CN105403645A - 一种在线浓缩装置及其在液相-气相二维色谱中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在线浓缩装置，其自上游至下游依次包括以下组件：上游连接管(3)、溶剂蒸发装置和下游连接管(9)；所述溶剂蒸发装置包括馏分收集仓(6)、柱塞杆(4)和控温加热装置(5)；其中所述柱塞杆(4)能上下移动；所述柱塞杆(4)内部具有连通所述上游连接管(3)和所述馏分收集仓(6)的贯穿通道；所述上游连接管上设有与其交叉的溶剂排出管(1)，在两者的交叉处设有第一控制阀(2)；所述下游连接管上设有第二控制阀(8)，所述馏分收集仓(6)和所述第二控制阀(8)之间具有一段尾管(7)。本发明还包括包含该在线浓缩装置的液相-气相二维色谱。本发明的装置大大提高了低浓度样品分析的灵敏度。

Description

一种在线浓缩装置及其在液相-气相二维色谱中的应用

技术领域

本发明属于化学分析装置技术领域，具体在线浓缩装置及其在液相-气相二维色谱中的应用。

背景技术

苯并[α]芘(缩写为B[α]P)是毒性最强的多环芳烃类化合物，肿瘤流行病学调查及动物实验研究发现，B[α]P具有较强致癌性，与肿瘤的发生密切相关，尤其与人类肺癌的发生高度相关。作为一种卷烟主流烟气中的重要有害成分，在卷烟抽吸过程中苯并[α]芘有可能会随卷烟烟气进入人体，从而对吸烟者的健康造成影响。苯并[α]芘及其代谢产物最终随尿液排出，因此准确测定吸烟者尿液中的苯并[α]芘含量对于进一步深入了解吸烟与健康的关系具有重要意义。

关于苯并[α]芘含量的测定，目前已得到广泛应用的方法是GC-MS法、HPLC-MS法和HPLC荧光检测法。由于吸烟者体内的苯并[α]芘含量非常低，通常为微量或痕量级别，在用这些方法测定时，样品前处理需采用萃取或固相萃取富集和分离净化，这些方式处理样品需多次的浓缩、转移，操作麻烦，可引入实验误差的因素多；而且有机溶剂消耗大，对环境污染大。因此寻找更简便、快速的苯并[α]芘含量测定方法非常迫切。

液相-气相二维色谱(LC-GC)技术是近几年来发展起来的一种新技术，一方面，由于液相色谱能提供很好的族分离，可以对样品做净化、富集等处理，而气相色谱具有高分离能力和高分析速度，可对样品进行进一步分离、分析，两者的结合使两种色谱之间的优势得到充分发挥；另一方面，两者通过自动在线联用，大大减少样品的手工前处理工作，避免了人为误差。这不仅提高了分析方法的可靠性，还节约了时间，用这种方法可使复杂分析变得简单方便。但是目前LC-GC技术的主要缺点是进样量小，气相色谱μL级的进样量只允许液相色谱小体积切入。以岛津凝胶净化-气质联用仪为例，液相最大进样量是20μL，液相可切入气相的最大量也小于200μL，每次经液相初分的样品只能切割一段体积小于200μL的馏分进入气相色谱；这很大程度上限制了LC-GC优势的发挥和推广应用。因此，开发一种在液相色谱和气相色谱之间带在线浓缩功能的LC-GC分析装置非常必要。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种在线浓缩装置；第二目的在于提供一种具有该在线浓缩装置的液相-气相二维色谱；第三目的在于提供使用上述具有所述在线浓缩装置的液相-气相二维色谱的分析方法以及它们在吸烟者尿液分析中测定吸烟者尿液中苯并[α]芘含量的用途。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

本发明第一方面涉及一种在线浓缩装置，其自上游至下游依次包括以下组件：上游连接管3、溶剂蒸发装置和下游连接管9；

所述溶剂蒸发装置包括馏分收集仓6、密闭式插入所述馏分收集仓6内部的柱塞杆4和位于所述馏分收集仓6外壁的控温加热装置5；其中所述柱塞杆4能在待浓缩样品对其浮力或其自身重力的作用下沿所述馏分收集仓6内壁上下移动；所述柱塞杆4具有连通所述上游连接管3和所述馏分收集仓6的贯穿式通道；

所述上游连接管3上设有与其交叉的溶剂排出管1，在两者的交叉处设有第一控制阀2，所述第一控制阀2控制待浓缩样品由所述上游连接管3的入口端的输入和浓缩时挥发的溶剂经所述溶剂排出管1的排出；

所述下游连接管9设有用于控制浓缩后样品输出的第二控制阀8，所述馏分收集仓6和所述第二控制阀8之间具有一段尾管7，用于储存浓缩后样品。

所述柱塞杆4随所述馏分收集仓6仓体中液体的体积变化而上下移动，当仓体中有液体流入时，柱塞杆4上移，仓体扩大；在浓缩时，随着仓体中液体体积减少，柱塞杆4下移，仓体缩小。

在本发明优选的实施方案中，所述尾管7的容积为0.01-200μL。

在本发明优选的实施方案中，该在线浓缩装置上的溶剂排出管1连接抽真空装置，用于通过抽真空作用使馏分收集仓6中的溶剂挥发而排出，由此留在所述馏分收集仓6中的待分析组分得以浓缩。

其中所述控温加热装置5用于在程序控制下加热所述馏分收集仓6，例如加热至溶剂的沸点温度以上，但低于待分析组分的沸点，以便使溶剂挥发成气体，并从所述柱塞杆4的贯穿通道离开并从溶剂排出管1排出，由此留在所述馏分收集仓6中的待分析组分得以浓缩。

上述加热作用和抽真空作用可以单独进行也可以同时进行。

本发明第二方面涉及包含根据本发明第一方面所述的在线浓缩装置的液相-气相二维色谱，所述上游连接管3连接液相色谱分析装置16待浓缩流出馏分的出口，所述下游连接管9连接气相色谱分析装置20的进样口。

在本发明优选的实施方案中，所述液相色谱分析装置16与气相色谱分析装置20之间设有数控六通阀10，其第一接口供所述液相色谱分析装置16的待浓缩流出馏分流入，第五接口连接至第二流动相容器18，所述第二流动相用于将浓缩后的流出馏分带入所述气相色谱分析装置20中，第二和第四接口分别连接至在线浓缩装置19的上游连接管3和下游连接管9，第三接口连接至所述气相色谱分析装置20的进样口，第六接口为废液排出口15。

本发明第三方面涉及根据本发明第二方面所述的液相-气相二维色谱的分析方法，其包括以下步骤：

a.将待测样品通过所述液相色谱分析装置16进行分离，并经在线切割得到含待测组分的待浓缩流出馏分；

b.将上述含待测组分的待浓缩流出馏分通过所述在线浓缩装置19进行浓缩，得到的浓缩后样品进样到所述气相色谱分析装置20中，采用内标法得到待测组分的含量。

在本发明优选的实施方案中，在步骤a中，所述在线切割如下进行：使用数控六通阀10对所述液相色谱分析装置16的流出物按照保留时间进行馏分切割，以将具有特定保留时间的含待测组分的待浓缩流出馏分输送在所述在线浓缩装置19中进行浓缩。

在本发明优选的实施方案中，当所述待测样品为吸烟者的尿液时，其还包括以下前处理步骤：将吸烟者尿液样品用含待测组分对应内标物的有机溶剂萃取；静置分层后取有机溶剂层过滤，得到待测样品。所述萃取可以采用现有技术中各种已知的萃取方法，优选地采用漩涡萃取。所述过滤可以采用现有技术中各种已知的过滤方法，优选地采用针头过滤器过滤。

本发明第四方面涉及根据本发明第二方面所述的液相-气相二维色谱或根据本发明第三方面所述的分析方法用于测定吸烟者尿液中苯并[a]芘含量的用途。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的在线浓缩装置可将上游装置输送的待浓缩样品在线浓缩后直接输送到下游装置，设计巧妙、操作方便；当在液相色谱和气相色谱之间增加该在线浓缩装置后，可以充分实现一级色谱(LC)更大体积进样并更大体积切入二级色谱(GC)，对于低含量的样品，在实现样品高效净化的同时大大提高了分析灵敏度，可满足吸烟者尿液中超低含量苯并[α]芘分析的要求。

2、本发明的二维色谱分析装置及分析方法避免了样品前处理过程中的浓缩、转移、定容等前处理步骤，减少了实验误差，由于样品处理人工操作环节大大减少，方法的重现性也得到明显提高。

附图说明

图1为本发明的在线浓缩装置结构示意图，其中箭头方向表示物料输送方向。

图2为含有本发明的在线浓缩装置的液相-气相二维色谱结构示意图；其中箭头方向代表物料输送方向。

图3为本发明实施例2含苯并[α]芘的尿液样品的液相色谱图。

图4为本发明实施例2含苯并[α]芘的尿液样品的气相色谱图。

图中：1-溶剂排出管；2-第一控制阀；3-上游连接管；4-柱塞杆；5-控温加热装置；6-馏分收集仓；7-尾管；8-第二控制阀；9-下游连接管；10-数控六通阀；11-第一泵；12-第二泵；13-第一脱气装置；14-第二脱气装置；15-废液排出口；16-液相色谱分析装置；161-柱温箱；162-液相色谱柱；163-紫外检测器；164-进样器；17-第一流动相容器；18-第二流动相容器；19-在线浓缩装置；20-气相色谱分析装置。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

如图2所示的包含如图1所示的在线浓缩装置的液相-气相二维色谱。所述在线浓缩装置，其自上游至下游依次包括以下组件：上游连接管3、溶剂蒸发装置和下游连接管9；

所述溶剂蒸发装置包括馏分收集仓6、密闭式插入所述馏分收集仓6内部的柱塞杆4和位于所述馏分收集仓6外壁的控温加热装置5；其中所述柱塞杆4能在待浓缩样品对其浮力或其自身重力的作用下沿所述馏分收集仓6内壁上下移动；所述柱塞杆4具有连通所述上游连接管3和所述馏分收集仓6的贯穿式通道；

所述上游连接管3上设有与其交叉的溶剂排出管1，在两者的交叉处设有第一控制阀2，所述第一控制阀2控制待浓缩样品由所述上游连接管3的入口端的输入和浓缩时挥发的溶剂经所述溶剂排出管1的排出；

所述下游连接管9设有用于控制浓缩后样品输出的第二控制阀8，所述馏分收集仓6和所述第二控制阀8之间具有一段尾管7，用于储存浓缩后样品。所述尾管7的容积为0.01-200μL。该在线浓缩装置还连接抽真空装置。

所述上游连接管3连接液相色谱分析装置16待浓缩流出馏分的出口，所述下游连接管9连接气相色谱分析装置20的进样口。所述气相色谱分析装置20后连有质谱仪。

所述液相色谱分析装置16与气相色谱分析装置20之间设有数控六通阀10，其第一接口供所述液相色谱分析装置16的待浓缩流出馏分流入，第五接口连接至第二流动相容器18，所述第二流动相用于将浓缩后的流出馏分带入所述气相色谱分析装置20中，第二和第四接口分别连接至在线浓缩装置19的上游连接管3和下游连接管9，第三接口连接至所述气相色谱分析装置20的进样口，第六接口为废液排出口15。

该装置的工作原理如下：首先启动第一泵11，使第一流动相容器17中的第一流动相经由第一脱气装置13进入液相色谱分析装置16中；待测样品经进样器164进入液相色谱分析装置16中，并经液相色谱柱162进行分离；来自所述液相色谱分析装置16的流出馏分经第一接口进入数控六通阀10中，含待测组分的待浓缩流出馏分经数控六通阀转入在线浓缩装置19中进行浓缩；转移完后，切换数控六通阀10，让第一泵11流动相废液和不含待测组分的流出馏分经废液排出口15排出。启动第二泵12，使第二流动相容器18中的第二流动相经由第二脱气装置14进入数控六通阀10中；第二流动相18将在线浓缩装置19中浓缩后的含待测组分的流出馏分经所述数控六通阀10的第三接口排出并输送到气相色谱分析装置20的进样口，进行气相色谱分析。

其中所述第一流动相为用于液相色谱的任何常规流动相。所述第二流动相为用于气相色谱的任何常规流动相。

其中，所述在线浓缩装置19的工作原理如下：转动第一控制阀2使上游连接管3的入口端与所述馏分收集仓连通，并关闭第二控制阀8，待浓缩样品经所述上游连接管3和所述柱塞杆4的贯穿通道进入所述馏分收集仓6中，并使所述柱塞杆4向上移动，开启控温加热装置5和抽真空装置；等所述待浓缩样品进样完成后，转动第一控制阀2使上游连接管3的入口端关闭且使所述溶剂排出管1经由所述上游连接管3与所述馏分收集仓6连通，待浓缩样品中的溶剂经所述溶剂排出管1排出，所述馏分收集仓6中样品体积减少，所述柱塞杆4向下移动；待样品浓缩完成后，浓缩后样品储存在尾管7中，打开所述第二控制阀8即可排出。

实施例2

采用如实施例1所述的液相-气相二维色谱分析装置对吸烟者尿液进行分析以测定其中苯并[α]芘含量的方法，其包括以下步骤：

取主动吸烟者尿液样品10.0mL于50mL的试管中，加入含D12-苯并[α]芘内标(浓度为0.1ng/mL)的环己烷10mL；用高速匀浆机20000转/min漩涡震荡5min，静置分层后，取上层清液1.0mL，经0.25μm滤头过滤后，样品通过进样器进入高效液相色谱仪，由第一泵11输送第一流动相17经硅胶柱分离，将10-10.8min的流出组分通过数控六通阀10转入在线浓缩装置19中，其余流动相废液从数控六通阀10的第六接口排出。启动在线浓缩装置19中的控温加热装置5对馏分收集仓6进行加热，并抽真空排除溶剂，让含待测组分的流出馏分在线浓缩到体积小于200μL；浓缩好后启动第二泵12输送第二流动相20把在线浓缩装置19中的浓缩后馏分输送到气相色谱进样口中。启动GC-MS，待浓缩后馏分完全进入气相色谱后，关闭气相色谱和数阀六通阀10之间的阀门，避免第二流动相20进入进样口，启动气相色谱升温进行分析，待测组分在19.65min出峰。

各步骤具体条件如下：

液相色谱分离：液相色谱带紫外检测器163(λ＝383nm)：UHPAQSi色谱柱(3.5μm，4.6mmi.d×150mm，微孔球形硅胶)；柱温30℃恒温；流动相为环己烷-丙酮(20:1)，流速1.0mL/min；双泵系统，第一泵11用于控制色谱柱流量，第二泵12用于控制HPLC与GC之间的切换。液相色谱进样量为200μL。在该条件下苯并[a]芘的出峰在10-10.8min之间(图3)，为了避免保留时间波动而损失，把9.8-11.2min流出馏分转入在线浓缩装置19中，浓缩到体积200μL以下；然后通过第二泵12和数控六通阀10把浓缩后的样品输送到到气相色谱的进样口。

在线浓缩：具体操作为把液相色谱中9.8-11.2min(流速1.0mL/min)流出馏分转入在线浓缩装置19中，转入体积为1.4mL；馏分转入时和浓缩时通入气相色谱的第二控制阀8关闭，当馏分全部转入后，由第一控制阀2控制关闭连接液相色谱，同时打开溶剂排除管道1，馏分收集仓6升温到60℃，并从溶剂排出管道1抽真空5-6min让溶剂蒸发浓缩样品。当样品浓缩到200μL以下，关闭溶剂排出管道1，同时打开通向液相色谱和气相色谱通道，由图2中第二泵12把浓缩后的样品转入气相色谱中。

气相色谱质谱分析：样品完全进入气相色谱后，关闭液相色谱通道，通过气相色谱中溶剂排出阀除去惰性石英管中的溶剂。溶剂完全排除后关闭溶剂排出口，启动气相色谱升温进行气相色谱分析。

气相色谱带柱头大体积进样附件，保留间隙柱为5m×0.53mmi.d.(J&W)的空柱，预保留柱规格为5m×0.25mmi.d×0.25μmdf，DB-5ms(J&W)；主分析柱为HP-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mmi.d×0.25μmdf,)；色谱柱升温程序：初始温度150℃，以10℃/min速率升至260℃，再以2℃/min速率升至280℃，保持20min；进样口温度280℃，载气为氦气，恒流流速l.2mL/min。

质谱条件：选择离子检测(SIM)，苯并芘与D12-苯并[a]芘的保留时间分别为19.65min和19.57min，苯并[a]芘与D12-苯并[a]芘的定量离子对分别为m/z252和m/z264，每个离子停留100ms。在该条件下实际尿液样品的典型色谱图见图4。

实施例3

取被动吸烟者尿液样品10.0mL于50mL的试管中，加入含D12-苯并[α]芘内标(浓度为0.1ng/mL)的环己烷10mL；用高速匀浆机20000转/min漩涡震荡5min，静置分层后，取上层清液1.0mL，经0.25μm滤头过滤后，样品通过进样器进入高效液相色谱仪，由第一泵11输送第一流动相17经硅胶柱分离，将10-10.8min的流出组分通过数控六通阀10转入在线浓缩装置19中，其余流动相废液从数控六通阀10的第六接口排出。启动在线浓缩装置19中的控温加热装置5对馏分收集仓6进行加热，并抽真空排除溶剂，让含待测组分的流出馏分在线浓缩到体积小于200μL；浓缩好后启动第二泵12输送第二流动相20把在线浓缩装置19中的浓缩后馏分输送到气相色谱进样口中。启动GC-MS，待浓缩后馏分完全进入气相色谱后，关闭气相色谱和数阀六通阀10之间的阀门，避免第二流动相20进入进样口，启动气相色谱升温进行分析，待测组分在19.65min出峰。

采用本方法对吸烟者尿液中的苯并[α]芘进行测定，结果见表1。从分析结果可看出不同吸烟者尿液中苯并[α]芘含量无明显差异，说明吸烟不是人体苯并[α]芘摄入的主要影响因素。

表1：样品分析结果

实施例4-测定方法工作曲线、检测限和定量限

配制不同浓度的系列标准工作液按实施例2选定仪器条件进样，以标准溶液与内标溶液的质量浓度比对峰面积比制作工作曲线。标准曲线的每一点进样三次，取其峰面积的平均值，峰面积做纵坐标，标样浓度作横坐标，绘制线性回归曲线，回归方程A＝10.26C-0.082，相关系数为0.9995，线性范围为0.1～1000ng.L^-1。对最低浓度的苯并[a]芘标准溶液进行10次测定，计算其标准偏差，以3倍标准偏差作为检测限，10倍标准偏差作为定量限，结果分别为0.36ng/L和0.93ng/L。

测定仪器的灵敏度以其检测限(LOD)和定量限(LOQ)来衡量，其中所述检出限指的是能可靠地被检出的分析信号所需要的某元素的最少浓度或含量；其中所述定量限指的是样品中被测物能被定量测定的最低量。

已知检测限的值为3倍标准偏差，定量限的值为10倍标准偏差。

结果表明本发明的分析装置的灵敏度较高。

实施例5-方法回收率和重复性

同一尿液样品取4份，其中1份为参比，另3份分别加入高、中、低不同浓度水平的苯并[a]芘，样品按实施例2中选定的前处理条件处理，选定色谱条件进样分析，通过加标样品测出量减去样品实际含量再除以标准加入量计算回收率，得到苯并[a]芘的回收率在86.4％-91.5％之间，说明方法回收率较好。

将同一尿液样品在同一天内重复测定7次，以及在不同天内重复测定7次，测得苯并[a]芘含量的日内相对标准偏差(RSD)为4.86％，日间RSD为5.22％。表明方法的重复性良好，满足日常烟气样品的检测。

Claims (9)

1.一种在线浓缩装置，其特征在于，其自上游至下游依次包括以下组件：上游连接管(3)、溶剂蒸发装置和下游连接管(9)；

所述溶剂蒸发装置包括馏分收集仓(6)、密闭式插入所述馏分收集仓(6)内部的柱塞杆(4)和位于所述馏分收集仓(6)外壁的控温加热装置(5)；其中所述柱塞杆(4)能在待浓缩样品对其浮力或其自身重力的作用下沿所述馏分收集仓(6)内壁上下移动；所述柱塞杆(4)具有连通所述上游连接管(3)和所述馏分收集仓(6)的贯穿式通道；

所述上游连接管(3)上设有与其交叉的溶剂排出管(1)，在两者的交叉处设有第一控制阀(2)，所述第一控制阀(2)控制待浓缩样品由所述上游连接管(3)的入口端的输入和浓缩时挥发的溶剂经所述溶剂排出管(1)的排出；

所述下游连接管(9)设有用于控制浓缩后样品输出的第二控制阀(8)，所述馏分收集仓(6)和所述第二控制阀(8)之间具有一段尾管(7)，用于储存浓缩后样品。

2.根据权利要求1所述的在线浓缩装置，其特征在于，所述尾管(7)的容积为0.01-200μL。

3.根据权利要求1所述的在线浓缩装置，其特征在于，所述溶剂排出管(1)连接抽真空装置。

4.一种包含根据权利要求1所述的在线浓缩装置的液相-气相二维色谱分析装置，其特征在于，所述上游连接管(3)的入口端连接液相色谱分析装置(16)待浓缩流出馏分的出口，所述下游连接管(9)的出口端连接气相色谱分析装置(20)的进样口。

5.根据权利要求4所述的液相-气相二维色谱分析装置，其特征在于，所述液相色谱分析装置(16)与气相色谱分析装置(20)之间设有数控六通阀(10)，其第一接口供所述液相色谱分析装置(16)的待浓缩流出馏分流入，第五接口连接至第二流动相容器(18)，所述第二流动相用于将浓缩后的流出馏分带入所述气相色谱分析装置(20)中，第二和第四接口分别连接至在线浓缩装置(19)的上游连接管(3)和下游连接管(9)，第三接口连接至所述气相色谱分析装置(20)的进样口，第六接口为废液排出口(15)。

6.一种使用根据权利要求4所述的液相-气相二维色谱分析装置的分析方法，其特征在于，其包括以下步骤：

a.将待测样品通过所述液相色谱分析装置(16)进行分离，并经在线切割得到含待测组分的待浓缩流出馏分；

b.将上述含待测组分的待浓缩流出馏分通过所述在线浓缩装置(19)进行浓缩，得到的浓缩后样品进样到所述气相色谱分析装置(20)中，采用内标法得到待测组分的含量。

7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，在步骤a中，所述在线切割如下进行：使用数控六通阀(10)对所述液相色谱分析装置(16)的流出物按照保留时间进行馏分切割，以将具有特定保留时间的含待测组分的待浓缩流出馏分输送在所述在线浓缩装置(19)中进行浓缩。

8.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，当所述待测样品为吸烟者的尿液时，其还包括以下前处理步骤：将吸烟者尿液样品用含待测组分对应内标物的有机溶剂萃取；静置分层后取有机溶剂层过滤，得到待测样品。

9.根据权利要求4所述的液相-气相二维色谱分析装置或根据权利要求6所述的分析方法用于测定吸烟者尿液中苯并[a]芘含量的用途。