CN105441572A - 鉴别当归早薹的dna分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别当归早薹的DNA分子标记及其应用。本发明通过扩增片段长度多态性分析技术研究早薹当归和正常当归在基因组学水平的差异，获得早薹当归的特异分子标记片段，并通过PCR技术对差异片段的序列进行分析，获得3个DNA分子标记。本发明采用AFLP筛选当归和早薹性状相关的分子标记，通过大量实验建立、优化，筛选出适合当归种的AFLP的反应及银染反应体系，获得清晰的DNA指纹图谱，筛选得到当归早薹性状的分子连锁标记。本发明优选得到的DNA分子标记稳定性好，重复性好，可以应用于早薹当归的种质鉴定，对选育抗早薹品种的当归具有重要意义。

Description

鉴别当归早薹的DNA分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种当归早薹的鉴别方法，具体涉及一种鉴别当归早薹的DNA分子标记序列及其具体应用。

背景技术

核酸序列的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于药用植物特异性状的分子标记以及在药用植物的种质选育具有重要意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有生理、生化指标的检测、显微检测等方法，这些方法需要复杂的操作和特殊的设备。1993年PE公司的Dr.KaryB.Mullis发明了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物研究和临床治疗中，对DNA的检测进入了新时代。

扩增片段产度多态性(AFLP)分析技术基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同分子量的DNA片段，再使用双链人工接头和酶切片段相连接，连接产物作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1-3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，一般以DNA作为模板需要添加3个选择性核苷酸作为引物分离效果较好。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测选择性扩增获得的DNA片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3'端的选择碱基序列(1-3bp)。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而AFLP分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。AFLP高效可靠的特点使它在基因组研究中有广阔的应用前景。

当归早薹影响当归的产量和品质，因此选育出优良品种的当归具有重要意义，但是目前关于当归早薹的鉴别方法未见报道。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种鉴别当归早薹的DNA分子标记和其应用。

技术方案，为了解决以上问题，本发明采取的技术方案为：

鉴别当归早薹的DNA分子标记，所述的DNA分子标记是通过扩增片段长度多态性分析技术研究早薹当归和正常当归在基因组学水平的差异，获得早薹当归的特异分子标记片段，并通过PCR和测序技术对差异片段的序列进行分析，获得DNA分子标记ZT-1、ZT-2和ZT-3，它们的序列分别为SEQIDNo:1，SEQIDNo:2和SEQIDNo:3。

SEQIDNo:1的序列为：

CAAGCAAACCATTGTAGATGGGGTTACTTTTGCACCTAACAACATTGTTGCTTTGTTAGATCATAAGGATTTCCCTAGTGATTTTCATATCATTCAGGATTTCCTCGCCTGTAGTCCATTGAACTTTGCTCTAACTCAACCTTTGAAGGTTTCGTGTAAGAGTGTTATGCAGGTATGGACCACTGCTAAGTTTGCGAAGCTGGCATCGTCAGGACAGCTCCACATGTCGTTTGTTCACAATGGGACTGTCTATGGGGTCACTCCTGAAGTTGTAGAAGATGCACTCCAATTACCCAAGCTCGGTACTA。

SEQIDNo:2的序列为：

CATCCAGATGTACCTGCAAAGAAATTTCCTTGTCAAAGACAAGTTGCTGACCAGTCCCGTAGGCTGATCCTTCCCTTAGAGGGTACCATAGGATTTAAGTCTGGTAGGGTATACGAGGGTTCTGTAGTTAGCTAGAATCCCAAGTTTCACTTGACGCCTGTGAAGGCACTTGGTTCATGGAACCACTAACCGTTGTCATTGACCATGAAATGGTTGAACAAATAGTTGCTTCCATCAACTTTTCCTCTGTGTGT。

SEQIDNo:3的序列为：

AGTCCTAGAGTACCTAGGCGGAGTACAATTGTTTGTAGAGCACTATCTTGAGTTTTCTTGTTGTCTGAGCATTGATGTTATCTGAGGTTTACCTCACATATTTTATTGAAACTTCTTCCTCAAAATTCCGGAAGAAGGGTGATGGTTATTGGGTGT。

作为优选方案，以上所述的鉴别当归早薹的DNA分子标记，对早薹当归和正常当归进行基因组水平多样性分析，在6％的聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳，电泳结果用硝酸银染色，染色后的聚丙烯酰胺凝胶比较早薹当归和正常当归基因组水平差异，割取差异明显、分子量较大的片段，获得早薹当归的特异分子标记片段。

本发明所述的DNA分子标记在早薹当归的种质鉴定中的应用。

一种早薹当归的种质鉴定试剂盒，其含有本发明提供的DNA分子标记。

有益效果：本发明提供的鉴别当归早薹的DNA分子标记具有以下优点：

本发明采用AFLP筛选当归和早薹性状相关的分子标记，通过大量实验建立、优化，摸索出适合当归种的AFLP的反应体系及银染反应体系，获得清晰的DNA指纹图谱，并在此基础上筛选当归早薹的分子连锁标记。本发明优选得到的早薹当归种质中的特异性DNA序列，序列可以应用于早薹当归的种质鉴定，对选育抗早薹品种的当归具有重要意义。本发明提供的当归早薹的DNA分子标记稳定性好，重复性好。

附图说明

图1为基因组DNA电泳图。

图2为早薹和正常当归选择性扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图1中1为正常当归；2为早薹当归；图2中ZC：正常生长当归；ZT：早薹当归。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均属于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

当归早薹的DNA分子标记序列筛选方法：

1.当归基因组总DNA提取

提取植物基因组DNA用改良的CTAB法。称取当归叶片1g，用液氮充分磨成粉末，收集粉末于离心管中，加4mL预热至65℃的CTAB提取液，65℃保温1h。加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)抽提、颠倒使混匀，5500rpm/min离心10min，取上清液，重复抽提2-3次。吸取上清液加入2/3体积预冷的异丙醇，在-20℃静置2h。7500g离心10min，沉淀用400μLTE溶解，加入预煮沸的RNaseA4μL，37℃保温30min。再用等体积氯仿/异戊醇(24：1)抽提1-2次，取上清液加入等体积异丙醇沉淀DNA，轻摇管子混匀至出现白色絮状沉淀。用牙签挑出DNA，放入800μL76％乙醇、0.2M乙酸钠中洗涤20min，将牙签及其上的DNA在70％冷乙醇中洗涤几秒钟后放入一支装有300μLTE的1.5mL离心管中，轻摇，4℃下过夜使DNA溶解。分装，置于-20℃长期保存。

2.DNA浓度与质量测定

(1)琼脂糖电泳法

将提取的模板DNA在1％琼脂糖凝胶电泳上检测，以1×TAE为缓冲液，指示剂为溴酚兰，电泳结束后EB染色，胶块于成像系统中观察照相，如图1所示。纯的DNA样品在紫外线下应呈现一条迁移率很小的整齐条带。如果溴酚兰前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存在RNA杂质，若DNA在凝胶上不形成清晰的条带，而只是弥散的一片，则表明DNA已严重降解。

(2)紫外分光光度法

取50μLDNA溶液稀释20倍，以双蒸水为对照用紫外分光光度计测定波长为260、280nm下的光吸收值。DNA浓度(μg/μL)按OD260×50/1000×稀释倍数计算；纯度按OD260/OD280之比值判断。纯的DNA溶液其OD260/OD280应在1.9-1.6之间，如OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6则表明有蛋白质或酚类物质污染。

3.AFLP方法的建立

AFLP体系及程序参照Vos等的方法。

(1)酶切反应

DNA用EcoRⅠ和MseⅠ双酶切，37℃过夜，65℃2小时。反应体系：DNA200ng，10×Buffer2μL，MseⅠ0.3μL(10U/μL)，EcoRⅠ0.25μL(10U/μL)，加ddH₂O至总体积10μL。

(2)连接反应

酶切产物在连接酶的催化下和接头连接，16℃过夜。反应体系：酶切产物5μL，Buffer1μL，MseⅠ接头(50μM)0.5μL，EcoRⅠ接头(5μM)0.5μL，加ddH₂O至总体积10μL。

(3)连接产物预扩增

预扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(26个循环)；72℃延伸5min。反应体系：模板1μL，EcoRⅠ(100ng/L)预扩引物0.3μL，MseⅠ(100ng/L)预扩引物0.3μL，Buffer2μL，dNTP(10mM)0.4μL，MgCl₂(25mM)1.2μL，Tag酶(5U/μL)0.2μL，加ddH₂O至总体积20μL。

(4)预扩增产物为模板进行选择性扩增

优化选择性扩增反应条件，设立模板浓度梯度、酶离子浓度梯度、dNTP浓度梯度；扩增结果电泳检测。选择性扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s(每次循环下降0.7℃)，72℃延伸1min(13个循环)；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(24个循环)；72℃延伸5min。

(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

参照优化条件进行早薹、正常当归基因组水平多样性分析。选择性扩增产物在6％的聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳，电泳结果硝酸银染色。如图2所示。

4.差异表达片段的分离和再扩增

(1)差异表达片段的分离

染色后的聚丙烯酰胺凝胶比较早薹和正常当归基因组差异，割取差异明显、分子量较大的片段。50μLddH₂O溶解，95℃加热15min，4℃过夜，-20℃冷冻保存。

(2)差异片段的PCR扩增

2μL差异片段溶解液作为反应模板再次通过PCR反应对差异DNA片段进行富集。扩增引物和选择性扩增引物一致。反应条件94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(30个循环)；72℃延伸5min。扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。将电泳条带从琼脂糖凝胶上割取，Takara割胶纯化试剂盒对割取的凝胶进行分离纯化。

①用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物(AFLP多态性片断的产物20μL)。

②割取含有目的片段的琼脂糖块并使它尽可能小，放入1.5mL离心管中。

③每100mg琼脂糖加入300μLS1液，置于50℃水浴10min，使琼脂糖块完全溶化，每2min颠倒混匀一次。

④加入1/3S1液体积的异丙醇，混匀，50℃保温1min后，混匀。

⑤将溶化后的Agarose液移入吸附柱，9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。

⑥在吸附柱中加入W1液500μL，9000g离心5s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管。

⑦在吸附柱中加入Wl液500μL，静置1min后，离心15s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管。

⑧离心1min。

⑨将吸附柱放入干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入T1液30μL，静置1min后，离心1min。将1.5mL离心管贮存于-20℃备用。

5.割胶纯化产物的克隆和测序

(1)连接反应

连接反应体系

割胶纯化产物	xμL
		pMD18-TVector(50ng/μl)	1μL
SolutionⅠ	5μL
		ddH2O	至终体积10μL

稍混匀，离心，16℃过夜以提高连接效率，同时做阳性对照。

(2)感受态细胞的制备

①从LB平板挑取新活化的E.coliDH5α单菌落。

②单菌落接种于3-5mL试管装的液体LB中，37℃振荡培养12h。

③把培养好的菌悬液以1：100或者1：50的比例接种于100mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h，测其OD₆₀₀为0.5左右。

④50mL试管收集菌，冰上放置0.5-1h，4℃，4000rpm离心10min。

⑤弃上清，4℃，4000rpm离心1min，弃上清，每管加入预冷的100mMCaCl₂20mL，用移液枪轻轻吹打以悬浮细胞，冰上放置15min。

⑥4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

⑦每管加入预冷的100mMCaCl₂2mL，轻轻吹打使其悬浮，冰上放置。

⑧分装后加甘油至终浓度15％，-70℃贮存。

(3)连接产物的转化

热激法将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞。

①取一支感受态细胞，冰上融化，取2μL连接反应液与之混匀，冰浴30-45min，每隔20min轻轻摇匀。

②42℃中热冲击90s，勿动，冰上放置2min。

③加LB至1mL，混匀。

④37℃，150rpm温和培养1-1.5h。

(4)重组质粒的筛选与鉴定

①重组质粒的筛选

取200μL已转化的感受态细胞悬液涂布于含有75μg/mLAMP的LB平板，待液体被完全吸收后，37℃倒置培养16-18h，挑取克隆。

②重组质粒的提取

③重组质粒的PCR鉴定

用PCR方法鉴定所提质粒是否含有外源目的片段。所用引物、反应条件如上。

6.测序

送于上海生物工程技术服务公司用通用引物测序，获得3个早薹当归的特异分子标记序列，即ZT-1、ZT-2和ZT-3，它们的序列分别为SEQIDNo:1，SEQIDNo:2和SEQIDNo:3。

针对分子标记ZT-1设计引物，并以当归DNA为模版进行PCR扩增。引物序列为，Primer-F：

GGATTTCCTCGCCTGTAGTCC，Primer-R：AACGACATGTGGAGCTGTCC。以早薹和正常当归的基因组DNA为模版进行PCR扩增反应。反应条件，94℃变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min(40环)。对PCR产物进行电泳检测，早薹当归的标记率为80％。实施例2

针对分子标记ZT-2设计引物，并以当归DNA为模版进行PCR扩增，引物序列为，Primer-F：

CCGTAGGCTGATCCTTCCCT，Primer-R：CCATGAACCAAGTGCCTTCAC。以早薹和正常当归的基因组DNA为模版进行PCR扩增反应。反应条件，94℃变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min(40环)。对PCR产物进行电泳检测，早薹当归的标记率为75％。实施例3

针对分子标记ZT-3设计引物，并以当归DNA为模版进行PCR扩增，引物序列为，Primer-F：

GAGTACCTAGGCGGAGTACA，Primer-R：ACACCCAATAACCATCACCC。以早薹和正常当归的基因组DNA为模版进行PCR扩增反应。反应条件，94℃变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min(40环)。对PCR产物进行电泳检测，早薹当归的标记率为70％。实施例4

配置早薹当归鉴定的试剂盒，试剂盒系PCR反应反应体系，包括引物，缓冲液，镁离子，DNA聚合酶，底物(dNTP)，水。以早薹和正常当归的基因组DNA为模版进行PCR扩增反应，反应条件同前。对PCR产物进行电泳检测，ZT-1序列引物对早薹当归的标记率为75％。

以上实施例结果表明，本发明筛选得到的当归早薹DNA分子标记，稳定性好，重复性好，可以用于当归早薹的鉴别，为选育和保证当归品质具有重要的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>南京中医药大学

<120>鉴别当归早薹的DNA分子标记及其应用

<130>

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>308

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

caagcaaaccattgtagatggggttacttttgcacctaacaacattgttgctttgttaga60

tcataaggatttccctagtgattttcatatcattcaggatttcctcgcctgtagtccatt120

gaactttgctctaactcaacctttgaaggtttcgtgtaagagtgttatgcaggtatggac180

cactgctaagtttgcgaagctggcatcgtcaggacagctccacatgtcgtttgttcacaa240

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cggtacta308

<210>2

<211>254

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

catccagatgtacctgcaaagaaatttccttgtcaaagacaagttgctgaccagtcccgt60

aggctgatccttcccttagagggtaccataggatttaagtctggtagggtatacgagggt120

tctgtagttagctagaatcccaagtttcacttgacgcctgtgaaggcacttggttcatgg180

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<212>DNA

<213>人工序列

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Claims (6)

1.鉴别当归早薹的DNA分子标记，其特征在于，所述的DNA分子标记是通过扩增片段长度多态性分析技术研究早薹当归和正常当归在基因组学水平的差异，获得早薹当归的特异分子标记片段，并通过PCR技术对差异片段的序列进行分析，获得DNA分子标记ZT-1，其序列为SEQIDNo:1，

SEQIDNo:1的序列为：

CAAGCAAACCATTGTAGATGGGGTTACTTTTGCACCTAACAACATTGTTGCTTTGTTAGATCATAAGGATTTCCCTAGTGATTTTCATATCATTCAGGATTTCCTCGCCTGTAGTCCATTGAACTTTGCTCTAACTCAACCTTTGAAGGTTTCGTGTAAGAGTGTTATGCAGGTATGGACCACTGCTAAGTTTGCGAAGCTGGCATCGTCAGGACAGCTCCACATGTCGTTTGTTCACAATGGGACTGTCTATGGGGTCACTCCTGAAGTTGTAGAAGATGCACTCCAATTACCCAAGCTCGGTACTA。

2.鉴别当归早薹的DNA分子标记，其特征在于，所述的DNA分子标记是通过扩增片段长度多态性分析技术研究早薹当归和正常当归在基因组学水平的差异，获得早薹当归的特异分子标记片段，并通过PCR技术对差异片段的序列进行分析，获得DNA分子标记ZT-2，其序列为SEQIDNo:2，

SEQIDNo:2的序列为：

CATCCAGATGTACCTGCAAAGAAATTTCCTTGTCAAAGACAAGTTGCTGACCAGTCCCGTAGGCTGATCCTTCCCTTAGAGGGTACCATAGGATTTAAGTCTGGTAGGGTATACGAGGGTTCTGTAGTTAGCTAGAATCCCAAGTTTCACTTGACGCCTGTGAAGGCACTTGGTTCATGGAACCACTAACCGTTGTCATTGACCATGAAATGGTTGAACAAATAGTTGCTTCCATCAACTTTTCCTCTGTGTGT。

3.鉴别当归早薹的DNA分子标记，其特征在于，所述的DNA分子标记是通过扩增片段长度多态性分析技术研究早薹当归和正常当归在基因组学水平的差异，获得早薹当归的特异分子标记片段，并通过PCR技术对差异片段的序列进行分析，获得DNA分子标记ZT-3，其序列为SEQIDNo:3，

SEQIDNo:3的序列为：

AGTCCTAGAGTACCTAGGCGGAGTACAATTGTTTGTAGAGCACTATCTTGAGTTTTCTTGTTGTCTGAGCATTGATGTTATCTGAGGTTTACCTCACATATTTTATTGAAACTTCTTCCTCAAAATTCCGGAAGAAGGGTGATGGTTATTGGGTGT。

4.根据权利要求1～3任一项所述的鉴别当归早薹的DNA分子标记，其特征在于，对早薹当归和正常当归进行基因组水平多样性分析，在6％的聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳，电泳结果用硝酸银染色，染色后的聚丙烯酰胺凝胶比较早薹当归和正常当归基因组DNA差异，结合PCR和测序技术，获得早薹当归的特异分子标记序列。

5.权利要求1～3任一项所述的DNA分子标记在早薹当归的种质鉴定中的应用。

6.早薹当归的种质鉴定试剂盒，其特征在于含有权利要求1～3任一项所述的DNA分子标记。