CN105412075A - 双氢青蒿素在制备防治骨质疏松药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了双氢青蒿素在制备防治骨质疏松药物中的应用。基于现有双氢青蒿素用途的局限性,发明人对双氢青蒿素进行了深入的研究,发现双氢青蒿素可抑制破骨细胞的分化形成和骨吸收活性,并发现其在动物体内有明显的抗骨丢失功能,因此可用于治疗骨质疏松。本发明首次报道了双氢青蒿素对骨质疏松直接效应,并对其药用价值进行了分析,填补了国内外这一领域的空白,开拓了双氢青蒿素的新用途。由于双氢青蒿素属天然植物活性产物,因此其来源广泛,在制备防治骨质疏松药物应用方面具有广阔的市场前景及经济价值。
Description
技术领域
本发明属于骨质疏松治疗技术领域,尤其是天然活性产物用于治疗骨质疏松,具体涉及双氢青蒿素在制备防治骨质疏松药物中的应用。
背景技术
骨是一个由有机基质矿化而不断自我更新的组织,这一过程依赖于破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成两者之间的动态平衡,如果平衡被打破,无论是骨吸收增加还是骨形成增加,都会引起骨的疾病,例如骨质疏松,Paget’s病,骨硬化。其中,骨质疏松是一个常见的年龄相关的退化性疾病,常见于绝经后雌激素水平下降的妇女。脆性骨折是骨质疏松常见的并发症,其高发病率与死亡率给社会和人们带来了极大负担。根据2004年美国wurgeonGneneral`s的报道,50岁以上的妇女有50%脆性骨折的风险。因此,对骨质疏松的治疗具有极为重要的卫生经济学意义。
破骨细胞的主要功能就是通过分泌酸性物质和蛋白酶吸收骨组织的有机物质和矿化成分从而介导骨的重吸收。RANKL(eceptoractivatorofnuclearfactorkappa-Bligand)是破骨细胞形成和活化的重要因子。RANKL与其受体RANK结合后激动多个胞内转录因子,如NF-κB、AKT、ActivatorProtein1(AP-1)、MitogenActivatedProteinkinase(MAPK)和NuclearFactorofActivatedT-cellcytoplasmic1(NFATc1),这些下游因子的活化则促进破骨细胞分化、功能相关基因的表达,包括TRACP,CathepsinK,MMP-9(基质金属蛋白酶)9和CTR(降钙素受体)的表达,进而促进多核的破骨细胞形成和其骨吸收活性。因而,RANKL被认为是治疗骨质疏松的靶点,通过肽类和自然化合物可以抑制破骨细胞的形成和功能。
目前针对骨质疏松的治疗主要着眼于抑制破骨细胞活性。临床用于抑制破骨细胞的药物主要有双膦酸盐、降钙素、雌激素。双膦酸盐结构与内源性骨代谢调节剂焦磷酸盐类似,通过抑制破骨细胞活性发挥抗骨吸收作用,主要用于治疗骨吸收明显增强的代谢性骨病。然而,和大多数干预措施一样,二膦酸盐类药物也会带来不利影响,包括食道溃疡,反酸、恶心、呕吐,并可导致颚骨坏死(ONJ)。CT是目前治疗高转换型骨质疏松症的首选药物之一。然而欧洲药品管理局人用药品委员会的临床研究报道和有关研究的数据资料进行了审查,指出长期使用降钙素6个月以上者的恶性肿瘤风险有轻微增高。雌激素既可促进降钙素的分泌,抑制骨吸收;又可降低PTH对血钙波动的反应性,抑制PTH的分泌,减少骨吸收。然而Women`sHealthInitiative的研究表明激素替代的确是骨质疏松症经济有效的治疗手段,但不推荐作为一线治疗药物,因为其可增加乳癌和心血管意外的风险。
倍半萜内醋类物质青蒿素是治疗疟疾的有效药物,而双氢青蒿素(DHA)是则是青蒿素的半合成衍生物,同时也是青蒿素类化合物(青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等)的代谢活性产物。其治疗疟疾的效用是青蒿素的5倍左右,联合氯喹可有效治疗疟疾,并减少副作用。
有文献报道双氢青蒿素具有抗癌作用,可抑制大鼠胶质瘤细胞生长、诱导细胞凋亡,减少缺氧诱导的低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和其基因蛋白血管内皮生长因子(VEGF)的表达。DHA可抑制核因子-κkappaB(NF-KB)的活性进而降低胰腺癌细胞的细胞活性,并且减少NF-KB相关基因产物如VEGF、c-myc和细胞周期蛋白D1的表达。在对人白血病细胞的研究中发现,DHA可抑制细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)的活性进而促进人白血病细胞的凋亡,动物实验也证明DHA可以有效抑制小鼠U937cells瘤体的生长。NF-KB和、Erk1/2是破骨细胞形成的重要转录因子和关键蛋白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供双氢青蒿素在制备防治骨质疏松药物中的应用。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
双氢青蒿素在制备抑制破骨细胞活性的药物中的应用。
双氢青蒿素在制备防治骨质疏松药物中的应用。
上述骨质疏松是由于雌激素下降导致的。
上述药物为注射剂、胶囊剂或片剂。
基于现有双氢青蒿素用途的局限性,发明人对双氢青蒿素进行了深入的研究,发现双氢青蒿素可抑制破骨细胞的分化形成和骨吸收活性,并发现其在动物体内有明显的抗骨丢失功能,因此可用于治疗骨质疏松。本发明首次报道了双氢青蒿素对骨质疏松直接效应,并对其药用价值进行了分析,填补了国内外这一领域的空白,开拓了双氢青蒿素的新用途。由于双氢青蒿素属天然植物活性产物,因此其来源广泛,在制备防治骨质疏松药物应用方面具有广阔的市场前景及经济价值。
附图说明
图1是双氢青蒿素化学结构式。
图2是MTS法细胞活力检测图。
图3是双氢青蒿素在不同浓度下对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响图。
图4是双氢青蒿素在不同浓度作用情况下对破骨细胞的形成数量的细胞培养结果量化图。
图5是体外破骨细胞骨吸收实验结果图,图中:A是破骨细胞在羟基磷灰石涂层板上的生长状况和骨吸收面积图;B是破骨细胞的数目量化图;C是骨吸收面积量化图。
图6是双氢青蒿素抑制破骨细胞关键基因表达的结果图。
图7是双氢青蒿素抑制破骨细胞NF-kB通路结果图,图中A是是双氢青蒿素对破骨细胞NF-kB转录活性影响图,B是双氢青蒿素对破骨细胞NF-kB蛋白表达调控图。
图8是双氢青蒿素抑制破骨细胞NFATc1通路结果图,图中A是双氢青蒿素对破骨细胞NFAT转录活性影响图;B是双氢青蒿素对破骨细胞NFATc1蛋白表达调控图。
图9是Micro-CT扫描并重建小鼠胫骨近端结果图,图中:A是小鼠骨扫描后3D重建图;B是骨小梁量化参数分析。
图10是小鼠胫骨近端组织病理学分析,图中:A是胫骨H&E和TRAP染色;B是骨小梁、破骨细胞面积与数量的量化分析。
具体实施方式
双氢青蒿素治疗骨质疏松的研究
该研究将结合细胞-分子生物学、骨质疏松动物模型构建、免疫组化、扫描电镜显微、Micro-CT骨微结构显影和3D重建技术,就双氢青蒿素(图1)对破骨细胞(Osteoclasts,OCs)形成、生存、骨吸收功能的影响,检测其对破骨细胞形成和功能行使过程中的关键基因和蛋白的调控作用,并在动物模型体内验证其抗骨质疏松的疗效。该研究将从干预OCs的角度阐述双氢青蒿素抗骨质疏松及溶骨性疾病的作用提供理论依据和数据支持。
1、不同浓度双氢青蒿素对破骨细胞生存的影响
将RAW264.7细胞接种于的96孔板,细胞贴壁后加入不同浓度的双氢青蒿素干预。培养一定时间后加入MTS分析液,孵育4小时后分析增殖状况。
结果:如图2所示,经测定双氢青蒿素在0.5μM到2.5μM浓度刺激情况下破骨细胞细胞活性良好,表明在此浓度范围对破骨细胞没有细胞毒性作用。
2、双氢青蒿素对RANKL诱导的小鼠破骨细胞形成的影响
分离、培养小鼠骨髓细胞,用M-CSF刺激生成小鼠骨髓来源巨噬细胞BMMs。将BMM接种于96孔板上,并用M-CSF、RANKL刺激细胞向破骨细胞分化。实验组加入双氢青蒿素,定期更换培养基,7天后PFA固定细胞,经TRACP染色,观察TRACP阳性的多核细胞,计数>3个核的细胞为破骨细胞样细胞。
结果:如图3和图4所示,细胞培养表明双氢青蒿素在0.5μM、1μM和2.5μM浓度时对破骨细胞有明显抑制作用,破骨细胞数量和大小均下降,结果有统计学差异(*p<0.01,**p<0.01,***p<0.001)。
3、双氢青蒿素对RANKL诱导的小鼠破骨细胞骨吸收活性的影响
OCs是体内唯一具有份吸收活性的细胞,骨吸收实验是体外检测破骨细胞骨吸收功能最可靠的方法。将BMM细胞种植于基磷灰石涂层板中,通过RANKL和双氢青蒿素的刺激,经过一定时间的孵育后将其漂洗,再用苏木素染色,通过扫描电镜观察骨吸收陷窝计数和面积,进而对OCs骨吸收活性进行评价。
结果:如图5所示,结果表明0.5μM、1μM双氢青蒿素可有效抑制破骨细胞骨吸收活性,结果有统计学差异(*p<0.01,**p<0.01)。
4、双氢青蒿素对破骨细胞特异基因表达的影响
将BMMs细胞接种于细胞培养板中,培养12h待细胞贴壁后,实验组加培养基RANKL,并以不同浓度的双氢青蒿素处理。通过Trizol试剂提取总RNA,将总RNA通过oligo-dT引物逆转录成cDNA。通过Real-TimePCR测定CathepsinK、CalcitioninReceptor、TRACP的表达。
结果:如图6所示,浓度0.5μM、1μM双氢青蒿素可抑制破骨细胞相关基因CathepsinK、CalcitioninReceptor、TRACP的表达。
5、双氢青蒿素对RANKL诱导的NF-κB信号通路的作用
RAW264.7细胞用荧光素酶受体基因p-NF-κB-TA-Luc转染,先用双氢青蒿素对已转染的RAW264.7细胞进行预刺激,然后加入RANKL诱导破骨细胞生成,培养一定时间后收集细胞裂解液进行荧光素酶检测实验,测定Luciferase值,从而反应细胞NF-κB基因表达状况。我们通过WesternBlot检测及蛋白印迹灰度分析的方法分析药物做用后RAW264.7细胞总蛋白中IκB-α的表达水平。
结果:如图7A所示,荧光酶报告基因分析0.25-5μM双氢青蒿素可以有效抑制NFκB转录活性。图7BWesternBlot分析双氢青蒿素对NFκB蛋白的水平调节。以β-actin为参照,并作比例分析。1μM双氢青蒿素有效地抑制RANKL诱导的NFκB蛋白表达。
6、NFAT基因的质粒转染及NFATc1信号通路的调节作用
RAW264.7细胞种植于细胞培养板中,培养于37℃含5%CO2的恒温培养箱中,过夜稳定、换液后分别加入含NFAT-luc质粒的DMEM培养基、Turbofect转染试剂等。孵育48h后,更换培养基和RANKL,实验组予以双氢青蒿素处理。8小时后进行荧光素酶检测实验,加入Luciferase检测lx细胞裂解液,转移至白板,加入Luciferase检测lx荧光素溶液,酶标仪测定Luciferase值。通过Westernblot检测药物刺激后RAW264.7细胞中NFATc1的基因和蛋白的表达水平。
结果:如图8A所示,双氢青蒿素可抑制破骨细胞NFAT活性。荧光酶报告基因分析0.25-5μM双氢青蒿素可以有效抑制NFAT转录活性(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。图8BWesternBlot分析双氢青蒿素对NFATc1蛋白的水平调节。以β-actin为参照,并作比例分析。1μM双氢青蒿素可时间依赖性地抑制NFATc1蛋白表达。
7、通过骨质疏松动物模型探讨双氢青蒿素治疗体内有效性
选用6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠,麻醉后行双侧卵巢切除术。手术过程均在严格无菌条件下进行,术后小鼠放至笼中自由进食小鼠消毒颗粒饲料和纯净水。对照组行假手术(Sham)。术后第5-6天给与双氢青蒿素腹腔注射治疗,按1mg/kg给药1次/2天,连续6周。对照组(OVX组与Sham组)则给与同量含DMSO的生理盐水溶液。
治疗结束后去小鼠胫骨行micro-CT扫描、3D成像,对药物作用后骨小梁体积比(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁之间的间隙(Tb.Sp)和骨密度(BMD)进行定量描述,并作组织病理分析量化骨小梁体积比(BV/TV)、破骨细胞表面积比例(Oc.s/BS)、单位面积破骨细胞数量(N.Oc/B.P),客观评价双氢青蒿素在骨质疏松动物体内的抗骨丢失作用效果。
结果:如图9所示,图9A中与假手术组(Sham)相比卵巢切除(OVX)可引起骨量严重丢失,1mg/kg双氢青蒿素亦可有效抑制小鼠骨量丢失。双氢青蒿素在1mg/kg用量时可有效增加BV/TV(骨体积分数)和Tb.N(骨小梁数量),并减少Tb.Sp(骨小梁分离度)。
如图10A所示对胫骨切片进行H&E、TRAP染色显示骨小梁和破骨细胞数目,图10B可见1mg/kg双氢青蒿素可升高BV/TV,并降低Oc.s/BS、N.Oc/B.P。
分析及结论:本发明的研究探索了双氢青蒿素治疗骨质疏松的有效性和实验条件下体内作用有效剂量,并揭示了其作用机制:
<1>发现双氢青蒿素在0.5-2.5μM时对破骨细胞的生存活性并无负面影响,在>0.5μM时对破骨细胞的形成产生抑制效应,并有效抑制破骨细胞骨吸收活性,在>0.5μM时可抑制破骨细胞相关基因的表达;动物模型试验也揭示双氢青蒿素在1mg/kg时可有效抑制雌激素下降导致的骨丢失。
<2>体外试验表明双氢青蒿素对雌激素下降导致骨质丢失的抑制作用是由其抑制NFκB和NFATc1通路介导的。
综上,双氢青蒿素可抑制破骨细胞的分化形成和骨吸收活性,其在动物体内有明显的抗骨丢失功能,因此可用于治疗骨质疏松。由于双氢青蒿素属天然植物活性产物,因此其来源广泛,在制备防治骨质疏松药物应用方面具有广阔的市场前景及经济价值。
Claims (4)
1.双氢青蒿素在制备抑制破骨细胞活性的药物中的应用。
2.双氢青蒿素在制备防治骨质疏松药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述骨质疏松是由于雌激素下降导致的。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述药物为注射剂、胶囊剂或片剂。
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冯明宣等: "双氢青蒿素通过AKT/ Src通路抑制钛颗粒介导的骨吸收", 《2015年浙江省骨质疏松与骨矿盐疾病学术年会暨骨质疏松症和骨质疏松性骨折诊治进展专题研讨会论文汇编》 * |
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