CN105510489B - 一种液相色谱馏分可在线连续切割检测的液相‑气相二维色谱及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液相色谱馏分可在线连续切割检测的液相‑气相二维色谱，其包括液相色谱分析装置(16)和位于其下游的气相色谱分析装置(20)；所述液相色谱分析装置(16)与气相色谱分析装置(20)之间设有至少两个在线浓缩装置，所述在线浓缩装置用于将所述液相色谱分析装置(16)按保留时间切割的多段流出馏分依次或交替进行浓缩后再分别进样到所述气相色谱分析装置(20)中。本发明还涉及使用该液相‑气相二维色谱的分析方法及应用。本发明的装置和方法可将经液相色谱分离的每一段馏分都可切割进入到气相色谱中，实现全二维色谱分析模式，用以解决现有技术中灵敏度低、对转入气相色谱进样口的溶剂量有限制、对组分不能连续切割等问题。

Description

一种液相色谱馏分可在线连续切割检测的液相-气相二维色 谱及其应用

技术领域

本发明属于化学设备技术领域，进一步属于化学分析技术领域，具体涉及一种液相色谱馏分可在线连续切割检测的液相-气相二维色谱及其应用。

背景技术

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是吸烟者血液中一类重要的有害成分，目前已报道的TSNAs有8种，其中对N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)4种的研究较为深入。我国曾经把NNK列为吸烟者血液安全性评价指标。4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)是NNK的主要代谢物，并且具有和NNK相似的致癌活性；因此准确测定吸烟者血液中的NNK及NNAL对于进一步深入了解吸烟与健康的关系具有重要意义。

目前用气相色谱测定烟草特有亚硝胺及其代谢产物含量，样品前处理采用固相萃取或柱层析分离净化；该类方法净化样品需多次的浓缩、转移，不仅操作繁琐，而且还会因在敞开环境中大量使用有机溶剂而污染环境，对实验操作人员的健康危害大。因此寻找更简便、快速的样品前处理方法非常迫切。在线液相-气相二维色谱是近几年来发展起来的新分析技术，样品先经液相色谱(LC)分离净化后，含待测组分的流出馏分在线切割进入气相色谱(GC)进行分析。液相色谱和气相色谱的在线联用能充分发挥两级色谱的互补性，一方面液相色谱的高柱效大大提高了样品的净化效果，能实现复杂基体中痕量待测成分与干扰物质的分离，而且二维色谱间在线切换还可减少样品前处理过程中的浓缩和转移，减少了人为分析误差，使分析结果的准确性、精密度大大提高。

现有商品化的在线液相-气相二维色谱仪只能实现液相色谱馏分中心切割，缺点是一次进样只能将液相色谱馏分的某一部分切割进入气相色谱，其余馏分都作为废液排除，无法将经液相色谱分离的每一段馏分都切割进入到气相色谱中。

鉴于上述现有技术的缺点，提出本发明。

发明内容

本发明的目的一方面是提供一种液相色谱馏分可在线连续切割检测的液相-气相二维色谱；另一方面是提供使用该液相-气相二维色谱的分析方法及其在痕量样品检测中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

本发明第一方面涉及一种液相色谱馏分可在线连续切割检测的液相-气相二维色谱，其包括液相色谱分析装置16和位于其下游的气相色谱分析装置20；所述液相色谱分析装置16与气相色谱分析装置20之间设有至少两个在线浓缩装置，所述在线浓缩装置用于将所述液相色谱分析装置16按保留时间切割的多段流出馏分依次或交替进行浓缩后再分别进样到所述气相色谱分析装置20中。该二维色谱装置下游连接质谱仪或者直接气相色谱仪直接改为使用气质联用仪。

在本发明优选的实施方案中，所述在线浓缩装置包括依次流体连通的以下组件：第一物料进出口3、溶剂蒸发装置和第二物料进出口9。

所述溶剂蒸发装置包括馏分收集仓6、密闭式插入所述馏分收集仓6内部的柱塞杆4和位于所述馏分收集仓6外壁的控温加热装置5；其中所述柱塞杆4能在待浓缩样品对其浮力或其自身重力的作用下沿所述馏分收集仓6内壁上下移动；所述柱塞杆4具有连通所述第一物料进出口3和所述馏分收集仓6的贯穿式通道；

所述第一物料进出口3上设有与其交叉的溶剂排出管1，在两者的交叉处设有第一控制阀2，所述第一控制阀2控制切割馏分由所述第一物料进出口3的输入和浓缩时挥发的溶剂经所述溶剂排出管1的排出；

所述第二物料进出口9上设有用于控制浓缩后样品输出的第二控制阀8，所述馏分收集仓6和所述第二控制阀8之间具有一段尾管7，用于储存浓缩后样品。

其中所述柱塞杆4随所述馏分收集仓6仓体中液体的体积变化而上下移动，当仓体中有液体流入时，柱塞杆4上移，仓体扩大；在浓缩时，随着仓体中液体体积减少，柱塞杆4下移，仓体缩小。在本发明优选的实施方案中，所述尾管7的容积为0.01-200μL。在本发明优选的实施方案中，该在线浓缩装置连接抽真空装置。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述液相色谱分析装置16与气相色谱分析装置20之间设有数控十通阀15；所述数控十通阀15的第一接口供所述液相色谱分析装置16的流出馏分流入；第三和第八接口分别连接第一在线浓缩装置21的第一物料进出口3和第二物料进出口9，第五和第十接口分别连接第二在线浓缩装置22的第一物料进出口3和第二物料进出口9，用两个在线浓缩装置对所述液相色谱分析装置16按保留时间连续切割的流出馏分分别进行在线浓缩；第六接口连接至第二流动相容器18，所述第二流动相用于将在线浓缩后的含待测组分的流出馏分带入所述气相色谱分析装置20中；第四接口用于抽真空和排出溶剂；第九接口连接至所述气相色谱分析装置20的进样口；第二接口与第七接口直接用管线连接。

本发明第二方面涉及根据本发明第一方面所述的液相-气相二维色谱的分析方法，其包括以下步骤：

a.将待测样品通过所述液相色谱分析装置16进行分离，并经所述数控十通阀15在线切割得到若干段含待测组分的流出馏分；

b.将上述含待测组分的流出馏分通过所述数控十通阀15的切换依次或交替进入所述第一在线浓缩装置21和所述第二在线浓缩装置22中进行浓缩，依次或交替得到浓缩后的含待测组分的流出馏分；

c.依次或交替使所述浓缩后的含待测组分的流出馏分进入所述气相色谱分析装置20中分析检测，采用内标法得到待测组分的含量。

在本发明优选的实施方案中，所述在线切割如下进行：使用数控十通阀15对所述液相色谱分析装置16的流出馏分按照保留时间进行馏分切割，以将具有特定保留时间的含待测组分的流出馏分进样到在线浓缩装置中。

在本发明优选的实施方案中，当所述待测样品为吸烟者的血液或尿液时，其还包括以下前处理步骤：将吸烟者血液或尿液样品用含待测组分相应内标物的二氯甲烷或氯仿溶液萃取；静置分层后取有机层过滤，得到待测样品。

本发明第三方面涉及根据本发明第一方面所述的液相-气相二维色谱或根据本发明第二方面所述的分析方法用于测定吸烟者血液中烟草特有亚硝胺或其代谢物含量的用途。例如血液中4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)或4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇NNAL的含量。

在本发明优选的实施方案中，所述液相色谱分析装置16中使用的色谱柱为氧化铝柱，所述氧化铝柱为球形氧化铝色谱柱，该柱由直径3～5μm的氧化铝微球装填而成。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、传统液相-气相二维色谱采用液相色谱馏分中心切割，缺点是一次进样只能将液相色谱馏分的某一部分切割进入气相色谱，其余馏分都作为废液排除，无法将经液相色谱分离的每一段馏分都切割进入到气相色谱中。而本发明则可通过控制好液相色谱分离速度、在线浓缩速度和气相色谱分析速度匹配，经液相色谱分离的每一段馏分都可切割进入到气相色谱中，实现全二维色谱分析模式，用以解决现有技术中灵敏度低、对转入气相色谱进样口的溶剂量有限制、对组分不能连续切割等问题。

2、本发明的液相-气相二维色谱能充分实现一级色谱(LC)更大体积进样和一级色谱馏分更大体积切入二级色谱(GC)，对于低含量的样品，可让样品连续进样并通过数控十通阀进行选择性的连续切割，当待检测的组分含量积累到理想分析量后再转入气相色谱分析，在实现样品高效净化的同时大大提高了分析灵敏度以及仪器适用范围。本发明的装置和方法可满足吸烟者血液中超低含量NNK和NNAL分析的要求，解决了目前标准方法不能满足吸烟者血液中烟草特有亚硝胺含量分析的瓶颈；而且经本发明方法净化后，干扰杂质的色谱峰明显减少，待测组分的色谱法突出且具有更好的峰型，说明样品净化效果显著提高。

3、本发明的装置和方法避免了样品前处理过程中的浓缩、转移、定容等前处理步骤，减少了实验误差，由于样品处理人工操作环节大大减少，方法的重现性也得到明显提高。同时由于在线操作减少了样品处理过程中的转移和待测成分的损失，样品分析结果的精密度也得到很大提高。

附图说明

图1为本发明的液相色谱馏分可在线连续切割检测的液相-气相二维色谱的结构示意图，其中箭头方向表示物料输送方向；

图2为本发明的液相-气相二维色谱中的在线浓缩装置结构示意图；

图3为本发明的液相-气相二维色谱中的数控十通阀在两种不同模式下的流路示意图；其中图a表示第一在线浓缩装置接收馏分(虚线表示)，第二在线浓缩装置处于被第二流动相洗脱并向气相色谱进样的状态(实线表示)，图3b表示第二在线浓缩装置接收馏分，第一在线浓缩装置处于被第二流动相洗脱并向气相色谱进样的状态。

图4为实施例1中的NNK和NNAL在碱性氧化铝色谱柱上分离的色谱图；

图5为实施例1中的NNK和NNAL的质谱图；

图6为实施例1中的NNK和NNAL的选择离子色谱图。

图中各附图标记含义如下：1-溶剂排出管；2-第一控制阀；3-第一物料进出口；4-柱塞杆；5-控温加热装置；6-馏分收集仓；7-尾管；8-第二控制阀；9-第二物料进出口；10-阀门；11-第一泵；12-第二泵；13-第一脱气装置；14-第二脱气装置；15-数控十通阀；16-液相色谱分析装置；161-柱温箱；162-液相色谱柱；163-紫外检测器；164-进样器；17-第一流动相容器；18-第二流动相容器；19-废液排出口；20-气相色谱分析装置；21-第一在线浓缩装置；22-第二在线浓缩装置。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

如图1所示的液相-气相二维色谱，其包括液相色谱分析装置16和位于其下游的气相色谱分析装置20；所述液相色谱分析装置16与气相色谱分析装置20之间设有数控十通阀15；所述数控十通阀15的第一接口供所述液相色谱分析装置16的流出馏分流入；第三和第八接口分别连接第一在线浓缩装置21的第一物料进出口3和第二物料进出口9，第五和第十接口分别连接第二在线浓缩装置22的第一物料进出口3和第二物料进出口9，用两个在线浓缩装置对所述液相色谱分析装置16按保留时间连续切割的流出馏分依次或交替进行在线切割、收集和浓缩；第六接口连接至第二流动相容器18，所述第二流动相用于将在线浓缩后的含待测组分的流出馏分带入所述气相色谱分析装置20中；第四接口用于抽真空和排出溶剂；第九接口连接至所述气相色谱分析装置20的进样口。

所述在线浓缩装置包括依次流体连通的以下组件：第一物料进出口3、溶剂蒸发装置和第二物料进出口9。所述溶剂蒸发装置包括馏分收集仓6、密闭式插入所述馏分收集仓6内部的柱塞杆4和位于所述馏分收集仓6外壁的控温加热装置5；其中所述柱塞杆4能在待浓缩样品对其浮力或其自身重力的作用下沿所述馏分收集仓6内壁上下移动；所述柱塞杆4具有连通所述第一物料进出口3和所述馏分收集仓6的贯穿式通道；所述第一物料进出口3上设有与其交叉的溶剂排出管1，在两者的交叉处设有第一控制阀2，所述第一控制阀2控制待切割馏分由所述第一物料进出口3的输入和浓缩时挥发的溶剂经所述溶剂排出管1的排出；所述第二物料进出口9上设有用于控制浓缩后样品输出的第二控制阀8，所述馏分收集仓6和所述第二控制阀8之间具有一段尾管7，用于储存浓缩后样品。所述尾管7的容积为0.01-200μL。该在线浓缩装置连接抽真空装置。

该二维色谱的工作原理如下：首先启动第一泵11，使第一流动相经由第一脱气装置13进入液相色谱分析装置16中；待测样品经进样器164进入液相色谱分析装置16中，并经液相色谱柱162进行分离；来自所述液相色谱分析装置16的流出馏分按保留时间经第一接口进入数控十通阀15中，含待测组分的待浓缩流出馏分经数控十通阀15转入第一在线浓缩装置21中进行浓缩；转移完后，切换数控六通阀15，让其他保留时间的含待测组分的待浓缩流出馏分经数控十通阀15转入第二在线浓缩装置22中进行浓缩；待某一在线浓缩装置中的物料浓缩完成后，启动第二泵12，使第二流动相18经由第二脱气装置14进入数控六通阀15中；第二流动相18将该在线浓缩装置中浓缩后的含待测组分的流出馏分经所述数控六通阀15的第九接口排出并输送到气相色谱分析装置20的进样口，进行气相色谱分析。待检测切割馏分多于两个时，两个在线浓缩装置交替工作，一个在浓缩时另一个进行洗脱并向气相色谱进样，如此交替进行，可以将液相色谱中按不同保留时间依次流出的各馏分依次捕集浓缩并依次向气相色谱进样。

其中，所述在线浓缩装置的工作原理如下：转动第一控制阀2使第一管道关闭且所述溶剂排出管1与所述馏分收集仓6连通；转动第二控制阀8使待浓缩样品经第二管道进入馏分收集仓6中，并使所述柱塞杆4向上移动，开启控温加热装置5和抽真空装置；等所述待浓缩样品进样完成后，关闭第二控制阀8进行浓缩。在浓缩过程中，待浓缩样品中的溶剂经所述溶剂排出管1排出，所述馏分收集仓6中样品体积减少，所述柱塞杆4向下移动。待样品浓缩完成后，浓缩后样品储存在尾管7中，打开第一控制阀2和所述第二控制阀8使第二流动相进入所述馏分收集仓6并带动浓缩后样品经由第二通道即可排出该在线浓缩装置。

实施例2

使用实施例1中的液相-气相二维色谱分析吸烟者血液中超低含量NNK和NNAL的方法，包括样品前处理和仪器分析，具体包括如下步骤：

A：样品萃取：取血液样品50mL于100mL的试管中，加入含氘带NNK和NNAL内标(浓度为50ng/L)的二氯甲烷10mL；用高速匀浆机20000转/min漩涡震荡5min，静置分层后，取下层清液(二氯甲烷层)1.0mL，经0.25μm滤头过滤后，得到待测样品，供下一步液相色谱分离用。

B：仪器分析：在线液相-气相二维色谱装置结构示意图见图1，样品通过进样器164进入高效液相色谱仪，由第一泵11输送第一流动相17经液相色谱柱162分离，所需要的馏分(含NNK和NNAL的部位)通过数控十通阀15依次转入第一在线浓缩装置21和第二在线浓缩装置22(图2)中，转移完后，切换数控十通阀15，让第一流动相废液从废液排出口排出；启动在线浓缩装置的控温加热装置5加热，并抽真空排除溶剂，让液相色谱切入馏分在线浓缩到体积小于200μL；浓缩好后启动第二泵12输送第二流动相18把在线浓缩装置中的浓缩后馏分输送到气相色谱预柱中，在气相色谱预柱和分析柱之间有溶剂排出阀，液相色谱切入样品真空蒸发排出溶剂后，再升温气化由载气输送进入毛细管分离柱，经分离柱分离后再通过质谱检测。更具体的过程如下：

B1：液相色谱分离：液相色谱带紫外检测器163，检测波长为：254nm，液相色谱分离柱为：球形氧化铝柱(该柱由3～5μm的球形氧化铝装填而成，柱的内直径为3.9mm，长度为150mm，由于NNK和NNAL和血液中的主要共存物差异比较大，用碱性氧化铝正相色谱能分离大部分的干扰组分，从而实现样品的净化)；通过柱温箱控制柱温30℃，保持恒温。考虑到从液相色谱切入气相色谱的馏分需排除溶剂后才能进行气相色谱分析，液相色谱最好采用易挥发的流动相，因此液相色谱流动相为二氯甲烷-丙酮(90/10，体积比)，流速0.8mL/min；双泵系统，第一泵11用于提供液相色谱分离的第一流动相17，第二泵12用于控制HPLC与GC之间的切换，把切割后的待检测的馏分转入到气相色谱中。液相色谱进样体积为400μL。在该条件下，NNK和NNAL分离的色谱图见图4；NNK的出峰在7.8–8.4min之间，NNAL的出峰时间在10.0–10.8min之间，为了避免保留时间细微波动而导致待测组分不能完全收集，本发明中把7.6–8.6min流出馏分转入第一在线浓缩装置21中，收集NNK，把9.8–11.0min流出馏分转入第二在线浓缩装置22中，收集NNAL；由于流速为0.8mL/min，液相色谱切割进入两在线浓缩装置的体积分别为0.8mL和0.96mL。具体操作为：7.6–8.6min流出馏分(含NNK部分)从数控十通阀15的1口进，经过2、7口后、从8口流出进入第一在线浓缩装置21，再通过3和4口真空浓缩，此时第二泵12关闭(如图3a)；该部分馏分切割完后，通过切换数控十通阀15，9.8–11.0min馏分又由1口进、10口流出后进入第二在线浓缩装置22、再经5和4口真空浓缩(如图3b)。在馏分切割进入第二在线浓缩装置22的过程中；启动第二泵12，第二流动相18从6口进、经7和2口，从3口流出，再经8口和9口，把第一在线浓缩装置21中的馏分洗脱进入气相色谱法。将数控十通阀15再次切换到馏分切割进入第一在线浓缩装置21时，启动第二泵12，第二流动相18从6口进、5口流出经过第二在线浓缩装置22，再通过10口，由9口流出，第二在线浓缩装置22中的组分洗脱进入气相色谱法，其中第二流动相18不进入气相色谱分析装置20中。由于数控十通阀15的切换，有两个在线浓缩装置交替收集液相色谱的流出馏分，可实现连续切割。通过控制好液相色谱分离速度、在线浓缩速度和气相分析速度匹配，经液相色谱分离的每一段馏分都可切割进入到气相色谱中，实现全二维色谱分析模式。在图3中列出了数控十通阀15两种不同模式下的流路。

B2：在线浓缩：在线浓缩装置见图2，柱塞杆4随所述馏分收集仓6仓体中液体的体积变化而上下移动，当仓体中有液体流入时，柱塞杆4上移，仓体扩大；在浓缩时，随着仓体中液体体积减少，柱塞杆4下移，仓体缩小，浓缩样品收集在体积为200μL的尾管7中，当柱塞杆4和馏分收集仓6的底部接触(浓缩馏分完全进入尾管7中)时，溶剂排出会自动停止。由于本实施例的在线二维色谱是在岛津凝胶气质联用仪上改装，液相色谱切入气相色谱的最大馏分体积为200μL；而本发明中两个色谱峰需收集的馏分体积分别为0.8mL和0.96mL。实验结果表明，在线浓缩装置升温到45℃，通过抽真空排出溶剂，控制时间为4.5min可将液相色谱的流出馏分体积浓缩到200μL以下。浓缩好后，关闭数控十通阀15上的真空溶剂排出口4口，同时打开通向液相色谱和气相色谱通道，由图1中第二泵12把浓缩后的样品转入气相色谱分析装置20中。

B3：气相色谱质谱分析：样品完全进入气相色谱后，关闭液相色谱通道，通过气相色谱中溶剂排出阀除去惰性石英管中的溶剂。溶剂完全排除后关闭溶剂排出口，启动气相色谱升温进行气相色谱分析。以NNK和NNAL完全分离并尽可能缩短分析时间为目标，最终选择了如下色谱条件：柱头带可排除溶剂的石英衬管的气相色谱仪，预保留柱规格为：5m×0.25mm i.d×0.25μm df，DB-5ms(J&W)；分析柱规格为：Agilent DB-35MS UI毛细管色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；载气为氦气，采用恒流模式；流速为1.2mL/min；进样口温度：290℃；色谱柱升温程序：初始温度50℃(保持1.0min)，以30℃/min速率升至170℃，然后以5℃/min速率升至230℃，再以30℃/min速率升至290℃。

质谱条件：以NNK和NNAL达到最高响应为目标，对质谱条件进行了优化，最终选择电离方式：EI源；电离能量：30eV；离子源的温度：250℃；传输线温度250℃；扫描质量范围50-300amu；扫描间隔0.5s；四级杆温度：120℃；扫描模式：选择离子检测(SIM)模式，采用从总离子流图提取单离子的方法进行定量，根据其质谱图(图5)，NNK和NNAL的定量离子分别为m/z 177和209；其同位素内标的定量离子分别为m/z 181和213；在选定条件下，NNK和NNAL的选择离子色谱图见图6。

实施例3-测定方法工作曲线、检出限和定量限

标准溶液的配制：

标准贮备液制备：分别称取0.1g的NNK和NNAL(精确至0.1mg)于100mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，配制成各组分浓度为1.0mg/mL混合标准贮备液，密封避光贮存于-20℃条件下。

内标储备溶液：分别称取100mg的d4-NNK和d4-NNAL(精确至0.1mg)于100mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容至刻度，配制成各组分浓度为0.1mg/mL混合内标储备液，密封避光贮存于-20℃条件下。

标准工作溶液：用氯仿逐级稀释标准贮备液得6级标准工作溶液，对应各待测组分的浓度为0.01ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL，内标物的浓度为0.05ng/mL。

样品萃取溶液：用内标储备液配制成含0.05ng/mL内标物的二氯甲烷溶液。

配制一系列不同TSNAs浓度标准溶液(内标浓度均为0.05ng/mL)，按实施例2选定仪器条件进行分析，以标样峰面积(A)和浓度(C)的进行线性回归，得到线性回归方程；结果见表1。将最低浓度的标准溶液连续进样10次，测定其标准偏差，以3倍标准偏差作为检出限，以10倍标准偏差作为定量限；具体结果见表1。

表1：测定方法工作曲线、相关系数、检出限及定量限

测定仪器的灵敏度以其检测限(LOD)和定量限(LOQ)来衡量，其中所述检出限指的是能可靠地被检出的分析信号所需要的某元素的最少浓度或含量；其中所述定量限指的是样品中被测物能被定量测定的最低量。

已知检测限的值为3倍标准偏差，定量限的值为10倍标准偏差。

表1中的结果表明本发明的分析装置的灵敏度较高。

实施例4-方法回收率和重复性

日内精密度为：同一吸烟者的血液样品在实施例2的相同条件下同一天内测定7次，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差(RSD)，可得四种NNK和NNAL的RSD在4.3％-4.8％范围内；说明方法精密度良好。

日间精密度为：将每天吸烟数量频率保持一致的吸烟者血液在实施例2的相同条件下每天测定1次，共7天，计算7次测定结果的相对标准偏差，可得NNK和NNAL的RSD在5.2％-6.0％范围内；说明在不同时间内测定，方法精密度仍然良好。

测定时每样称取相同样品4份，其中1份不加标准品，另3份分别加入已知量的NNK和NNAL(添加量分别为0.03、0.06、0.09ng；样品按选定的样品前处理条件处理，并按选定仪器条件进样分析，通过加标样品测出量减去未加标样品测出量(本底),再除以标准加入量计算回收率。得TSNAs的回收率在73.5％～82.9％之间，说明方法回收率很高。

实施例5

采用实施例2的方法对吸烟者血液中的NNK和NNAL进行测定，结果见表2。从分析结果可看出，尽管采用了超高灵敏的分析方法和装置，但只有混合型卷烟吸烟者血液中的烟草特有亚硝胺浓度在分析方法的定量限以上，烤烟型卷烟抽吸者血液中的烟草特有亚硝胺含量大部分仍然在定量限以下。无论是混合型卷烟抽吸者还是烤烟型卷烟抽吸者，其血液中的烟草特有亚硝胺含量均远低于对人体产生危害的浓度水平。

表2：代表性样品中TSNAs含量测定结果

备注：“-”表示含量低于定量限

实施例6

所测定样品为混合型卷烟重度吸烟者的血液样品，取血液样品50mL于100mL的试管中，加入含氘带NNK和NNAL内标(浓度为50ng/L)的二氯甲烷10mL；用高速匀浆机20000转/min漩涡震荡5min，静置分层后，取下层清液(二氯甲烷层)1.0mL，经0.25μm滤头过滤后，供下一步液相色谱分离用。样品通过进样器进入高效液相色谱仪，实验条件同实施例2，把7.6–8.6min流出馏分转入第一在线浓缩装置21中，收集NNK，把9.8–11.0min流出馏分转入第二在线浓缩装置22中，切割馏分在两个在线浓缩装置中均浓缩到小于200μL尾管中。浓缩好后，进入气相色谱分析装置，启动气相色谱升温进行气相色谱分析。测定结果表明，该血液样品总NNK含量为4.04ng/L，NNAL含量为3.86ng/L。

实施例7

所测定样品为混合型卷烟轻度吸烟者的血液样品，取血液样品50mL于100mL的试管中，加入含氘带NNK和NNAL内标(浓度为50ng/L)的二氯甲烷10mL；用高速匀浆机20000转/min漩涡震荡5min，静置分层后，取下层清液(二氯甲烷层)1.0mL，经0.25μm滤头过滤后，供下一步液相色谱分离用。样品通过进样器进入高效液相色谱仪，实验条件同实施例2，把7.6–8.6min流出馏分转入第一在线浓缩装置21中，收集NNK，把9.8–11.0min流出馏分转入第二在线浓缩装置22中，切割馏分在两个在线浓缩装置中均浓缩到小于200μL尾管中。浓缩好后，进入气相色谱分析装置，启动气相色谱升温进行气相色谱分析。测定结果表明，该血液样品总NNK含量为2.93ng/L，NNAL含量为1.87ng/L。

实施例8

所测定样品分别为烤烟型卷烟重度吸烟者、烤烟型卷烟重度吸烟者和电子烟吸烟者的血液样品，分别取血液样品50mL于100mL的试管中，加入含氘带NNK和NNAL内标(浓度为50ng/L)的二氯甲烷10mL；用高速匀浆机20000转/min漩涡震荡5min，静置分层后，取下层清液(二氯甲烷层)1.0mL，经0.25μm滤头过滤后，供下一步液相色谱分离用。样品通过进样器进入高效液相色谱仪，实验条件同实施例2，把7.6–8.6min流出馏分转入第一在线浓缩装置21中，收集NNK，把9.8–11.0min流出馏分转入第二在线浓缩装置22中，切割馏分在两个在线浓缩装置中均浓缩到小于200μL尾管中。浓缩好后，进入气相色谱分析装置，启动气相色谱升温进行气相色谱分析。测定结果表明，上述3类吸烟者血液中均没有NNK和NNAL检出。

Claims (4)

1.一种使用液相-气相二维色谱的分析方法，所述液相-气相二维色谱包括液相色谱分析装置(16)和位于其下游的气相色谱分析装置(20)；所述液相色谱分析装置(16)与气相色谱分析装置(20)之间设有至少两个在线浓缩装置，所述在线浓缩装置用于将所述液相色谱分析装置(16)按保留时间切割的多段流出馏分依次或交替进行浓缩后再分别进样到所述气相色谱分析装置(20)中；所述在线浓缩装置包括依次流体连通的以下组件：第一物料进出口(3)、溶剂蒸发装置和第二物料进出口(9)；其中，

所述溶剂蒸发装置包括馏分收集仓(6)、密闭式插入所述馏分收集仓(6)内部的柱塞杆(4)和位于所述馏分收集仓(6)外壁的控温加热装置(5)；其中所述柱塞杆(4)能在待浓缩样品对其浮力或其自身重力的作用下沿所述馏分收集仓(6)内壁上下移动；所述柱塞杆(4)具有连通所述第一物料进出口(3)和所述馏分收集仓(6)的贯穿式通道；

所述第一物料进出口(3)上设有与其交叉的溶剂排出管(1)，在两者的交叉处设有第一控制阀(2)，所述第一控制阀(2)控制切割馏分由所述第一物料进出口(3)的输入和浓缩时挥发的溶剂经所述溶剂排出管(1)的排出；

所述第二物料进出口(9)上设有用于控制浓缩后样品输出的第二控制阀(8)，所述馏分收集仓(6)和所述第二控制阀(8)之间具有一段尾管(7)，用于储存浓缩后样品；

所述液相色谱分析装置(16)与气相色谱分析装置(20)之间设有数控十通阀(15)；所述数控十通阀(15)的第一接口供所述液相色谱分析装置(16)的流出馏分流入；第三和第八接口分别连接第一在线浓缩装置(21)的第一物料进出口(3)和第二物料进出口(9)，第五和第十接口分别连接第二在线浓缩装置(22)的第一物料进出口(3)和第二物料进出口(9)，用两个在线浓缩装置对所述液相色谱分析装置(16)按保留时间连续切割的流出馏分分别进行在线浓缩；第六接口连接至第二流动相容器(18)，所述第二流动相用于将在线浓缩后的含待测组分的流出馏分带入所述气相色谱分析装置(20)中；第四接口用于抽真空和排出溶剂；第九接口连接至所述气相色谱分析装置(20)的进样口；第二接口与第七接口直接用管线连接；

其特征在于，所述分析方法包括以下步骤：

a.将待测样品通过所述液相色谱分析装置(16)进行分离，并经所述数控十通阀(15)在线切割得到若干段含待测组分的流出馏分；

b.将上述含待测组分的流出馏分通过所述数控十通阀(15)的切换依次或交替进入所述第一在线浓缩装置(21)和所述第二在线浓缩装置(22)中进行浓缩，依次或交替得到浓缩后的含待测组分的流出馏分；

c.依次或交替使所述浓缩后的含待测组分的流出馏分进入所述气相色谱分析装置(20) 中分析检测，采用内标法得到待测组分的含量。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述在线切割如下进行：使用数控十通阀(15)对所述液相色谱分析装置(16)的流出馏分按照保留时间进行馏分切割，以将具有特定保留时间的含待测组分的流出馏分进样到在线浓缩装置中。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，当所述待测样品为吸烟者的血液或尿液时，其还包括以下前处理步骤：将吸烟者血液或尿液样品用含待测组分相应内标物的二氯甲烷或氯仿溶液萃取；静置分层后取有机层过滤，得到待测样品。

4.根据权利要求3所述的分析方法用于测定吸烟者血液中烟草特有亚硝胺或其代谢物含量的用途。