CN105463098A - 一种dpyd*9b基因多态性的引物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种DPYD*9B基因多态性的引物及其检测方法。本发明提供的DPYD*9B基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明提供的DPYD*9B基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了DPYD*9B基因多态性的检测，可以对肿瘤患者进行有效的药物敏感指导，提高药物的清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应，为实现肿瘤患者个体化治疗提供了依据，更有利于肿瘤患者的康复。

Description

一种DPYD*9B基因多态性的引物及其检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种DPYD*9B基因多态性的引物及其检测方法。
背景技术
二氢嘧啶脱氢酶 (dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)编码基因是位于1号人类染色体的短臂上 (1q22)，基因全长约150kb，含有3kb 的编码序列，其由23个外显子构成，长度从69bp到1404bp，基因中内含子由长短不等的序列组成。二氢嘧啶脱氢酶是作用于5-FU药物代谢途径的关键酶之一，是分解代谢的限速酶，其含量的高低决定了5-FU药物的代谢速度，进而影响体内药物的毒性和疗效。
5-Fu及其前体药物卡培他滨广泛用于肿瘤化疗，80%以上的5-Fu及其前体药物是通过DPD代谢降解为无活性代谢物二氢氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同个体间DPD酶活性存在明显差别，导致药物清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应存在明显的个体差异性。
DPYD突变会影响DPD酶活性的改变，中国北方人群的研究发现DPYD *9(外显子2，T85C)的突变频率较高(11.25%)。因此，检测DPYD基因多态性可以对肿瘤患者进行药物敏感指导，提高治疗效果，降低药物的毒副作用。
中国专利CN102146440B公开了一种甄别DPYD基因*9A突变位点的PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶。该实时荧光PCR检测方法可以实现二氢嘧啶脱氢酶基因*9A突变位点快速、准确、特异分析。但是，但其高居不下的假阳性率为实际应用所诟病，而且该检测方法还存在检测通量少，每次只能检测一种突变类型的缺陷，不能满足实际应用的需要。
中国专利CN102952866B公开了一种DPYD基因多态性检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片包括野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成。该液相芯片可用于并行或单项检测DPYD基因三种常见基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突变型。但是，上述检测方法操作复杂，不利于大规模的推广和应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种DPYD*9B基因多态性的引物及其检测方法，该引物主要用于检测DPYD基因的DPYD*9B(c.2846A>T)位点，具有特异性强、检测灵敏度高、准确性好等优点，为DPYD*9B基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
本发明提供了一种DPYD*9B基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物为：针对DPYD*9B的上游引物5’- GCTTGCTAAGTAATTCAGTGGCTAT-3’（SEQ ID NO.1）和下游引物5’- AGCATTCTAATTCCAGCAGGATTC-3’（SEQ ID NO.2）；所述SNaPshot PCR引物为：针对DPYD*9B的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAAGTTGTGGCTATGATTG-3’（SEQ ID NO.3）。
另外，本发明还提供了一种DPYD*9B基因多态性的检测方法，包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃ 保温。
进一步地，所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。
进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
除此之外，本发明提供的所述的DPYD*9B基因多态性的引物在制备检测DPYD*9B基因多态性试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：本发明提供的DPYD*9B基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了DPYD*9B基因多态性的检测，可以对肿瘤患者进行有效的药物敏感指导，提高药物的清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应，为实现肿瘤患者个体化治疗提供了依据，更有利于肿瘤患者的康复。
附图说明
图1为本发明提供的DPYD*9B基因引物的扩增片段；
图2为本发明提供的DPYD*9B基因引物扩增产物的部分测序图；
图3为本发明提供的DPYD*9B基因SNaPshot PCR引物的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一、引物
本发明提供的DPYD*9B基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，所述PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
表1 本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性
将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：
1)DPYD*9B基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点，无其它同源基因，DPYD*9B基因扩增片段位于chr1:97547858-97548057，长度为200bp，扩增序列图如图1。
2）使用表1中PCR扩增引物分别对检测样本进行扩增及Sanger测序，测序结果如图2所示，各引物扩增序列与DPYD*9B基因参考序列吻合。
3）使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。
实施例三、DPYD*9B基因多态性的检测
1）提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。
2）配制PCR扩增引物，震荡混匀；短暂离心后备用；PCR扩增采用Q5™热启动超保真2X Master Mix（购自NEB公司，货号M0494L），反应体系如表2所示，震荡混匀，短暂离心后，分装18.0μL至标记好的PCR反应管；往标记好的PCR反应管加入引物混合物5.0μL，按照以下程序进行PCR扩增：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，2:9个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
表2、PCR试剂配制表格
3）配制SNaPshot PCR引物，在SNaPshot PCR产物中加入1.0μL SAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，15min；80℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。
实施例四、检测DPYD*9B基因多态性的方法的特异性
本发明的检测特异性定义为阴性符合率。本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阴性结果与Sanger法显示的结果相符，无突变的样本(阴性)共19例，结果如表3所示，本发明的检测特异性为100%。
表3、DPYD*9B基因检测特异性的试验数据
实施例五、检测DPYD*9B基因多态性的方法的灵敏度
本发明的检测灵敏度定义为阳性符合率。本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阳性结果与Sanger法显示的结果相符，突变的样本(阳性)共2例，结果如表4所示。本发明的检测灵敏度为100%。
表4、DPYD*9B基因检测灵敏度的试验数据
实施例六、检测DPYD*9B基因多态性的方法的准确度
本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对21例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用Sanger测序法进行验证。不同方法检测结果一致，如表5所示。本发明的准确度为100%。
表5、DPYD*9B基因SNPs位点检测准确度的试验数据
实施例七、检测DPYD*9B基因多态性的方法的精密度
本发明的精密度定义为对标本进行重复检测得到同一结果的能力。本发明进行了人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比试验，结果如表6所示，所有结果均显示一致，本发明精密度为100%。
表6、DPYD*9B基因检测精密度试验数据
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域检测科技股份有限公司
<120> 一种DPYD*9B基因多态性的引物及其检测方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcttgctaag taattcagtg gctat 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcattctaa ttccagcagg attc 24
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttttttttt tttttttttt ttttgagcaa gttgtggcta tgattg 46

Claims (7)

1.一种DPYD*9B基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物为：针对DPYD*9B的上游引物5’- GCTTGCTAAGTAATTCAGTGGCTAT-3’和下游引物5’- AGCATTCTAATTCCAGCAGGATTC-3’；所述SNaPshot PCR引物为：针对DPYD*9B的SNaPshot PCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAAGTTGTGGCTATGATTG-3’。
2.一种DPYD*9B基因多态性的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
3.根据权利要求2所述的DPYD*9B基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
4.根据权利要求2所述的DPYD*9B基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
5.根据权利要求2所述DPYD*9B基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。
6.根据权利要求2所述的DPYD*9B基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
7.根据权利要求1所述的DPYD*9B基因多态性的引物在制备检测DPYD*9B基因多态性试剂中的用途。
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