CN105431544B - 微生物的检查方法 - Google Patents
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Abstract
一种微生物的检查方法，其具有试样调制工序，所述试样调制工序包括：将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序；将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序；及以不发出荧光的液体稀释该静置工序后的溶液的稀释工序。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的检查方法，特别是涉及适于检测包含在压载水等中而存活的浮游生物等微生物的微生物的检查方法。
背景技术
未搭载货物的船舶为了使该船舶稳定而搭载压载水航行，在搭载货物的海域将上述压载水排出。
压载水通常在与搭载的海域不同的海域排出，因此有可能将该压载水所含有的浮游生物、细菌等微生物搬运至原来的栖息地以外的海域，引起破坏生态系等问题。
为了解决这样的问题，制定与压载水的限制有关的国际规则，通过了“用于限制并管理船舶的压载水及沉殿物的国际条约(压载水管理条约)”。
就与上述压载水管理条约相关的“关于压载水采样的指标(G2)”而言，在“压载水排出基准(D-2)”中，将从船舶排出的压载水所含有的存活的微生物的允许个体数根据所述微生物的最小尺寸区分而规定的，例如，关于最小尺寸50μm以上的微生物(以下，称为“L尺寸生物”。)，规定为10个/m3以下，关于最小尺寸为10μm以上且小于50μm的微生物(以下，称为“S尺寸生物”。)，规定为10个/mL以下。
目前为止，作为排出上述压载水时用于确认是否满足上述排出基准的方法，已知如下微生物检查装置：专利文献1所记载的使以送水泵抽取的海水通过流动池而测量图像的微生物检查装置专利文献2所记载的使以送水泵抽取的海水通过网眼不同的滤波器单元，使滤波器上的微生物发光，计算微生物的微生物检查装置等。
上述专利文献1所记载的微生物检查装置，包含：染色部，在使液体检测物流动的同时，使存在于该检测物中具有活细胞的生物染色；浓缩部，在使所述经施行染色的检测物流动的同时，进行浓缩，以提高所述生物的浓度；个体测量部，取得所述经浓缩的检测物中包含所述生物的个体的图像信息；及控制机构，根据由所述个体测量部输出的所述个体的图像信息，测定该生物。
由此，可以以流动方式进行检测物液体中生物的染色工序、液体中生物的浓缩工序，液体中生物的信息获取的工序等，因此与以分批方式进行各方式的方法相比，能够大幅缩短一个工序结束的检测物的一部分进展至下一个工序为止的待机时间，或使其为0，防止在待机时间染色的状态劣化，从该意义来讲，具有能够稳定取得生物生死的信息的优点。
然而，上述专利文献1所记载的微生物检查装置，使由送水泵抽取的海水依次通过各种工序，从而存在装置庞大、且制造成本高的问题。此外，虽然依次通过各种工序而缩短待机时间，但存在直到测定结束为止至少需耗费数小时这样的问题。
此外，上述专利文献2所记载的微生物检查装置的特征在于，具备如下工序：使海水通过将网眼不同的3种滤波器串联配置而成的滤波器单元的工序；产生由滤波器捕获且存活的微生物造成的发色、发光及荧光中任一者的工序；及检测发色、发光及荧光中任一者，利用图像分析计算压载水或海水中的微生物数的工序。
由此，能够实现阶段性地捕捉每一尺寸的微生物，其结果，具有能够迅速测定是否满足按每一尺寸的基准限制的允许残存基准这样的优点。
然而，专利文献2所记载的微生物检查装置也与专利文献1同样，使以送水泵抽取的海水依次通过各种工序，从而具有装置庞大、制造成本高的问题。
在此，鉴于上述问题，本申请人通过专利文献3提出一种微生物的检查方法，该微生物的检查方法通过利用分批式的测定池，能够简便地且在短时间内，并以高精度测定压载水中微生物的量。
本申请人提出的微生物的检查方法具备：搅拌混合工序，在分批式的试样容器内，将试样中添加有荧光染色试剂的试样溶液搅拌、混合；激发工序，在搅拌所述试样溶液的同时，对所述试样容器的被照射面照射激发光；受光工序，对通过所述激发光而荧光发光的微生物的荧光进行计数；及微生物数推定工序，根据通过该受光工序检测的发光数，计算试样容器中试样所含有的微生物量。
由此，具有如下作用、效果：能够在极短时间内使微生物明亮地发光，简便地且在短时间内测量压载水中微生物的量，且由于荧光发光的厚度部分薄，因此背景与微生物的荧光发光的光量差非常明确，能够提高微生物荧光发光的检测精度。
作为上述微生物的检测原理，例如图6所示，利用光电增倍管，以电信号检测荧光染色的浮游生物等微生物，将连续检测到的例如约0.9V的电压的背景成分与存活的浮游生物通过的荧光强度进行比较，能够根据浮游生物通过时荧光强度的峰的高度、即电压的高度，与背景成分区别。在此，所谓背景成分，是指样品水本身的荧光即自身的荧光、染色剂在样品水中自然分解而发出荧光。
然而，就上述提出的方案而言，存在随着背景成分增大，干扰成分也变大的倾向，其结果，背景成分增大后S/N比降低，存在对检测精度造成影响这样的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009－85898号公报
专利文献2：日本特开2007－135582号公报
专利文献3：日本特开2014－042463号公报
发明内容
发明所要解决的课题
鉴于上述问题，本发明的技术课题在于提供一种微生物的检测方法，其能够减少背景成分的荧光发光而提高检测精度。
用于解决课题的方法
根据本发明的微生物的检查方法，用于测定试样中的微生物量，所述试样中的微生物量的测定包括：将试样及荧光染色试剂搅拌、混合来调制试样的试样调制工序；及根据对所述试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数来计算微生物量的微生物量计算工序，所述试样调制工序包括：将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序；将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序；及以不发出荧光的液体稀释该静置工序后的溶液的稀释工序。
在所述荧光染色工序中，可以向试样容器投入该试样容器整体容积的1～10％容量的试样，且向所述试样容器中投入相对于所述试样1容量为1％容量的荧光染色试剂，并搅拌、混合。进而，作为所述荧光染色试剂，也可以使用FDA，并添加至其在稀释前试样中的浓度为0.01mM。
根据本发明的微生物的检查方法，用于测定试样中的微生物量，所述试样中的微生物量的测定包括：试将试样及荧光染色试剂搅拌、混合来调制试样的试样调制工序；及根据对所述试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数来计算微生物量的微生物量计算工序，所述试样调制工序包括：将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序；将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序；及向该静置工序后的溶液中添加pH调节剂的pH调节工序。在所述pH调节工序中，也可以在所述荧光染色工序的溶液的pH为8.0时，在该pH调节工序中添加pH调节剂，以使pH为6.0。
发明的效果
根据本发明的微生物的检查方法，首先，在荧光染色工序中将荧光染色试剂与少量的试样搅拌、混合，接着，在静置工序中静置溶液一定时间，进而在稀释工序中以不发出荧光的液体稀释。由此，在所述荧光染色工序中搅拌、混合少量的试样中所含有的微生物与荧光染色试剂，以几乎没有不均的状态确实染色，在所述稀释工序中添加稀释液时，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，在最终工序的微生物量计算工序中，能够减少背景成分的荧光发光，提高S/N比，显著提高检测精度。在此，如果在所述荧光染色工序中，向试样容器中投入该试样容器整体容积的1～10％容量的试样，且向所述试样容器中投入相对于所述试样1容量为1％容量的荧光染色试剂，并搅拌、混合，则能够进一步提高检测精度。进而，作为荧光染色试剂，使用FDA，并添加至其在稀释前试样中的浓度为0.01mM时有效。
此外，本发明的微生物的检查方法中，所述试样调制工序包括：将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序；将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序；向该静置工序后的溶液中添加pH调节剂的pH调节工序，例如在荧光染色工序中试样的pH若为弱碱性，则试样中所含有的微生物与荧光染色试剂被搅拌、混合，以几乎没有不均的状态确实染色，在该pH调节工序中添加pH调节剂而试样的pH为弱酸性时，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，在最终工序的微生物量计算工序中，能够减少背景成分的荧光发光，提高S/N比，显著提高检测精度。此时，如果在所述pH调节工序中，在所述荧光染色工序的溶液的pH为8.0时，在该pH调节工序中添加pH调节剂，以使pH为6.0，则能够进一步提高检测精度。
附图说明
图1是第1实施例的微生物的检查方法的概略工序图。
图2是第2实施例的微生物的检查方法的概略工序图。
图3是应用于微生物的检查方法的检查装置的概略图。
图4(a)～(b)是显示背景成分中，未稀释者的一例的电压波形图。
图5(a)～(b)是显示背景成分中，稀释者的一例的电压波形图。
图6是显示比较以往的背景成分与存活的浮游生物通过的荧光强度的电压波形图。
具体实施方式
图1是第1实施例的微生物的检查方法的概略工序图，图2是第2实施例的微生物的检查方法的概略工序图。
如图1及图2所示，微生物的检查方法包括：试样调制工序，采集压载水作为试样，将该试样与荧光染色试剂搅拌、混合，调制试样；及微生物量计算工序，使用微生物检查装置1，根据对试样调制工序调制的试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数，计算微生物量。
本发明的第1实施例中，所述试样调制工序包括：荧光染色工序，将一定量的试样及该荧光染色试剂搅拌、混合；静置工序，将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间；及稀释工序，以不发出荧光的液体稀释该静置工序后的溶液。
此外，在第2实施例中，所述试样调制工序包括：荧光染色工序，将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合；静置工序，将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间；及pH调节工序，向该静置工序后的溶液中添加pH调节剂。
参照图1说明第1实施例的试样调制工序。操作人员预先准备例如容积为100ml的试样容器2，该试样容器2由例如玻璃、石英、丙烯酸树脂等透射光的透明材质形成。然后，将试样采集于该试样容器2，添加荧光染色试剂等调制后，将试样容器2收纳于微生物检查装置1内，计算微生物量。需要说明的是，以下“ml”表示毫升。
测定微生物量时，优选预先将大量的压载水浓缩为一定量。此外，操作人员使用吸管等采集被浓缩为一定量的压载水作为试样，将试样容器2的总容积的1～10％容量的试样投入试样容器2。例如，如果试样容器的总容积为100ml，则作为投入试样容器2的量，以1ml～10ml的范围为佳，更优选为5ml。
其次，在试样容器2内添加荧光染色试剂。该荧光染色试剂可以使用通常已知的钙黄绿素AM(Calcein-AM，德国Promocell GmbH公司制)、FDA即二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate)等。钙黄绿素AM具有易于对植物性浮游生物染色的倾向，而FDA具有易于对动物性浮游生物染色的倾向。本发明中，作为染色试剂，优选使用FDA。此时，当FDA的浓度为1mM时，优选在试样容器2中投入相对于所述试样1容量为1％容量的染色试剂。即，采集1ml试样时，添加0.01ml即10μL的1mM浓度的FDA为宜，采集5ml试样时，添加0.05ml即50μL的1mM浓度的FDA为宜，采集10ml试样时，添加0.1ml亦即100μL的1mM浓度的FDA为宜。其后，操作人员利用转子等搅拌机构在试样容器2中混合、搅拌试样溶液。以上是图1中的荧光染色工序。
其次，作为图1中的静置工序，操作人员将上述荧光染色工序后的试样容器2静置一定时间。作为此时的条件，优选在20℃的环境下，静置约30分钟。
进而，作为图1的稀释工序，操作人员使用不发出荧光的液体在上述静置工序后的试样容器2中进行稀释。稀释时，例如，使用背景干扰少、即不发出荧光的人工海水为佳，作为稀释量，将投入试样容器2的量设为对应于试样的采集量的90ml～99ml的范围为佳。另外，作为不发出荧光的液体，不限于人工海水，例如，作为不发出荧光的液体，可应用添加荧光染色试剂之前的染色之前的含有生物的试样。由此，具有不需另外准备、调制例如人工海水等不发出荧光的液体的优点。
如上所述，首先，将荧光染色试剂与少量的试样搅拌、混合，接着，将该溶液静置一定时间，进而以不发出荧光的液体稀释静置后的溶液。由此，将少量的试样中所含有的微生物与荧光染色试剂搅拌、混合，以几乎没有不均的状态确实染色，添加稀释液时，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，能够减少背景成分的荧光发光。
接着，参照图2说明第2实施例的试样调制工序。与上述实施例同样，操作人员预先准备容积100ml的试样容器2。然后，操作人员使用吸管等采集被浓缩为一定量的压载水作为试样，将试样容器2的总容积容量的试样投入试样容器2。例如，如果试样容器的总容积为100ml，则向试样容器2中投入100ml的试样。然后，使用FDA作为荧光染色试剂，并且相对于试样100ml，添加1ml即1000μL的1mM浓度的FDA为佳。其后，操作人员在试样容器2中利用转子等搅拌机构混合、搅拌试样溶液。以上是图2中的荧光染色工序。此时的溶液为pH8.0附近的弱碱性。
然后，作为图2中的静置工序，操作人员将上述荧光染色工序后的试样容器2静置一定时间。作为此时的条件，在20℃的环境下，静置约30分钟为佳。
其次，作为图2中的pH调节工序，操作人员向上述静置工序后的试样容器2中添加pH调节剂，使溶液的pH为pH6.0附近的弱酸性。作为pH调节剂，使用例如MES buffer，适当调节pH调节剂的浓度、投入量，以使pH从8.0转变为6.0。
如上所述，首先，将荧光染色试剂与试样搅拌、混合，接着，将该溶液静置一定时间，进而向静置后的溶液中添加pH调节剂，调节pH。由此，在最初的荧光染色工序中pH为弱碱性，将试样中所含有的微生物与荧光染色试剂搅拌、混合，以几乎没有不均的状态确实染色，添加最后的pH调节工序的pH调节剂时，pH转变为弱酸性，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，能够减少背景成分的荧光发光。
图1的第1实施例及图2的第2实施例中的试样调制工序后，进行以下的微生物量计算工序。
图3是应用于微生物的检查方法的检查装置的概略图。说明该检查装置1的原理即知，将试样容器2设置于检查装置1，按下操作部3的测定开始按钮，由此，在预定时间后点亮LED光源4，对试样容器2照射透射激发光用带通滤波器5的光。此时，例如，照射作为波长特性为450nm～490nm的波长的光，试样容器2内的检测物即微生物发出荧光。然后，该荧光透射荧光用带通滤波器6，利用光电增倍管(PMT)7来检测。
光电增倍管(PMT)7通过利用光电效果而将光能量转换为电能量，并且附加电流放大功能，能够以高感度检测荧光发光。将检测的电信号送往CPU基板8，计算一定临限值以上的受光波形。
进而，CPU基板8根据受光波形计算值推定所述试样容器5内的水100ml中存在的微生物数，在显示部9中显示是否满足排水基准。
以下，验证上述第1实施例的结果。
验证是否如上述第1实施例那样，因稀释而背景减少，其结果干扰减少，S/N比提高。
作为未稀释者的一例，相对于总容积为100ml的试样容器2，投入含有生物的海水5ml、无生物的人工海水95ml、与1mM浓度的FDA 1ml作为试样，进行搅拌、混合。然后，将该试样容器2静置一定时间，具体而言，在20℃的环境下静置约30分钟，利用检查装置1测定。将此时的背景成分显示于图4(a)。此物，将放大图显示于图4(b)。此时背景成分的电压为0.3977V，信号电压S为0.006118V，噪声电压N为0.001157V，S/N比为5.2878。
作为稀释者的一例，利用所述段落0025～0030的方法调节试样，利用检查装置1测定。将此时的背景成分显示于图5(a)。此外，将放大图显示于图5(b)。此时背景成分的电压为0.03977V，信号电压S为0.006354V，噪声电压N为0.000479V，S/N比为13.2651。
将未稀释者与稀释者比较时，背景成分的电压约减少至20分之1，S/N比提高约2.5倍。
如上所述，根据本实施方式，在荧光染色工序中将荧光染色试剂与少量的试样搅拌、混合，接着，在静置工序中将溶液静置一定时间，进而在稀释工序中以不发出荧光的液体稀释，因此在所述荧光染色工序中搅拌、混合少量的试样中所含有的微生物与荧光染色试剂，以几乎没有不均的状态确实染色，在所述稀释工序中添加稀释液时，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，在最终工序的微生物量计算工序中，能够减少背景成分的荧光发光，提高S/N比，显著提高检测精度。
此外，所述试样调制工序包括：荧光染色工序，将一定量的试样及该荧光染色试剂搅拌、混合；静置工序，将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间；及pH调节工序，向该静置工序后的溶液中添加pH调节剂，此时，如果在荧光染色工序中试样的pH为弱碱性，则试样中所含有的微生物与荧光染色试剂被搅拌、混合，以几乎没有不均的状态确实染色，在该pH调节工序中添加pH调节剂而试样的pH变为弱酸性时，荧光染色试剂的染色活性度已不起作用，在最终工序的微生物量计算工序中，能够减少背景成分的荧光发光，提高S/N比，显著提高检测精度。
产业上的可利用性
本发明可应用于一种微生物的检测方法等，所述微生物的检测方法能够减少背景成分的荧光发光，提高检测精度。
符号说明
1 检查装置
2 试样容器
3 操作部
4 LED光源
5 激发光用带通滤波器
6 荧光用带通滤波器
7 光电增倍管(PMT)
8 CPU基板
9 显示部
Claims (3)
1.一种微生物的检查方法，其特征在于，用于将含有微生物的海水浓缩而制作的试样投入透明的试样容器后，测定投入至所述试样容器的试样中的微生物量，
所述试样中的微生物量的测定包括：将试样及荧光染色试剂搅拌、混合来调制试样的试样调制工序；及根据对所述试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数来计算微生物量的微生物量计算工序，
所述试样调制工序包括：将一定量的试样及所述荧光染色试剂搅拌、混合的荧光染色工序；将该荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序；及以不发出荧光的液体稀释该静置工序后的溶液的稀释工序，
所述荧光染色工序中，向试样容器中投入该试样容器整体容积的1～10％容量的试样，且向所述试样容器中投入相对于所述试样的容量为1％容量的荧光染色试剂，并搅拌、混合，
所述稀释工序中，向所述试样容器中投入所述试样容器整体容积的90～99％容量的不发出所述荧光的液体，
所述荧光染色试剂使用FDA或钙黄绿素AM，并添加至其在稀释前试样中的浓度为0.01mM，
不发出所述荧光的液体为添加所述荧光染色试剂之前的含有生物的海水。
2.一种微生物的检查方法，其特征在于，用于将含有微生物的海水浓缩而制作的试样投入透明的试样容器后，测定投入至所述试样容器的试样中的微生物量，
所述试样中的微生物量的测定包括：将试样及荧光染色试剂搅拌、混合来调制试样的试样调制工序；及根据对所述试样照射特定波长的激发光而获得的荧光发光的发光数来计算微生物量的微生物量计算工序，
所述试样调制工序包括：将所述试样容器的总容积容量的所述试样投入所述试样容器的工序；将所述试样容器的总容积的试样及所述荧光染色试剂以该荧光染色试剂在添加试样后的试样中的浓度为0.01mM的方式添加并搅拌、混合的荧光染色工序；将所述荧光染色工序后的溶液静置一定时间的静置工序；及向所述静置工序后的溶液中添加pH调节剂的pH调节工序，
所述pH调节工序中，在所述荧光染色工序中溶液的pH为8.0时，在该pH调节工序中调节pH调节剂的浓度、投入量，以使pH为6.0，
所述荧光染色试剂使用FDA或钙黄绿素AM。
3.根据权利要求1或2所述的微生物的检查方法，所述含有微生物的海水是为了使船舶稳定而作为压载水使用的海水。
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