CN105409778B - 红腺忍冬无菌组培苗叶柄不定芽诱导的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，采用苗龄为45‑55天的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽的诱导，对叶柄进行增加伤口面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织不定芽，其中愈伤组织诱导培养与不定芽诱导培养的培养温度均为25±3℃，相对湿度为50％‑75％，光照为12h/d，光照强度为2000‑3000Lux。本发明的方法简单方便，在短期内能够快速有效地将红腺叶柄诱导出不定芽，为红腺忍冬优良种质保存、快速繁育及在研究、生产中的应用提供了新的技术参考。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄不定芽诱导的方法。
背景技术
红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)，又名盘腺忍冬、菰腺忍冬、腺背金银花等，为忍冬科忍冬属(Lonicera)植物，属多年生半缠绕藤本或者藤状灌木，老茎中空，主要产于河南、广西、山东、云南等地。2005年版《中国药典》将红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.与灰毡毛忍冬Lonicera nuwranthoides Hand.Mazz.和华南忍冬Lonicera confuseDC.规定为山银花(我国名贵中药材之一)的三种来源。红腺忍冬社会需求量大，产需供求缺口大，其药用价值和保健作用足以推动山银花的种植、加工、销售等行业的发展、基础研究及临床应用研究。
组织培养作为一种现代生物技术，在植物种质资源保存和优良品种快速繁育方面具有重要的应用价值。目前关于山银花组织培养相关的报道较少，对红腺忍冬组织培养研究的报道也不多，红腺忍冬属于木质藤本，组织培养难度大，目前山银花组织培养中主要以常规苗木(生长于山地或实验基地等非无菌环境中的常规苗木)的带腋芽茎段或顶芽作为外植体进行组织培养，且以带腋芽的半木质化的茎段为首选材料，需经过消毒灭菌后诱导成成初代芽，解决了其范围内的一些技术问题，但随着对此初代芽的继续培养，后期会出现一些问题，如内生菌的表现等使得最终无菌苗成苗率极低，阻碍了壮苗移栽的进展，育苗成本高，没有大规模应用于实际，而对于红腺忍冬组培苗叶柄不定芽诱导的研究尚未有报道，本发明经申请人通过大量的摸索试验后，发现了诱导红腺忍冬无菌苗的新方法，即以红腺忍冬的叶柄为诱导对象，成功诱导出完整的无菌苗植株，为此领域的基础研究及应用研究提供了新的参考方向。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种以苗龄为50d左右的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体诱导出不定芽的方法，诱导率达18.25％。本发明简单方便，在短期内能够快速有效地将红腺叶柄诱导不定芽，为红腺忍冬优良种质资源保存、快速繁育及在研究、生产中的应用提供了新的技术参考。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，采用苗龄为45-55天的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽的诱导。
优选的是，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为45-55天的生长健壮的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为45-55天的生长健壮的红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为25±3℃，相对湿度为50％-75％，光照为12h/d，光照强度为2000-3000Lux。
优选的是，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤1)中，所述生根培养基为含0.2mg/Lα-萘乙酸的1/2MS培养基。
优选的是，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，对叶柄进行增加伤口面积处理是指用灭过菌的手术剪刀将叶柄沿其长度方向间隔剪伤多个伤口以增加伤口面积，伤口深度为0.5-1.0mm。
优选的是，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0-3.0mg，赤霉素0.25-1.0mg，其余成分为MS培养基。
优选的是，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0mg，赤霉素0.3mg，其余成分为MS培养基。
优选的是，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0mg，赤霉素0.3mg，营养剂1.2-1.4mg，其余成分为MS培养基，其中，所述营养剂的制备方法为：将牛奶树汁液、椰子汁和竹醋液按体积比为5:20:1混合得混合液，将五味子、黄芪和甘草按质量比为2:5:7混合，研磨成粉后得混合物，将混合液与混合物按照质量比为6-8:1混合，先置于40℃、超声功率为300W的条件下超声处理1h，然后置于40-45℃下真空回流提取4-5h，过滤得提取液，将所述提取液喷雾干燥即得所述营养剂，所述牛奶树汁液为划伤牛奶树树皮获得的白色乳汁。
优选的是，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，采用苗龄为50天的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽的诱导。
本发明至少包括以下有益效果：
1)本发明能利用苗龄为50d左右的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄作为外植体诱导出不定芽，从接种叶柄外植体之日起，培养30d之内即可诱导出愈伤组织，培养至第50d-60d时，此愈伤组织诱导出不定芽，第60d时，不定芽诱导率可达12.50％，继续培养至第90d时，不定芽诱导率可达18.25％，芽诱导持续时间较长，适宜培养条件下可持续培养1年以上，在这1年当中，不定期的诱导出新的不定芽，累计算来，能够诱导出不定芽的这部分外植体，到后期(自接种培养以来第9-10个月)每个外植体出芽数在5-15个不等，有些外植体诱导出的芽数甚至超出15个芽，芽诱导的后效应效果持续时间长，为红腺忍冬种质资源的保存和药材的来源等研究及应用提供新的参考途径，为更进一步开发利用该物种提供了一定的技术参考；
2)本发明采用红腺忍冬无菌组培苗的叶柄为外植体，是由于红腺忍冬普通常规苗本身带有病菌，容易感染病菌，脱毒过程比较难，直接导致不定芽的无菌苗诱导率更低，而以无菌苗的叶柄为外植体，拓宽了实验对象的范围，并已经成功诱导出不定芽，且芽诱导的后效应效果持续时间长，为此领域的研究及应用提供新的参考技术和方向。
3)本发明通过在不定芽诱导培养基中增加适量的营养剂，将培养60天后的不定芽诱导率提高至20.48％，继续培养至第90d时，不定芽诱导率提高至36.62％。本发明的营养剂由牛奶树汁液、椰子汁和竹醋以适当体积比对五味子、黄芪和甘草进行超声和回流提取，提取液喷雾干燥所得，具有促进愈伤组织生成不定芽的作用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实施例4的红腺忍冬叶柄诱导不定芽效果图；
图2为对比例2的红腺忍冬叶柄诱导不定芽效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例、对比例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为45天的生长健壮的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为45天的生长健壮红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续在该不定芽诱导培养基上培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为22℃，相对湿度为50％，光照为12h/d，光照强度为2000Lux。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤1)中，所述生根培养基为含0.2mg/Lα-萘乙酸的1/2MS培养基。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，对叶柄进行增加伤口面积处理是指用灭过菌的手术剪刀将叶柄沿其长度方向间隔剪伤多个伤口以增加伤口面积，伤口深度为0.5-1.0mm。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0mg，赤霉素0.25mg，其余成分为MS培养基。
实施例2：
一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为50天的生长健壮的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为50天的生长健壮的红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为25℃，相对湿度为65％，光照为12h/d，光照强度为2500Lux。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤1)中，所述生根培养基为含0.2mg/Lα-萘乙酸的1/2MS培养基。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，对叶柄进行增加伤口面积处理是指用灭过菌的手术剪刀将叶柄沿其长度方向间隔剪伤多个伤口以增加伤口面积，伤口深度为0.5-1.0mm。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.5mg，赤霉素0.6mg，其余成分为MS培养基。
实施例3：
一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为55天的生长健壮的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为55天的生长健壮的红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为28℃，相对湿度为75％，光照为12h/d，光照强度为3000Lux。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤1)中，所述生根培养基为含0.2mg/Lα-萘乙酸的1/2MS培养基。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，对叶柄进行增加伤口面积处理是指用灭过菌的手术剪刀将叶柄沿其长度方向间隔剪伤多个伤口以增加伤口面积，伤口深度为0.5-1.0mm。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤3.0mg，赤霉素1.0mg，其余成分为MS培养基。
实施例4：
一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为50天的生长健壮的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为50天的生长健壮的红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为25℃，相对湿度为65％，光照为12h/d，光照强度为2500Lux。
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其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，对叶柄进行增加伤口面积处理是指用灭过菌的手术剪刀将叶柄沿其长度方向间隔剪伤多个伤口以增加伤口面积，伤口深度为0.5-1.0mm。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0mg，赤霉素0.3mg，其余成分为MS培养基。
实施例5：
一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为50天的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为50天的生长健壮的红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为25℃，相对湿度为65％，光照为12h/d，光照强度为2500Lux。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤1)中，所述生根培养基为含0.2mg/Lα-萘乙酸的1/2MS培养基。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，对叶柄进行增加伤口面积处理是指用灭过菌的手术剪刀将叶柄沿其长度方向间隔剪伤多个伤口以增加伤口面积，伤口深度为0.5-1.0mm。
其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0mg，赤霉素0.3mg，营养剂1.2-1.4mg，其余成分为MS培养基，其中，所述营养剂的制备方法为：将牛奶树汁液、椰子汁和竹醋液按体积比为5:20:1混合得混合液，将五味子、黄芪和甘草按质量比为2:5:7混合，研磨成粉后得混合物，将混合液与混合物按照质量比为6-8:1混合，先置于40℃、超声功率为300W的条件下超声处理1h，然后置于40-45℃下真空回流提取4-5h，过滤得提取液，将所述提取液喷雾干燥即得所述营养剂，所述牛奶树汁液为划伤牛奶树树皮获得的白色乳汁。
对比例1：
在实施例4的基础上，其中，所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，步骤3)中，将不定芽诱导培养基替换为MS培养基。
对比例2：
在实施例4的基础上，将所述的不定芽诱导培养基更换为：每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、赤霉素(GA3)0.5mg，其余成分为MS培养基的培养基。
对比例3：
在实施例4的基础上，将所述的不定芽诱导培养基更换为：每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3.5mg、赤霉素(GA3)1.5mg，其余成分为MS培养基的培养基。
对比例4：
在实施例4的基础上，将所述的不定芽诱导培养基更换为：每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg、赤霉素(GA3)0.15mg，其余成分为MS培养基的培养基。
为了说明本发明的有益效果，本发明的发明人针对实施例4、实施例5和对比例1-4中对红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的过程进行了观察，得出以下结果：
根据公式：不定芽诱导率(％)＝(诱导出不定芽的叶柄总个数/接种的叶柄总个数)×100％；根据公式：平均芽数(个)＝(诱导出不定芽总芽数/能诱导出芽的叶柄总个数)
实施例4：
培养30天即可长出绿色愈伤组织(Φ0.25cm，且量少)，不定芽诱导率为0，平均芽数为0个，愈伤组织大小为Φ0.25cm；
继续培养至第50d时，即可诱导出不定芽，培养至第60d时，不定芽诱导率达12.50％；平均芽数为1.65个，愈伤组织大小为Φ0.63cm；
继续培养至第90天时如图1所示，不定芽诱导率提高至18.25％，平均芽数1.8个，愈伤组织大小为Φ0.70cm。
实施例5：
培养30天即可长出绿色愈伤组织(Φ0.35cm，且量少)，不定芽诱导率为0，平均芽数为0个，愈伤组织大小为Φ0.35cm；
继续培养至第50d时，即可诱导出不定芽，培养至第60d时，不定芽诱导率达20.48％，平均芽数为2.5个，愈伤组织大小为Φ0.72cm；
培养至第90天时，不定芽诱导率提高至36.62％，平均芽数3.1个，愈伤组织大小为Φ0.81cm。由实施例4和实施例5可以看出，在不定芽诱导培养基中添加适量的营养剂可以提高不定芽的诱导率。
对比例1：
培养30天即可长出绿色愈伤组织(Φ0.1cm，且量少)，不定芽诱导率为0，平均芽数为0个，愈伤组织大小为Φ0.1cm；
继续培养至第60d时，不定芽诱导率达0；平均芽数为0个，愈伤组织大小为Φ0.23cm；
继续培养至第90天时，不定芽诱导率提高至0，平均芽数0个，愈伤组织大小为Φ0.30cm。
对比例2：
培养30天即可长出绿色愈伤组织(Φ0.2cm，且量少)，不定芽诱导率为0，平均芽数为0个，愈伤组织大小为Φ0.20cm；
继续培养至第50d时，即可诱导出不定芽，培养至第60d时，不定芽诱导率达10.50％，平均芽数为1个，愈伤组织大小为Φ0.50cm；
培养至第90天时如图2所示，不定芽诱导率提高至16.67％，平均芽数1.5个，愈伤组织大小为Φ0.50cm。
对比例3：
培养30天即可长出绿色愈伤组织(Φ0.26cm，且量少)，不定芽诱导率为0，平均芽数为0个，愈伤组织大小为Φ0.26cm；
继续培养至第50d时，即可诱导出不定芽，培养至第60d时，不定芽诱导率达8.9％；平均芽数为0.9个，愈伤组织大小为Φ0.37cm；
继续培养至第90天时，不定芽诱导率提高至13.55％，平均芽数1.2个，愈伤组织大小为Φ0.44cm。
对比例4：
培养30天即可长出绿色愈伤组织(Φ0.13cm，且量少)，不定芽诱导率为0，平均芽数为0个，愈伤组织大小为Φ0.13cm；
继续培养至第50d时，即可诱导出不定芽，培养至第60d时，不定芽诱导率达6.5％；平均芽数为0.7个，愈伤组织大小为Φ0.28cm；
继续培养至第90天时，不定芽诱导率提高至9.40％，平均芽数0.8个，愈伤组织大小为Φ0.38cm。
对比例5：
在实施例4的基础上，针对不同苗龄的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄为外植体进行了试验研究，分别取苗龄为20天、30天、40天、50天、60天、70天的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽的诱导培养，不定芽诱导培养基以及其他方法等均与实施例4相同，发明人得出培养90天后，不定芽诱导率、平均芽数以及愈伤组织的大小见表1所示。
表1不同苗龄的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄对不定芽培养的影响
| 苗龄/天 | 不定芽诱导率 | 平均芽数/个 | 愈伤组织大小/cm |
| 20 | 4.2％ | 0.3 | Φ0.33 |
| 30 | 8.4％ | 0.7 | Φ0.40 |
| 40 | 13.2％ | 1.2 | Φ0.51 |
| 50 | 18.25％ | 1.8 | Φ0.70 |
| 60 | 16.7％ | 1.6 | Φ0.64 |
| 70 | 15.9％ | 1.5 | Φ0.57 |
由表1可知，不同苗龄的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄对不定芽培养有显著影响，其中，以苗龄为50天左右的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽诱导时不定芽诱导率最高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (4)
1.一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，其特征在于，采用苗龄为45-55天的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽的诱导；
包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为45-55天的生长健壮的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为45-55天的生长健壮的红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为25±3℃，相对湿度为50％-75％，光照为12h/d，光照强度为2000-3000Lux；
步骤3)中，所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0mg，赤霉素0.3mg，其余成分为MS培养基；
所述生根培养基为含0.2mg/Lα-萘乙酸的1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，其特征在于，步骤3)中，对叶柄进行增加伤口面积处理是指用灭过菌的手术剪刀将叶柄沿其长度方向间隔剪伤多个伤口以增加伤口面积，伤口深度为0.5-1.0mm。
3.根据权利要求1所述的红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，其特征在于，采用苗龄为50天的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽的诱导。
4.一种红腺忍冬无菌组培苗叶柄诱导不定芽的方法，其特征在于，采用苗龄为45-55天的红腺忍冬无菌组培苗的叶柄进行不定芽的诱导；
包括以下步骤：
1)材料准备：将红腺忍冬无菌组培苗接种到生根培养基中培养，取得苗龄为45-55天的生长健壮的无菌组培生根苗；
2)材料取样：取苗龄为45-55天的生长健壮的红腺忍冬无菌组培生根苗的正常叶柄待用；
3)叶柄不定芽的诱导：将选定待用的叶柄进行增加伤口表面积处理后接种于不定芽诱导培养基中培养，诱导出叶柄愈伤组织，继续培养将此叶柄愈伤组织诱导出不定芽，其中愈伤组织培养与不定芽诱导培养的培养温度均为25±3℃，相对湿度为50％-75％，光照为12h/d，光照强度为2000-3000Lux；
所述生根培养基为含0.2mg/Lα-萘乙酸的1/2MS培养基；
所述不定芽诱导培养基为每升培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤2.0mg，赤霉素0.3mg，营养剂1.2-1.4mg，其余成分为MS培养基，其中，所述营养剂的制备方法为：将牛奶树汁液、椰子汁和竹醋液按体积比为5:20:1混合得混合液，将五味子、黄芪和甘草按质量比为2:5:7混合，研磨成粉后得混合物，将混合液与混合物按照质量比为6-8:1混合，先置于40℃、超声功率为300W的条件下超声处理1h，然后置于40-45℃下真空回流提取4-5h，过滤得提取液，将所述提取液喷雾干燥即得所述营养剂，所述牛奶树汁液为划伤牛奶树树皮获得的白色乳汁。
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