CN105467052A - 参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析化学领域，特别涉及参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法。该参乌益肾片成分检测方法为：取参乌益肾片供试品溶液以及标准品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～15min，8％～20％乙腈；15～30min，20％～30％乙腈；30～50min，30％～90％乙腈；50～60min，90％乙腈；根据HPLC检测结果，获得参乌益肾片成分及其含量。本发明对参乌益肾片指纹图谱和3个指标成分进行分析，快速、简便、准确，可作为全面评价该制剂质量的有效方法之一。

Description

参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，特别涉及参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法。

背景技术

肾脏的生理功能主要是排泄代谢产物及调节水、电解质和酸碱平衡，分泌多种活性物质，维持机体内环境稳定，以保证机体的正常生理功能。肾炎是由免疫介导的、炎症介质(如补体、细胞因子、活性氧等)参与的，最后导致肾固有组织发生炎性改变，引起不同程度肾功能减退的一组肾脏疾病，可由多种病因引起。在慢性过程中也有非免疫、非炎症机制参与。肾炎的主要表现：乏力、腰部疼痛、纳差、肉眼血尿、水肿、高血压、肾功能异常、尿量减少(部分患者少尿)、充血性心力衰竭等。一旦罹患肾炎将会给患者带来极大的痛苦。

参乌益肾片是由制何首乌、菟丝子、太子参、麸炒苍术和枸杞子等12味药组成的成方制剂，补益肾元，健运脾肾，活血和络，渗湿泄浊。适用于慢性肾炎、慢性肾盂肾炎、糖尿病肾病、高血压性肾损害等原因所致的慢性肾功能衰竭气阴两虚兼湿浊证患者。参乌益肾片中的主要成分有萜类、酚酸类及蒽醌类等成分。

随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。影响中药制剂质量的因素主要包括：

1、原药材的质量

中药材的质量好坏是直接影响中药制剂临床疗效的关键原因之一，由于目前中药材的来源较为复杂，且品种繁多，许多药材市场常常以次充好从中取得大量的经济利益。此外，现今我国药材市场对野生药材的供应相对缺乏再加上受到国家对野生自然资源采集的限制许多地方采取用种植的药材来代替这种家种的药材会严重影响药剂的质量，使药材的质量下降，特别是过量使用化肥，大幅度提升家中药材的产量，从而导致这与野生药材的气味发生了改变，从而影响了中药的疗效。

2、生产过程

在中药制剂的每一个环节中从投料到制剂的制备都需要投料人员认真仔细的按照工艺中的处方核查所投的药味及数量，如果少投或者多投都会影响到产品的整体质量。此外，还要注意中药制剂的粉碎、浓缩、干燥、精制和提取等方面的工序，这对中药成品的成分含量具有较大的影响作用。因此，在工艺设计时应根据药材的性质进行综合性的思考，选择最优的制备条件和最佳工艺，并做好工序中的质量监督工作，从而保障中药制剂的质量。

3、工艺用水、洁净区环境、工艺卫生

在制剂时，工艺用水也是重要的一个步骤，如果工艺卫生和洁净区环境存在不合格的情况，那将会直接引发微生物的滋生和污染，从而导致生产的制剂出现不合格的产品。

4、包装材料及现代包装技术

现今制剂的包装材料也是影响制剂质量的关键，例如塑料具有透气性和吸附性，它既能保证液体药物的溶媒挥发，也会使其含挥发成分的药物性能改变，加速药物的分解，使用劣质的保障袋，也会使有害的物质渗入制剂当中，此外，由于中药制剂具有剂型多、品种繁杂和生产量小等特点，因此，就会出现因包装袋质量差而导致液体剂外漏、液体发生霉变、药液与包装之间发生反应、固体制剂因为受潮变质等问题的出现，这严重影响制剂的质量。

因此，为了更好地对药品质量进行控制，保证其临床疗效，需建立全面评价该制剂质量的方法。目前关于参乌益肾片的质量控制方法尚无明确报道，因此提供一种参乌益肾片的质量控制方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法。本发明得到分离度、重现性均较好的参乌益肾片指纹图谱，标示出13个共有峰，各批次样品相似度在0.96以上；通过对照品比对，确定了3个成分，分别为二苯乙烯苷(2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)、芍药苷、芍药内酯苷，并对其进行定量分析。本发明对参乌益肾片指纹图谱和3个指标成分进行分析，快速、简便、准确，可作为全面评价该制剂质量的有效方法之一。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种参乌益肾片成分检测方法，取参乌益肾片供试品溶液以及标准品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：

采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～15min，8％～20％乙腈；15～30min，20％～30％乙腈；30～50min，30％～90％乙腈；50～60min，90％乙腈；

根据HPLC检测结果，获得参乌益肾片成分及其含量。

作为优选，HPLC检测的波长为210nm～250nm和/或320nm。

在本发明提供的一些实施例中，检测波长为210～250nm时，色谱峰较全面且各色谱峰分离较好，适宜指纹图谱的建立。作为优选，检测波长为230nm。

在本发明提供的一些实施例中，在测定参乌益肾片中有效成分含量时，选择210～250nm检测芍药苷、芍药内酯苷的含量，选择320nm检测二苯乙烯苷的含量。作为优选，检测芍药苷、芍药内酯苷的含量的检测波长为230nm。

在本发明提供的一些实施例中，酸为磷酸、甲酸、冰乙酸或三氟乙酸中的一种或两者以上的混合物。

作为优选，酸为磷酸。

在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，酸的体积百分数为0.1％～0.5％。

在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，磷酸、甲酸或三氟乙酸的体积百分数为0.1％。

在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，冰乙酸的体积百分数为0.5％。

作为优选，HPLC检测的流动相流速为0.8～1.5mL/min。

优选地，HPLC检测的流动相流速为1.0mL/min。

作为优选，HPLC检测的柱温20℃～40℃。

优选地，HPLC检测的柱温30℃。

作为优选，C18色谱柱为ThermosyncronisC18色谱柱、Agilent5TC-C18色谱柱、Kromasil100-5C18色谱柱、WaterssymmetryC18色谱柱或PhenomenexLunaC18色谱柱。

在本发明提供的一些实施例中，C18的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，以(4.6×250mm，5μm)表示。

在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的理论板数不低于3000。

作为优选，标准品溶液为二苯乙烯苷标准品溶液、芍药苷标准品溶液或芍药内酯苷标准品溶液中的一种或两者以上的混合物。

作为优选，在标准品溶液中二苯乙烯苷的含量为70.25～281.00μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，在标准品溶液中二苯乙烯苷的含量为86.86μg/mL。

作为优选，在标准品溶液中芍药苷的含量为37.26～149.04μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，在标准品溶液中芍药苷的含量为60.01μg/mL。

作为优选，在标准品溶液中芍药内酯苷的含量为34.97～139.88μg/mL。

在本发明提供的一些实施例中，在标准品溶液中芍药内酯苷的含量为88.32μg/mL。

作为优选，参乌益肾片供试品溶液的制备方法为：取参乌益肾片与乙醇水溶液混合，超声提取，冷却，乙醇水溶液补足减失质量，混匀，过滤，取续滤液过滤膜，得到参乌益肾片供试品溶液。

作为优选，乙醇水溶液的体积百分数为60％～80％。

优选地，乙醇水溶液的体积百分数为70％。

作为优选，以g/mL计，参乌益肾片与乙醇水溶液的比例为1：(40～60)。

优选地，以g/mL计，参乌益肾片与乙醇水溶液的比例为1：50。

作为优选，超声的功率为100～500W，频率为10～100kHz。

优选地，超声的功率为250W，频率为40kHz。

作为优选，超声提取的时间为40～50min。

优选地，超声提取的时间为45min。

在本发明提供的一些实施例中，滤膜的孔径为0.22μm。

本发明还提供了一种参乌益肾片指纹图谱构建方法，取不同批次的参乌益肾片供试品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：

采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～15min，8％～20％乙腈；15～30min，20％～30％乙腈；30～50min，30％～90％乙腈；50～60min，90％乙腈；

根据HPLC检测结果，标定共有峰，以中位数法建立参乌益肾片指纹图谱。

在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的检测波长为210～250nm时，色谱峰较全面且各色谱峰分离较好，适宜指纹图谱的建立。作为优选，检测波长为230nm。

在本发明提供的一些实施例中，酸为磷酸、甲酸、冰乙酸或三氟乙酸中的一种或两者以上的混合物。

作为优选，酸为磷酸。

在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，酸的体积百分数为0.1％～0.5％。

在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，磷酸、甲酸或三氟乙酸的体积百分数为0.1％。

在本发明提供的一些实施例中，在酸的水溶液中，冰乙酸的体积百分数为0.5％。

作为优选，HPLC检测的流动相流速为0.8～1.5mL/min。

优选地，HPLC检测的流动相流速为1.0mL/min。

作为优选，HPLC检测的柱温20℃～40℃。

优选地，HPLC检测的柱温30℃。

作为优选，C18色谱柱为ThermosyncronisC18色谱柱、Agilent5TC-C18色谱柱、Kromasil100-5C18色谱柱、WaterssymmetryC18色谱柱或PhenomenexLunaC18色谱柱。

在本发明提供的一些实施例中，C18的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，以(4.6×250mm，5μm)表示。

在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的理论板数不低于3000。

作为优选，参乌益肾片供试品溶液的制备方法为：取参乌益肾片与乙醇水溶液混合，超声提取，冷却，乙醇水溶液补足减失质量，混匀，过滤，取续滤液过滤膜，得到参乌益肾片供试品溶液。

作为优选，乙醇水溶液的体积百分数为60％～80％。

优选地，乙醇水溶液的体积百分数为70％。

作为优选，以g/mL计，参乌益肾片与乙醇水溶液的比例为1：(40～60)。

优选地，以g/mL计，参乌益肾片与乙醇水溶液的比例为1：50。

作为优选，超声的功率为100～500W，频率为10～100kHz。

优选地，超声的功率为250W，频率为40kHz。

作为优选，超声提取的时间为40～50min。

优选地，超声提取的时间为45min。

在本发明提供的一些实施例中，滤膜的孔径为0.22μm。

在本发明提供的一些实施例中，建立参乌益肾片指纹图谱采用的软件为中药色谱指纹图谱相似度评价系统。

在本发明提供的一些实施例中，参乌益肾片供试品的批次为5～15批次。

作为优选，参乌益肾片供试品的批次为10批次。

本发明提供了参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法。该参乌益肾片成分检测方法为：取参乌益肾片供试品溶液以及标准品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～15min，8％～20％乙腈；15～30min，20％～30％乙腈；30～50min，30％～90％乙腈；50～60min，90％乙腈；根据HPLC检测结果，获得参乌益肾片成分及其含量。本发明至少具有如下优势之一：

通过对照品比对，确定了3个成分，分别为二苯乙烯苷(2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)、芍药苷、芍药内酯苷，并对其进行定量分析，本发明检测条件下样品中除目的成分外不含有其它干扰成分。结果显示本发明提供的检测方法具有良好的精密度、线性关系、稳定性、重复性，回收率高，耐用性良好；

参乌益肾片指纹图谱的分离度、重现性均较好，信息全面，标示出13个共有峰，各批次样品相似度在0.96以上；

本发明同时对参乌益肾片指纹图谱和3个指标成分进行分析，快速、简便、准确，可作为全面评价该制剂质量的有效方法之一。

附图说明

图1示230nm检测波长下的色谱图，其中线A示二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷的混合对照品溶液，线B示参乌益肾片供试品溶液，线C示不含制何首乌的阴性样品，线D示不含赤芍的阴性样品；1号峰示芍药内酯苷(albiflorin)，2号峰示芍药苷(paeoniflorin)，4号峰示二苯乙烯苷(2,3,5,4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucopyranoside)；

图2示320nm检测波长下的色谱图，其中线A示二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷的混合对照品溶液，线B示参乌益肾片供试品溶液，线C示不含制何首乌的阴性样品，线D示不含赤芍的阴性样品；4号峰示二苯乙烯苷；

图3示参乌益肾片指纹图谱；1～13为共有峰；130701、130303、130902、130903、130904、130905、130607、130102、130103和130107为参乌益肾片批号；

图4示参乌益肾片指纹图谱中共有峰的归属；其中1、2、5号峰来源于赤芍，3号峰来源于菟丝子与车前子，4号峰来源于制何首乌，6、7、8、9、10号峰来源于熟大黄，11、13号峰来源于熟大黄和制何首乌，12号峰来源于熟大黄和麸炒苍术。

具体实施方式

本发明公开了参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明参乌益肾片成分检测方法及指纹图谱构建方法中所用试剂、仪器均可由市场购得：

Agilent1200高效液相色谱仪，DAD紫外检测器(美国安捷伦公司)；MettlerAE240电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；BP211D型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Centrifuge5415D高速离心机(德国eppendorf公司)；Milli-QAcademic纯水机(美国密理博公司)；KQ—250DB型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；

参乌益肾片(江苏康缘药业股份有限公司生产，批号为130701、130303、130902、130903、130904、130905、130607、130102、130103和130107)；对照品二苯乙烯苷(批号110844-201109，质量分数以94.7％计)、芍药苷(批号110738-201337，质量分数以94.9％计)，购自中国食品药品检定研究院，芍药内酯苷(批号MUST-14031214，纯度≥98.0％)，购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，美国天地公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1～5参乌益肾片成分定量检测方法

对照品溶液的制备：取对照品二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷适量，精密称定，加70％乙醇制成含二苯乙烯苷86.86μg/mL、芍药苷60.01μg/mL、芍药内酯苷88.32μg/mL的混合对照品溶液，即得。

供试品溶液的制备：取供试品内容物，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，称定质量，超声(250W，40kHz)提取45min，放冷，再称定质量，用70％乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，即得。

色谱柱梯度洗脱程序：0～15min，8％～20％乙腈，15～30min，20％～30％乙腈，30～50min，30％～90％乙腈，50～60min，90％乙腈。

进样量为10μL；理论板数按二苯乙烯苷峰计算不低于3000。

二苯乙烯苷定量测定检测波长：320nm。

其他色谱条件选择如表1所示：

表1本发明实施例1～5的色谱条件

按照表1所示色谱条件，采用本发明提供的梯度洗脱程序，分别对对照品溶液和供试品溶液进行色谱分析。其中，采用实施例1中提供的色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析所得色谱图如图1、2所示。

图1为230nm检测波长下的色谱图，其中线A示二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷的混合对照品溶液，线B示参乌益肾片供试品溶液，线C示不含制何首乌的阴性样品，线D示不含赤芍的阴性样品。1号峰示芍药内酯苷(albiflorin)，2号峰示芍药苷(paeoniflorin)，4号峰示二苯乙烯苷(2,3,5,4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucopyranoside)。

图2为320nm检测波长下的色谱图，其中线A示二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷的混合对照品溶液，线B示参乌益肾片供试品溶液，线C示不含制何首乌的阴性样品，线D示不含赤芍的阴性样品。4号峰示二苯乙烯苷(2,3,5,4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucopyranoside)。

采用其他实施例提供的色谱条件对标准品溶液和待检溶液进行分析的色谱图与此相似。

实施例6精密度试验

采用实施例1提供的检测方法，取同一供试品(批号130701)溶液连续进样6针，以峰面积计算各指标成分RSD，分别为二苯乙烯苷0.37％、芍药苷0.33％、芍药内酯苷0.28％。以二苯乙烯苷为参照峰，计算各个共有峰相对保留时间RSD均小于0.20％，13个共有峰相对峰面积RSD均小于3.05％。

实施例7线性关系的考察

精密称取二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷适量，加70％乙醇制成含二苯乙烯苷351.3μg/mL、芍药苷、186.3μg/mL、芍药内酯苷174.9μg/mL的混合对照品溶液，将其作为母液用70％乙醇逐倍稀释，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，采用实施例1提供的检测方法测定，以进样质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性拟合，得线性回归方程分别为Y＝38.2290X+9.3690，r＝1.0000；Y＝11.5062X+10.0724，r＝1.0000；Y＝9.8139X+5.5938，r＝1.0000。二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷分别在35.13～351.3μg/mL、18.63～186.3μg/mL、17.49～174.9μg/mL范围内呈良好的线性关系。

实施例8稳定性试验

取同一对照品溶液，精密吸取10μL，分别于0、3、6、10、16、20、24h注入高效液相色谱仪，以峰面积为指标计算各成分RSD值，结果分别为二苯乙烯苷0.08％、芍药苷0.13％、芍药内酯苷0.15％。

取同一供试品(批号130701)内容物，研细，取约1g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μL，分别于0、2、6、9、14、18、24h注入液相色谱仪，采用实施例1提供的检测方法进行检测，以峰面积为指标计算各成分RSD值，二苯乙烯苷0.54％、芍药苷0.57％、芍药内酯苷1.30％。以二苯乙烯苷为参照峰，计算各个共有峰相对保留时间RSD均小于1.05％，13个共有峰相对峰面积RSD均小于2.98％。结果表明对照品溶液和供试品溶液放置24h稳定性良好。

实施例9重复性试验

取同一供试品(批号130701)内容物，研细，取约1g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，平行制备6份，采用实施例1提供的检测方法测定，计算质量分数。二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷的平均质量分数结果分别为0.70、0.35、0.27mg/g，RSD分别为0.32％、0.76％、1.33％。以二苯乙烯苷为参照峰，计算各个共有峰相对保留时间RSD均小于0.85％，13个共有峰相对峰面积RSD均小于2.55％。结果表明本方法重复性良好。

实施例10回收率试验

取同一供试品(批号130701)内容物，研细，取0.5g，取9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，3份一组，分别精密加入混合对照品溶液(含二苯乙烯苷350.0μg/mL、芍药苷176.4μg/mL、芍药内酯苷135.6μg/mL)0.8mL、1mL、1.2mL，再精密加入70％乙醇至50mL，超声提取(250W，40kHz)45min，放冷，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，注入高效液相色谱仪，采用实施例1提供的检测方法测定，计算回收率。结果二苯乙烯苷、芍药苷、芍药内酯苷的平均回收率分别为99.58％、100.21％、99.63％，RSD分别为0.94％、0.95％、1.32％。

采用实施例2～5的检测方法同样具有良好的精密度、线性关系、稳定性、重复性，回收率高。

由上述试验结果显示：230nm下反应的信息较全面，色谱峰较全面且各色谱峰分离较好，选择230nm测定芍药苷、芍药内酯苷的含量；同时，选择320nm测定二苯乙烯苷的含量。并且对3个指标成分进行了峰纯度验证，结果表明在本发明所确定的检测条件下样品中所测定的3个成分不含其他干扰成分。方法学验证试验结果表明本发明所采用的检测方法耐用性良好。

实施例11采用本发明提供的检测方法对不同批次产品测定试验

取10批参乌益肾片，按实施例1提供的供试品溶液制备方法和色谱条件进样分析，分别计算3种成分的量，结果见表2。结果表明，不同批次胶囊中3种成分的含有量差异较小。

表2样品测定结果(n＝2)

实施例12指纹图谱的建立与技术参数

根据10批参乌益肾片检测所得图谱，标定13个共有峰，采用国家药典颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》进行分析，经数据匹配，以中位数法建立对照指纹图谱，见图3。10批所测供试品色谱图与对照指纹图谱相似度分别为0.984、0.970、0.977、0.981、0.992、0.968、0.971、0.978、0.987和0.997。

指纹图谱中共有峰的归属：将熟大黄、车前子、泽泻、茯苓、赤芍、泽兰、怀牛膝、枸杞子、麸炒苍术、太子参、菟丝子、制何首乌药材分别按处方量取样后以实施例1提供的检测方法进行分析，通过保留时间和DAD扫描分析，指纹图谱中标定的13个共有峰分别来自车前子、熟大黄、赤芍、菟丝子、麸炒苍术、制何首乌药材，其中1、2、5号峰来源于赤芍，3号峰来源于菟丝子与车前子，4号峰来源于制何首乌，6、7、8、9、10号峰来源于熟大黄，11、13号峰来源于熟大黄和制何首乌，12号峰来源于熟大黄和麸炒苍术，结果见色谱图4。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种参乌益肾片成分检测方法，其特征在于，取参乌益肾片供试品溶液以及标准品溶液进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：

采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～15min，8％～20％乙腈；15～30min，20％～30％乙腈；30～50min，30％～90％乙腈；50～60min，90％乙腈；

根据HPLC检测结果，获得参乌益肾片成分及其含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的波长为210nm～250nm和/或320nm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酸为磷酸、甲酸、冰乙酸或三氟乙酸中的一种或两者以上的混合物。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述酸的水溶液中，所述酸的体积百分数为0.1％～0.5％。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的流动相流速为0.8～1.5mL/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的柱温20℃～40℃。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为ThermosyncronisC18色谱柱、Agilent5TC-C18色谱柱、Kromasil100-5C18色谱柱、WaterssymmetryC18色谱柱或PhenomenexLunaC18色谱柱。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准品溶液为二苯乙烯苷标准品溶液、芍药苷标准品溶液或芍药内酯苷标准品溶液中的一种或两者以上的混合物。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述参乌益肾片供试品溶液的制备方法为：取参乌益肾片与乙醇水溶液混合，超声提取，冷却，乙醇水溶液补足减失质量，混匀，过滤，取续滤液过滤膜，得到参乌益肾片供试品溶液。

10.一种参乌益肾片指纹图谱构建方法，其特征在于，取不同批次的参乌益肾片供试品溶液进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：

采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相、酸的水溶液为流动相B相，梯度洗脱程序为：0～15min，8％～20％乙腈；15～30min，20％～30％乙腈；30～50min，30％～90％乙腈；50～60min，90％乙腈；

根据HPLC检测结果，标定共有峰，以中位数法建立参乌益肾片指纹图谱。