CN105377300A - 含有甘油和鞣质的用于局部应用的组合物 - Google Patents

Abstract

用于局部应用的制剂，其包含甘油和植物鞣质，其中所述植物鞣质具有结合甘油，使得甘油具有成膜剂性质的能力。

Description

含有甘油和鞣质的用于局部应用的组合物

背景技术

几乎所有的细菌，病毒，免疫学或创伤性起源的皮肤和粘膜损伤，涉及细胞损伤，以及他们的治愈直接关系到受损细胞的更换。为了生长，细胞需要水合和干净，无病原体，无化学品，无废料蛋白和蛋白水解酶的环境。在这些条件下，母细胞分泌包括胶原蛋白，弹性蛋白，层粘连蛋白，纤连蛋白和其他蛋白质的游离颗粒的细胞外基质，其形成附着子细胞的垫层。如果没有这种基质，子细胞没有附着的支持体，因此无法成长；因此，损伤不能痊愈。

局部皮肤和粘膜损伤涉及细胞损伤，是非常难以愈合的，因为，除含有死细胞，细胞碎片，阻碍细胞生长和伤口修复的多个蛋白水解酶，这些病变保持开放到外部环境和常常受到污染。这就是为什么大多数的慢性伤口，如褥疮，糖尿病溃疡，或下肢静脉溃疡，永远无法愈合的原因，近40％的患者在他们经历伤口消退之前死亡。

目前，还没有具有所需的所有多重和基本性质的单一的物质或产品，并且没有可用于皮肤和粘膜损伤的完整的治疗。例如，当前没有用于愈合慢性伤口的治疗。所有可用的药物或者充当抗菌药，抗生素以减少微生物生长，充当水凝胶或藻酸盐或酯以保持水合伤口，充当止痛药或麻醉药来减轻疼痛，充当含胶原或透明质酸的制剂以提供细胞基质成分的一种，或者构成生物工程化的皮肤或表皮移植物以取代皮肤，但这些治疗中没有涉及清洁损害和通过促进细胞生长以有利于天然皮肤或粘膜修复过程。

同样缺乏适用于局部病毒感染如唇疱疹，生殖器疱疹，鼻窦炎，和流感的有效治疗，其中大量的游离的病毒颗粒存在于受感染的生物表面，并通过局部可用的蛋白酶持续攻击新的健康细胞。病毒感染通常是通过损伤表面上存在的多个蛋白酶介导的。目前，没有任何药物减少游离的病毒颗粒或蛋白酶，感染的主要物质。为了治疗病毒咽喉感染，海水或盐水含漱药仍然被认为是最好的补救办法之一，因为这些渗透活性的解决方案形成在咽喉粘膜的高渗膜，并由此产生低渗液体向外渗出有助于减少对咽喉表面污染物载荷。不幸的是，这种高渗溶液膜在几分钟内被流出低渗液体稀释，限制了治疗的功效。不推荐使用增加的盐或其它渗透成分的浓度，因为导致强刺激，细胞损伤和黏膜灼烧，或者因为在细胞附近有毒的化学品的存在将阻止细胞生长。

因此，非常重要的是，找到能够满足从被感染表面清洁所有污染物，例如自由浮动的细菌，病毒颗粒，死细胞，细胞碎片，死蛋白，基质金属蛋白酶，生长因子，细胞因子，蛋白酶，或灰尘颗粒的多种需求的物质，以便提供细胞生长和组织修复必要的环境，而没有对细胞或细胞基质的任何毒性作用。

甘油，具有多个羟基的多元醇，是一种天然或合成来源的粘稠的，透明的，安全的，渗透性活性的，亲水性的溶液。甘油通常用作食品成分，防腐剂，和保湿剂，并进入许多化妆品和药品的组合物。甘油被广泛用于创伤和烧伤局部应用，经常用作与其它活性成分联合的赋形剂。在所有这些制剂中，甘油被用作媒介物，稀释剂，粘度增强剂，加湿剂，或味道调节剂，但不作为活性成分以治疗局部皮肤或粘膜病理。

损伤的皮肤或粘膜用作半透膜，并允许渗透发生。溶剂的跨半透膜的流动构成渗流或渗透。达到渗透平衡所需要的压力被称为渗透压。所述溶剂的浓度越高，它施加渗透压越大。淡水被认为是等渗于1000千克/立方米的密度。海水和甘油分别具有1025千克/立方米及1259千克/立方米的密度。由甘油施加的渗透压是高出海水近10倍。甘油的溶质浓度也远高于海水。在溶液中总溶质浓度确定液体的渗流，因为渗透是由横跨半渗透膜存在的溶质/溶剂浓度差异所驱动。总溶质浓度可以通过该溶液的重量摩尔渗透压浓度来确定。含有3.4％NaCl的海水的渗透压是0.581摩尔/公斤(总溶质/摩尔重量/公斤)，与之相比的是，甘油渗透压为10.86摩尔/公斤。这表明，纯甘油比海水渗透活性高近18倍。因此，甘油可能已经是为了产生低渗液体的渗透流出和清洁损伤的应用于感染的表面的产品选择。不幸的是，渗出的低渗液体立即稀释甘油和在几分钟之内从伤口表面排出甘油，限制这些清洁效果。

因此，需要安全和无刺激性的治疗，其具有保湿(保持水合)，清洁，杀菌，并且还具有抗细菌，抗病毒和抗蛋白酶活性的多个性质。

WO00/74668公开了使用高渗渗透活性溶液，其用于治疗局部损伤，涉及使用甘油作为粘稠溶液以用于局部应用，所述局部应用用于治疗溃疡或浅表损伤，其包含甘油作为活性成分和羽衣草(Alchemillavulgaris)水甘油化提取物作为细胞生长促进剂。然而，在WO00/74668中使用的甘油不是成膜剂，因此无法提供上述详细的优点。单独使用甘油作为治疗剂来清洁受感染或损伤的组织是不常见的，因为，由于渗透，从组织的内部低渗液体流出的现象，甘油在几分钟之内得到稀释，逐渐失去其渗透性质和活性，并没有令人满意地作为总的清洁剂。甘油膜应保留在半透活组织膜至少30分钟，以产生足够的清洁生物组织表面的渗透。

本发明涉及如何改善活生物表面对甘油膜的保留时间，以克服上述的缺点的问题。

其次，冷冻保存是其中通过冷却到零度以下的温度，保存细胞，全组织，或易受化学反应性或时间引起的损害影响的任何其它物质的方法。在足够低的温度下，可能会造成所涉及的材料受到损害的任何酶或化学活性被效地停止。冷冻保存方法力求达到低温，而不产生冷冻过程中由于冰晶的形成而导致的额外伤害。对于长期活细胞储存，冷冻保护剂必须是对细胞无毒的，并能防止晶体形成。这对于活细胞和组织储藏或保存(例如：皮肤移植)特别重要，因为，当死亡或正在死亡的细胞数量增加时，成功的细胞复活或组织移植的可能性降低。

目前，DMSO(二甲基亚砜)，人或牛胎血清(FCS)，和甘油被用作冷冻保护介质，以保护细胞免受冻结温度和水晶体损伤，从而最大限度地减少细胞的死亡率。不幸的是，这些冷冻保存剂中没有一个能够在很长一段时间，即数月至数年保存细胞。通常，30-40％的细胞在活细胞冷冻保存的几天之内，和50％以上的活细胞在冷冻保存的数月内死亡(Bravo等人，烧伤26(4)，367-78，2000)(Bravoetal.Burns26(4),367-78,2000)，特别是由于形成水晶体所造成的细胞损伤。

因此，迫切需要找到一种冷冻保存剂，其能够形成围绕细胞或组织的薄膜，并保护它们免受外界侵害以及水晶体的形成，以增强细胞生存力。

概要

为了解决上述的详细问题，本发明提供一种甘油制剂，其含有特定植物鞣质，所述特定植物鞣质能够结合至甘油分子和由此改善甘油制剂在半渗透生物膜上的膜形成性能和保留时间期间。这种成膜剂甘油可用作局部应用的天然和安全的治疗，以治疗各种皮肤和粘膜感染和在冷冻保存过程中保护活组织。

因此本发明涉及用于局部应用的包括甘油和植物鞣质的制剂。所述植物鞣质具有结合甘油，使得甘油具有成膜剂性质的能力。

在一个实施方案中，植物鞣质是选自原花色素。

在优选的实施方案中，这些原花色素是从植物的部分或整株植物获得，所述植物选自欧洲越橘，大果越橘，葡萄，欧洲接骨木，山茶，大豆，儿茶，白蜡树，银杏，黑果醋栗，艾菊属银胶菊属(Tenacetumparthenium)，白柳(Salixalba)，鼠尾草(Salviaofficinalis)，迷迭香(Rosmarinusofficinalis)，仙人掌属(Opunitiasp.)，桑(Morusalba)，悬钩子属(Rubussp.)，栎属(Quercussp.)，松属(Pinussp.)，以及它们的组合。

在更优选的实施方案中，富含原花色素的鞣质级分从植物的部分，或整株植物获得，所述植物选自欧洲越橘(Vacciniummyrtillus)，大果越橘(Vacciniummacrocarpon)，葡萄(Vitisvinifera)，欧洲接骨木(Europeanelder)，山茶(Camelliasinensis)，黑果醋栗(Ribesnigrum)，儿茶(Acaciacatechu)，白蜡树(Fraxinuschinensis)，银杏(Gingkobiloba)，大豆(Glycinemax)，以及它们的组合。

在另一个实施方案中，原花色素是合成的，而不是从植物获得的。

在一个实施方案中所述制剂的甘油含量介于30％至99.99％(v/v)。

在一个实施方案中，所述制剂包括活性成分。活性成分可以从药物，抗生素，防腐剂，营养素，抗体，生长因子或蛋白质中选择。

本发明还涉及上述制剂用于皮肤和粘膜感染的治疗的用途。

上述制剂可进一步用于保护，运输，储存或冷冻细胞，组织或器官。在一个实施方案中最终溶液中的成膜剂甘油与存在于最终溶液中的其它的稀释剂，诸如例如FCS，培养基，和DMSO相比的浓度，在2至50％(v/v)，优选10至30％(v/v)，更优选15至20％(v/v)之间变化。

本发明还涉及通过以下增强生物表面对甘油膜的保留时间的方法：制备甘油和具有结合甘油分子的能力的植物鞣质的溶液，将溶液施加到生物表面。

本发明还涉及治疗皮肤和粘膜感染的方法，其包括施加上述制剂至患处(受影响的区域)(affectedarea)的步骤。

本发明还涉及制备成膜剂甘油的方法，包括混合甘油或多元醇溶液与甘油结合植物鞣质。在一个实施方案中植物鞣质可以作为粉末或液体添加。

如在实施例和在下面的附图中描述的研究显示，通过添加鞣质改善甘油成膜剂性质，和与非成膜剂甘油相比成膜剂的治疗功效大幅增加：

附图

图.1：通过热重分析(TGA)测量单独的甘油与成膜剂甘油相比的溶解性。

图.2：成膜剂甘油与正常的甘油相比对糖尿病伤口的膜保留持续时间。

图.3：牛皮癣，湿疹及皮炎(PED)现象的平均整体症状严重程度的测量：单独的甘油-对照组的影响。

图.4：牛皮癣，湿疹及皮炎(PED)表现的平均整体症状严重程度的测量：成膜剂甘油的影响；积极治疗组：用成膜剂甘油VB-DERM治疗如通过实施例5制剂n°11，和51。结果表明，成膜剂甘油完全消除生长刺激因子，白介素，和干扰素的所有游离粒子，并恢复正常的皮肤细胞生长。

图.5：采用成膜剂甘油治疗的PED患者生活质量中的改善，与正常甘油相比。

图.6：各自的治疗(成膜剂甘油与正常甘油相比)对总体PED严重性的影响。

图.7：总体鼻窦炎病况；采用正常甘油喷雾治疗的对照组；采用成膜剂甘油喷雾治疗的成膜剂甘油组，如通过实施例5-制剂n°5。

图.8：抗生素疗法；在对照组和成膜剂甘油组中使用抗生素治疗的比较必要性。

图.9：Orosol(成膜剂甘油)与对照治疗(单用甘油)相比对粘膜炎的影响。

详细说明

本发明涉及用于局部应用的成膜剂甘油制剂，其包含甘油和植物鞣质。所述植物鞣质具有结合甘油，使得甘油具有膜形成性质的能力。此成膜剂质量导致活生物表面对甘油膜的保留时间的增强。作为这样的制剂旨在用于对皮肤和粘膜感染的治疗。

术语成膜剂甘油表示甘油溶液，所述甘油溶液包含特定，天然或合成的鞣质或鞣质的级分，所述甘油溶液在半渗透活生物膜施用时，形成膜，所述膜抵抗作用在它之上的机械力，所述抵抗程度比正常甘油好得多。当正常的，可商购的甘油施加在半渗透生物膜时，甘油的高渗性从活组织内部吸引低渗液体，这导致甘油获得迅速稀释，失去渗透力，并在应用后10～15分钟停止其活动。另一方面，成膜剂甘油抵抗向施加在其上的向外的液体流压力，并仅使得稀释缓慢，因此保存其渗透力的时间期间比正常的甘油长得多，即30分钟至几个小时，这取决于应用部位和向外的液体流的压力。

甘油，也称为甘油或甘油，含有通过定义的糖醇化合物，其包括一个以上羟基(OH)，其连接于脂族骨架的单独的碳原子。这一组包括二醇，甘油，和季戊四醇，也包括如下的产品，如三羟甲基乙烷，三羟甲基丙烷，1,2,6-己三醇，山梨糖醇，肌醇，木糖醇，和聚(乙烯醇)。多元醇可以从天然来源获得或可以合成。我们选择了最常用的多元醇，即甘油。甘油是一种高渗粘性糖醇溶液，将其通过渗透吸引存在于活生物表面之下较深组织的低渗液体，从而水合该表面。不幸的是，由此产生的向外的低渗液体流稀释甘油和在几分钟之内逐渐减小这种效果。低渗液体的向外渗出和因此甘油的清洁效果只持续5至20分钟的一段时间，需要频繁应用，这是不实际的。这就是为什么，尽管甘油是良好的渗透剂，但是甘油仅被使用作为保湿剂，而不是作为适当用于治疗局部损伤的药物的原因。

成膜剂甘油表示粘性液体甘油，其形成薄的渗透活性的，半渗透的，柔性的，非增塑剂膜，所述膜能够从施加所述甘油的活生物表面吸引低渗液体，并且与标准甘油相比能够更好地抵抗崩解或溶解度。

鞣质包括天然涩多酚(astringentpolyphenolic)化合物，其含有足够的羟基和其它合适的基团如羧基以与蛋白质和各种其他大分子，如糖形成强络合物。

鞣质可以是天然来源的，如植物鞣质，或合成的。与小而简单的黄酮相比，因为是被高度支化的大分子，鞣质的单体，二聚体和聚合物具有更多结合相邻的糖或其它分子的机会。鞣质上的羟基的存在允许与如多元醇的大分子形成稳定交联，而这种交联有助于改善多元醇(甘油)膜的机械耐受性。因为文献引用的合成聚合物的多种毒性作用，本发明人推测，植物鞣质，具有与蛋白质结合的很强亲和力，而且同样具有与其它大分子如多糖，碳水化合物和糖结合的很强亲和力，可以在添加到多元醇时，改善多元醇，例如甘油的膜形成性能。鞣质构成极好的解决方案，因为：(1)鞣质是惰性的分子，并与细胞结构没有相互作用；(2)鞣质当施加到活组织时是无毒和无刺激的；(3)鞣质是非常大的分子，并且不能进入细胞；和(4)鞣质可以掺入甘油以形成均匀的溶液。

一般地，鞣质被分为两大类：可水解和缩合鞣质。正如其名称所示，可水解鞣质通过酸或酶迅速水解，和该水解的产物是没食子酸或鞣花酸。经干馏，没食子酸和其他成分转化为邻苯三酚(pyrogallol)。缩合鞣质对水解更耐受。它们是由类黄酮色素形成。在无机酸或酶的存在下，它们被分解成红色鞣酐，其是水不溶性的。原花色素(PCDs)是缩合酚聚合物，其含有通过C4-C6或C4-C8键连接在一起的黄烷-3-醇单元。原花色素的结构变化范围从二聚体和三聚体至更复杂的低聚物和聚合物，取决于儿茶素连接基团的数目，C-环的三个手性中心(碳2，3和4)的羟基化和立体化学，其是不容易通过水解裂解。本发明人已观察到，从2至5个儿茶素或表儿茶素分子形成的原花色素(PCDs)是特别适合于大分子结合的。

在一个本发明实施例中植物鞣质是选自原花色素或原花青素(PCDs)。

在优选的实施方案中，这些原花色素是从植物的部分或整株植物获得，所述植物选自欧洲越橘，大果越橘，葡萄，欧洲接骨木，山茶，大豆，儿茶，白蜡树，银杏，黑果醋栗，艾菊属银胶菊属，白柳，鼠尾草，迷迭香，仙人掌属，桑，悬钩子属，栎属，松属，大黄素(Rheumemodi)及其组合。

在另一个实施方案中原花色素是合成的，而不是从植物而获得。

本发明人发现，在他们的研究(见实施例3-药理研究)发现中，某些PCD或它们的组合)是非常高度形成膜的，这意味着它们与单独的甘油相比增加甘油膜保留持续时间200％至300％。这些组合优选包括：欧洲越橘(果实提取物)+大果越橘(果实提取物)；葡萄(种子提取物)+欧洲接骨木(果实提取物)；山茶(叶提取物)+欧洲越橘；欧洲越橘+欧洲接骨木；山茶+葡萄+欧洲接骨木；葡萄+欧洲接骨木+大豆(种子提取物)；大果越橘+山茶+葡萄；和大果越橘+山茶+欧洲越橘+葡萄。

与之相比的是，下面的鞣质丰富的植物提取物的组合已被发现具有高膜形成性质，这意味着它们与单独的甘油相比增加膜保留持续时间100至200％：儿茶+白蜡树(树皮和整株植物)；白蜡树+鼠尾草+银杏；迷迭香+黑果醋栗；银杏(根)+合成聚合物。

此外，另一组被指定为具有中等膜形成性质，这意味着它们与单独的甘油相比增加膜保留持续时间20％至99％：桑(果实)+悬钩子属(果实)；栎属(果实，树皮)+松属(树皮，果实)。艾菊属银胶菊属(花和叶)+白柳(整株植物)；大黄素+仙人掌属(果实)+松属(树皮)。

这些组合可以互换。

公知的是多元醇和聚合物含有足够的游离氧分子，以与酚类化合物的羟基形成强氢键。已采用合成或天然的，水溶的或水不溶性的，纯化的或粗制聚合物进行许多研究，以调查植物鞣质的生物利用度和消化率，以制备合成聚合物和塑料，以提高材料的粘度或刚性或量化鞣质，但从未研究使用鞣质或聚合物以改进局部用于治疗皮肤或粘膜伤害的甘油膜形成性质。

但是应该理解的是，本发明不关注使用甘油作为增塑剂或在皮肤上使用甘油作为保湿剂。在甘油中加入鞣质不改变甘油或甘油膜在生物膜上的粘度，但是提高甘油在活生物膜上的附着。

由发明人进行的研究的目的是确定植物鞣质，特别是植物鞣质的原花色素(PCDs)级分，它可以与甘油分子结合，以形成机械耐受的甘油膜，其能够在低渗液体渗出期间在生物膜上保持不变。目的是执行这种最佳生物粘性，渗透活性，高渗和安全膜作为一种有效的治疗来清洁损伤，从损伤除去污染物，保持水合的损伤，保护细胞外基质，并准备一个有利的场所以用于细胞生长在一种无毒，无化学品的环境。

本发明人确定了特定甘油结合植物鞣质，所述植物鞣质与单独的甘油相比能够提高甘油膜的机械耐受性并由此保持膜在活细胞上完好并持续长得多的时间。在受损的皮肤或粘膜表面保持成膜剂甘油的这种增加的持续时间有效地水合和清洁生物表面以及移除所有存在于表面上的自由浮动污染物。污染物的缺乏和清洁和湿润的环境加速受损组织的愈合。甘油膜同样保护损伤的表面免受外界侵害。

甘油也被用来作为冷冻保护剂而在低温(-70℃至-196℃)冷冻细胞和组织。甘油的羟基与H₂O相互作用并阻止水的晶体形成特性。水的分子组织被修改，导致在冰冻期间较少的水结晶形成和低细胞损伤。通常使用多达介于5和20％的浓度的甘油与DMSO(1-5％)，血清(10-20％)和培养基以用于冷冻细胞和活组织。二甲基亚砜使细胞膜多孔，其在解冻期间保护细胞免受损害而甘油保护膜结构，并保持内部蛋白质的性质。大于20％的浓度时，甘油变得太高渗和由于其渗透作用损害细胞。不幸的是，采用这些冷冻保护剂的细胞的存活很少超过60％，导致所存储的组织的移植差。更高浓度的任意成分均未被发现增强细胞存活。不良细胞存活率是由于，事实上，尽管活细胞膜周围存在高浓度的甘油分子，在冷冻期间细胞脱水释放在膜表面上的大量水分子。这种水被甘油捕获，但由于甘油不作为膜存在，一些水分子结晶。水结晶进一步增加游离的甘油分子和细胞膜之间的距离，从而进一步促进水晶体形成和随后的细胞损伤。即使在相当努力寻找能够保护完整的细胞表面和捕获从细胞内扩散的所有的水分子的成膜剂冷冻保护剂，还没有发现安全成膜剂冷冻保护剂。

发明人已发现保持与细胞膜紧密接触的成膜剂甘油，相对于单独的甘油，可以更好地保持活细胞。上述制剂可以由此进一步用于保护，运输，储存或冷冻细胞，组织或器官。在一个实施方案中成膜剂甘油在样品中的净浓度在2至50％(v/v)，优选10至30％(v/v)，特别是15至20％(v/v)变化。因此成膜剂甘油构成用于克服这一困难并防止水晶体损伤细胞的最佳解决方案。

在一个本发明实施例中制剂的甘油含量介于30％至99.99％(v/v)。甘油在用于局部应用的制剂中的％可以根据其中产物被施加的身体部分而变化，例如用于在开放慢性伤口应用的较厚的产品，在阴道腔内应用的较不厚的产品或在鼻腔或口腔中应用的薄得多的制剂。甘油在制剂中的百分比可以在30和99.99％(v/v)之间变化，例如在90和99％(v/v)之间变化以用于阴道应用，在70和99.9％(v/v)之间变化以用于在皮肤伤口上应用，在30至60％(v/v)之间变化以用于对敏感粘膜如鼻粘膜应用。

在另一个实施方案中制剂还包含活性成分。活性成分可以选自药物，抗生素，防腐剂，营养素，抗体，蛋白质，生长因子，或要求与甘油膜施加到其上的损伤表面接触的任何其它物质。

制剂可以采用1和500毫升之间的体积填充到管，塑料容器，注射器，安瓿，喷雾剂，金属容器中，这取决于容器的类型。成膜剂甘油也可以并入棉，聚合物，塑料，纤维素或其它类型的敷料，其通常用于在创伤和损伤上的应用。

本发明还涉及通过以下增强生物表面保留甘油膜的持续时间的方法：制备甘油和具有结合甘油分子的能力的植物鞣质的溶液，将溶液施加到生物表面。

甘油中鞣质丰富的植物的提取物浓度可以根据用于获得成膜剂作用的鞣质的初始浓度和组成而变化。

关于制剂的工作机制本发明人假设如下。渗透活性溶液可以在生物表面，其中细胞原生质膜暴露于外部环境(皮肤损伤，其中皮肤角质细胞损坏和底层细胞暴露，粘膜如咽喉和口腔，鼻腔和阴道腔)，以便在生物膜上形成渗透活性薄膜和创建低渗液体的向外流动。液体的向外流动应分离和排出杂质如死细胞，细胞膜，灰尘颗粒，细菌，病毒颗粒，自由浮动的蛋白分子如蛋白酶，等等，从而导致损伤和粘膜的清洁。这种作用的机械方式产生抗细菌，抗病毒，防腐，清洁和水合效果，这是促进细胞生长和愈合必要的。海水，含有3-3.4％的NaCl(盐)常用于清洁损伤或漱口，但不是非常有效的，因为低渗液的向外流动即刻稀释，并移除该渗透膜，限制盐溶液的作用持续时间仅为几分钟。由生物表面保留高渗膜的持续时间越短，其清洁功效较小。

甘油比海水或3％的食盐溶液更粘稠，并在生物膜上比海水保持相对较长的时间。因为甘油是作为防腐剂，抗病毒剂，清洁和保湿剂(hydratingagent)用于局部应用的一种无毒，无刺激性，完全安全，和便宜的产品，它本应已被广泛用于治疗局部感染，清洁伤口和促进伤口愈合。但是，这并不是事实，因为甘油也被低渗液体的向外流动稀释，它通过其非常渗透活性产生，并因此在它的应用后仅仅几分钟被从表面上除去，这大大缩短了甘油作用的持续时间，并没有留出足够的时间进行彻底的表面清洁。这就解释了为什么使用单独的甘油清洁粘液或损伤的表面是不能令人满意的。

甘油的三个羟基通过与水形成氢键使其易溶于水。稀释甘油会立刻被低渗液体流消除，这逐渐但迅速(5-10分钟内)减少甘油的渗透效应。为了克服这个问题的唯一解决办法是保持重新应用产品多次，每次10-15分钟，以重构所述渗透活性膜，这是不实际的。

因此，优选的解决方案涉及提高甘油的膜保留持续时间，而不改变产品的渗透性质或安全性，以便提供一种有效的，安全的，且廉价的方法来清洁生物表面。

甘油完全通过它的机械性能作用于生物表面，而没有与底层活生物膜或细胞的任何生物，药理，代谢或免疫学相互作用，重要的是，选择所述物质是因为，它改善甘油的膜形成性质是相似的或惰性的能力。

本发明还涉及治疗皮肤和粘膜感染的方法，包括将上述制剂施加至患处(受影响的区域)的步骤。在本申请中术语皮肤指的是身体的所有区域的皮肤，也包括例如，嘴唇上的非常敏感的皮肤。本制剂同样可以应用到皮肤和粘膜上，如口腔，咽喉，鼻孔，鼻窦，身体表面上的受损皮肤和组织，阴道腔和其他身体自然开口。皮肤和粘膜感染表示皮肤或黏膜的表面上的任何不希望的病原体或物质的存在，干扰正常细胞功能或与愈合过程。

本发明还涉及制备成膜剂甘油的方法，包括混合甘油或含有甘油结合植物鞣质的多元醇溶液。在一个实施方案中植物鞣质可以作为粉末或液体添加。

通过以下实施例的内容进一步说明本发明，但不限于以下实施例的内容。

实施例

实施例1：鞣质丰富的植物提取物的制备

最初，186个鞣质丰富的植物物质被选定以用于制备原花色素(PCD)丰富的干的植物提取物。

PCD富含植物提取物是从富含鞣质的不同植物材料，例如蔬菜，坚果，树皮，的果实，种子，皮，肉以及任何其他鞣质丰富的植物材料制备。将该原料以原样(湿)使用，但也可能已被通过干燥，分离并除去低鞣质含量的成分进行预先排序。

鞣质丰富的植物提取物使用文献(AjilaCM.CritRevBiotechno，31(3)227-249，2011)中描述的和本领域技术人员已知的标准方法制备。总之，在初期阶段，含有原花色素的固体植物材料的含水混合物是通过加热约4千克的固体植物材料与24-40升的去离子水制成(固体材料与以水比为1：6至1:10)，任选在加压(60-100psi的压力)下，并在180至250℃的温度下，持续时间的范围为30分钟至5小时，这取决于所处理的植物材料的刚性。加热后，通过将该混合物通过棉绷带布将液体提取物从较大碎片分离。将分离的固体弃去，收集PCD富集的液体。然后通过加热(180-200℃)或通过喷雾干燥提取物和将其用作PCD富含提取物以用于各种实验的以及用于掺入甘油。

提取物中的原花色素含量用酸丁醇测定按照Porter等人(Porter等植物化学，1986年)的方法来确定。简言之，200微克干燥的植物提取物用300μl70％的丙酮稀释，将溶液吸移到一个100×12毫米的管。加入3.0ml的丁醇-HCl试剂(95：5)和0.1ml的2％在HCl2N中制备的铁酸。将管涡旋，然后在管的口覆盖玻璃大理石，并将其在加热块中在97至100℃进行60分钟。然后将管冷却下来，并且在550nm处记录吸光度。计算作为无色花色素当量的缩合鞣质百分比的公式为：(吸光度550nm×78.26×稀释因子)/(％干物质)。

只有那些具有波特(porter)值高于200的并指示高浓度的PCD的植物提取物(测试的186个中的42个)被用于进一步的测试。对提取物不进行纯化以浓缩特定类型的鞣质，其原因在于最佳结果是用PCD的混合物获得的，而不是采用特定类型的鞣质获得的。干燥的植物提取物主要包括二聚体，三聚体和五聚体儿茶素构件块。

实施例2：成膜剂甘油的制剂

根据需要用于局部应用的甘油膜的类型，含干粉0.1～8.0％的PCD被掺入甘油，并在37℃搅拌下充分混合6小时，以获得均匀溶液。植物来源的甘油可以从供应商如在法国的Interchimie购买。将该制剂装入管，塑料容器，注射器，安瓿，喷雾剂，金属容器，使用1至500毫升之间的体积，这取决于容器的类型和所需的用途。

实施例3(a)：药理学研究：单独的甘油与含有不同植物鞣质的甘油相比的膜保留能力的测量

进行实验以研究，在相同的条件下与非PCD甘油膜(正常甘油)相比，含有PCD富含植物提取物(成膜剂甘油)的新的甘油膜的效果。本研究的目的是选择那些单独的PCD，或它们的组合，其改善生物膜对甘油膜的保留。

测试模型：

在没有用来研究生物表面保留膜的持续时间的任何具体体内模型的情况下，使用人多层表皮的体外模型来评价，加入无细胞毒性浓度的单独或作为不同组合的不同PCD富含植物提取物对甘油膜保留的效应。人表皮生长在可渗透的聚碳酸酯过滤器(直径1cm)中，并保持在浸泡培养基的海绵上，它的外表面保持与空气接触，如同在体内的情况。通过毛细管作用，使培养基扩散通过聚碳酸酯过滤器和供应营养到表皮细胞以保持这些细胞存活。

插入一个或两个额外的聚碳酸酯过滤器增大了培养基和细胞之间的距离；达到细胞的可用培养基的量然后减小，并且在不存在养分和水合的情况下，细胞死亡。细胞死亡可以通过重要的MTT染色来测量(法拉利MJ.免疫学方法期刊(J.Immunolmethods)13(2)，165-172，1990)。活细胞的百分比与表皮表面保留甘油膜的持续时间成比例。

测试产品：

含各种甘油制剂的测试产品(主要是PCD丰富的植物提取物)，浓度％在0.1至5.0之间。植物提取物加入到膜物质，以研究其对膜的细胞粘着性的效果。

每表皮应用的测试产品的数量：20微升(μl)

暴露的方法：

借助吸管，将甘油制剂作为薄层直接施用在表皮(每浓度n＝6)：表皮置于两个过滤器上和测试产品施用在表皮表面。将过滤器保持在海绵上，将其插入到培养皿中，培养皿含有合适量的营养滋养细胞的培养基。在实验期间，将细胞培养过滤器轻轻在6h，24h和48h取出，并在无血清培养基中搅拌20秒期间，以允许产品膜脱离(当膜或膜成分不良好附着到表皮表面时)。表皮上的渗透膜的缺乏最大限度地减少液体培养基供给细胞，并导致细胞死亡。根据用于在甘油中每个测试产品浓度所获得的初步结果，植物鞣质的浓度被增加或减少，以获得最大成膜剂的效果。

暴露条件：37℃，5％CO₂培养72小时。

细胞生存力测定：

MTT染色和组织学分析。细胞生存力评分如下：

分数4：100％的细胞(与对照相比)具有强烈的蓝色。

3：大约75％的活细胞具有深蓝色。

2：大约50％的活细胞具有中等蓝色。

1：约25％的活细胞具有淡蓝色。

0：无活细胞，发白的表皮颜色。

在每个实验中，在每个时间点获得的6块表皮的评分被求平均值，以确定细胞的存活。然后计算3个单独实验的平均值分数的平均值，以计算与用单独的甘油治疗的细胞相比的平均细胞存活百分比。

对照：

阳性对照：无测试的产品，但采用与测试产品相同的试验条件。在这些条件下几乎95-100％的细胞在72h内死亡。

甘油对照：与阳性对照相同，不同之处在于不含任何PCD提取物的甘油施用在培养表面。在这些条件下因营养供应差，在72h内近60-70％的细胞死亡。

结果：

72小时后，细胞存活％如下：

阳性对照：6.32(±2.4)％

单独的甘油：23.85(±4.8)％，表明与阳性对照相比17.53％更高的细胞生存力。这表明，甘油发挥渗透作用以继续营养和水合细胞。

成膜剂甘油：当PCD富含植物提取物或合成的聚合物以介于0.1至5.0％的浓度加入到甘油时，细胞的存活受到影响如下：

非常高的甘油膜保留能力(与单独的甘油相比+200～+300％活细胞)：

来自以下的PCD：(1)单独欧洲越橘，和(2)以下的PCD-丰富的植物鞣质的组合：欧洲越橘(果实提取物)+大果越橘(果实提取物)葡萄(种子提取物)+欧洲接骨木(果实提取物)；山茶(叶提取物)+欧洲越橘；欧洲越橘+欧洲接骨木；山茶+葡萄+欧洲接骨木；葡萄+欧洲接骨木+大豆(种子提取物)；大果越橘+山茶+葡萄；和大果越橘+山茶+欧洲越橘+葡萄。

高膜保留能力(与单独的甘油相比+100至+199％活细胞)：

来自于以下的PCD：(1)单独的儿茶(树皮和植物)，艾菊属银胶菊属(花与叶)；白柳(整株植物)；鼠尾草；迷迭香；大果越橘；葡萄；山茶；欧洲接骨木；仙人掌属(果实)，和(2)白蜡树+银杏的组合；白蜡树+银杏+山茶；葡萄+黑果醋栗。

中等膜保留能力(与单独的甘油相比+10至+99％活细胞)：

桑(果实)；悬钩子属(果实)；栎属(果实，树皮)，松属(树皮，果实)。

中度成膜剂活性也采用合成聚合物如含有合成鞣剂(syntan)的聚合物(实施例BlancotanSH2和LedosolCRP可以从意大利Silvateams.p.a.购买)或聚合树脂(如AritanA7，含阴离子氮的聚合物树脂可从印度ArihantDyechem公司购买得到)。

结论：

这些结果证明，许多不同的鞣质，但特别是二聚体至五聚体儿茶素类，天然或合成的，通过与甘油分子结合能够产生成膜剂甘油，并且能够在生物表面改善甘油膜的机械性能。

为了测量如实施例2中制备的制剂的成膜剂质量，进行测试，其以间接方式显示出甘油的成膜剂质量已被提高。

实施例图3(b)：药理学研究：单独的甘油与成膜剂甘油相比的溶解度体外测量

为了验证加入鞣质对甘油的机械耐受性和在通过它自己的渗透活性引起的水中的溶解度的效果，我们进行单独甘油与成膜剂甘油(包含1％鞣质富含植物提取物)的热重分析(TGA)。各测试物的膜暴露于一定温度(30℃)&相对湿度(20％)气氛和时间相关的质量增加被测定。溶解度因此可以量化(图1)。

初步结果表明，鞣质降低在水中的甘油的溶解度。降低的溶解度是假想归咎于鞣质占据一些甘油的羟基基团，其因此不可用于结合水分子。

实施例3(c)：药理学研究：在糖尿病性溃疡中单独甘油与成膜剂甘油相比的膜保留持续时间的测量

甘油体内的成膜剂能力：实验在具有糖尿病溃疡面积约4(±1.5)cm²的表面积的患者中进行。2毫升甘油(第1组，n＝6处溃疡)或2毫升成膜剂甘油(第2组，n＝6处溃疡)施加于伤口表面和在应用后伤口保持在垂直位置。在6小时期间每隔一小时收集伤口流体的样品(100微升)，和对甘油的量进行测定。

得到的结果如下(参照图2)。

结果表明，本研究的实验条件下，近92％的正常甘油在1小时内被消除，并且100％在2小时内被消除，与之相比，只有34％至56％成膜剂甘油减少。成膜剂甘油的活性持续6小时。

实施例4：鞣质-甘油结合和生产成膜剂甘油的测定结果

如实施例3中药理研究所示，在不同浓度的与甘油混合的42个鞣质富含植物提取物(它们是单独或以各种的组合存在的)中，下列植物鞣质(PCD)显示不同程度膜形成性质：

非常高膜形成质量：6个植物提取物被归类为非常高活性：欧洲越橘，大果越橘，葡萄，欧洲接骨木，山茶和大豆，因为它们与单独的甘油相比增加了膜保留持续时间200％至300％。采用以下得到的甘油膜质量非常高：(1)来自单独的欧洲越橘的PCD，以及来自以下的PCD-丰富的植物鞣质的组合的PCD：(2)欧洲越橘(果实提取物)+大果越橘(果实提取物)；(3)葡萄(种子提取物)+欧洲接骨木(果实提取物)；(4)山茶(叶提取物)+欧洲越橘；(5)欧洲越橘+欧洲接骨木；(6)山茶+葡萄+欧洲接骨木；(7)欧洲越橘+欧洲接骨木+大豆(种子提取物)；(8)大果越橘+山茶+葡萄；(9)大果越橘+山茶+欧洲越橘+葡萄。

高膜形成质量：9个植物提取物被归类为高活性的，因为它们与单独的甘油相比增加了膜保留持续时间100至200％：儿茶(树皮和整株植物)，艾菊属银胶菊属(花和叶)；白柳(整株植物)；鼠尾草；迷迭香；白蜡树，银杏；黑果醋栗(果实)和仙人掌属(果实)，以及合成聚合物如Aritan-A7，LedosolCRP和BlancotanSH2

中度膜形成质量：4个植物提取物被分类为中度活性，因为它们与单独的甘油相比增加了膜保留持续时间10～99％：桑(果实)；悬钩子属(果实)；栎属(果实，树皮)，松属(树皮，果实)。

这些结果表明：1.鞣质结合甘油；2.一些植物鞣质与甘油分子结合非常强烈，而另一些采用较小的强度结合。这表明，甘油与鞣质的结合是特异性的；3.只要鞣质加入到甘油鞣质与甘油的结合就开始；4.相比于聚合物或大缩合鞣质，鞣质二聚体，三聚体和五聚体显示出更强的结合和成膜剂效果。这可能与这样的事实相关，更小的鞣质分子有与甘油结合的多种可能性。当两个组分被混合并存储时近50％的PCD-甘油结合发生，并且当将溶液作为薄膜在皮肤或粘膜表面施加时，剩余50％。合成聚合物也可以与甘油分子结合和改善甘油膜的膜保留持续时间。

基于这些发现，成膜剂甘油可通过混合甘油或任何其它的多元醇溶液与甘油结合植物PCD来制备。

实施例5：治疗皮肤和粘膜感染的制剂的实施例

按实施例2所示制备不同成膜剂甘油制剂。百分比表示干PCD-丰富的植物提取物的重量/重量(wt/wt)。

1.甘油-69.22％，大果越橘提取物-0.18％，欧洲越橘提取物-0.18％；赋形剂：蜂蜜-29.0％，水-1.42％填充于10ml的管以治疗创伤性口腔溃疡。

2.甘油-72.92％，大果越橘提取物-0.30％，欧洲越橘提取物-0.36％；赋形剂：蜂蜜-12.0％，水-14.42％填充于20ml喷雾剂中以治疗口腔粘膜炎。

3.甘油-74.265％，葡萄种子提取物-0.48％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.32％；赋形剂：蜂蜜-12.0％，水-12.935％填充于30ml喷雾剂以用于咽喉应用。

4.甘油-73.94％，葡萄种子提取物-0.48％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.32％，大豆种子提取物0.07；赋形剂：蜂蜜-12.0％，水-13.19％，填充于20ml喷雾剂中以用于儿童咽喉应用。

5.甘油-32.488％，大果越橘提取物-0.12％，欧洲越橘提取物-0.12％，山茶提取物-0.22％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.10％；赋形剂：水-66.952％，填充于15毫升塑料(plastic)喷雾剂中以用于鼻鼻窦炎的治疗。

6.甘油-68.66％，欧洲越橘提取物-0.18％，山茶提取物-0.30％，赋形剂：蜂蜜-29.0％，水-1.76％，黄原胶0.1％，填充于50ml管中以用于褥疮上的局部应用。

7.甘油-99.16％，欧洲越橘提取物-0.18％，柠檬酸qsppH值为4.5；赋形剂：水-0.66％，填充在10毫升具有插管的管中以用于治疗阴道干燥和感染。

8.甘油-72.06％，葡萄种子提取物-0.18％。赋形剂：蜂蜜27.0％，水-0.66％，黄原胶0.10％，填充于100ml管中以用于皮肤损伤上的局部应用。

9，甘油-76.166％，山茶提取物-0.24％，葡萄种子提取物-0.36％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.20％。赋形剂：蜂蜜-20.0％，水-2.934％，黄原胶0.10％，填充于6毫升PET管中以用于冷疱(唇疱疹)病变的局部应用。

10.甘油-97.48％，大果越橘提取物-0.18％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.36％，柠檬酸qsppH值为4.5；赋形剂：水-1.98％，填充于10ml具有套管的管以用于治疗生殖器疱疹和细菌性阴道炎的阴道应用。

11.甘油-76.42％，大果越橘提取物-0.12％，山茶提取物-0.48％，葡萄种子提取物-0.36％；赋形剂：蜂蜜-19.0％，水-3.52％，填充于50ml管中以用于牛皮癣，湿疹和皮炎损害上的局部应用。

12.山梨糖醇-94.7％，大果越橘提取物-2.1％，儿茶3.2％，填充于20ml管中以用于静脉腿溃疡上的局部应用。

13.甘油-90.60％，大果越橘提取物-1.30％，白柳-5.0％；赋形剂：水-3.10％，填充在50ml管中以用于对糖尿病溃疡的局部应用。

14.山梨糖醇-74.265％，葡萄种子提取物-0.48％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.32％；赋形剂：蜂蜜-12.0％，水-12.935％，填充于塑料100毫升容器中以用于皮肤灼伤上的局部应用。

15.山梨糖醇-73.94％，葡萄种子提取物-0.48％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.32％，大豆种子提取物0.07；赋形剂：蜂蜜-12.0％，水-13.19％，填充于10ml的注射器以用于慢性伤口的局部应用。

16.山梨糖醇-32.488％，大果越橘提取物-0.12％，欧洲越橘提取物-0.12％，山茶提取物-0.22％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.10％；赋形剂：水-66.952％，填充于50ml喷雾剂中以用于咽喉应用来治疗流感。

17.木糖醇-68.66％，欧洲越橘提取物-0.18％，山茶提取物-0.30％，赋形剂：蜂蜜-29.0％，水-1.76％，黄原胶0.1％，填充于100ml管中以用于治疗慢性干燥溃疡。

18.甘油-95％，欧洲越橘提取物-5.0％，柠檬酸qsppH为4.5，填充于4毫升胚珠中以用于阴道引进以治疗细菌性阴道病。

19.甘油-50％，木糖醇-20％，葡萄种子提取物-1.0％。赋形剂：蜂蜜28.8％，黄原胶0.20％，用来浸泡聚酯绷带以用于对慢性伤口的应用。

20.1克包含400mg葡萄的提取物，350mg大果越橘，100毫克欧洲越橘和150毫克粉状大米淀粉的植物鞣质的制剂喷洒在4×5厘米棉纱布。第一纯甘油施加在损伤表面上(6mL在慢性疮(溃疡)的10平方厘米(cm²)表面上)和伤口表面被绷带封闭覆盖，所述喷洒的鞣质部被引导朝向伤口表面。

21.5×5厘米棉非粘性纱布型敷料浸泡在含有甘油(82％)，0.5％的S.nigra(欧洲接骨木)植物提取物和17.5％％蜂蜜的溶液中，并包装在铝袋中。纱布直接局部用于损伤的表面。

22.甘油-76.0％，山茶提取物-0.5％，葡萄种子提取物-0.5％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.5％。赋形剂：蜂蜜-22.5％混合在水凝胶中和固定在交联的聚合物表面(每10cm²聚合物表面10克)上以用于褥疮，糖尿病性溃疡和静脉腿溃疡(venouslegulcer)的局部应用。

23.甘油-97.48％，大果越橘提取物-2.10％，S.nigra(欧洲接骨木)果实提取物-0.42％，吸附在柔性氧化锌纳米复合绷带上作为伤口愈合敷料以用于慢性褥疮和糖尿病性溃疡。

24.甘油-68.66％，Aritan-A7-0.18％，白蜡树-0.30％，赋形剂：蜂蜜-29.0％，水-1.76％，黄原胶0.1％，填充在50ml管中以用于对褥疮的局部应用。

25.甘油-99.16％，黑果醋栗提取物-0.18％，柠檬酸qsppH4.5；赋形剂：水-0.66％，填充在10ml具有插管的管以用于阴道干燥和感染的治疗。

26.甘油-72.06％，银杏根提取物-0.18％，BlancotanSH20.20％，赋形剂：蜂蜜27.0％，水-0.46％。黄原胶0.10％，填充在100ml管中以用于皮肤损伤上的局部应用。

27.甘油99.5％，LedosolCRP粉0.5％，填充于50ml罐中以用于对牛皮癣，湿疹和皮炎损害的局部应用。

28.甘油30％，蜂蜜69.5％，白蜡树干燥提取物0.50％，填充于50ml容器中以用于咽喉表面的局部应用以治疗病毒咽喉和窦感染。

实施例6：冷冻保存实验；甘油与成膜剂甘油比较研究

本研究的目的是比较单独的或与能够在活组织表面上形成甘油膜的鞣质或聚合物组合的甘油的保护作用，并评价对细胞生存所得的影响。

所用的活细胞和组织：

血管人平滑肌细胞(SMC)，皮肤成纤维细胞，大鼠肾上皮细胞，MDBK和MDCK细胞系的原代培养生长于25平方厘米塑料组织培养烧瓶中。用胰蛋白酶-EDTA溶液分散细胞，用培养基洗涤，并制备含有1x10⁷细胞/ml的细胞悬浮液。也将人血淋巴细胞悬浮液制备成非粘附细胞的样品。同样地，被收集用于医院的鲜活人类皮肤样品被切成1平方厘米片，各皮肤样品的两片被冷冻保存在如下面给出的不同的培养基中。

四个冷冻培养基在DMEM(Dubelco极限必需培养基)中制备，含有以下的任一个：(1)5％DMSO，10％FCS和培养基qsp百毫升；(2)2％DMSO+10％血清和培养基qsp100毫升；(3)甘油20％，FCS10％，2％DMSO和培养基qsp100毫升；或(4)甘油20％植物PCD1％，FCS10％，DMSO2％和培养基qsp100毫升，其被称为成膜剂甘油。培养基贮存在2℃至8℃直至使用。注意适当冷冻培养基取决于具体的细胞系。

细胞悬浮液以约100-200×g离心5至10分钟，并倾析上清液而不干扰细胞沉淀。以每毫升1×10⁸细胞的密度将细胞沉淀重新悬浮在冷的冷冻培养基中。将细胞悬浮液的等分试样分配到致冷储存小瓶中并冷冻在受控速率冷冻装置中，降低温度每分钟约1℃，至多达-70℃。组织和细胞培养小瓶然后转移至液氮容器(-196℃)，并保持6个月的时期。皮肤移植之后进行同样的技术。

为了解冻，取出安瓿并将其放置在室温下持续约1分钟，然后转移到37℃水浴中持续2-3分钟，直到完全解冻。在无菌环境中打开之前以70％的酒精擦拭安瓿。以10ml含5％FCS的DMEM稀释细胞，离心，产生沉淀，在培养基中再稀释，并使用锥虫蓝和MTT染色测定活细胞的数量。

以相似的方式处理皮肤移植物，除了移植物被切成5片，引入含有15毫升具有10％FCS的细胞生长培养基的25cm²组织培养瓶中并生长，为期10天。经过10天的培养，用胰蛋白酶-EDTA溶液分散生长移植物细胞，制备细胞悬浮液和对活细胞的数量进行计数。

结果：

活细胞培养的细胞的平均数目：(1)5％DMSO，10％FCS在培养液中＝65.2％；(2)2％DMSO+10％血清在培养基中＝62.6％；(3)20％甘油，10％FCS和2％的DMSO在培养基中＝68.4％；和(4)20％含1％植物PCD的甘油，10％FCS，2％DMSO在称为成膜剂甘油的培养基中＝91％。

活皮肤移植细胞的平均数目：(1)5％的DMSO，10％FCS在培养液中＝51.1％；(2)2％DMSO+10％血清在培养基中＝54.9％；(3)20％甘油，10％FCS和2％的DMSO在培养基中＝63.3％；和(4)20％甘油，来自大果越橘的1％植物PCD(0.5％)和黑果醋栗(0.5％)，10％FCS，2％DMSO在称为成膜剂甘油的培养基中＝83.8％。

结论：相对于单独的甘油，对于各个分散的细胞和组织移植物冷冻保存，成膜剂甘油是更有效的。

实施例7：冷冻保存剂成膜剂甘油的实例

按实施例2中详述的制备不同的制剂。百分比表示干PCD-丰富的植物提取物的重量/重量。

1.甘油20％，欧洲越橘的植物的PCD0.5％，儿茶(A.catechu)0.4％，和白柳0.1％；DMSO5.0％，胎牛血清20％，胞培养基qsp100ml用来存放分散的活细。

2.甘油20％，植物PCD1％(大果越橘0.5％和黑果醋栗0.5％)，FCS10％，DMSO2.0％在培养基qsp100％中。

3.甘油10％，葡萄种子的植物的PCD1.0％和欧洲接骨木0.5％，DMSO2.0％，胎牛血清10％，培养基qsp100ml用于在移植和运输之前存储皮肤移植物。

实施例8：单独的甘油与含有1％植物的PCD组合的甘油如实施例5中第2个(n°2)制剂(代码-Orosol)相比的体外渗透特性

在没有体内模型模仿低渗液体从口腔或阴道粘膜的渗透渗出的情况下，使用人表皮的细胞培养模型，其中包含在空气/液相中的聚碳酸酯过滤器上生长的正常人上皮细胞。在最佳条件下，多层细胞培养物，等同于粘膜表面，在聚碳酸酯支持物上获得。这种支持物放置在海绵中与限定的量的培养基接触。该培养基扩散到海绵和过滤器，并为细胞提供营养物，以及水合。在这些条件下，可将细胞培养保持存活至少一周。

为了创建粘膜干燥的实验模型，我们在细胞和海绵之间插入一个或两个额外的过滤器，从而降低了可用于细胞的液体培养基的量。在不存在水合的情况下，细胞死亡，细胞死亡率可以用活体染料MTT测定。细胞死亡率是与培养物表面干燥成正比。

如果一种渗透性的活性，高渗溶液施加于暴露至干燥的表皮表面，由于渗透培养基被吸引到表皮，并增加可用于细胞的培养基的量。因此细胞存活正比于渗透和细胞水合的程度。

本研究的目的是评估成膜剂甘油相比于常规甘油的水合性能。产品施用至正常的(没有过滤器)，稍有脱水(1个过滤器)或严重脱水的(2个额外的过滤器)的表皮(20微升)表面上，并在37℃-5％CO₂培养细胞一周。通过在第1，3和5天在培养基中搅拌培养物20秒洗涤各表皮，并在第7天用MTT染色测定细胞生存力。

1周培养后的细胞存活平均得分如下：

1.一般加湿培养物(无过滤器)：100％

2.没有产品的部分脱水对照：43.11％

3.没有产品的严重脱水的培养物：11.57％

4.具有甘油的部分脱水培养物：62.3％

5.具有甘油的严重脱水的培养物：43.15％

6.具有成膜剂甘油的部分脱水培养物：89.46％

7.具有成膜剂甘油的严重脱水的培养物：77.89％

结论：与正常甘油相比，成膜剂甘油在表皮的表面上保持一段较长的时间，具有较高的渗透作用，并保护细胞免受脱水。

实施例9：成膜剂相比正常甘油的大鼠体内伤口愈合性能

实验病变诱导的方法：

大鼠背部皮肤被剃光，和采用取皮机在下皮制成3个圆形病变，0.8毫米的直径和深度。0.2ml的每种测试产品施用到每个病变，连续7天。每天对病变直径进行测定，和对平均值进行了比较。

测试产品：

第1组：蒸馏水；第2组：单独的甘油；第3组：如实施例N°6所示的成膜剂甘油(10只大鼠每组)。

结果：

在蒸馏水组中平均病变(损伤(lesion))大小(在7天期间的直径/天/病变)＝3.32平方厘米；甘油组中平均病变大小＝2.95平方厘米，在成膜剂甘油组中平均病变大小＝2.03平方厘米。

结论：

虽然单独的甘油的确加速愈合，采用成膜剂甘油的愈合率是快得多的。

甘油和鞣质制剂的稳定性：

进行了研究，以评估在30℃±2℃和40℃±2℃储存超过36个月的实施例引述的制剂的稳定性。所述制剂在36个月的最低期限是稳定的。

内容物-容器相互作用：

实施例中列举的制剂填充入塑料(PE，PET)管和铝容器，以规则的间隔对所述内容物进行了分析，以评估所述内容物和容器之间的任何相互作用。刚制备后和储存在37℃下12个月后样品的红外分光光度法分析表明，内容物和容器之间不存在任何相互作用。

在使用中的稳定性：

在使用期间研究了实施例中列举的组合物的样品的分解或污染。获得的结果验证了产物在使用中的稳定性持续1-3个月。

毒性：

根据NF-ISO10993标准评估成膜剂甘油的细胞毒性，表明该产品在L929细胞的培养基中高达5％的浓度时没有细胞毒性。

过敏症：

根据美国食品药品管理局良好实验室规范(GLP)规例(21CFR，第58部分，2005年4月1日)和经合组织的良好实验室规范，通过理事会1997年11月26日决策采用的参考ENV/MC/CHEM(98)17的要求，采用制剂N°2，3，5的实施例，进行这项研究。

将产物注入皮内，以及直接通过贴剂局部应用在剃毛的G.猪皮上，以评估局部反应和迟发型超敏反应。为了比较，用0.9％NaCl溶液通过皮内注射该溶液和通过局部应用进行相同的阴性对照试验。该产品通过皮内注射致敏皮肤，但局部应用没有引起过敏。

在体内经口毒性：

成膜剂甘油的样品如实施例N°2，7，8和20被给予大鼠，采用5克/千克体重的剂量。这项研究是根据GLP规范进行的。在不存在任何异常的情况下，在高于5克/千克对于所有测试的产品估计急性致死量。

局部刺激：

是使用测试产品组合物N°2，7，9，10和12的实施例，根据1982年2月21日发表在法兰西共和国的官方杂志的皮肤和体外BCOP眼刺激试验的方案，进行该研究。原发性皮肤刺激指数低于0.50和产品被分类为是对皮肤无刺激性的。对于所有的产品，平均牛角膜不透明度指数介于10和25之间，因此该产物被分类为对眼睛具有微刺激性。

实施例11：临床疗效

按照在文本给出组合物的实施例制备不同制剂，在患有皮肤或粘膜病状的患者中评价组合物的临床疗效。研究的总结如下。

研究1：单独的甘油与成膜剂(实施例5的制剂N°11被称为VB-DERM)用于牛皮癣，湿疹和皮炎的治疗的疗效。

对患有牛皮癣，湿疹及皮炎(PED)的皮肤病变(损伤)的107例患者进行为期6周的长，单盲试验，其中组合物如制剂N°11如实施例5与单独的甘油比较的对因牛皮癣，湿疹或皮炎(PED)导致的皮肤病变(损伤)的治疗的临床疗效。56例患者采用成膜剂甘油制剂VB-DERM治疗(成膜剂甘油组)和51例患者采用单独的甘油治疗(对照组)。将产物局部应用，每天两次，为期6周。在第0，1，2，4和6周评价损害(病变)，采用0至4的等级。

所有在整个研究中，成膜剂甘油制剂(VB-DERM)功效对银屑病，湿疹，和皮炎的非常积极的结果已被观察到。

分析在6周的跨度在规则的时间间隔记录的分数，其明确证明了，成膜剂甘油与单独的甘油相比是更为有效地用于PED病变的治疗(图3，4和6)。成膜剂甘油的伤口清洁和愈合疗效在治疗与这些疾病相关的全部症状中统计学显著(p<0.005)：红斑&瘙痒，水肿，干燥，渗出，脱皮和结痂，和瘙痒。恰从开始治疗后第二周，通过研究者和患者所评定的生活质量也显著改善(图5)。

这些结果表明，成膜剂甘油在PED病变的表面上保持长得多的时间期间，从而保持损伤清洁以至于没有所有的游离污染物(死细胞，细胞碎片，蛋白水解酶，基质金属蛋白酶(MMP)，细胞因子，白介素，干扰素，病毒，细菌，灰尘颗粒)和恢复正常的皮肤细胞的生产。因此相对于非成膜剂甘油，成膜剂甘油在治疗皮肤疾病中具有更高活性，所述皮肤疾病累及皮肤过度增长，病变中存在污染物，在损伤部位的多个自由浮动的杂质如死细胞，细胞因子，基质金属蛋白酶，以及其他的蛋白质分子的参与。这些污染物从病变永久移除，从而为正常皮肤生长创造有利的环境。

研究2：单独的甘油和成膜剂甘油(组成如实施例5制剂N°10(HG-VB))用于治疗生殖器疱疹的治疗疗效

一个开放标签，单臂，前瞻性，多中心，中试研究被进行以评估成膜剂甘油(HG-VB)，相比于正常标准甘油，在患生殖器疱疹感染女性中的效果。

60名有生殖器疱疹可见病变的女性采用HG-VB(每天10毫升)治疗，连续14天。产物每日施用到阴道腔内，和在第1(2小时)，4，7，和14天和治疗前对生殖器疱疹的症状进行评价。还收集来自生殖器病变的涂片以使用Tzanck测试评价负荷病毒的多核巨细胞的数目。在相同的临床条件下只采用甘油对20名女性进行治疗。

结果：观察到，与用单独甘油治疗相比，第一次应用HG-VB的2小时之后，在阴道瘙痒，发红，疼痛，干燥，出脓，水疱的存在方面有统计学显著降低，以及阴道pH值的正常化。这项研究的结果清楚地证明，成膜剂甘油历时6-8小时持续从阴道腔的内部分排出低渗液体并清除所有的污染物，与之形成相对的是，单独甘油具有较短的作用持续时间(0.5至1h)。

研究3：单独的甘油和成膜剂甘油(甘油与PCD-丰富的植物提取物相组合如实施例5的制剂N°9(HL-VB))在消除唇疱疹损害(病变)表面上存在的游离病毒颗粒的功效

在具有开放式唇疱疹病变的60例患者中进行一个开放标签，单臂，前瞻性，多中心，中试研究。通过施加几滴以下所述产品采用正常的甘油治疗30例患者和采用HL-VB治疗30例患者，每组中相同，每天两次，持续连续14天的最长期限。对唇病变涂片进行收集并且通过使用Tzank测试量化每个病变中多核病毒感染的巨细胞的数量来测量平均病毒浓度，并且在这两个组中确定游离的病毒颗粒的平均量。

在甘油治疗组中游离的病毒颗粒的平均量为>750，635(±17.51)，542(±22.35)，和522(±13.50)，与之相比的是，在第1，4，7和14天分别为465(±10.8)，359(±6.35)，226(±10.22)，和0.0。这些结果表明，与单独的甘油相比，HL-VB，即含有PCD的甘油或成膜剂甘油在更长的时间期间内发挥其效果。

研究4：单独的甘油及与PCD丰富的植物提取物组合的甘油，称为成膜剂甘油(组成如实施例5的制剂N°5(G-PCD))在打开患鼻窦炎的患者中封闭窦开口的细菌生物膜中的功效

在鼻窦感染的急性症状的患者中进行G-PCD的21天对照临床试验，G-PCD与单独的甘油比较。

本研究的目的是评估G-PCD溶液(32％甘油，1％植物PCD在水中)如实施例N°5的窦开口的功效，所述G-PCD溶液与单独的甘油(32％甘油在水中)相比。在127例急性和慢性鼻窦炎患者中109例被选以进行研究。58例患者采用G-PCD治疗和51例患者采用甘油治疗。产品(在每个治疗应用中3个)作为喷雾剂被给予，每日2-3次，持续21天的最长期限。

研究的参数为：1.对鼻充血和流鼻水的影响；2.对在鼻窦表面周围的压疼的影响；3.在窦感染方面患者的总体状况；和4.对抗生素治疗的影响。30分钟，3天，7天后结果的记录，相比于甘油组，针对以下疾病G-PCD组中表现出显著更大症状减少：鼻充血(-31.02％，-57.23％和-73.79％，与之相比的是-20.40％，-19.09％和-30.25％)，窦性疼痛(-6.91％，-79.02％和-85.18％，与之相比的是-1.69％，-8.36％和-53.36％)，和整体鼻窦炎病况(-4.15％，-69.84％和-79.89％，与之相比的是-22.56％，+3.52％和-17.62％)(图7)。在第一次产物施用后30分钟内，G-PCD组中流鼻水的强度增加高达164.79％，与之相比的是，甘油组中只有31.71％。这些结果表明，在相同条件下与甘油相比，G-PCD施加非常高的渗透压，导致生物膜的破裂和窦的开口。G-PCD组中只有21％的患者需要抗生素治疗的时间是平均7.41天，与之相比的是，甘油组中40％的患者需要抗生素治疗的时间是10.5天(图8)

这些结果清楚地表明，与标准甘油溶液相比，成膜剂甘油在鼻粘膜表面保持更长时间期间。

研究5：单独的甘油与含1％植物PCD的甘油(成膜剂甘油组成如实施例5制剂N°2(Orosol))比较的在口腔黏膜炎病变上的比较成膜性和渗透性能

化学疗法和放疗引起的口腔粘膜炎病变显示出高度受损的口腔粘膜，在病变中有感染和毒性化学药品的存在。这导致严重的疼痛，烧灼感，和进食困难。在研究中登记的69例患者中，采用Orosol溶液治疗48例和采用甘油作为喷雾剂治疗21例。产物每天施用4-5次，为期28天。治疗前，第一次产品的应用后30分钟，和在第1，2，3，4，7，14，21和28天对总粘膜炎的等级，疼痛的强度和烧灼感，新溃疡的形成和对进食障碍(病损)的影响进行了评估。与甘油组相比，在Orosol组中观察到，在粘膜炎愈合中的统计学显著差异(图9)。与对照组中的单独的甘油相比，Orosol活性的持续时间长近3倍的时间，在治疗效果中成比例地增加。成膜剂甘油在长得多的一段时间内吸引了低渗液体，清洁病损，并有助于促进康复。

这5个临床研究的结果证明：

1.与单独甘油相比，含有植物PCD的甘油在损伤的表面和粘膜上形成了持久高度渗透膜。

2.受损表面上的清洁效果与渗透甘油膜滞留在损伤上的持续时间成正比。

3.由于渗透活性膜的非药理学的机械性能，不管污染物的性质如何，低渗液体的渗透压渗出消除了所有的自由浮动的污染物。

4.含有PCD的成膜剂甘油是安全的，无刺激性。

Claims (15)

1.一种用于局部应用的制剂，其包含甘油和植物鞣质，其中所述植物鞣质具有结合甘油，使得甘油具有成膜剂性质的能力。

2.权利要求1的制剂，其中所述植物鞣质是选自原花色素。

3.权利要求2的制剂，其中原花色素是从植物的部分或整株植物获得，所述植物选自欧洲越橘，大果越橘，葡萄，欧洲接骨木，山茶，大豆，儿茶，白蜡树，银杏，黑果醋栗，艾菊属银胶菊属，白柳，鼠尾草，迷迭香，仙人掌属，桑，悬钩子属，栎属，松属，大黄素，以及它们的组合。

4.权利要求2的制剂，其中原花色素是从植物的部分，或整株植物获得的，所述植物选自欧洲越橘，大果越橘，葡萄，欧洲接骨木，山茶，大豆，和它们的组合。

5.权利要求2的制剂，其中原花色素是合成的。

6.权利要求1至5的制剂，其中在制剂中甘油含量占30％至99.99％(v/v)。

7.权利要求1至6的制剂，其进一步包含活性成分。

8.权利要求7的制剂，其中所述活性成分选自药物，抗生素，防腐剂，营养素，抗体，生长因子或蛋白质。

9.权利要求1至8的制剂用于治疗皮肤和粘膜感染的用途。

10.权利要求1至8的制剂用于保护，运输，储存或冷冻细胞，组织或器官的用途。

11.权利要求10的用途，其中成膜剂甘油在最终溶液中的净浓度在2-50％之间(v/v)，优选10-30％(v/v)，更优选15-20％(v/v)之间变化。

12.通过以下增强生物表面保留甘油膜的持续时间的方法：制备甘油和具有结合甘油分子的能力的植物鞣质的溶液，以及将所述溶液应用至生物表面。

13.治疗皮肤和粘膜感染的方法，包括应用权利要求1至8中任一项的制剂在受影响的区域上的步骤。

14.制备成膜剂甘油的方法，包括混合甘油或具有结合甘油的植物鞣质的多元醇溶液。

15.权利要求14的方法，其中所述植物鞣质作为粉末或液体被添加。