KR20160011672A - 미생물의 검사 방법 - Google Patents

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아키코 나카타
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Abstract

미생물의 검사 방법으로서, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 형광 발광하지 않는 액체로 희석하는 희석 공정을 포함하는 시료 조제 공정을 갖는다.

Description

미생물의 검사 방법{MICROORGANISM TESTING METHOD}
본 발명은, 미생물의 검사 방법에 관한 것으로서, 특히 밸러스트수 등에 포함되어 생존하고 있는 플랑크톤 등의 미생물을 검출하는 데에 적합한 미생물의 검사 방법에 관한 것이다.
하물을 적재하고 있지 않은 선박은, 당해 선박을 안정시키기 위하여 밸러스트수를 탑재하여 항행하고, 하물을 적재하는 해역에 있어서 상기 밸러스트수를 배출한다. 밸러스트수는, 통상, 탑재하는 해역과 상이한 해역에 배출되기 때문에, 그 밸러스트수에 포함되는 플랑크톤이나 세균 등의 미생물을 본래의 생식지 이외의 해역에 옮겨, 생태계를 파괴하는 것 등의 문제를 일으킬 우려가 있다.
이와 같은 문제에 대처하기 위하여, 밸러스트수의 규제에 관한 국제적인 룰이 책정되고,「선박의 밸러스트수 및 침전물의 규제 및 관리를 위한 국제 조약 (밸러스트수 관리 조약)」이 채택되었다.
상기 밸러스트수 관리 조약에 관련된「밸러스트수 샘플링에 관한 가이드라인 (G2)」는,「밸러스트수 배출 기준 (D-2)」에 있어서, 선박으로부터 배출되는 밸러스트수에 포함되어 생존하고 있는 미생물의 허용 개체수를, 예를 들어, 최소 사이즈가 50 ㎛ 이상인 미생물 (이하,「L 사이즈 생물」이라고 한다.) 에 대해서는 10 개/㎥ 이하, 최소 사이즈가 10 ㎛ 이상 50 ㎛ 미만인 미생물 (이하,「S 사이즈 생물」이라고 한다.) 에 대해서는 10 개/㎖ 이하로, 상기 미생물의 최소 사이즈에 의해 구분하여 규정하고 있다.
현재까지, 상기 밸러스트수를 배출할 때에 상기 배출 기준을 만족하고 있는지의 여부를 확인하기 위한 수법으로서, 특허문헌 1 에 기재되어 있는 송수 펌프로 퍼 올린 해수를 플로셀에 통수하여 화상 계측하는 것이나, 특허문헌 2 에 기재되어 있는 송수 펌프로 퍼 올린 해수를 메시가 상이한 필터 유닛에 통수하여 필터 상의 미생물을 발광시켜 미생물을 계수하는 것 등의 미생물 검사 장치가 알려져 있다.
상기 특허문헌 1 에 기재된 미생물 검사 장치는, 액체의 검체를 흘리면서 그 검체 중에 존재하는 생세포를 갖는 생물을 염색하는 염색부와, 상기 염색이 실시된 검체를 흘리면서 상기 생물의 농도를 높이도록 농축하는 농축부와, 상기 농축된 검체 중의 상기 생물을 포함하는 개체의 화상 정보를 취득하는 개체 계측부와, 상기 개체 계측부로부터 출력된 상기 개체의 화상 정보로부터 상기 생물의 측정을 실시하는 제어 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 것이다.
이것에 의해, 검체의 액체 중의 생물의 염색 공정, 액체 중의 생물의 농축 공정, 액체 중의 생물의 정보 취득 공정 등을 플로 방식으로 실시할 수 있기 때문에, 각 방식을 배치 방식으로 실시하는 수법과 비교하여, 하나의 공정을 끝낸 검체의 일부가 다음 공정으로 진행될 때까지의 대기 시간을 대폭적으로 단축, 또는 0 으로 할 수 있어, 대기 시간에서의 염색 상태의 열화를 방지하는 의미에서 안정적인 생물의 생사 정보를 취득할 수 있는 것 등의 장점이 있다.
그러나, 상기 특허문헌 1 에 기재된 미생물 검사 장치는, 송수 펌프로 퍼 올린 해수를 각종 공정에 순차 통수시키는 것이고, 장치가 대규모가 되고, 또 제조 비용이 높아지는 문제가 있다. 그리고, 각종 공정에 순차 통수시켜 대기 시간이 단축되는 것이지만, 측정이 완료되는 데에는 적어도 수 시간 걸리는 것 등의 문제가 있다.
또, 상기 특허문헌 2 에 기재된 미생물 검사 장치는, 해수를 메시가 상이한 3 종의 필터를 직렬로 배치하여 이루어지는 필터 유닛에 통수하는 공정과, 필터에 보집되어 생존하고 있는 미생물에 의한 발색, 발광 및 형광 중 어느 것을 발생시키는 공정과, 발색, 발광 및 형광 중 어느 것을 검출하여 화상 해석에 의해 밸러스트수 또는 해수 중의 미생물수를 계수하는 공정을 갖춘 것을 특징으로 하는 것이다.
이것에 의해, 단계적인 사이즈마다의 미생물의 포착을 실현할 수 있고, 그 결과, 사이즈마다의 기준으로 규제된 허용 잔존 기준을 만족하고 있는지의 여부를 신속히 측정할 수 있는 것 등의 장점이 있다.
그러나, 특허문헌 2 에 기재된 미생물 검사 장치에서도, 특허문헌 1 과 동일하게 송수 펌프로 퍼 올린 해수를 각종 공정에 순차 통수시키는 것이고, 장치가 대규모가 되고, 제조 비용이 높아지는 문제점이 있었다.
그래서, 본 출원인은, 상기 문제점을 감안하여, 배치식의 측정 셀을 이용함으로써, 밸러스트수 중의 미생물의 양을 간편하고 또한 단시간에, 나아가 고정밀도로 측정할 수 있는 미생물의 검사 방법을, 특허문헌 3 에 의해 제안하고 있다.
본 출원인이 제안한 미생물의 검사 방법은, 배치식의 시료 용기 내에서 시료에 형광 염색 시약을 첨가한 시료 용액의 교반·혼합을 실시하는 교반 혼합 공정과, 상기 시료 용액을 교반하면서 상기 시료 용기의 피조사면에 여기광을 조사하는 여기 공정과, 상기 여기광에 의해 형광 발광한 미생물의 형광을 카운트하는 수광 공정과, 그 수광 공정에 의해 검출한 발광수로부터 시료 용기 중의 시료에 포함되는 미생물량을 산출하는 미생물수 추정 공정을 구비한 것이다.
이것에 의해, 매우 단시간에 미생물이 밝게 발광하고, 밸러스트수 중의 미생물의 양을 간편하고 또한 단시간에 계측할 수 있는, 또 형광 발광의 두께 부분이 얇아지기 때문에, 백그라운드와 미생물의 형광 발광의 광량차가 매우 명확해져, 미생물의 형광 발광의 검출 정밀도를 향상시킬 수 있는 것 등의 작용·효과가 있다.
상기 서술한 미생물의 검출 원리로는, 예를 들어 도 6 에 나타내는 바와 같이, 형광 염색한 플랑크톤 등의 미생물을 광전자 증배관에서 전기 신호로 검출하고, 연속적으로 검출되는 예를 들어 약 0.9 V 의 전압의 백그라운드 성분과, 살아있는 플랑크톤이 통과하는 형광 강도를 비교하여, 플랑크톤이 통과했을 때의 형광 강도의 산의 높이 요컨대 전압의 높이에 의해 백그라운드 성분과 식별할 수 있는 것이다. 여기서, 백그라운드 성분이란, 샘플수 자체의 형광, 요컨대 자가 형광이나 염색제가 샘플수 중에서 자연 분해되어 형광한 것이다.
그러나, 상기 제안에 있어서는, 백그라운드 성분이 커짐에 따라 노이즈 성분도 커지는 경향이 있고, 그 결과, 백그라운드 성분이 크면 S/N 비가 낮아지고, 검출 정밀도에 영향을 미치는 것 등의 문제가 있었다.
일본 공개특허공보 2009-85898호 일본 공개특허공보 2007-135582호 일본 공개특허공보 2014-042463호
상기 문제점을 감안하여 본 발명은, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시켜 검출 정밀도를 향상시킬 수 있는 미생물의 검출 방법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
본 발명에 의한 미생물의 검사 방법은, 시료 중의 미생물량을 측정하기 위한 방법으로서, 상기 시료 중의 미생물량의 측정은, 시료 및 형광 염색 시약을 교반·혼합하여 시료를 조제하는 시료 조제 공정과, 상기 시료에 특정 파장의 여기광을 조사하여 얻어진 형광 발광의 발광수로부터 미생물량을 산출하는 미생물량 산출 공정을 포함하는 것이고, 상기 시료 조제 공정은, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치 (靜置) 시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 형광 발광하지 않는 액체로 희석하는 희석 공정을 포함한다.
상기 형광 염색 공정에 있어서, 시료 용기에 그 시료 용기 전체 용적의 1 ∼ 10 ％ 용량의 시료를 투입함과 함께, 상기 시료 용기에 상기 시료 1 용량에 대하여 1 ％ 용량의 형광 염색 시약을 투입하여 교반·혼합해도 된다. 또한, 상기 형광 염색 시약으로서, FDA 를 사용하고, 희석 전의 시료 중의 농도가 0.01 mM 이 되도록 첨가해도 된다.
본 발명에 의한 미생물의 검사 방법은, 시료 중의 미생물량을 측정하기 위한 방법으로서, 상기 시료 중의 미생물량의 측정은, 시료 및 형광 염색 시약을 교반·혼합하여 시료를 조제하는 시료 조제 공정과, 상기 시료에 특정 파장의 여기광을 조사하여 얻어진 형광 발광의 발광수로부터 미생물량을 산출하는 미생물량 산출 공정을 포함하고, 상기 시료 조제 공정은, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 pH 조정제를 첨가하는 pH 조정 공정을 포함한다. 상기 pH 조정 공정에 있어서, 상기 형광 염색 공정에서의 용액의 pH 가 8.0 이었을 때에, 당해 pH 조정 공정에서 pH 가 6.0 이 되도록 pH 조정제를 첨가해도 된다.
본 발명의 미생물의 검사 방법에 의하면, 먼저, 형광 염색 공정에 있어서 소량의 시료에 형광 염색 시약을 교반·혼합하고, 이어서 정치 공정에 있어서 용액을 일정 시간 정치시키고, 추가로 희석 공정에 있어서 형광 발광하지 않는 액체로 희석하는 것이다. 이것에 의해, 상기 형광 염색 공정에서 소량의 시료 중에 포함되는 미생물과 형광 염색 시약이 교반·혼합되어, 매우 얼룩이 없는 상태로 깨끗하게 염색되고, 상기 희석 공정에서 희석액이 첨가되었을 때에는, 이미 형광 염색 시약의 염색 활성도가 작용하지 않고, 최종 공정의 미생물량 산출 공정에 있어서는, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시키고, S/N 비를 높게 하여, 검출 정밀도에 현격히 향상시키는 것이 가능해진다. 여기서, 상기 형광 염색 공정에 있어서, 시료 용기에 그 시료 용기 전체 용적의 1 ∼ 10 ％ 용량의 시료를 투입함과 함께, 상기 시료 용기에 상기 시료 1 용량에 대하여 1 ％ 용량의 형광 염색 시약을 투입하여 교반·혼합하면, 더욱 검출 정밀도를 향상시킬 수 있다. 또한, 형광 염색 시약으로는, FDA 를 사용하고, 희석 전의 시료 중의 농도가 0.01 mM 이 되도록 첨가하는 것이 효과적이다.
또, 본 발명의 미생물의 검사 방법은, 상기 시료 조제 공정이, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 pH 조정제를 첨가하는 pH 조정 공정을 포함하고, 예를 들어, 형광 염색 공정에 있어서 시료의 pH 가 약알칼리성이면, 시료 중에 포함되는 미생물과 형광 염색 시약이 교반·혼합되어, 매우 얼룩이 없는 상태로 깨끗하게 염색되고, 상기 pH 조정 공정에서 pH 조정제가 첨가되어 시료의 pH 가 약산성이 되었을 때에는, 이미 형광 염색 시약의 염색 활성도가 작용하지 않고, 최종 공정의 미생물량 산출 공정에 있어서는, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시키고, S/N 비를 높게 하여, 검출 정밀도에 현격히 향상시키는 것이 가능해진다. 이 때, 상기 pH 조정 공정에 있어서, 상기 형광 염색 공정에서의 용액의 pH 가 8.0 이었을 때에, 당해 pH 조정 공정에 있어서 pH 가 6.0 이 되도록 pH 조정제를 첨가하면, 더욱 검출 정밀도를 향상시킬 수 있다.
도 1 은 제 1 실시예에 관련된 미생물의 검사 방법의 개략 공정도이다.
도 2 는 제 2 실시예에 관련된 미생물의 검사 방법의 개략 공정도이다.
도 3 은 미생물의 검사 방법에 적용되는 검사 장치의 개략도이다.
도 4 는 백그라운드 성분 중, 희석되지 않는 것의 일례를 나타내는 전압 파형도이다.
도 5 는 백그라운드 성분 중, 희석되는 것의 일례를 나타내는 전압 파형도이다.
도 6 은 종래의 백그라운드 성분과, 살아있는 플랑크톤이 통과하는 형광 강도를 비교하는 전압 파형을 나타내는 도면이다.
도 1 은 제 1 실시예에 관련된 미생물의 검사 방법의 개략 공정도이고, 도 2 는 제 2 실시예에 관련된 미생물의 검사 방법의 개략 공정도이다.
도 1 및 도 2 에 나타내는 바와 같이, 미생물의 검사 방법은, 밸러스트수를 시료로서 채취하고, 이 시료와 형광 염색 시약을 교반·혼합하여 시료를 조제하는 시료 조제 공정과, 미생물 검사 장치 (1) 를 사용한 공정으로서 시료 조제 공정에서 조제한 시료에 특정 파장의 여기광을 조사하여 얻어진 형광 발광의 발광수로부터 미생물량을 산출하는 미생물량 산출 공정을 포함하는 것이다.
본 발명의 제 1 실시예에 있어서는, 상기 시료 조제 공정이, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 형광 발광하지 않는 액체로 희석하는 희석 공정을 포함한다.
또, 제 2 실시예에 있어서는, 상기 시료 조제 공정이, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 pH 조정제를 첨가하는 pH 조정 공정을 포함한다.
도 1 을 참조하여 제 1 실시예의 시료 조제 공정을 설명한다. 작업자는, 미리, 예를 들어 유리나 석영이나 아크릴 수지 등의 광을 투과하는 투명한 재질로 형성된, 예를 들어 100 ㎖ 용적의 시료 용기 (2) 를 준비해 둔다. 그리고, 이 시료 용기 (2) 에 시료를 채취하고, 형광 염색 시약 등을 첨가하여 조제한 후, 시료 용기 (2) 를 미생물 검사 장치 (1) 내에 수용하여 미생물량을 산출한다. 또한, 이하「㎖」는 밀리리터를 나타낸다.
미생물량의 측정시에는, 미리 대량의 밸러스트수를 일정량으로 농축해 두는 것이 바람직하다. 그리고, 작업자는 일정량으로 농축된 밸러스트수로부터 피펫 등을 사용하여 시료로서 채취하고, 시료 용기 (2) 의 전체 용적의 1 ∼ 10 ％ 용량의 시료를 시료 용기 (2) 에 투입한다. 예를 들어, 시료 용기의 전체 용적이 100 ㎖ 이면, 시료 용기 (2) 에 투입하는 양으로는 1 ㎖ ∼ 10 ㎖ 의 범위이고, 보다 바람직하게는 5 ㎖ 로 하는 것이 좋다.
다음으로, 시료 용기 (2) 내에 형광 염색 시약을 첨가한다. 이 형광 염색 시약은 일반적으로 알려져 있는 칼세인 AM (Calcein-AM, 독일국 Promocell GmbH 사 제조) 이나, FDA 요컨대 Fluorescein diacetate 등을 사용할 수 있다. 칼세인 AM 은, 식물성 플랑크톤에 대하여 염색하기 쉬운 경향이 있는 한편, FDA 는, 동물성 플랑크톤에 대하여 염색하기 쉬운 경향이 있다. 본 발명에 있어서는, 염색 시약으로서 FDA 를 사용하는 것이 바람직하다. 이 때, FDA 의 농도가 1 mM 인 경우, 시료 용기 (2) 에는, 상기 시료 1 용량에 대하여 1 ％ 용량의 염색 시약을 투입하는 것이 바람직하다. 즉, 시료를 1 ㎖ 채취한 경우에는, 1 mM 농도의 FDA 를 0.01 ㎖ 요컨대 10 ㎕ 첨가하고, 시료를 5 ㎖ 채취한 경우에는, 1 mM 농도의 FDA 를 0.05 ㎖ 요컨대 50 ㎕ 첨가하고, 시료를 10 ㎖ 채취한 경우에는, 1 mM 농도의 FDA 를 0.1 ㎖ 요컨대 100 ㎕ 첨가하면 된다. 그 후, 작업자는 시료 용기 (2) 에 회전자 등의 교반 수단에 의해 시료 용액을 혼합·교반한다. 이상이 도 1 에 있어서의 형광 염색 공정이다.
다음으로, 도 1 에 있어서의 정치 공정으로서, 작업자는 상기 형광 염색 공정 후의 시료 용기 (2) 를 일정 시간 정치시킨다. 이 때의 조건으로는, 20 ℃ 의 환경하에서, 약 30 분간 정치시키는 것이 바람직하다.
또한, 도 1 의 희석 공정으로서, 작업자는 상기 정치 공정 후의 시료 용기 (2) 에 있어서 형광 발광하지 않는 액체를 사용하여 희석한다. 희석시에는, 예를 들어, 백그라운드 노이즈가 적은, 요컨대 형광을 발하지 않는, 인공 해수를 사용하는 것이 좋고, 희석량으로서 시료 용기 (2) 에 투입하는 양은, 시료의 채취량에 대응한 90 ㎖ ∼ 99 ㎖ 의 범위로 하는 것이 좋다. 또한, 형광 발광하지 않는 액체로는, 인공 해수에 한정되지 않고, 예를 들어, 형광 발광하지 않는 액체로서, 형광 염색 시약 첨가 전의 염색 전의 생물이 든 시료를 적용 가능하다. 이것에 의해, 예를 들어, 인공 해수 등의 형광 발광하지 않는 액체를 별도 준비, 조제할 필요가 없다는 장점이 있다.
상기와 같이, 먼저, 소량의 시료에 형광 염색 시약을 교반·혼합하고, 이어서 이 용액을 일정 시간 정치시키고, 추가로 정치 후의 용액에 형광 발광하지 않는 액체로 희석한다. 이것에 의해, 소량의 시료 중에 포함되는 미생물과 형광 염색 시약이 교반·혼합되어, 매우 얼룩이 없는 상태로 깨끗하게 염색되고, 희석액이 첨가되었을 때에는, 이미 형광 염색 시약의 염색 활성도가 작용하지 않고, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시키는 것이 가능해진다.
다음으로, 도 2 를 참조하여 제 2 실시예의 시료 조제 공정을 설명한다. 상기의 실시예와 동일하게, 작업자는, 미리 100 ㎖ 용적의 시료 용기 (2) 를 준비해 둔다. 그리고, 작업자는 일정량으로 농축된 밸러스트수로부터 피펫 등을 사용하여 시료로서 채취하고, 시료 용기 (2) 의 전체 용적의 용량의 시료를 시료 용기 (2) 에 투입한다. 예를 들어, 시료 용기의 전체 용적이 100 ㎖ 이면, 시료 용기 (2) 에 100 ㎖ 의 시료를 투입해 둔다. 그리고, 형광 염색 시약으로서 FDA 를 사용함과 함께, 시료 100 ㎖ 에 대하여, 1 mM 농도의 FDA 를 1 ㎖ 요컨대 1000 ㎕ 첨가하면 된다. 그 후, 작업자는 시료 용기 (2) 에 회전자 등의 교반 수단에 의해 시료 용액을 혼합·교반한다. 이상이 도 2 에 있어서의 형광 염색 공정이다. 이 때의 용액의 pH 8.0 부근의 약알칼리성이다.
그리고, 도 2 에 있어서의 정치 공정으로서, 작업자는 상기 형광 염색 공정 후의 시료 용기 (2) 를 일정 시간 정치시킨다. 이 때의 조건으로는, 20 ℃ 의 환경하에서, 약 30 분간 정치시키는 것이 바람직하다.
다음으로, 도 2 에 있어서의 pH 조정 공정으로서, 작업자는 상기 정치 공정 후의 시료 용기 (2) 에 pH 조정제를 첨가하여 용액의 pH 가 pH 6.0 부근의 약산성으로 하는 것이다. pH 조정제로는, 예를 들어, MES buffer 를 사용하고, pH 가 8.0 에서 6.0 으로 이행되도록 적절히, pH 조정제의 농도나 투입량을 조절하면 된다.
상기와 같이, 먼저, 시료에 형광 염색 시약을 교반·혼합하고, 이어서 이 용액을 일정 시간 정치시키고, 추가로 정치 후의 용액에 pH 조정제를 첨가하여 pH 조정한다. 이것에 의해, 최초의 형광 염색 공정에서는 pH 가 약알칼리성이고, 시료 중에 포함되는 미생물과 형광 염색 시약이 교반·혼합되어, 매우 얼룩이 없는 상태로 깨끗하게 염색되고, 마지막 pH 조정 공정의 pH 조정제가 첨가되었을 때에는 pH 가 약산성으로 이행되어, 이미 형광 염색 시약의 염색 활성도가 작용하지 않고, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시키는 것이 가능해진다.
도 1 의 제 1 실시예 및 도 2 의 제 2 실시예에 있어서의 시료 조제 공정 후에는, 이하의 미생물량 산출 공정에 이른다.
도 3 은 미생물의 검사 방법에 적용되는 검사 장치의 개략도이다. 그 검사 장치 (1) 의 원리를 설명하면, 시료 용기 (2) 를 검사 장치 (1) 에 세트하고, 조작부 (3) 의 측정 개시 버튼의 압하에 의해, 소정 시간 후 LED 광원 (4) 이 점등되고, 여기광용 밴드 패스 필터 (5) 를 투과한 광이 시료 용기 (2) 에 조사된다. 이 때, 예를 들어, 파장 특성으로서 450 ㎚ ∼ 490 ㎚ 의 파장의 광이 조사되고, 시료 용기 (2) 내의 검체 요컨대 미생물이 형광 발광하게 된다. 그리고, 이 형광이 형광용 밴드 패스 필터 (6) 를 투과하여 광전자 증배관 (PMT) (7) 에 의해 검지되게 된다.
광전자 증배관 (PMT) (7) 은, 광전 효과의 이용에 의해 광 에너지가 전기 에너지로 변환됨과 함께, 전류 증폭 기능이 부가되어 있어, 고감도로 형광 발광을 검지할 수 있다. 검지된 전기 신호는 CPU 기판 (8) 에 보내지고, 일정 임계값 이상의 수광 파형이 카운트된다.
또한, CPU 기판 (8) 은, 수광 파형 카운트값으로부터 상기 시료 용기 (5) 내의 물 100 ㎖ 중에 존재하는 미생물수를 추정하여, 배수 기준을 만족하는지의 여부를 표시부 (9) 에 표시한다.
이하, 상기 제 1 실시예의 결과를 검증한다.
상기 서술한 제 1 실시예와 같이, 희석에 의해 백그라운드가 저감되고, 그 결과 노이즈가 감소하고, S/N 비가 향상되는지의 여부를 검증하였다.
희석되지 않는 것의 일례로서, 전체 용적이 100 ㎖ 인 시료 용기 (2) 에 대하여, 시료로서 생물이 든 해수 5 ㎖ 와, 생물이 없는 인공 해수 95 ㎖ 와, 1 mM 농도의 FDA 를 1 ㎖ 를 투입하고, 교반·혼합을 실시하였다. 그리고, 이 시료 용기 (2) 를 일정 시간 정치시키고, 구체적으로는 20 ℃ 의 환경하에서 약 30 분간 정치시키고, 검사 장치 (1) 에 의해 측정하였다. 그 때의 백그라운드 성분을 도 4 의 (a) 에 나타낸다. 또, 확대도를 도 4 의 (b) 에 나타낸다. 이 때의 백그라운드 성분의 전압은 0.3977 V 이고, 신호 전압 (S) 이 0.006118 V 이고, 잡음 전압 (N) 이 0.001157 V 이고, S/N 비는 5.2878 이 되었다.
희석되는 것의 일례로서, 전술한 단락 0025 ∼ 0030 의 수법에 의해 시료의 조정을 실시하고, 검사 장치 (1) 에 의해 측정하였다. 그 때의 백그라운드 성분을 도 5 의 (a) 에 나타낸다. 또, 확대도를 도 5 의 (b) 에 나타낸다. 이 때의 백그라운드 성분의 전압은 0.03977 V 이고, 신호 전압 (S) 이 0.006354 V 이고, 잡음 전압 (N) 이 0.000479 V 이고, S/N 비는 13.2651 이 되었다.
희석되지 않는 것과 희석되는 것을 비교하면, 백그라운드 성분의 전압은 약 20 분의 1 로 저감되고, S/N 비는 약 2.5 배 높아졌다.
이상과 같이 본 실시형태에 의하면, 형광 염색 공정에 있어서 소량의 시료에 형광 염색 시약을 교반·혼합하고, 이어서 정치 공정에 있어서 용액을 일정 시간 정치시키고, 추가로 희석 공정에 있어서 형광 발광하지 않는 액체로 희석하는 것이기 때문에, 상기 형광 염색 공정에서 소량의 시료 중에 포함되는 미생물과 형광 염색 시약이 교반·혼합되어, 매우 얼룩이 없는 상태로 깨끗하게 염색되고, 상기 희석 공정에서 희석액이 첨가되었을 때에는, 이미 형광 염색 시약의 염색 활성도가 작용하지 않고, 최종 공정의 미생물량 산출 공정에 있어서는, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시켜, S/N 비를 높게 하여, 검출 정밀도에 현격히 향상시키는 것이 가능해지는 것이다.
또, 상기 시료 조제 공정이, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 pH 조정제를 첨가하는 pH 조정 공정을 포함하는 것이었던 경우에는, 형광 염색 공정에 있어서 시료의 pH 가 약알칼리성이면, 시료 중에 포함되는 미생물과 형광 염색 시약이 교반·혼합되어, 매우 얼룩이 없는 상태로 깨끗하게 염색되고, 상기 pH 조정 공정에서 pH 조정제가 첨가되어 시료의 pH 가 약산성이 되었을 때에는, 이미 형광 염색 시약의 염색 활성도가 작용하지 않고, 최종 공정의 미생물량 산출 공정에 있어서는, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시키고, S/N 비를 높게 하여, 검출 정밀도에 현격히 향상시키는 것이 가능해지는 것이다.
산업상 이용가능성
본 발명은, 백그라운드 성분의 형광 발광을 저감시켜 검출 정밀도를 향상시킬 수 있는 미생물의 검출 방법 등에 적용하는 것이 가능하다.
1 : 검사 장치
2 : 시료 용기
3 : 조작부
4 : LED 광원
5 : 여기광용 밴드 패스 필터
6 : 형광용 밴드 패스 필터
7 : 광전자 증배관 (PMT)
8 : CPU 기판
9 : 표시부

Claims (5)

  1. 시료 중의 미생물량을 측정하기 위한 미생물의 검사 방법으로서,
    상기 시료 중의 미생물량의 측정은, 시료 및 형광 염색 시약을 교반·혼합하여 시료를 조제하는 시료 조제 공정과, 상기 시료에 특정 파장의 여기광을 조사하여 얻어진 형광 발광의 발광수로부터 미생물량을 산출하는 미생물량 산출 공정을 포함하는 것이고,
    상기 시료 조제 공정은, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 형광 발광하지 않는 액체로 희석하는 희석 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물의 검사 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 형광 염색 공정은, 시료 용기에 그 시료 용기 전체 용적의 1 ∼ 10 ％ 용량의 시료를 투입함과 함께, 상기 시료 용기에 상기 시료 1 용량에 대하여 1 ％ 용량의 형광 염색 시약을 투입하여 교반·혼합하여 이루어지는, 미생물의 검사 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 형광 염색 시약은, FDA 를 사용하고, 희석 전의 시료 중의 농도가 0.01 mM 이 되도록 첨가하여 이루어지는, 미생물의 검사 방법.
  4. 시료 중의 미생물량을 측정하기 위한 미생물의 검사 방법으로서,
    상기 시료 중의 미생물량의 측정은, 시료 및 형광 염색 시약을 교반·혼합하여 시료를 조제하는 시료 조제 공정과, 상기 시료에 특정 파장의 여기광을 조사하여 얻어진 형광 발광의 발광수로부터 미생물량을 산출하는 미생물량 산출 공정을 포함하는 것이고,
    상기 시료 조제 공정은, 일정량의 시료 및 상기 형광 염색 시약을 교반·혼합하는 형광 염색 공정과, 그 형광 염색 공정 후의 용액을 일정 시간 정치시키는 정치 공정과, 그 정치 공정 후의 용액에 pH 조정제를 첨가하는 pH 조정 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물의 검사 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 pH 조정 공정은, 상기 형광 염색 공정에서의 용액의 pH 가 8.0 이었을 때에, 당해 pH 조정 공정에서 pH 가 6.0 이 되도록 pH 조정제를 첨가하여 이루어지는, 미생물의 검사 방법.
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