CN103204898B

CN103204898B - 抗癌化合物及其应用

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Publication number: CN103204898B
Application number: CN201210014531.7A
Authority: CN
Inventors: 谢伟东; 刘昕
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangzhou Zhirui Medical Technology Co ltd
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2017-03-01
Anticipated expiration: 2032-01-16
Also published as: CN103204898A

Abstract

本发明涉及一种抗癌药物，其为羊毛甾醇衍生物，该化合物具有抗癌作用，能抑制肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺细胞、脑癌细胞及胰腺癌细胞的生长，其通式为(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物。本发明还提供了该化合物或其可药用盐在制备治疗癌症的药物中的应用。该药物可单独使用，或联合用药，特别是与吉西他滨或多美吉联合用药。上述药物可以用于治疗肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、脑癌等癌症。

Description

抗癌化合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗癌化合物，具体的说，涉及一种羊毛甾醇衍生物及其在制备治疗癌症的药物中的应用。

背景技术

癌症是各种恶性肿瘤的统称，其细胞的生长和分裂速度高于正常细胞，可侵入原发组织或扩散至其他部位。目前治疗癌症主要是通过手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法。但手术疗法无法完全切除广泛的转移；放射疗法无法选择性的将辐射输送至癌细胞；化学疗法无法在快速增生的正常细胞存在下而选择性地杀死癌细胞；免疫疗法大部分局限于使用细胞因子或治疗用癌症疫苗，使用细胞因子治疗受到毒性危及生命的限制，使用癌症疫苗经常随着时间而产生免疫耐受性。

因此，目前仍在探索其他新的治疗方法。

在代谢类抗癌药中，具有代表性的药物包括吉西他滨(Gemcitabine，Gemzar，GEM，健择)，它在细胞内经过核苷激酶的作用转化成具有活性的代谢产物双氟二磷酸脱氧胞苷(dFdCDP)和双氟三磷酸脱氧胞苷(dFdCTP)，这两种代谢产物通过抑制核苷酸还原酶的活性，致使合成DNA所必需的脱氧核苷的产生受到抑制；同时，dFdCTP竞争性抑制DNA链延长、干扰DNA自我修复机制，阻止RNA合成，最终导致细胞凋亡

通过调控肿瘤相关信号通道，抑制激酶或/和血管生成是一种较新的癌症治疗途径。这一类代表药物包括特罗凯(Tarceva，Erlotinib，盐酸厄洛替尼)、多吉美(Nexavar)等。特罗凯(Tarceva)是一种可逆性的表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，可抑制人表皮生长因子受体(EGFR)的信号转导途径，进而通过抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤作用。多吉美(Nexavar)是一种人血管内皮生长因子受体(VEGFR)2及3激酶以及Raf激酶抑制剂，通过结合受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点抑制肿瘤血管发生。

现有的抗癌药物，如多吉美是通过两个方面来抑制肝癌的生长，即：抑制肿瘤细胞的增生和肿瘤血管的增生。

Rho/Rho激酶信号通路是体内普遍存在的一条信号通路，在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关作用于细胞骨架或其靶蛋白后，诱发肌动蛋白细胞骨架重排、调控基因转录及细胞周期等。通过调控Rho/Rho激酶信号通路来调控肿瘤细胞生长和血管生成的抗癌化合物，目前还不多见。

发明内容

有鉴于此，实有必要提供一种抗癌化合物及其应用。

一种抗癌化合物，其通式为(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物：

或通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的可药用盐；

其中X、X′分别为O、S或NR；R₁、R₂分别为氢、卤数、-OH、-SH、＝O、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、烷烃取代的硅氧基或C1-C5的烷基氨基；R₃、R₄、R₅分别为氢、卤数、-OH、-SH、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、甲硅烷基氧基或C1-C5的烷基氨基；其中R为烷基或氢。

优选地，所述的通式(I)为：

其中X为O、S或NR；R₁、R₂分别为氢、卤数、-OH、-SH、O＝、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、烷烃取代的硅氧基或C1-C5的烷基氨基；R₃分别为氢、卤数、-OH、-SH、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、甲硅烷基氧基或C1-C5的烷基氨基；其中R为烷基或氢。

优选地，所述的通式(I)为：

优选地，所述通式(II)为：

其中X、X′分别为O、S或NR；R₁、为氢、卤数、-OH、-SH、O＝、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、甲硅烷基氧基或C1-C5的烷基氨基；其中R为烷基或氢。

优选地，所述通式(II)为：

优选地，所述通式(III)为：

其中R₁、R₂分别为氢、卤数、-OH、-SH、＝O、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、烷烃取代的硅氧基或C1-C5的烷基氨基；R₃、R₄、R₅分别为氢、卤数、-OH、-SH、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、甲硅烷基氧基或C1-C5的烷基氨基；其中R为烷基或氢。

优选地，所述通式(III)为：

优选地，所述通式(IV)为：

其中R₁、R₂分别为氢、卤数、-OH、-SH、＝O、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、对甲基苯磺酰基、烷烃取代的硅氧基或C1-C5的烷基氨基。

优选地，所述通式(IV)为：

上述化合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

优选地，所述药物还包含吉西他滨或多吉美。

优选地，所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、脑瘤或胰腺癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1)本发明的化合物具有新作用靶点，基本无毒副作用等特点，是一类新的抗肿瘤药物。动物实验数据表明，化合物LD030对多种实体肿瘤，如肝癌和胰腺癌有非常好的抑制作用，是一个在中美两国都有很好销售前景的创新药物，其作用位点是Rho信号传递通道中的一个磷酸激酶，Rac-1。LD030与Rac-1结合，干扰了Rac-1调节JAK2/STAT3的蛋白质表达，进而对肿瘤生长产生了抑制作用。

2)抗癌的机理与现有药物不同

本发明的化合物通过三个方面抑制肝癌的生长：抑制肿瘤细胞的增生，抑制肿瘤组织的血管增生，以及诱导癌细胞细胞凋亡。动物实验表明，LD030号化合物基本上无细胞、动物毒性作用。

3)实验表明，本发明的化合物对癌细胞的生长有抑制作用，但是对正常细胞的生长却没有抑制作用。

4)本发明的化合物除了可单独使用外，还可与其它药物联合用药，特别是与吉西他滨或多吉美联合用药。

附图说明

图1是LD020氢谱(CDCl₃为溶剂)图。

图2是LD021氢谱(DMSO为溶剂)图。

图3是LD028氢谱(DMSO为溶剂)图。

图4是LD028碳谱(DMSO为溶剂)图。

图5是LD030碳谱(CDCl₃为溶剂)图。

图6是LD030氢谱(CDCl₃为溶剂)图。

图7是LD030质谱图。

图8是不同化合物在不同细胞系中对信号通路的影响。

图9是计算机模拟的Rac-1蛋白的三维结构图。

图10是Rac-1结合了LD030后三维构象图。

图11是LD030处理肝癌细胞株HepG2的细胞生长抑制率曲线图。

图12是LD030处理胰腺癌细胞株PancI的细胞生长抑制率曲线图。

图13是LD030处理肺癌细胞株NCI-H460的细胞生长抑制率曲线图。

图14是LD030处理乳腺癌细胞株MCF-7的细胞生长抑制率曲线图。

图15是LD030处理脑瘤细胞株SF-268的细胞生长抑制率曲线图。

图16是不同用药后肿瘤大小变化的实物图。

图17是不同用药后肿瘤大小变化的曲线图。

图18是LD030、吉西他滨单用和联用后，肿瘤大小变化曲线图。

图19中的左图是小鼠体内肿瘤大小的对照实物图，右图为用药组和对照组中提取的蛋白电泳图。

图20是用LD030处理裸鼠中空纤维中的肝癌细胞株HepG2后的细胞生长率的影响。

图21是比较用LD030和多吉美(nexavar)处理裸鼠中空纤维肝癌细胞株HepG2后的细胞生长率的影响。

图22是比较LD030和多吉美(nexavar)对裸鼠中肝癌细胞株(HepG2)生长的影响。

图23是用LD030处理HepG2细胞24小时后的流式细胞仪检测结果图。

图24是20μM的LD030处理PancI细胞后，相关蛋白电泳图。

图25是用50μM的LD030处理PancI细胞后，相关蛋白电泳图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

该化合物是通过抑制Rho信号转导通路中的Rac-1激酶，下调磷酸化-Jak1，Jak2以及Stat3，从而抑制肿瘤血管的生成；下调磷酸化-c-Raf-MEK-ErK，从而抑制肿瘤细胞生长的效果；上调细胞凋亡蛋白酶3，9，进而上调磷酸化JNK及p38从而诱导凋亡。本发明将该化合物与rac-1的三维蛋白结构嵌合，发现该化合物通过阻断GTP/GDP之间的转换，抑制rac-1的活性，从而阻断该通道的信号转导，进而下调磷酸化jak2/stat3的表达，抑制癌细胞生长和血管生成，导致凋亡。

为便于理解本发明，对相关概念做如下具体解释：

Rho GTP酶信号通路：哺乳动物Rho家族至少有10个成员，包括Rho(异构体A至E、G)、Rac(异构体1～3)、Ras等，是控制GTP/GDP的细胞信号开关。GEFs和GAPs蛋白在Rho GTP酶的调节中发挥作用。哺乳类动物细胞内，各种细胞表面受体一旦被激活，将导致特异性GEFs被激活。激活的GEFs可促进GDP转变为GTP，因此，激活的GEFs可促进特异的Rho GTP酶上的GDP转换为GTP，最终导致Rho GTP酶的激活。激活的Rho GTP酶能与多种的效应靶标相互作用，产生不同的细胞效应，比如肌动蛋白细胞骨架重组，内吞及胞吐、转录激活、DNA合成激活和/或翻译调节。

Rac-1是一种上调细胞信号蛋白，是Rho信号转导通路中的磷酸激酶，调节jak2/stat3的表达，而jak2/stat3促进肿瘤生长。

GEFs(Guanosine nucleotide exchange factors，鸟苷酸交换因子)：GEFs可促进GDP转变为GTP形式；

GAPs(GTPase activating proteins，GTP酶激活蛋白)：激活小G蛋白的内源性GTP酶活性，水解GTP成GDP；

STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3，信号转导子和转录激活子3)是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白，是STATs七个家族成员之一。多种肿瘤细胞中STAT3均有异常高表达，STAT3过度激活导致细胞的异常增殖和凋亡障碍，促进肿瘤的形成、发展。Janus激酶(JAK)属于IL-6家族受体，是STAT3信号途径中的上游酪氨酸激酶活性的受体。

可以用来有效抑制Rho GTP酶的激活的五个靶位点：①GEF-Rho GTPase相互作用表面：用于激活GTP/GDP交换；②Rho-效应物接触面：将激活Rho的信号传输到特异性的下游反应元件上；⑧单独的效应分子，Rho GTPases的最终作用位点；④抑制RhoGAP催化活性：促进GTP-水解作用钝化；⑤将Rho蛋白的C末端进行脂质异戊二烯化修饰。

药学上可接受的盐：是指药学上可接受的有机或无机化合物的应用程序的盐。首选盐类包括但不限于：硫酸盐，柠檬酸，乙酸，草酸，氯，溴，碘，硝酸盐，硫酸氢钠，磷，酸洗磷化，异烟，乳酸，水杨酸，柠檬酸酸，酒石酸，油酸，泛酸，酒石酸，抗坏血酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，葡萄糖酸，蔗糖，甲酸，苯甲酸，谷氨酸，磺酸，苯，甲苯磺酸盐，以及1，1’-亚甲基-2-羟基-3-萘盐。药学上可接受的盐可能会涉及如醋酸离子，琥珀酸等离子或反离子的另一种分子列入。该反离子可以是任何有机或无机成分的以稳定母体化合物。此外，药学上可接受的盐可能有其多个带电离子的结构。多种情况下带电离子都是药学上可接受的盐的一部分。因此，药学上可接受的盐可以有一个或多个带电离子和/或一个或多个反离子。

药学上可接受的溶剂：该种形式的溶剂化学药可接受的例子包括水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲基亚砜，乙酸乙酯，乙酸和乙醇胺等。

分子亲和力：分子之间的专一而可逆的结合能力叫做亲和力。

吉西他滨(Gemcitabine，Gemzar，GEM，健择)：它在细胞内经过核苷激酶的作用转化成具有活性的代谢产物双氟二磷酸脱氧胞苷(dFdCDP)和双氟三磷酸脱氧胞苷(dFdCTP)，这两种代谢产物通过抑制核苷酸还原酶的活性，致使合成DNA所必需的脱氧核苷的产生受到抑制；同时，dFdCTP竞争性抑制DNA链延长、干扰DNA自我修复机制，阻止RNA合成，最终导致细胞凋亡

多吉美(nexavar)：通用名为甲苯磺酸索拉非尼片，是一种人血管内皮生长因子受体(VEGFR)2及3激酶以及Raf激酶抑制剂，通过结合受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点抑制肿瘤血管发生。用于治疗不能手术的晚期肾细胞癌。

MTT方法：即四甲基偶氮唑盐比色法，是通过快速简便的颜色反应来检测细胞存活数量。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。

IC₅₀：半数抑制浓度，即当抑制作用为50％时的药物浓度。

LD₅₀：半数致死计量，指使实验动物一次染毒后，在14天内有半数实验动物死亡所使用的毒物计量。LD₅₀的单位为mg/kg体重，LD₅₀的数值越小，表示毒物的毒性越强；反之，LD₅₀数值越大，毒物的毒性越低。

ED50：半数有效量(50％effective dose)，在量反应中指能引起50％最大反应强度的药量，在质反应中指引起50％实验对象出现阳性反应时的药量。

治疗指数：通常将半数致死量(LD50)/半数有效量(ED50)的比值称为治疗指数，用以表示药物的安全性。药物的ED50越小，LD50越大说明药物越安全，一般常以药物的LD50与ED50的比值称为治疗指数(therapeutic index，TI)，用以表示药物的安全性。

实施例1：羊毛甾醇衍生物的合成

(1)取5克羊毛甾醇溶解于20毫升吡啶中，完全溶解后，滴加2毫升醋酸酐(约2个当量)，室温下反应12小时后结束反应。将反应混合物减压浓缩，浓缩液用冰浴冷却，并缓慢滴加质量浓度为10％的碳酸氢钠水溶液至完全无气泡冒出，用乙酸乙酯萃取3次后合并有机层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，再用无水硫酸钠干燥、过滤后，旋干有机层，得粗产物5.5克，过柱分离后得到4.5克目标产物，为白色固体，产率为84％。MS(ESI)：m/z569[M+H⁺]；目标产物测得的氢谱如图1所示，¹HNMR(CDCI₃，400MHz，特征氢谱)，4.51(1H，m)，2.08(3H，s，Me)。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD020。

(2)取4克步骤(1)合成的LD020溶于40毫升丙酮。剧烈搅拌下，加入0.02克(催化量)四氧化锇和3克(3个当量)N-氧化-N-甲基吗啉(NMO)，室温下搅拌反应7天后结束反应。减压浓缩反应液，残留物加入约30毫升饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷提取三次(每次50毫升)，合并二氯甲烷层，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，除去溶剂，得2.8克粗产物，过柱分离后得1.6克目标产物，为白色固体，产率为40％。MS(ESI)：m/z 503[M+H⁺]；目标产物的氢谱如图2所示，¹HNMR(DMSO，400MHz，特征氢谱)，4.35(1H，m)，4.15(1H，m)，3.99(1H，m)，2.08(3H，s，Me)。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD021。

(3)取1.5克步骤(2)中合成的LD021溶解于10毫升吡啶中，完全溶解后，滴加1.4毫升醋酸酐(约5个当量)，室温下反应12小时后结束反应。将反应混合物减压浓缩，浓缩液用冰浴冷却，并缓慢滴加质量浓度为10％的碳酸氢钠水溶液至完全无气泡冒出后。乙酸乙酯萃取3次后合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干有机层，得2克粗产物，过柱分离后得1.5克目标产物，为白色固体，产率为88％。MS(ESI)：m/z587[M+H⁺]；¹HNMR(DMSO，400MHz，特征氢谱)，4.35(1H，m)，4.15(1H，m)，3.99(1H，m)，，2.00(9H，s，3Me)。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD022。

(4)在强烈搅拌下，在溶解有1.4克LD022的40毫升二氯甲烷溶液中，加入0.6克间氯过氧苯甲酸(MCPBA，约1.5个当量)，在0℃下反应10小时后结束反应。加入1克氢氧化钙，在室温搅拌下1小时后，滤出固体，用滤饼50毫升二氯甲烷洗涤，把合并后的滤液浓缩，得粗产物，过柱分离后得0.8克目标产物，为白色固体，产率为55％。MS(ESI)：m/z603[M+H⁺]；¹HNMR(DMSO，400MHz，特征氢谱)，4.37(1H，m)，4.15(1H，m)，3.99(1H，m)，2.00(9H，s，3Me)。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD023。

(5)在0.7克LD023中加入饱和碳酸钾水溶液10毫升，室温条件下搅拌反应2小时后结束反应。减压浓缩反应混合物后，浓缩固体用二氯甲烷溶解洗涤3次(每次用50毫升)，合并二氯甲烷层，浓缩后过柱分离得0.35克目标产物，为白色固体，产率为75％。MS(ESI)：m/z477[M+H⁺]；反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD024。

(6)在不断搅拌下，向溶解了0.3克(0.6毫摩尔)LD024的50毫升二氯甲烷溶液中，加入0.4克氯铬酸吡啶盐(PCC，约3个当量)，在室温下搅拌反应2个小时。向反应溶液中加入50毫升无水乙醚，倾倒出醚层，黑色残渣用乙醚洗涤3次(每次用50毫升乙醚)，合并后的醚层，用100目粗硅胶过柱，蒸干，用200-300目的细硅胶分离，0.15克目标产物，为白色固体，产率51％。MS(ESI)：m/z 473[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD025。

实施例2：羊毛甾醇衍生物的合成

将0.1克LD020溶于10毫升二氯甲烷中，在强烈搅拌下，加入80毫克(约3个当量)间氯过氧苯甲酸，在0℃下反应10小时。加入0.1克氢氧化钙，在室温搅拌1小时后，滤出固体，用50毫升二氯甲烷洗涤固体，合并滤液，浓缩得粗产物，上柱分离后分别得20毫克下述的LD026-1号产物(产率18％)和30毫克下述LD026-2号产物(产率28％)，均为白色固体。氢谱表明，LD026-1和LD026-2的氢谱与化合物LD020的谱图一样。LD026-1号产物MS(ESI)：m/z485[M+H⁺]，LD026-2号产物MS(ESI)：m/z501[M+H⁺]。反应方程式如下：

实施例3：羊毛甾醇衍生物的合成

将0.1克LD021溶于10毫升二氯甲烷，在强烈搅拌下，加40毫克(约1.5个当量)入间氯过氧苯甲酸，在0℃下反应10小时。加入0.1克氢氧化钙，在室温搅拌1小时。滤出固体，固体用50毫升二氯甲烷洗涤，把滤液合并，浓缩得粗产物，上柱分离后得10毫克目标产物，产率10％，为白色固体。氢谱表明，LD0027与化合物LD021的谱图相同。MS(ESI)：m/z519[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD027。

实施例4：羊毛甾醇衍生物的合成

取0.1克LD021溶解于20毫升甲醇中，加入10毫克钯碳(10％)，于氢气氛围中搅拌反应12小时，用TLC(薄层层析板)监控反应直到反应完全。滤除钯碳后蒸干溶剂，得80毫克出产物。过柱分离得50克纯目标产物，为白色固体，产率49％。目标产物测得的氢谱如图3所示，氢谱特征表现为1.9PPM附近的峰值降低。碳谱如图4所示，MS(ESI)：m/z505[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD028。

实施例5：羊毛甾醇衍生物的合成

(1)将1克(约2.3毫摩尔)羊毛甾醇溶于50毫升二氯甲烷中，在不断搅拌下，加入1克(约1.6个当量)氯铬酸吡啶盐(PCC)，在室温搅拌下反应2个小时。加入50毫升无水乙醚，倾到出醚层，黑色残渣用乙醚洗涤3次(每次用50毫升)，合并醚层用100目粗硅胶过柱，蒸干后用200-300目的细硅胶分离，得0.45克目标产物，为白色固体，产率45％。MS(ESI)：m/z425[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD012。

(2)将0.1克LD012溶解于10毫升二氯甲烷，在强烈搅拌下，加入80毫克(约3个当量)间氯过氧苯甲酸，于0℃下反应10小时。加入0.1克氢氧化钙，在室温搅拌1小时后，滤出固体，用50毫升二氯甲烷洗涤，把滤液合并后浓缩，得粗产物，过柱分离后41毫克目标产物，为白色固体，产率为40％。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD015。

(3)将0.2克LD012溶于40毫升的丙酮，剧烈搅拌下，加入0.01克(催化量)四氧化锇和0.15克(3个当量)N-氧化-N-甲基吗啉(NMO)，室温下搅拌反应7天。减压浓缩反应液，残留物用氯化钠饱和后，用二氯甲烷提取3次(每次用50毫升)，合并二氯甲烷层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后，得粗产物，过柱分离后得40毫克目标产物，为白色固体，产率20％。MS(ESI)：m/z459[M+H⁺]。

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD013。

(4)取20毫克LD013溶解于4毫升吡啶中，滴加0.1毫升醋酸酐，室温下反应12小时。减压浓缩反应混合物后，残留液在冰浴冷却下缓慢滴加质量浓度为10％的的碳酸氢钠水溶液至完全无气泡冒出后，乙酸乙酯萃取3次后合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干有机层，过柱分离后得15克目标产物，为白色固体，产率60％。MS(ESI)：m/z543[M+H⁺]。

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD014。

实施例6：羊毛甾醇衍生物的合成

(1)将5g羊毛甾醇溶解于50毫升N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加异丙基二甲基硅基盐酸盐3.7毫升(2个当量)(DMIPS.HCl)和1毫升咪唑，室温搅拌下反应10小时。减压浓缩反应混合物后，残留液在冰浴冷却下缓慢滴加质量浓度为10％的碳酸氢钠水溶液至完全无气泡冒出后，用乙酸乙酯萃取3次后合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干有机层，得6克粗产物，过柱分离后得5克纯目标产物，为白色固体，产率80％。MS(ESI)：m/z527[M+H⁺]，。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD031。

(2)将LD031溶于40毫升丙酮中，在剧烈搅拌下，加入0.02克(催化量)四氧化锇和3克(3个当量)N-氧化-N-甲基吗啉(NMO)，室温反应7天。减压浓缩反应液，残留液用氯化钠饱和后，用二氯甲烷提取3次(每次用50毫升)。合并二氯甲烷层，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后，得2.6克粗产物，过柱分离后1.5克纯目标产物，为白色固体，产率38％。MS(ESI)：m/z561[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD032。

(3)将1克(0.6毫摩尔)LD032溶于50毫升二氯甲烷中，不断搅拌下，加入0.8克(约3个当量)氯铬酸吡啶盐(PCC)，在室温下反应2小时。向反应溶液中加入50毫升无水乙醚，倾倒出醚层，黑色残渣用乙醚洗涤3次(每次用50毫升)，合并醚层后用100目粗硅胶过柱，蒸干后用200-300目硅胶分离，得0.4克目标产物，为白色固体，产率70％。MS(ESI)：m/z559[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD033。

(4)将0.8克LD033溶于40毫升二氯甲烷中，强烈搅拌下，加入0.6克(约1.5个当量)间氯过氧苯甲酸，于0℃下反应10小时。加入1克氢氧化钙，在室温搅拌下1小时后，滤出固体，用50毫升二氯甲烷洗涤滤饼，把滤液合并浓缩，得粗产物，过柱分离后得0.6克纯目标产物，为白色固体，产率65％。MS(ESI)：m/z575[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD034。

(5)取0.5克LD034溶解于10毫升吡啶中，完全溶解后，滴加1.4毫升(约5个当量)醋酸酐，于室温下反应12小时。减压浓缩反应混合物后，残留液在冰浴冷却下缓慢滴加质量浓度为10％的碳酸氢钠水溶液至完全无气泡冒出后，用乙酸乙酯萃取3次后合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干有机层，得粗产物，过柱分离后得0.48克目标产物，为白色固体，产率88％。MS(ESI)：m/z617[M+H⁺]。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD035。

(6)将0.3克LD035溶解于10毫升四氢呋喃中，加入氟化四丁基氨盐0.1克(Bu4N⁺F^-)，室温搅拌下反应1小时。减压浓缩反应混合物后，残留固体用二氯甲烷溶解洗涤3次(每次用50毫升)，合并二氯甲烷层浓缩，过柱分离得0.15克目标产物，为白色固体，产率70％。¹³CNMR(CDCI₃，400MHz，特征碳谱)，209.3，170.3，83.7，78.4，70.7，68.1，谱图如图5所示；¹HNMR(CDCI₃，400MHz，特征氢谱)，3.20(1H，d，J＝10Hz)，2.342(2H，m)，2.08(3H，s，Me)，谱图如图6所示；MS(ESI)：m/z517[M+H⁺]，谱图如图7所示。反应方程式如下：

为了便于说明本发明的技术方案，将该化合物编号为LD030。

实施例7不同化合物及不同摩尔浓度对不同细胞系的生长抑制实验

利用MTT方法检测加入不同化合物及不同化合物浓度后细胞活力的大小，检测化合物对非小肺癌细胞系A549、肝癌细胞系HepG2及胰腺癌细胞系PancI的生长抑制效果。

MTT保存液的配制：称取MTT 0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，制得5mg/ml，即0.5％MTT溶液，放在-20℃避光保存。

MTT工作液配制：取MTT保存液用无菌PBS稀释10倍。

1640完全培养基配制：在1640培养基中加入一定量的胎牛血清(FBS)，配置成FBS体积分数为10％的培养基，在加入一定量的双抗(即青霉素和链霉素)，使得最终溶液中青霉素的浓度为100单位/ml，链霉素的浓度为100ug/ml。

实验步骤如下：

(1)取胰酶消化对数期细胞，调整细胞悬液浓度到6×10⁴cell/ml，铺96孔平底板每孔加入100ul细胞悬液，使待测细胞调密度至6000个细胞/孔，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)然后放入37℃的细胞培养箱，培养箱CO₂的浓度为5％，孵育过夜。

(3)将药物加入200ul DMSO进行溶解，制成浓度为5mg/ml的溶液。然后进行梯度稀释，浓度梯度为100uM、10uM、1uM、0.1uM。每个梯度每孔加入100ul，设3个复孔。同时设置不加本发明化合物的细胞对照孔，不加细胞的空白孔。

(4)将测孔板放置到5％CO₂，37℃细胞培养箱中，孵育48小时，每日在显微镜下观察细胞状态。

(5)待培养48小时后，先离心后弃去培养液，每孔加100ulMTT工作溶液，继续培养4h。

(6)终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值，检测不同化合物及不同化合物浓度对细胞生长的抑制率。

测得不同种类化合物及不同化合物浓度对胰腺癌细胞系PancI生长抑制效果如表1所示；对肝癌细胞系HepG2生长抑制效果如表2所示；对非小肺癌细胞系A549的生长抑制效果如表3所示。

表1不同化合物浓度及不同种类化合物对PancI细胞生长的抑制率

表2不同化合物浓度及不同种类化合物对HepG2细胞生长的抑制率

表3不同化合物浓度及不同种类化合物对A549细胞生长的抑制率

用体外MTT方法分析不同化合物抗人类癌细胞株的细胞毒性，所检测的人类癌细胞株包括HepG2(肝癌细胞株)、PancI(胰腺癌细胞株)以及A549(非小肺癌细胞株)。对不同化合物的浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM。结果显示，在较高浓度时，即为10μM或100μM时，大部分化合物有较好的抑制癌细胞生长的效果。部分化合物如LD012对A549的抑制率达到90％以上。

实施例8不同化合物在不同细胞系中对信号通路的影响

Western Blot蛋白质印迹检测药物对A549和HepG2细胞中pJAK-2、stat-3和pstat-3表达的影响。

试验方法：

1.在6孔板中每孔加入4*10⁵的A549，HepG2细胞，过夜培养。细胞汇合度70-80％。

2.药物稀释成10、100ul两个梯度后，吸取原有的细胞上清，含有药物的新鲜培养基。放回培养箱中培养48h。

3.48h后收集全部细胞，进行细部计数，按照细胞数目加入不同体积的裂解液，进行裂解后进行WB检测。

4.先进行GAPDH检测，检测其含量，然后调整上样量，WB检测pJAK-2、stat-3和pstat-3

测得不同化合物在不同癌细胞系中对信号通路的影响结果，如图8所示。由图8可知，在A549细胞系中，浓度均为100uM的不同的化合物对pJAK-2、stat-3和pstat-3在48小时的表达各不相同。其中化合物LD021、LD024、LD027、LD028和LD030能明显的抑制pJAK-2和pstat-3的表达，除化合物LD030之外，其他化合物对stat-3的表达无明显作用。

在HepG2细胞系中，不同化合物对pJAK-2、stat-3和pstat-3在48小时的表达也各不相同。其中LD030能同时抑制pJAK-2、stat-3和pstat-3的表达。化合物LD028和LD027对stat-3和pstat-3也有一定的作用。

由上述结果分析可得到，该系列化合物涉及pJAK-2、stat-3和pstat-3靶标信号传递通道和靶标蛋白。

实施例9：LD030的各项性能测试

1)使用反向蛋白质三维结构计算机模拟进行的蛋白质(Rac-1)-配体(ligand)亲和力测试

通过计算机iGEMDOCK软件进行模拟，得到Rac-1蛋白的三维结构如图9所示，Rac-1结合了LD030后构象改变如图10所示，通过计算机模型研究得到LD030与Rac-1的亲和力为-146，该数据表明LD030具有与Rac-1较强的结合能量。由于Rac-1是RHO信号转导通路中的一种磷酸激酶，由此可推断，LD030可以通过与Rac-1结合，阻断RHO信号转导通路。

2)LD030抗癌细胞株的细胞毒性实验

用体外MTT方法分析LD030抗人类癌细胞株的细胞毒性，所检测的人类癌细胞株包括HepG2(肝癌细胞株)、PancI(胰腺癌细胞株)、NCI-H460(肺癌细胞株)、MCF-7(乳腺癌细胞株)以及SF-268(脑瘤细胞株)。对LD030进行梯度稀释，然后用不同浓度的LD030处理癌细胞株，孵育48小时后，向每个管内加入MTT试剂，读取甲瓒沉淀物在OD570时的数值，检测细胞生长抑制率。处理HepG2细胞株的LD030的浓度分别为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM；处理PancI细胞株的LD030的浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM；处理NCI-H460细胞株的LD030的浓度分别为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM；处理MCF-7细胞株的LD030的浓度分别为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM；处理SF-268细胞株的LD030的浓度分别为0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM。图11至图15是不同梯度浓度的LD030处理各类癌细胞株的细胞生长抑制率曲线图，其中图11是不同梯度浓度的LD030处理肝癌细胞株HepG2的细胞生长抑制率曲线图，图12是不同梯度浓度的LD030处理胰腺癌细胞株PancI的细胞生长抑制率曲线图，图13是不同梯度浓度的LD030处理肺癌细胞株NCI-H460的细胞生长抑制率曲线图，图14是不同梯度浓度的LD030处理乳腺癌细胞株MCF-7的细胞生长抑制率曲线图，图15是不同梯度浓度的LD030处理脑瘤细胞株SF-268的细胞生长抑制率曲线图，结果显示100μM的LD030处理上述各类癌细胞株后，其细胞生长抑制率达到近80％，具有较好的抑制癌细胞生长的效果。

3)LD030的BALB/c鼠毒理实验

在成年的BALB/c鼠中进行LD030的动物毒性实验。以1-16mg/Kg的剂量进行小鼠腹腔注射。所有的处理后的BALB/c鼠没有出现任何明显的毒性，14天后仍存活。该结果证实了高达16mg/Kg剂量的LD030处理对BALB/c鼠是安全的。通过短期毒理实验，得到半数致死剂量LD50(连续处理)为4mg/kg，半数有效剂量ED50为0.2mg/kg，治疗指数(TherapeuticIndex)＝LD50/ED50≈20。

4)LD030对胰腺癌裸鼠模型中的胰腺癌细胞生长的影响

选取两株胰腺癌接种非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，肿瘤接种在小鼠腹面两侧。两周左右，作为胰腺癌裸鼠模型使用。

在胰腺癌裸鼠模型中，同时设置了五组药物实验，分别为①空白对照、②25mg/kg/次的吉西他滨(Gemcitabine)、③0.5mg/kg/次LD030、④1mg/kg/次LD030以及⑤0.5mg/kg/次LD030与25mg/kg/次的吉西他滨的组合物。观察用这五组药物处理(吉西他滨注射剂量25mg/kg/次，每周2次；LD030注射剂量0.5mg/kg/次或者1mg/kg/次，每周3次)43天后的胰腺癌裸鼠体内的肿瘤大小变化。实验结果见图16，图16是肿瘤大小变化的实物图，由图16可见，②③④⑤组用药后，肿瘤体积分别减小了37％、21％、62％、77％。该结果显示，针对胰腺癌细胞，1mg/kg LD030比25mg/kg的吉西他滨的药效好，LD030和吉西他滨联用效果比两种药物单用效果好。

另外，设置了六组药物实验，分别为①空白对照、②0.5mg/kg/次LD030③25mg/kg/次的吉西他滨(Gemcitabine)、④1mg/kg/次LD030、⑤0.5mg/kg/次LD030与25mg/kg/次的吉西他滨的组合物以及⑥1mg/kg/次LD030与25mg/kg/次的吉西他滨的组合物。用上述各组的药物处理(吉西他滨注射剂量25mg/kg/次，每周2次；LD030注射剂量0.5mg/kg/次或1mg/kg/次，每周3次)43天，实验结果见图17，图17是肿瘤大小变化的曲线图，由图17可见，抑制肿瘤大小的效果为⑥＞⑤＞④＞③＞②＞①，同时说明，LD030与吉西他滨联用比单用效果好。

同时，对LD030、吉西他滨单用和联用的对抑制肿瘤的效果也进行了相关实验。设置了四组用药，分别为①空白对照②吉西他滨(25mg/kg/次，每周2次)③LD030(0.5mg/kg/次，每周3次)④LD030(0.5mg/kg/次，每周3次)和吉西他滨(25mg/kg/次，每周2次)联合用药。处理43天。图18为LD030、吉西他滨单用和联用后，肿瘤大小变化曲线图。该图说明了在异种移植模型中，采用上述用药剂量和用药次数的情况下，LD030与吉西他滨(Gemcitabine)联用，肿瘤大小减少77％，吉西他滨单用，肿瘤的大小减少37％，LD030单用，肿瘤的大小减少21％。可见，LD030与吉西他滨联用能有效抑制胰腺癌生长。

LD030对异体移植胰腺癌细胞株生长的影响实验如下：每组裸鼠按0.01mg/kg剂量腹腔注射，每星期三次，结果见图19，图19中的左图是小鼠体内肿瘤大小的对照实物图，由该图可见，用药后，小鼠体内的肿瘤明显减小。右图为用药组和对照组中提取的磷酸化-信号传导与转录激活因子(p-STAT3)、磷酸化-JAK2(p-JAK2)、Bcl-XL、细胞凋亡蛋白酶3、9及GADPH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，醛脱氢酶)的蛋白电泳图。由该图可知，用药后，p-STAT3、p-JAK2、Bcl-XL的表达量明显减少，细胞凋亡蛋白酶3、9的表达量明显增多，GADPH作为内参，其表达量基本不变。说明LD030具有下调p-STAT3、p-JAK2、Bcl-XL，及上调细胞凋亡蛋白酶3、9的功能。

5)LD030对肝癌裸鼠模型中肝癌细胞株生长的影响

用LD030处理裸鼠中空纤维中的肝癌细胞株HepG2后的细胞生长率的影响见图20，使用空载体乙醇与LD030做对照实验，空载体乙醇处理后细胞生长率不变，而用LD030(1mg/kg，一日两次)处理后细胞生长率降到约63％。说明，LD030对肝癌细胞株HepG2具有抑制生长的作用。与空载体对照相比，p＜0.05，具有显著差异。

同时比较了用LD030和多吉美(nexavar)处理裸鼠中空纤维肝癌细胞株HepG2后的细胞生长率的影响，见图21。图21表明，使用空载体与LD030做对照实验，空载体处理后细胞生长率不变，用多吉美(75mg/kg，一日两次)处理后细胞生长率降到约80％，用LD030(1mg/kg，一日两次)处理后细胞生长率降到约63％。说明，LD030对肝癌细胞株HepG2具有抑制生长的作用，且在剂量小的情况下，可比多吉美达到更好的抑制效果。与空载体对照相比，p＜0.05，具有显著差异。

比较LD030和多吉美(nexavar)对裸鼠中肝癌细胞株(HepG2)生长的影响。多吉美的处理剂量为30mg/kg，一日两次，LD030的处理剂量为1mg/kg，一日两次。设置空白对照，同时采用LD030和多吉美分别用药和联合用药，结果见图22。在图22中，Nr代表多吉美，可见，LD030单独用药具有抑制肿瘤细胞的效果，但LD030与多吉美联合用药比两者单独用药效果好。LD030与空载体对照相比，p＜0.05，具有显著差异。

体外实验比较LD030和索坦(sutent，舒尼替尼，辉瑞公司)对肝癌细胞株HepG2生长的影响，见表4。表4数据说明了与索坦相比，LD030作用于肝癌细胞株HepG2具有较好的抑制效果，且所需剂量比索坦少。

表4体外实验比较LD030和索坦对肝癌细胞株HepG2和HepG2生长的影响

肝癌细胞株	LD030	索坦
			HepG2	IC50＝1.33μM	IC50＝3.6μM
HepG2	IC50＝1.57μM	IC50＝8.0μM

6)用LD030处理HepG2细胞24小时后导致凋亡的实验

用流式细胞仪检测LD030处理HepG2细胞24小时后导致凋亡的实验，用浓度分别为0.03μM、0.14μM、0.7μM、3.5μM、17.5μM的LD030处理细胞，同时设置空白对照，然后按如下步骤进行：

1.收集细胞{数目约(1～5)×106个/mL}，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2.3ml PBS洗涤1次。

3.离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1-2小时。

4.离心弃去乙醇固定液，3ml PBS重悬5min。

5.400目的筛网过滤1次，500-1000r/min离心5min，弃去PBS。

6.用1ml碘化丙啶(Propidium Iodide，PI，)染液染色，4℃避光30min。

7.流式细胞仪检测。

实验结果见图23，图23是用LD030处理HepG2细胞24小时后的流式细胞仪检测结果图。该图显示所用LD030处理浓度越大，则细胞裂解所占比例越大，表明，LD030对HepG2细胞有抑制作用。

7)LD030在胰腺癌细胞株PancI中对信号通路的影响

Jak/STAT通道在细胞生长，增殖、存活中起到很重要的作用，本实施例通过Western Blotting分析LD030在PancI细胞中对Jak/STAT磷酸化的影响。

用LD030处理细胞，LD030的处理浓度为20μM和50μM，处理时间为4小时、8小时、24小时、48小时。处理完后，收集并在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，5mMEDTA，40mM NaP2O7，1％Triton X-100，1mM二硫苏糖醇，200μM Na3VO4，100μMphenylmethysufonyl fluoride氟化物，2μg/ml亮抑酶肽，4μg/ml抑肽酶以及0.7μg/ml抑肽素)裂解。根据蛋白分析染色浓度(BioRad，500-0006)调整蛋白浓度。相同量的蛋白(50μg/泳道)用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜用抗p-Jak2的特异性抗体(Cell signaling，3771)，p-Stat3(Cell signaling，9131)以及α-微管蛋白(Zymed实验室，32-2500)。用增强型化学荧光(ECL Plus)检测系统(Amersham)检测到可见的蛋白条带。

图24和图25是分别用20μM和50μM的LD030处理PancI细胞不同时间段的蛋白电泳图。图24是用20μM的LD030处理PancI细胞4小时、8小时、24小时、48小时的p-jak2、p-stat3(tyr705)、p-JNK、P-p38和微管蛋白的蛋白电泳图；图24显示，与未用LD030对照相比，p-jak2、p-stat3(tyr705)在24小时和48小时较为明显的降低、p-p38蛋白表达量增加，表明，LD030处理细胞后，下调Jak、Stat3相关通道，上调p-JNK和p-p38。图25是用50μM的LD030处理PancI细胞4小时、8小时、24小时、48小时的p-jak2、p-stat3(tyr705)、p-c-raf、p-ERK、p-JNK、p38、Cyclin D1、Cyclin B1和微管蛋白的蛋白电泳图；图25显示，与未用LD030对照相比，p-jak2(磷酸化的酪氨酸激酶2)、p-stat3(tyr705)(磷酸化转录信号转导和激活蛋白3)、p-c-raf(磷酸化的原癌基因丝氨酸、苏氨酸激酶)、p-ERK(磷酸化的胞外信号调控激酶)在24小时和48小时较为明显的降低，p-JNK(磷酸化c-JUN N末端激酶)表达量增加(与图示不一样)，p-p38(有丝分裂原激活蛋白激酶)表达量增加，Cyclin D1(细胞周期D蛋白1)、Cyclin B1(细胞周期B蛋白1)在48小时减少，内参微管蛋白表达量基本不变。

由上述结果分析可得到，LD030涉及如下靶标信号传递通道和靶标蛋白：①Jak-stat3通道，其中靶标蛋白为磷酸化-jak1、jak2和stat3(p-jak1、p-jak2、p-stat3)；②C-raf通道，其中靶标蛋白为磷酸化-c-raf和ERK(p-c-raf、p-ERK)；③Apoptosis(凋亡)通道，其中靶标蛋白为磷酸化p38和JNK(p-p38、p-JNK)。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims

1.一种抗癌化合物，其特征在于：其为具有以下结构的化合物：

2.权利要求1所述的抗癌化合物在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于：所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、脑瘤或胰腺癌。

3.根据权利要求2所述的抗癌化合物在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于：所述药物还包含吉西他滨或多吉美。