CN105377372A - 一种通过rho途径治疗癌症的指令和方法 - Google Patents

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Abstract

用作抗癌试剂的羊毛甾醇衍生物，其可能通过作用于RHO途径，能够抑制肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、脑癌细胞和胰腺癌细胞的生长。这些羊毛甾醇衍生物可以化合物LD030代表。

Description

一种通过RHO途径治疗癌症的指令和方法
相关专利的交叉引用
本申请权利要求2013年2月1日提交的美国临时申请号61/759,533的权益，其全文内容在此引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及一种通过RHO途径的癌症治疗方法。特别地，它涉及到对RHO途径有影响并且可用于治疗癌症的新型羊毛甾醇衍生化合物。
背景技术
癌症是异常细胞在身体多个部位的不受控制生长。目前，可以通过手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法等治疗癌症，并取得不同程度的成功。但是，手术疗法不能完全去除扩散转移的肿瘤细胞。在快速增殖的正常细胞存在下，放射疗法和化学疗法不能充分地选择性杀死癌细胞。免疫疗法很大程度上受限于细胞因子或治疗性癌症疫苗的使用。细胞因子可能会引起严重的毒副作用以及疫苗的连续使用可能导致免疫耐受性。
因此，有必要探索可替代的治疗途径。
Rho/Rho激酶信号传导途径是在人类身体中普遍存在的信号传导途径。通过作为细胞信号转导途径上的信号转换或分子开关功能作用于细胞骨架或目标蛋白，从而诱导肌动蛋白细胞骨架重排以及调节基因转录和细胞周期。然而，还没有通过调节Rho/Rho激酶信号途径治疗癌症的已知的方法或试剂。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一组新的化合物，所述化合物通过一种新型机理而具备抗癌效果。此目的通过提供具有下列式的化合物来实现，所述化合物通过调节Rho/Rho激酶信号途径而具有抗癌活性：
其中，X、X’为O、S或NR；R1和R2独立为氢、卤素、-OH、-SH、＝O、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、对甲基苯磺酰基、烷烃取代硅氧基或C1-C5烷基氨基；R3、R4和R5独立为氢、卤素、-OH、-SH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、甲基苯磺酰基、甲硅烷基或C1-C5烷基氨基；R为烷基或氢。
优选的式(I)化合物如下：
优选的式(II)化合物为：
优选的式(III)化合物为：
优选的式(IV)化合物为：
本发明的另一个目的是上述化合物在制备抗癌药物中的用途。优选地，所述药物含有一种或多种上述化合物结合吉西他滨或蕾莎瓦(Nexavar)。
对比现有的抗癌试剂，本发明的有利效果如下：
(1)本发明的化合物特征在于新型靶向位点和很低的毒副作用。动物试验数据表明代表性化合物LD030为抑制诸如肝癌和胰腺癌的多种实体瘤的有效试剂。LD030的靶向位点显示是Rac-1，一种Rho信号通道的磷酸激酶。LD030与Rac-1的结合干扰Rac-1在调节JAK2/STAT3蛋白表达上的作用，因此抑制肿瘤生长。
(2)本发明的化合物具有区别于现有药物的抗肿瘤机理以及能够通过三种途径抑制肝细胞癌的生长：抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成和诱发癌细胞凋亡。动物试验表明化合物LD030在细胞和动物水平上几乎没有毒性。
(3)试验表明本发明的化合物能够选择性地抑制癌细胞生长，而对正常细胞几乎没有影响。
(4)本发明的化合物可以单独使用或与其他药物，尤其与吉西他滨或蕾莎瓦组合。
本发明的各种新颖特征在所附的权利要求中特别指出并构成本公开的一部分。为了更好的理解本发明，其操作优势、使用所获得的特定目的、应当参考附图和下面描述，其中指出并描述了本发明的优选实施方式。
附图的简要说明
图1表示LD020的1HNMR图谱(CDCL3作为溶剂)。
图2表示LD021的1HNMR图谱(DMSO作为溶剂)。
图3表示LD028的1HNMR图谱(DMSO作为溶剂)。
图4表示LD028的13CNMR图谱(DMSO作为溶剂)。
图5表示LD030的13CNMR图谱(CDCL3作为溶剂)。
图6表示1HNMR图谱(CDCL3作为溶剂)。
图7表示LD030的MS图谱。
图8表示电脑模拟的Rac-1的3-D结构。
图9表示结合LD030后的Rac-1的3-D证明图。
图10表示HepG2细胞在LD030处理下的生长曲线。
图11表示PancI细胞在LD030处理下的生长曲线。
图12表示NCI-H460细胞在LD030处理下的生长曲线。
图13表示MCF-7细胞在LD030处理下的生长曲线。
图14表示SF-268细胞在LD030处理下的生长曲线。
图15表示LD030处理后实际肿瘤大小的变化。
图16表示LD030处理后肿瘤大小的变化曲线。
图17表示用LD030、吉西他滨和两者组合处理后的肿瘤大小曲线。
图18左边为实际肿瘤大小图，右边为对应的蛋白质电泳图，表示LD030处理后的变化。
图19表示LD030对HepG2细胞生长的影响。
图20表示用LD030与蕾莎瓦组合处理时对HepG2细胞生长的影响相对未处理对照的百分比。
图21表示用LD030与蕾莎瓦组合处理时对HepG2细胞生长曲线的影响。
图22表示用LD030处理24小时的HepG2细胞的流式细胞术结果。
图23表示用20μMLD030处理的PancI细胞的蛋白质电泳结果。
图24表示用50μMLD030处理的PancI细胞的蛋白质电泳结果。
具体实施方式
羊毛甾醇衍生物的合成
(1)将5g羊毛甾醇溶解于20ml吡啶，羊毛甾醇完全溶解后，向其加入2ml乙酸酐(大约2个当量)。该混合物在室温反应12小时。然后减压浓缩该反应混合物、冰浴冷却并向其缓慢加入10％碳酸氢钠水溶液(质量浓度)直到没有气泡形成。采用乙酸乙酯萃取该混合物三次并合并有机层。经饱和氯化钠清洗后，该有机层经过无水硫酸钠干燥10-30分钟。过滤后，离心该有机层并干燥以获得～5.5g粗产品，该产品经柱分离后得到4.5g白色固体目标产物(称为ID20)。产率约为84％。MS(ESI)：m/z569[M+H+]。图谱如图1所示：1HNMR(CDCL3，400MHz)，4.51(1H，m)，2.08(3H，s，Me)。反应方程式为：
(2)将4gLD020溶解于40ml丙酮，在大力搅拌下向其缓慢加入0.02g(催化剂量)四氧化锇和3g(3个当量)N-氧-N甲基-吗啡(NMO)。在室温持续搅拌该混合物7天以完成反应。减压浓缩该反应混合物，向残留物中加入大约30ml饱和氯化钠溶液，采用二氯甲烷萃取3次(每次50ml)。合并二氯甲烷层并用饱和氯化钠溶液清洗，无水硫酸钠干燥。过滤后，离心该有机层并干燥获得约2.8g粗产品，该产品经柱分离后得到1.6g白色固体目标产物(称为LD021)。产率约为40％。MS(ESI)：m/z503[M+H+]。NMR图谱如图2所示：1HNMR(DMSO，400MHz)，4.35(1H，m)，4.15(1H，m)，3.99(1H，m)，2.08(3H，s，Me)。反应方程式为：
(3)将1.5gLD021溶解于10ml吡啶，完全溶解，向其加入1.4ml乙酸酐(大约5个当量)。该混合物在室温反应12小时。减压浓缩该反应混合物、然后冰浴冷却并向其缓慢加入10％碳酸氢钠水溶液(质量浓度)直到没有气泡形成。采用乙酸乙酯萃取该混合物三次并合并有机层。该有机层经饱和氯化钠清洗后，经过无水硫酸钠干燥10-30分钟。过滤后，离心该有机层并干燥以获得约2g粗产品，该产品经柱分离后得到1.5g白色固体目标产物(称为LD022)。产率约为88％。MS(ESI)：m/z587[M+H+]；1HNMR(DMSO，400MHz)，4.35(1H，m)，4.15(1H，m)，3.99(1H，m)，2.00(9H，s，3Me)。反应方程式为：
(4)将1.4gLD022溶解于40ml二氯甲烷，然后在大力搅拌下向其加入0.6g间氯过氧苯甲酸(MCPBA，大约1.5个当量)。在0℃搅拌10小时后，加入1g氢氧化钙并在室温持续搅拌1小时。过滤该混合物去除固体，采用二氯甲烷(约50ml)清洗。过滤后，离心有机层并干燥，经柱分离后获得约0.8g白色固体目标产物(称为LD023)。产率约为55％。MS(ESI)：m/z603[M+H+]；1HNMR(DMSO，至400MHz)，4.37(1H，m)，4.15(1H，m)，3.99(1H，m)，2.00(9H，s，3Me)。反应方程式为：
(5)将0.7gLD023溶解于10ml碳酸钾饱和水溶液，在室温搅拌持续反应2小时。减压浓缩该反应混合物后，溶解固体，并采用二氯甲烷清洗三次(每次50ml)，合并二氯甲烷层，然后离心并干燥，经柱分离后获得约0.35g白色固体目标产物(称为LD024)。产率约为75％。MS(ESI)：m/z477[M+H+]。反应方程式为：
(6)在持续搅拌下将0.3g(0.6毫摩尔)LD024溶解于50ml二氯甲烷，向其加入0.4g氯铬酸吡啶(PCC，大约3个当量)。在室温搅拌反应体系2小时后，加入50ml无水醚。分离醚层，采用醚清洗黑色残留物三次(每次50ml二乙醚)。合并醚层，经硅胶分离后获得0.15g白色固体目标产物(称为LD025)。产率为51％。MS(ESI)：m/z473[M+H+]。反应方程式为：
(7)将0.1gLD020溶解于10ml二氯甲烷，然后在大力搅拌下向其加入0.08g间氯过氧苯甲酸(MCPBA，大约3个当量)。在0℃搅拌10小时后，加入0.1g氢氧化钙并在室温持续搅拌1小时。过滤去除固体，再采用二氯甲烷(约50ml)清洗。合并所有液体部分，浓缩获得粗产品，经柱分离后获得约20mg白色固体产物1和30mg白色固体产物2，分别称为LD026-1和LD026-2。产率分别约为18％(LD026-1)和28％(LD026-2)。LD026-1：MS(ESI)：m/z485[M+H+]，LD026-2：MS(ESI)：m/z501[M+H+]。反应方程式为：
(8)将0.1gLD021溶解于10ml二氯甲烷，然后在大力搅拌下向其加入0.04g间氯过氧苯甲酸(MCPBA，大约1.5个当量)。在0℃搅拌10小时后，加入0.1g氢氧化钙并在室温持续搅拌1小时。过滤去除固体，再采用二氯甲烷(约50ml)清洗。合并液体部分，浓缩，经柱分离后获得约10mg白色固体产物(称为LD027)。产率约为10％。1HNMR(DMSO，400MHz)，4.35(1H，m)，4.15(1H，m)，3.99(1H，m)，2.08(3H，s，Me)。MS(ESI)：m/z519[M+H+]。反应方程式为：
(9)将0.1gLD021溶解于20ml甲醇，并向其加入10mgpd/C(10％)。在氢气氛围下搅拌反应体系12小时，并且采用TLC(薄层色谱板)监测直至反应完全。滤出Pd/C后，蒸发溶剂以获得80mg粗产物，该产物经柱分离后获得50mg纯的白色固体产物(称为LD028)。产率约为49％。测定的NMR图谱如图3所示，碳图谱如图4所示，MS(ESI)：m/z505[M+H+]。反应方程式为：
(10)在持续搅拌下将1g(2.3毫摩尔)羊毛甾醇溶解于50ml二氯甲烷，然后向其加入1g氯铬酸吡啶(PCC，大约1.6个当量)。加入50ml无水醚前，在室温搅拌反应体系2小时。分离醚层，采用醚清洗黑色残留物三次(每次50ml二乙醚)。然后合并醚部分，经硅胶分离后获得0.45g白色固体产物(称为LD012)。产率为45％。MS(ESI)：m/z425[M+H+]。反应方程式为：
(11)将0.1gLD012溶解于10ml二氯甲烷，然后在大力搅拌下向其加入0.08g间氯过氧苯甲酸(MCPBA，大约3个当量)。在0℃搅拌10小时后，加入0.1g氢氧化钙并在室温持续搅拌1小时。过滤去除固体，再采用二氯甲烷(约50ml)清洗。合并液体部分，并浓缩得到粗产品，经柱分离后获得约41mg白色固体产物(称为LD015)。产率约为40％。反应方程式为：
(12)将0.2gLD012溶解于40ml丙酮，在大力搅拌下向其缓慢加入0.01g(催化剂量)四氧化锇和0.15g(3个当量)N-氧-N甲基-吗啡(NMO)。反应结束之前，在室温持续搅拌该反应混合物7天。然后减压浓缩该反应混合物，并向残留物中加入大约30ml饱和氯化钠溶液，采用二氯甲烷萃取3次(每次50ml)。合并二氯甲烷层并用饱和氯化钠溶液清洗。然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后，获得粗产品，经柱分离后得到1.6g白色固体产物(称为LD013)。产率约为20％。MS(ESI)：m/z459[M+H+]。反应方程式为：
(13)将20mgLD013溶解于4ml吡啶，并向其加入0.1ml乙酸酐(大约5个当量)。然后该混合物在室温反应12小时。减压浓缩该反应混合物、然后冰浴冷却该混合物并向其缓慢加入10％碳酸氢钠水溶液(质量浓度)直到没有气泡形成。采用乙酸乙酯萃取该混合物三次并合并有机层。该合并的有机层经饱和氯化钠清洗后，经过无水硫酸钠干燥10-30分钟。过滤后，离心该有机层并干燥以获得粗产品，该产品经柱分离后得到15mg白色固体产物(称为LD014)。产率约为60％。MS(ESI)：m/z543[M+H+]。反应方程式为：
(14)将5g羊毛甾醇溶解于50mlDMF，并向其加入3.7ml(约2个当量)(DMIPS.HCl)和1ml咪唑。该混合物在室温搅拌10小时，然后减压浓缩。在该浓缩混合物中缓慢加入10％碳酸氢钠水溶液(质量浓度)直到没有气泡形成，然后采用乙酸乙酯萃取三次。合并所述有机层。采用饱和氯化钠清洗后，该有机层经无水硫酸钠干燥10-30分钟。然后过滤，离心并干燥获得粗产品，经柱分离后获得5g白色固体产物(称为LD031)。产率约为80％。MS(ESI)：m/z527[M+H+]。反应方程式为：
(15)将0.2gLD031溶解于40ml丙酮，在大力搅拌下向其缓慢加入0.01g(催化剂量)四氧化锇和3g(3个当量)N-氧-N甲基-吗啡(NMO)。在室温搅拌继续该反应7天。减压浓缩该反应混合物，然后向其加入大约50ml饱和氯化钠溶液，采用二氯甲烷萃取3次(每次50ml)。合并二氯甲烷层并用饱和氯化钠溶液清洗，然后用无水硫酸钠干燥。过滤后，离心干燥获得2.6g粗产品，经柱分离后得到1.5g白色固体产物(称为LD032)。产率约为38％。MS(ESI)：m/z561[M+H+]。反应方程式为：
(16)在持续搅拌下将1g(0.6毫摩尔)LD032溶解于50ml二氯甲烷，然后加入0.8g氯铬酸吡啶(PCC，大约3个当量)。在室温搅拌反应体系2小时并且加入50ml无乙醚。分离醚层，采用醚清洗固体三次(每次50ml二乙醚)。合并所有醚部分，经硅胶分离后获得0.4g白色固体产物(称为LD033)。产率为70％。MS(ESI)：m/z559[M+H+]。反应方程式为：
(17)将0.8gLD033溶解于40ml二氯甲烷，然后在大力搅拌下向其加入0.6g间氯过氧苯甲酸(MCPBA，大约1.5个当量)。在0℃搅拌继续反应10小时。然后，在滤出固体前加入1g氢氧化钙并在室温持续搅拌1小时，再采用二氯甲烷(约50ml)清洗。合并液体部分，浓缩得到粗产品，经柱分离后获得约0.6g白色固体产物(称为LD034)。产率约为65％。MS(ESI)：m/z575[M+H+]。反应方程式为：
(18)将0.5gLD034溶解于10ml吡啶，向其加入1.4ml乙酸酐(大约5个当量)。然后该混合物在室温反应12小时。减压浓缩该反应混合物、冰浴冷却然后缓慢加入10％碳酸氢钠水溶液(质量浓度)直到没有气泡形成。然后采用乙酸乙酯萃取三次。合并有机层并采用饱和氯化钠清洗，然后经过无水硫酸钠干燥10-30分钟，过滤后，离心并干燥以获得粗产品，该产品经柱分离后得到0.48g白色固体产物(称为LD035)。产率约为88％。MS(ESI)：m/z617[M+H+]。反应方程式为：
(19)将0.3gLD035溶解于10mlTHF，向其加入0.1gBu4N+F-，在室温搅拌使反应继续1小时。先减压浓缩该反应混合物再采用DCM清洗3次(每次50ml)，合并DCM溶液并浓缩获得粗产品，该产品经柱分离后获得0.15g白色固体产物(称为LD030)。产率约为88％。13CNMR(CDCL3，400MHz)，209.3、170.3、83.7、78.4、70.7、68.1。1HNMR(CDCL3，400MHz)，3.20(1H，d，J＝10Hz)，2.342(2H，m)，2.08(3H，s，Me)。MS(ESI)：m/z517[M+H+]。所测的NMR图谱如图5所示，碳图谱如图6所示以及MS如图7所示。反应方程式为：
化合物LD030对癌症细胞系的影响
MTT分析法，一种本领域众所周知的方法，用于分析化合物LD030对人类癌症细胞系诸如HepG2(肝癌细胞系)、PancI(胰腺癌细胞系)、NCI-H460(肺癌细胞系)、MCF-7(乳腺癌细胞系)和SF-268(脑瘤细胞系)的抗癌效果。逐级稀释LD030溶液得到一系列浓度降低的LD030溶液，用于处理上述在单独容器中培育的各种癌症细胞系。培育48小时后，在每个容器中加入MTT试剂并测定每个容器中甲瓒沉淀物的OD570值以获得细胞生长的抑制率。对于培育HepG2细胞系，LD030的浓度为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM。对于PancI细胞系，浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μM。对于NCI-H460细胞系，浓度为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM。对于MCF-7细胞系，浓度为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM。对于SF-268细胞系，浓度为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM。HepG2、PancI、NCI-H460、MCF-7和SF-268的细胞生长抑制率分别如图12-14所示。结果表明LD030在100μM对所有测试的癌症细胞系的抑制率在80％以上。
LD030对BALB/c小鼠的毒性研究
在成年BALB/c小鼠上进行LD030动物毒性试验。给小鼠腹腔注射1-16mg/kg剂量的LD039。对所有被处理的BALB/c小鼠没有表现出明显的毒性，并且14天后小鼠仍然存活。结果证明在高达16mg/kgLD030的剂量对BALB/c是安全的。通过短期毒理性试验，LD50的半致死剂量(持续处理情况下)为4mg/kg，半数有效量ED50为0.2mg/kg，则治疗指数为20(即，LD50/ED50≈20)。
LD030对裸鼠模型中胰腺癌细胞增殖的影响
选择两株胰腺癌细胞系移植到患有非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病(NOD/SCID)的小鼠，在小鼠腹侧接种肿瘤。大约两周，所述小鼠作为胰腺癌的裸鼠模型。
用5种试验处理方式处理该裸鼠模型，设置如下：(1)空白对照，(2)25mg/kg/次吉西他滨，(3)0.5mg/kg/次LD030，(4)1mg/kg/次LD030以及(5)0.5mg/kg/次LD030和25mg/kg/次吉西他滨。处理43天后(一周3次)，记录胰腺癌裸鼠的肿瘤大小，见图15所示。如图15所示，对于2、3、4和5处理组，肿瘤体积分别减少37％、21％、62％和77％。结果表明，对于胰腺癌细胞，1mg/kgLD030比25mg/kg吉西他滨更有效，并且使用LD030和吉西他滨的组合比单独使用两种化合物的一种更有疗效。
此外，用6个处理组进行另外一个研究：(1)空白对照，(2)0.5mg/kg/次LD030，(3)25mg/kg/次吉西他滨，(4)1mg/kg/次LD030，(5)0.5mg/kg/次LD030和25mg/kg/次地西他滨(decitabine)以及(6)1mg/kg/次LD030和25mg/kg/次吉西他滨。上述每一组，持续处理43天(单独使用吉西他滨组一周2次，其他组一周3次)，记录肿瘤大小，见图16所示。如图16所示，抑制肿瘤大小效果从(1)组到(6)组依次增加。此外结果再次表明，使用LD030和吉西他滨的组合比单独使用化合物的一种更有效果。
针对肿瘤抑制性，进行进一步试验来研究组合使用LD030和吉西他滨相比单独使用的效果。设置4个处理组：(1)空白对照，(2)吉西他滨(25mg/kg/次，一周2次)，(3)LD030(0.5mg/kg/次，一周3次)，(4)LD030(0.5mg/kg/次，一周3次)和吉西他滨(25mg/kg/次，一周2次)。处理持续43天，记录肿瘤大小，见图17所示。结果表明，在移植瘤模型中，组合使用LD030和吉西他滨，肿瘤大小减少77％，而单独使用吉西他滨减少37％，而单独使用LD030减少21％。因此，组合使用LD030和吉西他滨对胰腺癌的生长具有增强的抑制效果。
进一步研究LD030对同种异体移植胰腺癌细胞系生长的效果如下：给每只小鼠模型腹腔注射0.01mg/kgLD030，一周3次。结果如图18所示，左侧显示实际肿瘤大小(对比未处理对照小鼠)，表明处理后肿瘤明显减小。对从试验小鼠和对照小鼠提取的磷酸化信号转导和转录激活物(p-STAT3)、磷酸-JAK2(p-JAK2)、Bc1-XL、细胞凋亡蛋白酶3,9和GADPH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶或醛脱氢酶)进行蛋白质电泳。电泳结果如图18右侧所示，表明处理后，p-STAT3、p-JAK2和Bc1-XL的表达显著降低而细胞凋亡蛋白酶3,9显著提高。GADPH作为内参，表达基本没有变化。因此，提议LD030能够下调p-STAT3、p-JAK2和Bc1-XL，而上调含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3,9的功能。
LD030对患有肝细胞癌的裸鼠模型的肝癌细胞增殖的影响
LD030处理对裸鼠模型HepG2细胞生长的影响如图19所示。试验采用不改变细胞生长率的空白载体乙醇作为对照。相比之下，LD030(1mg/kg/次，一天两次)与乙醇对照相比降低了HepG2细胞的生长率约63％，有统计学显著性(p<0.05)。
LD030也对比了蕾莎瓦对HepG2细胞生长率的影响。结果如图20所示，并且表明尽管空白载体对照对生长率没有影响，而蕾莎瓦(75mg/kg，一天两次)却降低了生长率约80％，而LD030(1mg/kg，一天两次)降低了生长率约63％。因此，LD030具有抑制肝癌细胞系的效果，而且效果是统计学显著的(p<0.05)，但在较低的剂量下，蕾莎瓦更有效果。
进行对裸鼠肝癌细胞系(HepG2)的另外一个研究，其中蕾莎瓦的剂量为30mg/kg，一天2次，LD030的剂量为1mg/kg，一天2次，以及空白对照以及使用LD030和蕾莎瓦的组合。结果如图21所示，其中Nr表示蕾莎瓦。表明虽然LD030单独对肿瘤细胞具有抑制效果，当与蕾莎瓦组合使用时效果会提高。与空白对比时，LD030的效果是统计学显著的(p<0.05)。
表4表示对比LD030和SUTENT(索坦或舒尼替尼(sunitinib)，辉瑞公司制)对HepG2细胞生长影响的体外试验结果。结果表明LD030在抑制HepG2细胞上具有很好的效果且比SUTENT需要的剂量更少。
表4.SUTENT和LD030对肝癌细胞生长的体外影响
肝癌细胞 LD030 SUTENT
HepG2 IC50＝1.33μM IC50＝3.6μM
HepG2 IC50＝1.57μM IC50＝8.0μM
LD030对HepG2细胞细胞凋亡的影响
研究采用流式细胞技术检测用0.03μM、0.14μM、0.7μM、3.5μM、17.5μM浓度的LD030以及空白对照处理24小时后HepG2细胞的细胞凋亡。过程如下：
1.收集细胞(1-5×106/ml)，在500-1000r/min离心5min，去除培养基。
2.采用3mlPBS清洗细胞一次。
3.离心去除PBS，加入70％冰冷的乙醇进行固定，4℃，1-2小时。
4.离心去除乙醇，重悬于3mlPBS5min。
5.用400目网筛过滤，500-1000r/min离心5min去除PBS。
6.用1ml碘化丙啶(碘化丙啶，PI)在4℃，黑暗中染色30min。
7.进行流式细胞技术。
流式细胞术结果如图22所示，表明LD030浓度越高细胞裂解的比例越大，LD030对HepG2细胞具有抑制效果。
LD030对胰腺癌细胞系PancI信号通道的影响
Jak/STAT通道在细胞生长、增殖和存活中具有重要的作用。本发明利用蛋白免疫印迹研究LD030对PancI细胞Jak/STAT磷酸化的影响。
用浓度为20μM和50μM的LD030处理细胞4小时、8小时、24小时和48小时。处理后，收集细胞并在缓冲液(50mMTris-HClpH7.5、100mMNaCl、5mMEDTA、40mMNaP2O7、1％TritonX-100、1mM二硫苏糖醇、200μMNa3VO4、100μM苯甲基磺酰基氟化物、2μg/ml亮抑酶肽、4μg/ml抑肽酶和0.7μg/ml胃蛋白酶抑制剂)中裂解。分析染色蛋白(BioRad，500-0006)以调整蛋白浓度。将等量蛋白(50μg/泳道)用于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用抗p-Jak2的抗体(Cellsignaling制造，3771)、p-Stat3的抗体(Cellsignaling制造，9131)和α-微管蛋白的抗体(ZymedLaboratories制造，32-2500)处理该膜。通过增强化学发光(ECLPlus)检测系统(Amersham制造)检测可见蛋白条带。
上述试验用20μM和50μM的LD030分别处理的蛋白质电泳结果见图23和24所示。如图23所示，其中采用20μM的LD030处理PancI细胞4小时、8小时、24小时、48小时并用蛋白质电泳测定每个区间的p-jak2、p-stat3(tyr705)、p-JNK、P-p38和微管蛋白，与空白对照对比时，LD030处理24小时和48小时显著降低p-jak2和p-stat3(tyr705)，而p-p38蛋白表达增加。因而表明LD030处理下调Jak、Stat3-相关通道，以及上调p-JNK和p-p38。如图24所示，其中采用50μM的LD030处理PancI细胞4小时、8小时、24小时、48小时并用蛋白质电泳测定每个区间的p-jak2、p-stat3(tyr705)、pc-raf、p-ERK、p-JNK、p38、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B1和微管蛋白，与空白对照对比，LD030处理24小时和48小时显著降低p-jak2(磷酸化酪氨酸激酶2)、p-stat3(tyr705，转录信号传导蛋白3的磷酸化和活化)、p-c-raf(磷酸化原癌基因丝氨酸，苏氨酸激酶)和p-ERK(胞外信号磷酸化调节激酶)，而处理会增加p-JNK(磷酸化c-JUNN-末端激酶)和p-p38(有丝分裂活化蛋白激酶)的表达，并降低细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1在48小时的表达。微管蛋白表达作为内参基本没有变化。
上述结果表明LD030可能以下列信号传导通道和蛋白作为靶向：(1)Jak-stat3通道，其中靶向蛋白为磷酸化jak1、jak2和stat3(p-jak1、p-jak2和p-stat3)。(2)C-raf通道，其中靶向蛋白为磷酸化c-raf和ERK(pc-raf、p-ERK)。(3)细胞凋亡通道，其中靶向蛋白为磷酸化的p38和JNK(p-p38、p-JNK)。
基于3-D结构电脑模拟的亲和计算
采用iGEMDOCK模拟软件获得Rac-1蛋白的3维结构，如图8所示。也模拟连接LD030与Rac-1的结构变化，对于LD030和Rac-1之间的亲和，亲和力计算为-146，表现为强结合能。因在RHO信号传导途径中，Rac-1为磷酸化激酶，故LD030可能会通过结合Rac-1阻断经过RHO途径的信号传导。
LD030相关化合物对癌症细胞系的影响
采用MTT分析法检测用本发明不同的LD030相关化合物处理后的细胞活力。处理的细胞系为非小细胞肺癌细胞系A549、HepG2细胞和PancI细胞。
MTT保存液配置：将0.5gMTT溶解于100ml磷酸缓冲液(PBS)，用0.22μm膜过滤除菌，得到0.5％MTT溶液，在-20℃下避光保存。
MTT操作溶液配置：用无菌PBS稀释10倍MTT保存液，得到MTT操作溶液。
1640完全培养基配置：向1640基础培养基中加入一定量的小牛血清(FBS)从而使培养基含有体积比10％的FBS。然后加入一定量的双抗(即，青霉素和链霉素)，使最终浓度为青霉素100单位/ml和链霉素100μg/ml。
试验过程如下：
(1)取胰蛋白酶消化过的对数生长期的细胞并调节细胞悬液浓度为6×104个细胞/ml，然后在96孔板的每个孔中加入受测的100μl细胞悬液，调节密度为6000个细胞/孔。边缘孔加入无菌PBS。
(2)将96孔板放到含有5％CO2的37℃培养箱中并过夜培养。
(3)将被测化合物溶解于200μlDMSO得到5mg/ml溶液并稀释得到100μM、10μM、1μM和0.1μM的溶液。每三个重复孔中均加入100μl的一种溶液。设定含有细胞而不含本发明化合物的对照孔以及不含细胞的空白孔。
(4)将96孔板放到含有5％CO2的37℃培养箱中并培养48小时。每天在显微镜下检查细胞。
(5)培养48小时后，离心去除培养液。每孔加入100μlMTT操作溶液，并继续培养4h。
(6)终止培养，小心除去培养基。然后每孔加入100μlDMSO并在振荡器上低速振动10min使得所有晶体完全溶解。采用酶联免疫吸附检测仪器在OD570nm下测定每孔的吸光度值，得到不同浓度不同化合物对细胞生长的抑制率。
不同浓度的不同化合物对PancI细胞、HepG2细胞和A549细胞的生长抑制效果分别如表1、表2和表3所示。
表1对PancI细胞的效果(抑制百分比)
表2.对HepG2细胞的效果(抑制百分比)
表3.对A549细胞的效果(抑制百分比)
上述结果表明大部分化合物在10μM或100μM对抑制癌症细胞生长具有显著效果。一些这些化合物，诸如化合物LD012，对A549具有高于90％的抑制率。
虽然在优选实施例中已经描述并指出本发明的基本的新型特点，但是可以理解的是，本领域技术人员在不背离本发明的精髓下仍可以在所述的实施例的形式和细节上作各种删除、替代和改变。本发明不限于上述实施例，其仅作为例子，但是可以在由所附专利权利要求定义的保护范围内以各种方式修改。

Claims (11)

1.一种化合物，其包含抑制癌症细胞生长的性质以及一种选自由式(I)、(II)、(III)、(IV)组成的组的式：
其中，X、X’为O、S或NR；R1和R2独立为氢、卤素、-OH、-SH、＝O、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、对甲基苯磺酰基、烷烃取代硅氧基或C1-C5烷基氨基；R3、R4和R5独立为氢、卤素、-OH、-SH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、甲基苯磺酰基、甲硅烷基或C1-C5烷基氨基；R为烷基或氢。
2.权利要求1所述化合物，其为式(I)并具有以下结构：
3.权利要求1所述的化合物，其为式(II)并具有以下结构：
4.权利要求1所述的化合物，其为式(II)并具有以下结构：
5.权利要求1所述的化合物，其为式(IV)并具有以下结构：
6.权利要求1所述的化合物，其为：
7.一种用于治疗癌症的方法，包含给需要治疗的人施予权利要求1所述的化合物。
8.权利要求7所述的方法，其中所述化合物为：
9.权利要求8所述的方法，其中所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、脑瘤或者胰腺癌。
10.权利要求9所述的方法，其中所述癌症为肝癌或胰腺癌。
11.一种用于调节RHO途径的方法，包含将具有RHO途径的细胞与权利要求6所述的化合物接触的步骤。
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