷方法， (a)藉由選自以下所組成的任生物樣本中，基因的表現程度：的序列； U)偵測一 mRNA，此mRNA包括SEQ 上 JU/ i\KJ . I (i i)偵測一蛋白質，i , k此蛋白質包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2或4 ;以及 Π⑴摘測包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2或4的蛋白質生物活性；以及㈦與前列腺錄因的〖常控制程度相&，符合表現程度增加者。 25.如申請專利範圍第24項之前列腺癌的診斷方法八中上述别列腺癌為荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。 2 6.如申明專利範圍第2 4項之前列腺癌的診斷方法，其中上述表現程度為高於正常控制程度的至少】〇%以上。 2 7 ·如申印專利範圍第2 4項之前列腺癌的診斷方 2125-9924-PF;Susan 4 200920405 * 法，其中上述表# tir λ/ ' %度係藉由偵測一探針與上.述來自個體的生物樣本的基因鏟土 U轉錄本雜交而確認。 ..月專利乾圍第2 7項之前列腺癌的診斷方法其中上“雜交步驟在陣列中進行。、 ’ Μ專利範圍第24項之前列腺癌的診斷方法，其中上述表現程度係藉由侦測包括胺基酸序列卿ID N0:2或4的蛋白質與其抗體連接而確認。 30.如申請專利範圍第29項之前列腺癌的診斷方法’其中上述抗體連接至由_ Π) .32、33或34所組成的多胜肽。 31·如申請專利範圍第24項之前列腺癌的診斷方法，其中上述來自個體的生物樣本包括生物切片、唾液、血液或尿液。 32. —種抗體，連接至一包括胺基酸序列seq d NO: 33或34的蛋白質。 33. 種彳貞測岫列腺癌的組合物，包括—種抗體，談抗體連接至一包括胺基酸序列SEq ID N〇: 2或4的蛋白質。 34. 如申請專利範圍第33項之偵測前列腺癌的組合物’其中上述抗體連接至SEq ID N〇:32、33或34。 35. 一種治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，包括以下步驟： a) 使測試化合物與ΡΠΒ或NAALADL2多核苦龄始耳电編石馬的多胜肽接觸； b) 偵測上述多胜肽與上述測試化合物間的連接、、舌丨生. 2125-9924-PF;Susan 5 200920405 · 以及 • » c)選擇連接至上述多胜肽的測試化合物。 6 · 種治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，包括以下步驟： a)使測試化合物與PKIB或NAALADL2多核苷酸編瑪多胜肽接觸；貞測上述步驟a)的多胜肽的生物活性；以及 c)相較於無上述測試化合物存在時上述多胜肽的生物活性’選擇抑制PKIB或NAALADL2多核苦酸編碼的多胜狀的生物活性之測試化合物。如申印專利範圍第36項之治療或預防前列腺癌的組合物之筛選方法，其中上述生物活性為加速細胞增道或加速PKA-C細胞核聚集的活性。 —種治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，包括以下步驟： W使候選化合物與表現ρηβ或naaudl2的細胞接 b)相較於無上述測試化合物存在時的表現程度，選擇使PKIB或NAALADL2表現程度減少的候選化合物。 39.-種治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，包括以下步驟： a)使候選化合物與一細胞接觸，該細胞中導入一载體，該載體包括ΡΠΒ或NAAU1)L2 w得錄調節區域及一在該轉錄調節區域控制下表現的報導基因. 2125-9924-PF；Susan 6 200920405 · ♦ % . b)測量上缚報導基因的表現或活性；及〇相較於控制組，選擇降低上述報導基因的 / 性程度的候選化合物。或活 4 0.種治療或士防前列腺癌的組合物之篩選方法，包括以下步驟·· ’ a) 使PKIB多胜肽或功能等同物與pKA—c多胜肽或功能等同物在測試化合物存在下接觸； b) 偵測兩胜肽間的連接；以及 c )選擇抑制兩胜肽連接的測試化合物。 41. 如申请專利範圍第4〇項之治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，其中上述ρκίβ多胜肽的功能等同物包括由SEQ ID NO : 31所組成的多胜肽。 42. 如申請專利範圍第4〇項之治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，其中上述pKA_c多胜肽的功能等同物包括PKIB連接區域的胺基酸序列。 43. —種治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，包括以下步驟： a) 在適合ρκ IB多胜肽磷酸化Akt的條件下，將ΡΚIB 多胜肽或功能等同物、PKA_C多胜肽或功能等同物、及Akt 在測試化合物存在下培養； b) 偵測Akt的磷酸化程度； c) 比較控制組與步驟b )中測量的Akt鱗酸化程度；以及 d) 相較於控制程度，選擇使Akt磷酸化程度降低的化 2125-9924-PF;Susan 7 200920405 - 合物。 44_如申請專利範圍第43項之治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，其中上述Akt的磷酸化程度偵測在胺基酸序列SEQ ID N0 :35第473個絲胺酸殘基上的磷酸化。 4 5.如申請專利範圍第4 3項之治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，其中上述ρκ〗B多胜肽或功能等同物、PKA-C多胜肽或功能等同物、及Akt在細胞中表現，並藉由上述細胞或其胞溶物與測試化合物的接觸，在測試化合物存在下培養。 46.如申請專利範圍第35、36、38、39、40、或43 項中任一項之治療或預防前列腺癌的組合物之篩選方法，其中上述前列腺癌為荷爾蒙治療無效的前列腺癌或睪丸切除無效的前列腺癌。 2125-9924-PF/Susan 8 200920405 - 七、指定代表圖： (一）本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二）本代表圖之元件符號簡單說明：無。八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：益〇 2125-9924-PF;Susan 5