CN105377022B

CN105377022B - 没有辛辣味且没有催泪成分生成的洋葱

Info

Publication number: CN105377022B
Application number: CN201480024690.2A
Authority: CN
Inventors: 加藤雅博; 正野仁慈; 正村典也; 今井真介; 镰田庸宏
Original assignee: House Foods Group Inc
Current assignee: House Foods Group Inc
Priority date: 2013-05-01
Filing date: 2014-05-01
Publication date: 2018-01-12
Anticipated expiration: 2034-05-01
Also published as: JPWO2014178420A1; DK2992756T3; WO2014178420A1; US10271500B2; EP2992756A1; EP2992756A4; NZ713186A; HK1222296A1; EP2992756B1; JP5671657B1; US20160073607A1; PT2992756T; CN105377022A; PL2992756T3; TR201820127T4; ES2699989T3

Abstract

本发明的目的在于提供辛辣味极弱或者完全感觉不到的洋葱及其制造方法。一种洋葱，其特征在于，蒜氨酸酶基因的表达被抑制。

Description

没有辛辣味且没有催泪成分生成的洋葱

技术领域

本发明涉及辛辣味和催泪性极弱或者完全感觉不到的洋葱及其制造方法。

背景技术

近年，提供小孩也容易食用的蔬菜或由健康志向的消费者发起的摄取生蔬菜的风潮正在扩大，满足该要求成为蔬菜品种改良的一个潮流。但是，由于葱属植物，特别是洋葱由于特有的辛辣味，成为生吃困难的蔬菜。

已阐明属于洋葱的辛辣成分和催泪成分的催泪因子(lachrymatory factor)(LF)是以伴随生洋葱组织的切断或破碎而进行的下述反应机理生成的(非专利文献1)。

即，伴随调制或加工而引起洋葱细胞破碎时，作为底物的trans-1-propenylcysteine sulfoxide(PRENCSO)在蒜氨酸酶的作用下产生分解，由一分子的PRENCSO分别生成一分子的次磺酸(1-propenyl sulfenic acid)、丙酮酸、氨。接下来，生成的次磺酸在催泪因子合成酶(LFS)的作用下，变为也是辛辣成分的催泪因子(LF、propanethial-S-oxide)。

作为辛辣味弱的洋葱，在日本国内有被称为“新洋葱”的极早熟的品种。极早熟品种的洋葱，其特征在于，水分量多，干重少。由于该特征，PRENCSO浓度变低，生成的辛辣成分(催泪因子)量变少。但是，尽管极早熟品种的洋葱的辛辣味弱，但是并不是完全没有辛辣味，生吃时需要水浸。因此，存在不仅需要水浸的调制操作，而且由于水浸而营养成分流出的问题。此外该品种还存在储藏性差，仅能在有限的时期内提供的问题。

此外，作为生产辛辣味弱的品种的方法，也可以采取调整施肥，降低成为辛辣味来源的底物量的方法。但是，即使使用该方法，底物也并非完全没有，通常在生吃时辛辣味并没有变弱到感觉不到辛辣味的程度。

另外，目前为止开发·报告了辛辣味少的洋葱。专利文献1公开了辛辣味少的长日照洋葱，且示出了该洋葱组织破碎时的丙酮酸生成量为3.0～5.5μmol/g FW。此外，专利文献2也公开了辛辣味少的长日照洋葱，且示出了该洋葱组织破碎时的丙酮酸生成量为2.5～5.5μmol/g FW。但是，虽然这些洋葱的辛辣味的确弱，但是并非完全没有辛辣味，生吃时需要水浸。

因此，在该领域中仍然需求辛辣味和催泪性极弱或者完全感觉不到的洋葱。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特表2009-501528号公报

专利文献2:日本特表2011-510618号公报

非专利文献

非专利文献1:Imai S et al.；An onion enzyme that makes the eyeswater.Nature,419,685(2002).

发明内容

本发明的目的在于提供辛辣味和催泪性极弱或者完全感觉不到的洋葱及其制造方法。

本发明人等为了解决上述课题进行深入研究，结果发现通过抑制洋葱细胞中的蒜氨酸酶基因的表达，得到辛辣味和催泪性极弱或者完全感觉不到的洋葱，从而完成本发明。

即，本发明具有以下特征。

[1]洋葱植物体或其后代、或者其部分，其特征在于，蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制。

[2]根据[1]的洋葱植物体或其后代、或者其部分，其中，洋葱细胞破碎时的辛辣成分和催泪成分的生成与以往品种相比降低。

[3]根据[1]或者[2]的洋葱植物体或其后代、或者其部分，其中，蒜氨酸酶基因含有编码以下(a)-(c)的多肽的碱基序列:

(a)含有序列编号5所示的氨基酸序列的多肽；

(b)含有在序列编号5所示的氨基酸序列中具有一个或者多个的氨基酸的缺失、置换、插入和/或追加的氨基酸序列，且具有蒜氨酸酶活性的多肽；

(c)含有与序列编号5所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列，且具有蒜氨酸酶活性的多肽。

[4]洋葱植物体或者其部分的制造方法，其特征在于，该洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制，该制造方法包括以下工序:

(i)对洋葱种子进行突变诱导处理的工序，

(ii)栽培突变诱导处理了的洋葱种子而得到洋葱植物体或者其部分的工序，以及

(iii)从得到的洋葱植物体或者其部分，选拔显示以下的一个或多个特性的洋葱植物体或者其部分的工序:

a)洋葱细胞破碎时的辛辣成分和催泪成分的生成与以往品种相比降低；

b)蒜氨酸酶基因或者蛋白质的表达与以往品种相比被抑制；

c)洋葱细胞破碎时的丙酮酸的生成与以往品种相比降低；

d)洋葱细胞破碎后的残存PRENCSO量与以往品种相比多；以及

e)洋葱细胞破碎时的催泪因子(LF)的生成与以往品种相比降低。

[5]根据[4]的方法，其中，工序(iii)包括选拔至少显示特性b)的洋葱植物体或者其部分的工序。

[6]根据[4]的方法，其中，进一步包括以下工序(iv)，即重复进行一次或多次对选拔的洋葱植物体进行自体繁殖交配并将得到的洋葱植物体或者其部分付诸于工序(iii)的工序。

[7]根据[1]的洋葱植物体或其后代、或者其部分，其中，洋葱植物体的部分是以NCIMB 42219进行国际保藏的种子。

[8]根据[1]的洋葱植物体或其后代、或者其部分，其中，洋葱植物体的部分是以FERM BP-22260进行国际保藏的愈合组织。

[9]洋葱植物体或者其部分，其特征在于，蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制，是通过包括以下工序的方法而制造得到的，

(i)对洋葱种子进行突变诱导处理的工序，

(ii)栽培突变诱导处理了的洋葱种子，得到洋葱植物体或者其部分的工序，以及

b)蒜氨酸酶基因或者蛋白质的表达与以往品种相比被抑制；

c)洋葱细胞破碎时的丙酮酸的生成与以往品种相比降低；

d)洋葱细胞破碎后的残存PRENCSO量与以往品种相比多；以及

[10]根据[9]的洋葱植物体或者其部分，其中，工序(iii)包括选拔至少显示特性b)的洋葱植物体或者其部分的工序。

[11]根据[9]的洋葱植物体或者其部分，所述方法进一步包括以下工序(iv)，即重复进行一次或多次对选拔的洋葱植物体进行自体繁殖交配并将得到的洋葱付诸于工序(iii)的工序。

[12]洋葱植物体或者其部分的制造方法，其特征在于，该洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制，该制造方法包括将以蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制为特征的第一洋葱植物体与第二洋葱植物体进行交配。

[13]洋葱植物体或者其部分，其特征在于，蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制，是通过以下方法而制造得到的，该方法包括将以蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制为特征的第一洋葱植物体与第二洋葱植物体进行交配。

[14]洋葱植物体或其后代、或者其部分，其特征在于，是由以蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制为特征的洋葱植物体的部分而得到的。

[15]根据[14]的洋葱植物体或其后代、或者其部分，其中，是由以蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制为特征的洋葱植物体的种子或者愈合组织而得到的。

[16]根据[15]的洋葱植物体或其后代、或者其部分，其中，种子是以NCIMB 42219进行国际保藏的种子。

[17]根据[15]的洋葱植物体或其后代、或者其部分，其中，愈合组织是以FERM BP-22260进行国际保藏的愈合组织。

[18]测定洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达量来评价该洋葱植物体或者其部分的辛辣味的方法。

[19]与以往品种相比辛辣成分和催泪成分的生成降低了的洋葱植物体或者其部分的选择方法，其特征在于，包括测定洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达量，选择该基因的表达与以往品种相比被抑制的洋葱植物体或者其部分。

本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国特许出愿2013-096551号说明书和/或附图记载的内容。

根据本发明，能够提供辛辣味和催泪性极弱或者完全感觉不到的洋葱及其制造方法。

附图说明

图1是表示从洋葱球采取分析试样的方法的简图。

图2表示M4洋葱球的组织破碎时的丙酮酸生成量的测定结果。

图3表示M4洋葱球的组织破碎3小时后的PRENCSO残存量的测定结果。

图4表示M4洋葱球的组织破碎时的催泪成分(LF)生成量的测定结果。

图5表示M4洋葱球的蒜氨酸酶蛋白质表达量的测定结果。

图6表示M4洋葱球的蒜氨酸酶基因表达量的测定结果。

图7表示M4洋葱球的组织破碎时添加蒜氨酸酶时的催泪成分(LF)生成量的测定结果。

图8是表示由洋葱球取出的中心部的幼芽部分(含有圆盘茎的萌芽叶部分)的照片图。

图9是表示将愈合组织通过再分化培养基培养得到的培养物的照片图。箭头表示培养物中发现的滑面状的结构体。

图10是表示由愈合组织再分化得到的植物体的照片图。

图11表示#6系统的洋葱球与对照的洋葱球中的蒜氨酸酶基因的表达解析和注释结果。

图12表示在#6系统的洋葱球中表达显著被抑制的蒜氨酸酶基因编码的氨基酸序列。

具体实施方式

1.本发明的洋葱

本发明的洋葱，其特征在于，蒜氨酸酶基因的表达被抑制。

本发明中“洋葱植物体”，只要没有特别说明，是指洋葱植物体以及该植物体的部分。作为“植物体的部分”，只要没有特别说明，是指洋葱的种子、球、鳞茎、叶、茎、芽、花、花药、花粉、胚珠、以及来源于这些的细胞或组织、原生质体和愈合组织。洋葱的种子中包括以NCIMB42219进行国际保藏的种子，洋葱的愈合组织中包括以FERM BP-22260进行国际保藏的愈合组织。应予说明，本说明书中，洋葱球或者洋葱鳞茎有时简称为“洋葱”，这些术语可以相互互换使用。

此外，本发明中，洋葱植物体的“后代”是指，利用有性生殖和/或无性生殖，具有使用本发明的洋葱植物体或者其部分进行制造的过程的洋葱植物体，是指具有蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制这一特征的洋葱植物体。

本发明的洋葱植物体及其后代，可以按照使用的品种的常见栽培方法进行栽培，可以种子繁殖。应予说明，已知常见植物中，由其组织的一部分，能够诱导愈合组织。而且，这样诱导的愈合组织，通过调节培养的培养基组成和培养条件，容易再分化，能够再生成与由种子发育的情况在性质上没有差异的植物体。该性质当然也适用于洋葱，在来自于由球的生长点或花粉、胚珠、花药、幼芽等制作的愈合组织的基础上，能够进行植物体的再分化，这样再分化的植物体或从该植物体得到的种子具有与由种子发育而来的植物体或由该植物体得到的种子相同的性质。

本发明中“洋葱细胞”是指洋葱植物体、优选为洋葱球或者洋葱鳞茎中含有的细胞。

本发明中“蒜氨酸酶基因”，只要没有特别说明，是指包含一个或多个的单核苷酸多态性(SNP)的多个蒜氨酸酶基因的总称。

优选本发明中“蒜氨酸酶基因”是主要参与辛辣成分和催泪成分的生成的特定的蒜氨酸酶基因。对于这样的特定的蒜氨酸酶基因而言，使用由下述的感官评价、丙酮酸生成量、残存PRENCSO量和LF生成量构成的一个或多个评价和测定方法，选拔辛辣成分和催泪成分的生成降低了的洋葱(工序1)；将选拔的洋葱、和品种与该洋葱相同且具有辛辣味的洋葱作为对照，通过下述实施例7详述的方法，对于各自的表达基因使用下一代测序仪进行全面解析，提取在两者间表达量有差异的基因序列(工序2)；提取的基因序列中，发现在选拔的洋葱中表达以显著差异水平被抑制而在对照的洋葱中确认表达的蒜氨酸酶基因时，将其确定为上述特定的蒜氨酸酶基因(工序3)。该特定的蒜氨酸酶基因的表达量，例如，选拔的洋葱:对照的洋葱为1:50以上，优选为1:100以上，进一步优选为1:1000以上。

作为这样的特定的蒜氨酸酶基因，含有编码以下(a)-(c)的多肽的碱基序列或者由该碱基序列构成:

(a)含有序列编号5所示的氨基酸序列或者由该氨基酸序列构成的多肽；

(b)含有在序列编号5所示的氨基酸序列中具有一个或者多个氨基酸的缺失、置换、插入和/或追加的氨基酸序列或者由该氨基酸序列构成，且具有蒜氨酸酶活性的多肽；

(c)含有与序列编号5所示的氨基酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或者99％以上的同源性的氨基酸序列或者由该氨基酸序列构成，且具有蒜氨酸酶活性的多肽。

其中，“多个”是指10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或者2个。此外，氨基酸序列的比较，可以利用公知的方法进行，例如，可例举BLAST(Basic Local Alignment SearchTool at the National Center for Biological Information(美国国家生物技术信息中心的碱基局部对准检索工具))等，可以使用默认的设定实施。而且，“蒜氨酸酶活性”，是指分解PRENCSO，生成次磺酸、丙酮酸和氨的活性。蒜氨酸酶活性能够使用下述实施例详述的方法测定，分解PRENCSO生成的物质、或者由该物质进一步生成的物质(次磺酸在LFS的作用下变为LF)可以通过利用HPLC的检测·测定进行。

应予说明，将序列编号5所示的氨基酸序列作为查询序列，使用NCBI的ProteinBlast(参数使用默认)检索，结果表明序列编号5与Accession编号AAA32639.1、AAA92463.1、AAD26853.1分别具有99.8％(478a.a./479a.a.)、99.8％(478a.a./479a.a.)、98.7％(473a.a./479a.a.)的高的相同性。

本发明中“蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制”是指，洋葱细胞中的蒜氨酸酶基因的表达水平，与以往品种的洋葱细胞中的蒜氨酸酶基因的表达水平相比显著低，例如小于50分之1、小于100分之1、小于200分之1、小于300分之1、小于400分之1、小于500分之1、小于600分之1、小于700分之1、小于800分之1、小于900分之1、小于1000分之1、小于2000分之1、小于3000分之1、小于4000分之1、小于5000分之1、小于6000分之1、小于7000分之1、小于8000分之1、小于9000分之1、小于10000分之1、或者在其以下。该基因的表达可以不缺失，也可以缺失。

本说明书中“以往品种”，可列举洋葱细胞破碎时感觉到辛辣味和催泪性的常见的洋葱，例如，可举出现有的常见的春季播种栽培洋葱(例如，超北枫(スーパー北もみじ)、北枫2000(北もみじ2000)、北枫(北もみじ)、札幌黄、Paul Star、Tsukihikari、北见黄、月光22号、Okhotsk(オホーツク)等)、秋季播种栽培洋葱(例如、大阪丸、泉南甲高、泉州中甲黄、さつき、红叶等)，优选列举超北枫、北枫2000、札幌黄等。作为以往品种，将付诸于下述突变诱导法或基因重组方法、和育种交配前的洋葱(母株)、春季播种的洋葱(例如，超北枫、北枫2000、札幌黄等)的蒜氨酸酶基因的表达量设置为100时，可列举具有40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、或者100以上的蒜氨酸酶基因的表达量的洋葱等。以下，本说明书中“以往品种”以相同的含义使用。

本发明的洋葱，由于蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制，因此洋葱细胞破碎时，洋葱细胞含有的PRENCSO没有在蒜氨酸酶的作用下被分解/转化而残存。由此丙酮酸和次磺酸的生成量与来自以往品种的洋葱细胞破碎时的这些物质的生成量相比降低，以及LFS作用于次磺酸而得到的作为辛辣成分和催泪成分的LF的生成量，与来自以往品种的洋葱细胞破碎时的该物质的生成量相比降低。由此本发明的洋葱中，与以往品种的洋葱相比，洋葱细胞破碎时感觉到的辛辣味和催泪性极弱或者完全感觉不到。本发明的洋葱，残存PRENCSO量优选为2.0μmol/gFW以上，进一步优选为3.0μmol/gFW以上，更优选为4.0μmol/gFW以上，特别优选为5.0μmol/gFW以上。和/或，本发明的洋葱，优选丙酮酸生成量为2.0μmol/g FW以下，进一步优选为1.5μmol/g FW以下，更优选为1.0μmol/g/FW以下，特别优选为0.5μmol/g/FW以下。和/或，本发明的洋葱从洋葱细胞破碎开始约1分20秒后的LF生成量，优选为1.0×10⁶Peak area/提取液μl以下，更优选为9.0×10⁵Peak area/提取液μl以下，8.0×10⁵Peak area提取液/μl以下，7.0×10⁵Peak area/提取液μl以下，或者6.0×10⁵Peakarea/提取液μl以下，进一步优选为5.0×10⁵Peak area/提取液μl以下，4.0×10⁵Peakarea/提取液μl以下，3.0×10⁵Peak area/提取液μl以下，2.0×10⁵Peak area/提取液μl以下，或者1.0×10⁵Peak area/提取液μl以下。

本发明的洋葱，由于与以往品种的洋葱相比，洋葱细胞破碎时感觉到的辛辣味极弱或者完全感觉不到，所以即便是对洋葱的辛辣味反感的大人或小孩，不进行水浸，也能够生吃。此外，由于生吃时，不需要水浸，因此洋葱的营养成分例如作为有益健康的槲皮素不流入水中，能够有效摄取营养成分。此外，不需要水浸，使得在工业上制造切片洋葱的工场中，不需要水浸工序，也能够降低制造成本。

而且，由于本发明的洋葱不具有催泪性，能够大幅改善家庭中的调制或大规模的剥洋葱制造工场中的作业环境。

而且此外，本发明的洋葱由于辛辣味极弱或者完全感觉不到，因此能够容易调制目前为止没有使用洋葱的加工食品原料，例如，非加热蔬菜原料(切割蔬菜)、加热蔬菜原料(能够短时间调制具有甜味的炒煎洋葱)、调味料(PRENCSO是氨基酸，能够赋予料理风味)。

此外，本发明的洋葱在洋葱细胞破碎时的PRENCSO残存量与以往品种的洋葱相比显著提高。已确认PRENCSO具有健康功能性(特开2007-210918号公报)，作为功能性材料是被期待的物质。但是，以往品种的洋葱，在调制·加工的过程中，由于PRENCSO被分解/转化，所以即使食用洋葱，摄取PRENCSO也不容易。另一方面，本发明的洋葱中，由于PRENCSO没有在蒜氨酸酶的作用下被分解/转化而残存，因此，能够简便且有效地摄取PRENCSO。

2.本发明的洋葱的制造方法

本发明的洋葱，能够利用突变诱导法或基因重组方法制造。

在利用突变诱导法的方法中，能够通过将洋葱种子付诸于公知的突变诱导处理(例如，使用甲磺酸乙酯(EMS)等的化学处理、使用γ射线、X射线、重离子束等的物理处理)来进行。使用的重离子束，能够诱导突变即可没有特别限制，例如，能够使用氮离子束、碳离子束、氖离子束、氩离子束等。重离子束的射线量，可以根据使用的离子束的种类、种子的量等适当确定，将来自被照射的种子的发芽率和正常发育率作为指标，进行确定。具体而言，可以选择发芽率为约80％以上，且发芽个体中的正常发育个体率为50％以上的射线量。例如，重离子束的射线量，如果是氖离子束，可以从5～50Gray，优选为10～40Gray，进一步优选为20～30Gray的范围选择。

洋葱种子不限于特定的品种，可以利用以往品种的种子。

变异诱导处理的种子，按照常见的洋葱栽培的顺序进行栽培，结球。对得到的洋葱球，按照以下记载的评价选拔方法，能够得到蒜氨酸酶基因的表达被抑制的目标洋葱球。对这样选拔的洋葱球，进行自体繁殖交配，将得到的种子再次栽培，对从中得到的洋葱球进行评价选拔。通过重复该工序一次以上，能够得到蒜氨酸酶基因的表达稳定地被抑制的目标洋葱系统。应予说明，用于评价选拔的洋葱组织不需要是结球的洋葱球，也可以使用生长途中的叶等球以外的组织。

在利用基因重组方法的方法中，可以利用能够抑制(包括缺失)蒜氨酸酶基因表达的技术。作为这样的技术，例如，可举出蒜氨酸酶基因的破坏、和/或、蒜氨酸酶基因的表达调节区域的破坏。其中“蒜氨酸酶基因的表达调节区域”，是调节蒜氨酸酶基因表达(转录)的区域，该区域包括启动子区域和/或增强子区域。此外“破坏”，是指在蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域中导入变异，由此，缺失或者抑制蒜氨酸酶基因的表达。在蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域导入的变异，能够缺失或者抑制蒜氨酸酶基因的表达即可没有特别限制，可以通过置换、缺失、插入、和/或追加一个或多个碱基来进行。例如，可以使蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域的一部分或者全体缺失来进行。向蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域导入变异，可以通过利用同源重组方法的公知方法来进行。例如，可举出利用同源重组法的双交换等。简单来说，在用于基因导入的本领域技术人员公知的常见的载体中克隆来自作为宿主的洋葱的蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域。蒜氨酸酶基因、或者含有蒜氨酸酶基因的上游区域，可以通过基于洋葱的蒜氨酸酶基因的碱基序列信息设计·合成引物或者探针，使用该引物或者探针，筛选来自作为宿主的洋葱的cDNA文库或者基因组文库而得到。作为载体，只要是作为植物转化用而常见的公知的载体即可，例如，可以使用双元载体或者其他载体。双元载体含有农杆菌T-DNA的右侧边界(RB)和左侧边界(LB)的2个的约25bp边界序列，在两边界序列之间插入上述蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域。在被克隆的蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域的碱基序列中导入变异，制备含有具有变异的蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域的DNA构建物。变异的导入，例如，可以利用基于PCR法的变异导入法等。通过将该DNA构建物导入作为宿主的洋葱，DNA构建物上的具有变异的蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域和该宿主染色体上的蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域会产生同源重组，能够破坏宿主的蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域。

作为将如上述构建的载体导入作为宿主的洋葱的细胞的转化法，可以例示使用农杆菌的方法，除此以外，也可以通过基因枪、电穿孔、病毒载体、Floral Dip法、叶盘法等进行导入。关于植物的转化技术、组织培养技术，例如，记载于岛本功、冈田清孝监修、植物细胞工学系列15、模型植物的实验方案，从遗传学方法到基因组解析，秀润社(2001年)。

对于利用双元载体-农杆菌系的方法而言，准备植物细胞、愈合组织或者植物组织片，使其感染农杆菌，将具有上述变异的蒜氨酸酶基因和/或蒜氨酸酶基因的表达调节区域导入植物细胞内。转化中，可以向培养基中添加酚性化合物(乙酰丁香酮)，特别是单子叶植物中，该细胞能够有效进行转化。

更具体地，制备农杆菌的菌液，在该菌液中浸渍作为宿主的洋葱的愈合组织或者组织(例如叶片、根、茎片、生长点等)数分钟，除去水分后，在固体培养基着床进行共存培养。愈合组织是植物细胞块，可以从植物组织片或者完熟种子等利用愈合组织诱导培养基进行诱导。选择被转化的愈合组织或组织片，然后，对于愈合组织，利用再分化培养基再分化为幼植物体。另一方面，对于组织片，可以从组织片诱导愈合组织而再分化为幼植物体，或者由组织片制备原生质体，经过愈合组织培养而再分化为幼植物体。将这样操作得到的幼植物体在生根后转移至土壤再生为植物体。由该植物体，利用常见的栽培方法(TanikawaT,Takagi M,Ichii M(1996)Plant regeneration from suspension cultures of onion(Allium cepa L.).Plant Tissue Cult Lett 13:259-264；Eady CC(2002)GeneticTransformation of Onions.In:Rabinowitch HD,Currah L(eds)Allium Crop Science:Recent Advances,CABI Publishing,New York,pp 119-144)，能够得到种子。

此外，使用Floral Dip法时，例如制备农杆菌的菌液，在该菌液中浸渍未成熟的花芽发育至发达的作为宿主的洋葱的花芽后，使植物保持原样发育而收获种子。播种收获的种子，选择转化的个体，通过将选择的个体转移至土壤并使其发育，能够得到基因重组的洋葱植物体。这样操作得到的洋葱植物体，按照常见的洋葱栽培顺序进行栽培，使其结球。对得到的洋葱球，利用以下记载的评价选拔方法能够得到蒜氨酸酶基因的表达被抑制的目标洋葱球。对于这样操作选拔的洋葱球，进行自体繁殖交配，将得到的种子再次栽培，对由此得到的洋葱球进行评价选拔，通过重复该工序一次以上，能够得到蒜氨酸酶基因的表达稳定地被抑制的目标洋葱系统。应予说明，用于评价选拔的洋葱组织不需要是结球的洋葱球，也可以使用生长途中的叶等球以外的组织。

3.洋葱的评价选拔方法

从利用上述方法制造的洋葱中，可以利用以下方法评价选拔蒜氨酸酶基因的表达被抑制的目标洋葱。

(分析试样的制备)

为了避免由作为分析试样而使用的部位引起的测定值或评价不同，分析试样使用以下特定的部位。分析试样如下采取:在距离洋葱球的上端1/3～1/2的高度，沿着与球的上下方向轴(通过洋葱球的底盘部和尖端部的轴)垂直的面切割为2份，从得到的上侧部分(包括尖端部的一侧)或者下侧部分(包括底盘部的一侧)的切断面中心部的鳞叶进行采取(参照图1)。“切断面中心部的鳞叶”是指切断面上出现的鳞叶中最内层的鳞叶(围绕存在于轴心的芽的鳞叶)或者其附近的鳞叶的切断面侧的表层部。“表层部”例如是距离切断面厚度为2mm～10mm的部分。基于各个测定的结果选拔植物个体时，分析试样优选来自包含植物生长点的部位以外的部分。例如洋葱球(鳞茎)的底盘部包括生长点，但是通过预先保留包含该生长点的部位，从而能使被选拔的个体从该部位再生，是有利的。

分析试样的尺寸没有特别限制，是评价或者测定方法中足够的量即可。

分析试样根据需要，可以使用微型乳棒或珠磨机进行破碎。破碎处理条件可以边观察破碎后的试样形状边确定。

(蒜氨酸酶基因或者蛋白质的表达量)

蒜氨酸酶基因的表达量可以利用用于核酸定量的公知的方法(例如、NorthernBlotting法、实时PCR法等)测定。优选利用实时PCR法。实时PCR法可以使用由分析试样根据规定方法合成的cDNA来进行。使用的引物是能够扩增蒜氨酸酶基因的配对(ペア)即可，不限制扩增区域和长度。使用的实时PCR法可以使用SYBR Green法、荧光探针法的任意一种。此外用于各试样之间的基因表达量的校正的看家基因的种类也没有特别限制，例如可以利用泛素基因。

本发明与以往品种的洋葱相比蒜氨酸酶基因的表达量少时，能够评价·选拔为蒜氨酸酶基因的表达缺失或者被抑制的目标洋葱。优选选拔利用上述方法测定的蒜氨酸酶基因的表达水平与以往品种的蒜氨酸酶基因的表达水平相比小于50分之1、小于100分之1、小于200分之1、小于300分之1、小于400分之1、小于500分之1、小于600分之1、小于700分之1、小于800分之1、小于900分之1、小于1000分之1、小于2000分之1、小于3000分之1、小于4000分之1、小于5000分之1、小于6000分之1、小于7000分之1、小于8000分之1、小于9000分之1、小于10000分之1或者其以下的洋葱。

蒜氨酸酶蛋白质的表达量可以利用用于蛋白质定量的公知方法(例如，WesternBlotting法、酶免疫测定法(ELISA)等)测定。优选利用ELISA法。ELISA法中使用的抗蒜氨酸酶抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。作为多克隆抗体可以使用未精制的抗血清，也可以使用由抗血清精制的多克隆抗体。也可以使用2种单克隆抗体进行夹心ELISA法。作为免疫的动物，可举出兔子、大鼠、山羊、鸡等。作为ELISA法中用于检测的二次抗体，可以使用结合有过氧化酶、碱性磷酸酶等能够检测的酶的二次抗体。用于ELISA法的试样使用稀释至具有定量性的浓度为止的试样。破碎分析试样，由破碎的分析试样使用水系溶剂提取，得到试样原液，将其由原液稀释1000倍，优选稀释10倍到稀释1000倍进行分析，更优选原液～稀释100倍，进一步优选原液～稀释50倍。应予说明，破碎的分析试样，可以使用刚刚破碎之后～3小时后(破碎后的经过时间没有特别限制)的试样。

本发明与以往品种的洋葱相比蒜氨酸酶蛋白质量少时，可以评价·选拔为蒜氨酸酶基因的表达缺失或者被抑制的目标洋葱。优选选拔利用上述方法测定的蒜氨酸酶蛋白质的表达量与同样测定的以往品种的洋葱中的蒜氨酸酶蛋白质量相比为30分之1以下、优选50分之1以下、进一步优选100分之1以下、500分之1以下、1000分之1以下的洋葱。

将洋葱组织的一部分或者全部破碎时，作为辛辣成分的底物的PRENCSO瞬间被蒜氨酸酶分解，生成辛辣成分的前体物质即次磺酸。因此，如上所述，基于蒜氨酸酶基因或者蛋白质的表达量评价·选拔的洋葱与常见的洋葱相比，洋葱细胞破碎时产生的辛辣味和催泪性优势地降低。因此，将蒜氨酸酶基因或者蛋白质的表达量作为指标，能够评价洋葱的辛辣味或催泪性。

本发明的洋葱，在基于上述蒜氨酸酶基因或者蛋白质的表达量进行的评价选拔基础上，可以使用基于将洋葱组织的一部份或者全部破碎时生成的辛辣味和催泪成分的生成量的以下的一个或多个评价和测定方法进行选拔。

(感官评价)

感官评价评价将分析试样的一部分破碎时感觉到的催泪性或者食用时感觉到的辛辣味的程度。本发明与以往品种的洋葱相比，至少2名专家感觉到辛辣味和/或催泪性明显降低时，可以评价·选拔为辛辣味和/或催泪性降低的洋葱。

(丙酮酸生成量)

通过测定将洋葱组织的一部分或者全部破碎时生成的丙酮酸，可以间接评价来自分析试样的洋葱的辛辣味的程度。丙酮酸的生成量，可以通过在将分析试样刚刚破碎之后～3小时后，与二硝基苯肼反应，利用分光光度计测定吸光度(515nm)来进行。分析试样使用稀释至具有定量性的浓度为止的试样，优选使用原液～稀释5倍的试样。本发明与以往品种的洋葱相比，破碎的分析试样中的丙酮酸生成量少时，可以评价·选拔为辛辣味降低的洋葱。优选选拔利用上述方法测定的丙酮酸生成量为2.0μmol/g FW以下、进一步优选为1.5μmol/g FW以下、更优选为1.0μmol/g/FW以下、特别优选为0.5μmol/g FW以下的洋葱。

(残存PRENCSO量)

将洋葱组织的一部分或者全部破碎时，作为辛辣成分的前体物质的PRENCSO瞬时被蒜氨酸酶完全分解为次磺酸、丙酮酸和氨。因此，常见的被破碎的洋葱组织中PRENCSO不可能残存。因此，破碎后，经过规定时间后，通过测定破碎液中的PRENCSO量(残存PRENCSO量)，能够间接测定蒜氨酸酶的活性。残存PRENCSO量可以使用将分析试样破碎并经过0.5分钟～3小时、优选3小时后的试样，利用HPLC来测定。本发明与以往品种的洋葱相比破碎分析试样后的残存PRENCSO量多时，可以评价·选拔为辛辣味或催泪性降低的洋葱。优选选拔利用上述方法测定的残存PRENCSO量为2.0μmol/g FW以上、进一步优选为3.0μmol/g FW以上、更优选为4.0μmol/g FW以上、特别优选为5.0μmol/g FW以上的洋葱。

(LF生成量)

通过测定将洋葱组织的一部分或者全部破碎时生成的辛辣味和催泪成分LF，能够评价来自分析试样的洋葱的辛辣味和催泪性的程度。LF的生成量可以使用刚刚破碎分析试样之后～3分钟后、优选约1分20秒后的试样，利用HPLC来测定。本发明与以往品种的洋葱相比破碎的分析试样中的LF生成量少时，能够评价·选拔为辛辣味和催泪性降低的洋葱。优选选拔利用上述方法测定的LF生成量为1.0×10⁶Peak area/μl提取液以下、更优选为9.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、8.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、7.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、或者6.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、进一步优选为5.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、4.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、3.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、2.0×10⁵Peak area/μl提取液以下、或者1.0×10⁵Peak area/μl提取液以下的洋葱。

利用上述方法制造以及评价·选拔的本发明的洋葱可以按照使用的品种的常见的栽培方法进行栽培。

本发明的洋葱，进一步可以通过利用有性生殖或者无性生殖的方法制造。作为利用有性生殖的方法，通过将本发明的洋葱植物体与第二洋葱植物体交配得到种子，进一步通过按照常见的洋葱栽培的顺序栽培得到的种子得到植物体，接着进一步通过由得到的植物体得到其部分，由此进行制造。根据需要，交配最终得到的洋葱，利用上述方法评价选拔蒜氨酸酶基因的表达被抑制的洋葱。“交配”可以进行自身交配、同胞受粉、回交、与相同或不同的近交系的交配、或者群体交配，“第二洋葱”可以选择与作为目标的交配相适应的洋葱，例如，可以从相同或不同的近交系或以往品种中选择。使用交配最终得到的洋葱植物体，进行同样地一次以上的交配可以得到本发明的洋葱。作为利用无性生殖的方法，得到本发明的洋葱的鳞茎，通过按照常见的洋葱栽培的顺序栽培得到植物体，或者由本发明的洋葱得到愈合组织，通过将其再分化为幼植物体得到植物体，接着进一步通过从得到的植物体得到其部分，由此可以制造。本发明有时将这样具有使用本发明的洋葱进行制造的经过的洋葱称为本发明的洋葱植物体的“后代”。该“后代”及其部分，只要该“后代”具有蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制的特征，则包含于本发明。

(实施例)

以下示出实施例，对本发明作进一步详细说明。但是，本发明不受到这些实施例的限制。

[实施例1]

没有辛辣味和催泪性的春季播种洋葱的制造

(1-1)M1洋葱球的制作

对添加有超北枫的种子约1500粒(6.08g)的直径10cm的塑料培养皿以20Gy照射氖离子束，制备照射初代(以下称为M1)种子。从得到的M1种子取60粒，进行发芽试验，估计发芽率和正常发育率。具体地，将Golden Peatban加入附带的塑料托盘，用700mL自来水充满。吸去注水10～15分钟后全部的水，向托盘内充满的膨胀的Golden Peatban播种60粒。保持原样，室内放置一晚后，转移至温室内(温室设定为15℃)使其生长。播种1个月后的发芽率为86.7％，第二叶鞘出现个体率为55.8％。

从用于发芽试验的剩余的M1种子取1450粒播种(3月)于多孔托盘，温室内继续育苗。将其中的1000株定植(5月)于田间(大地)。之后的栽培与常见的在北海道的洋葱栽培相同。收获(9月)M1洋葱457球。

(1-2)M1洋葱的选拔

[一次选拔]

a)对破碎的组织的催泪性的强弱·生洋葱气味的强弱的感官评价

(样品制备)

剥掉茶色的皮和鳞片直到在除了球的上端之外的整个周围茶色的部分消失。使用手术刀刀片，以在球的纵向方向切出的方式剥下剥掉皮的洋葱球的最外层鳞片的一部份(约5g～10g份)。此时，切出的鳞片的厚度大约比1mm薄时，以将其内侧的鳞片切出来使用的方式进行。在切出的鳞片的横方向进行切开，将鳞片的上端和下端以合并的方式进行折叠。将切出并进行二折的鳞片装入家用带拉链的塑料袋(18cm×20cm)(以位于带拉链的塑料袋的基本正中的方式放置)。带拉链的塑料袋中尽可能不残存空气，拉紧拉链。保持原样，放置于金属板上，从带拉链的塑料袋上方，用橡胶锤敲打进行二折的鳞片(约15～20秒)，破碎洋葱鳞片直至没有鳞片的形状残存的程度。

(感官评价)

破碎后立即将带拉链的塑料袋移至面部(鼻+口)附近，按下计时器(count up功能)的开始按钮之后，立刻拉开塑料袋的拉链，鼻和口靠近塑料袋的开口部，进行感官评价。感官评价的指标设置为以下2点。

1.是否感觉到生洋葱破碎时的味道。

2.到开始感觉到生洋葱破碎时感觉到的催泪性为止需要多少时间。

完成感官评价的带拉链的塑料袋，立即拉紧拉链，并且放入较大的塑料袋中，不使催泪性或味道扩散而影响其后的样品的感官评价。

感官评价的结果，将生洋葱气味或者催泪性弱的试样判定为阳性试样，对阳性试样的洋葱球，进行标记以使其能够识别，10℃下冷藏保管。

(注意点)

考虑到防止催泪因子或味道成分的扩散，样品制备和感官评价在台式通风橱上进行，而且，为了防止手上味道残留，佩带橡胶手套进行。

在对一个样品进行感官评价后，对下一个样品进行感官评价之前空出3分钟以上，以防止灵敏度降低。

(感官评价的灵敏度检查)

对样品洋葱进行连续评价的中途，使用感觉到催泪性的非照射洋葱或很难感觉到催泪性的生洋葱破碎气味弱的市售品种，进行同样的感官评价，进行灵敏度的检查。此外，另外地在一次选拔实施之前，为了考察利用在密封的袋中将鳞片破碎时感觉到的催泪性或生洋葱气味进行评价·选拔的可靠性，关于将水果洋葱、色拉洋葱、超北枫的鳞片分别破碎时是否能够将其区别开来，通过盲检进行试验。其结果，由于能够选择催泪性弱的水果洋葱，因此，判断将组织破碎时的感官评价用于一次选拔没有问题。

(一次选拔的结果)

一次选拔的结果为选拔生洋葱气味或者催泪性弱的38球。

[二次选拔]

a)鳞片破碎液中的催泪因子(LF)生成量的测定

将一次选拔中为阳性且10℃保管的洋葱球，再次按照与一次选拔时相同的顺序，对最外层的鳞片的一部份取样。将切出的鳞片重量×1/2量的蒸馏水放入装有洋葱鳞片的带拉链的塑料袋中，尽量不残留空气，拉紧拉链。保持原样，从带拉链的塑料袋的上方，用橡胶锤敲打，将洋葱鳞片破碎(开始破碎时，按下计时器(count up功能)的开始按钮，记录破碎后的时间)。挥舞破碎后的带拉链的塑料袋，将袋的内容物尽量收集至一处，在塑料袋的破碎物集中的位置附近刺入带针头的1mL注射器，抽取洋葱破碎液。注射器的前端将针头替换为0.2μm或0.45μm过滤器，过滤抽取的洋葱破碎液。立即使用微量注射器保持原样采取过滤的洋葱破碎液1μL，注入HPLC，考察LF生成量(记录从破碎开始至HPLC注入所需要的时间)。将剩余的滤液置于冰上。HPLC注入后，使用带针头的注射器，进一步回收洋葱破碎液，记录得到的破碎液量。

b)鳞片破碎液的LFS活性的测定

在分析LF生成量的滤液(10μL)中混合123μL的50mM磷酸缓冲液(pH6.5)。从得到的稀释液取20μL，用40μL的50mM磷酸缓冲液(pH6.5)稀释。使用制备的稀释液10μL，如下所示，进行利用HPLC的LFS活性测定。

＜LFS活性测定的顺序＞

1.向新的Eppendorf管中加入40μL大蒜蒜氨酸酶(50单位/mL)。

2.向其中添加10μL的1/20汁液(上述制备的稀释液)，移液(ピペッティング)20次。

3.进而，添加20μL的PRENCSO(20mg/ml)，移液5次立即关闭盖。

4.启动设置为3分钟的计时器。

5.在剩余20秒之际，打开Eppendorf管的盖，使用10μL微量注射器，在正好变为3分钟时，取样1μL，保持原样注入HPLC。

6.用蒸馏水将HPLC的注入口和微量注射器清洗。

c)鳞片破碎液的蒜氨酸酶活性的测定

将测定LF生成量的滤液(稀释前)作为蒜氨酸酶源，进行LFS活性测定反应，根据HPLC上出现的LF峰区域考察蒜氨酸酶活性的强度。

蒜氨酸酶活性测定的顺序

1.向新的Eppendorf管加入20μL滤液。

2.向其中添加5μL的rLFS，移液20次。

3.进一步，添加10μL的PRENCSO(20mg/ml)，移液5次立即关闭盖。

4.启动设置为3分钟的计时器。

6.用蒸馏水将HPLC的注入口和微量注射器清洗。

d)HPLC分析条件

上述的a)～c)中使用的HPLC条件如下所示。3个测定，由于均是进行LF生成程度的HPLC分析，因此HPLC条件完全相同。

HPLC分析条件

柱:ODS(SenshuPak ODS 4.6mm×25cm)

流动相:甲醇:0.005％三氟乙酸水＝3:7

检测:254nm

温度:35℃

流速:0.6ml/min

(二次选拔的结果)

二次选拔的结果，选拔9球(个体编号B0266、B0108、B0277、B0297、B0383、B0317、B0280、B0258)。

(1-3)M2洋葱球的制作

选拔的M1洋葱(9球，B0266、B0108、B0277、B0297、B0383、B0317、B0280、B0258、B0371)分别进行自体繁殖交配。结果得到约350粒(B0108:71粒、B0297:约80粒、B0280:约200粒、B0371:1粒)的种子(以下称为M2子代)。将得到的M2种子按照与M1栽培相同的顺序栽培，得到M2洋葱197球(B0108:18球、B0297:73球、B0280:106球)。

(1-4)M2洋葱的选拔

(分析试样的制备)

为了避免因作为分析试样使用的部位引起的测定值或评价不同，分析试样使用以下特定的部位。分析试样如下采取：在距离洋葱球的上端1/3～1/2的高度，沿着与球的上下方向轴(通过洋葱球的底盘部和尖端部的轴)垂直的面分割为2部分，从得到的上侧部分(包括尖端部的侧)或者下侧部分(包括底盘部的侧)的切断面中心部的鳞叶采取(参照图1)。洋葱的各部位的说明如上述所示。

将按照上述“(分析试样的制备)”记载的方法从上述M2洋葱采取的600mg洋葱组织加入装有3个3mmφ的氧化锆球的Eppendorf公司制离心管(2ml)。添加0.6mL蒸馏水，利用QIAGEN公司制MM300型珠磨机通过30Hz×2分钟×3次的处理进行破碎。将粉碎的洋葱组织样品10μL添加至ELISA板的孔中。将添加试样的ELISA板在调温至37℃的恒温槽内静置1小时。经过1小时后，将ELISA板从恒温槽取出，进行以下清洗步骤。(i)从全部的孔除去溶液。(ii)在各孔每孔添加300μl清洗缓冲液(0.05％聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20同等品)in 140mM NaCl,10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.4))，立即除去清洗缓冲液，将该操作重复3次。(iii)在将第3次的清洗缓冲液除去后，在盖有纸巾的实验台上敲打ELISA板，从孔内将清洗缓冲液完全去除。在经过以上清洗步骤((i)～(iii))的ELISA板的各孔中每孔添加300μl封闭溶液(1％(w/v)BSA in包被缓冲液(50mM sodium carbonate-bicarbonate buffer(pH9.6))。保持原样将ELISA板在调温至37℃的恒温槽内静置1小时。经过1小时后，重复上述清洗步骤((i)～(iii))。在清洗后的ELISA板各孔中每孔添加100μl一次抗体(将抗蒜氨酸酶大鼠抗血清用稀释缓冲液(0.1％BSA in 140mM NaCl,10mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.4))稀释至1000倍的抗体)。使用调温至37℃的恒温槽内时，保持原样将ELISA板静置3小时，使用4℃冰箱时静置一晚(16小时～22小时)，使一次抗体反应。与一次抗体的反应后，将ELISA板供于上述清洗步骤((i)～(iii))。在清洗后的ELISA板的各孔中每孔添加200μl二次抗体(将POD conjugated anti-rat IgG whole molecule SigmaA0545用稀释缓冲液稀释10000倍的抗体)。将添加二次抗体的ELISA板在调温至37℃的恒温槽内静置1小时。经过1小时后，重复上述清洗步骤((i)～(iii))。在清洗后的ELISA板每孔添加100μl显色试剂(TBA ELISA底物溶液(Bio-Rad 172-1066)。添加后，立即将ELISA板在25℃恒温室内边以60rpm振荡搅拌边进行显色反应。添加显色试剂后，在10分钟～60分钟之间使用酶标仪(Emax Molecular Dynamics公司)测定650nm的吸光度。代替提取样品而使用精制蒜氨酸酶(制作法是特开2009-254344号记载的方法)，使用溶液的稀释系列，基于同样地测定的值，制作标准曲线，将提取样品中的吸光度测定值换算为蒜氨酸酶浓度。而且将使用Bradford法测定的提取液中的总蛋白质量作为基础，换算为每1ng提取蛋白质。

将单位提取蛋白质的ELISA显色量为非照射对照洋葱的1/10以下作为选拔基准，选拔蒜氨酸酶蛋白质表达量少的个体18球。

(1-5)M2选拔球的自体繁殖采种(M3子代的制造)

5月～10月

得到采种数:3250粒(个体编号300号:280粒、438号:55粒、444号:56粒、455号:800粒、479号:86粒、482号:66粒、486号:960粒、487号:176粒、489号:265粒、511号:75粒、512号:61粒、515号:367粒)的M3种子。

(1-6)来自M3种子的球栽培

3月～9月

对于上述3250粒的M3种子中1078粒(个体编号300号:100粒、438号:55粒、444号:56粒、455号:100粒、479号:86粒、482号:66粒、486号:100粒、487号:176粒、489号:100粒、511号:75粒、512号:61粒、515号:100粒)，按照与M1或M2栽培相同的顺序栽培，得到M3洋葱球466球(300号:81球、438号:28球、444号:22球、455号:74球、479号:29球、482号:15球487号:67球、489号:37球、511号:60球、512号:4球、515号:49球)。

(1-7)从M3洋葱球中的选拔

11月～3月

对于上述M3洋葱球，将鳞叶破碎后的PRENCSO残存量作为指标，选拔蒜氨酸酶活性弱的个体。选拔基准是残存PRENCSO量为3.26μmol/g FW以上。该选拔基准是基于以下原因而设定：在预备研究中，实施蒜氨酸酶活性的强度和感官评价结果的比较时，蒜氨酸酶活性为1/40时，通过感官评价确认辛辣味降低。上述蒜氨酸酶活性变为1/40时的残存PRENCSO量(3.26μmol/g)如下求出：从使用在与M3洋葱球栽培相同的田地中栽培的常见洋葱(札幌黄)(6球)的模型实验，测定蒜氨酸酶活性变为1/40时的残存PRENCSO量。对选拔的几个洋葱，感官评价鳞叶，考察辛辣味的有无。

此外，对于这些选拔球，使用以自体繁殖采种为目标的栽培途中的叶进行感官评价和蒜氨酸酶活性测定，进行特性把握。

结果，选拔残存PRENCSO量为3.26μmol/g FW以上的9球(#2,#6,#10,#11,#37,#230,#262,#263,#651)。

(1-8)M3选拔球的自体繁殖采种(M4子代的制造)

5月～10月

得到1687粒(#6:328粒、#10:338粒、#230:13粒、#263:1008粒)M4种子。

除此以外。将#2和#6交配，得到2粒。

(1-9)来自M4种子的球栽培

3月～9月

上述1689粒的M4种子中，对于400粒(#6:200粒、#10:200粒)，按照与M1～M3栽培相同的顺序栽培，得到M4洋葱球226球(#6:158球、#10:68球)。

[实施例2]

各种测定

(2-1)组织破碎时的丙酮酸生成量测定

将按照上述(1-4)“(分析试样的制备)”记载的方法采取的600mg洋葱组织装入装有3个3mmφ锆球的Eppendorf管公司制离心管(2mL)。添加0.6mL蒸馏水，使用QIAGEN公司制MM300型珠磨机进行30Hz×2分钟×3次的处理进行破碎。粉碎后，室温下静置10分钟后，以15000rpm、4℃离心10分钟将上清作为样品。将样品20μL加入96孔板，粉碎开始30分钟后添加水43μL、DNPH溶液66μl，37℃下反应10分钟。10分钟后，添加66μL 1.5M NaOH，停止反应，用移液管进行3次以上混合。利用分光光度计测定515nm的吸光度。代替提取样品而使用丙酮酸Na溶液的稀释系列，基于同样地测定的值制作标准曲线，将提取样品中的吸光度测定值换算为丙酮酸量。

(2-2)破碎3小时后的残存PRENCSO量测定

将按照上述(1-4)“(分析试样的制备)”记载的方法采取的600mg洋葱组织装入装有3个3mmφ锆球的Eppendorf公司制离心管(2mL)。添加0.6mL蒸馏水，利用QIAGEN公司制MM300型珠磨机进行30Hz×2分钟×3次的处理进行破碎。室温下静置3小时后，将15000rpm、4℃、10分钟离心的上清，用0.45μm的膜过滤器过滤，作为测定样品。PRENCSO量的测定，利用公知的方法(特开2009-254344号公报)记载的方法实施。

(2-3)破碎时的催泪成分(LF)生成量测定

将按照上述“(分析试样的制备)”记载的方法采取的400mg洋葱组织采取至1.5mLEppendorf管。利用微型乳棒粉碎20秒后，立即以15000rpm、10秒、4℃离心，粉碎开始1分20秒后，利用HPLC分析离心上清1μL中的催泪成分(LF)量。

HPLC的分析条件使用下述条件。该HPLC分析条件中，催泪成分(LF)在保留时间约9.6分钟被检测到。

[HPLC分析条件]

柱；ODS(SenshuPak ODS 4.6mm×25cm)

流动相:甲醇:0.005％三氟乙酸水＝3:7

检测:254nm

柱温度35℃

流速:0.6ml/min

(2-4)使用ELISA的蒜氨酸酶蛋白表达量的测定

按照与丙酮酸生成量测定时同样的方法将粉碎的洋葱组织作为样品，使用与上述“(1-4)M2洋葱的选拔”记载ELISA法同样的方法，测定样品中的蒜氨酸酶蛋白表达量。

(2-5)使用实时PCR的蒜氨酸酶基因的表达量的测定

从-80℃冷冻保存的洋葱组织100mg，使用Rneasy Plant Mini kit(Qiagen公司制)，按照添付的手册采取RNA。对采取的RNA使用NanoDrop 1000(NanoDropTechnologies公司制)进行浓度测定后，使用ReverTra Ace(注册商标)qPCR RT Master Mix with gDNARemover(TOYOBO制)按照添付的手册进行逆转录反应，合成cDNA。各基因的定量，使用下表的引物组和THUNDERBIRD(注册商标)SYBR(注册商标)qPCR Mix(TOYOBO制)，以7900HT FastReal-Time PCR System(Applied Biosystems)进行。结果以作为看家基因之一的泛素得表达量进行校正。

蒜氨酸酶引物:

正向引物5'-AATGAGACCTCCATCCCCATC-3'(序列编号1)

反向引物5'-TCGAAACCCTCTCCACTTTG-3'(序列编号2)

泛素引物:

正向引物5'-ACGATTACACTAGAGGTGGAGAGCTC-3'(序列编号3)

反向引物5'-CCTGCAAATATCAGCCTCTGCT-3'(序列编号4)

(2-6)数据显示和统计解析

测定值以平均值±标准偏差表示，统计解析使用Dunnett检验。显著水平以5％(*)和1％(**)表示。

[实施例3]

M4洋葱球的各种测定·评价的结果

(3-1)感官评价

将M4洋葱球2个系统(#6、#10)各20球和作为对照的札幌黄5球按照上述(1-4)“(分析试样的制备)”记载的方法采取试样，上述“(感官评价)”记载的方法，即，将M4洋葱球和对照球比较，对于将试样的一部份破碎时感觉到的催泪性、或者食用时感觉到的辛辣味的程度，至少2名专家感官评价能否感觉到辛辣味和/或催泪性明显降低。结果，#6、#10全部球中完全感觉不到辛辣味(表1)。

[表1]

	感官评价个数	感觉到辛辣味的个数
			对照	5球	5球
#6	20球	0球
			#10	20球	0球

(3-2)组织破碎时的丙酮酸生成量

对得到的M4洋葱球2个系统(#6、#10)各19球和作为对照的札幌黄5球按照上述(2-1)“(组织破碎时的丙酮酸生成量测定)”记载的方法测定破碎时的丙酮酸生成量。

结果由图2示出。与对照比较，#6、#10丙酮酸生成量被显著抑制。该结果与感官评价的结果一致。

(3-3)破碎3小时后的残存PRENCSO量

对得到的M4洋葱球2个系统(#6、#10)各19球和作为对照的札幌黄5球使用上述(2-2)“(破碎3小时后的残存PRENCSO量测定)”记载的方法进行试样采取以及测定破碎3小时后的残存PRENCSO量。

结果由图3示出。与对照比较，#6、#10的PRENCSO残存。这样的洋葱目前为止没有发现。此外该结果与感官评价、丙酮酸生成量的分析结果一致。

(3-4)破碎时的催泪成分(LF)生成量

对得到的M4洋葱球2个系统(#6、#10)各19球和作为对照的札幌黄5球使用上述(2-3)“(破碎时的催泪成分(LF)生成量测定)”记载的方法进行试样采取以及测定破碎时的催泪成分(LF)生成量。

结果由图4示出。与对照比较，#6、#10的催泪成分(LF)生成量显著被抑制。

(3-5)蒜氨酸酶蛋白表达量

对得到的M4洋葱球2个系统(#6、#10)各19球和作为对照的札幌黄5球使用上述(2-4)“(使用ELISA的蒜氨酸酶蛋白表达量的测定)”记载的方法进行试样采取，利用ELISA法测定蒜氨酸酶蛋白的表达量。

结果由图5示出。确认与对照比较，#6、#10蒜氨酸酶蛋白的表达显著被抑制。

(3-6)蒜氨酸酶基因的表达量

对得到的M4洋葱球2个系统(#6、#10)各3球和作为对照的札幌黄3球使用上述(2-5)“(使用实时PCR的蒜氨酸酶基因的表达量测定)”记载的方法，使用定量RT-PCR测定蒜氨酸酶基因的表达量。

将结果换算为蒜氨酸酶基因/泛素基因的比并由图6示出。与对照比较，#6、#10的蒜氨酸酶基因/泛素基因的值分别为187分之1、1000分之1，确认蒜氨酸酶基因的表达显著被抑制。

根据这一结果和利用上述ELISA的蒜氨酸酶蛋白表达量的抑制的结果，确认#6、#10没有辛辣味是因为蒜氨酸酶的表达被抑制。

[实施例4]

#6、#10的LFS活性的确认

如上述“(3-4)破碎时的催泪成分(LF)生成量”所示，确认#6、#10破碎时的LF生成量显著被抑制。作为其原因，考虑有可能不仅蒜氨酸酶而且LFS的活性也被抑制。因此，将以公知的方法(特开2009-254344号公报)记载的方法由大蒜制备的精制蒜氨酸酶12.5单位加入到按照与上述“(3-4)”同样的方法采取的#6、#10的洋葱组织，按照与上述同样的方法测定破碎时生成的催泪成分LF的量。作为对照，使用上述方法对札幌黄5球进行试样采取和测定破碎时的催泪成分(LF)生成量。

结果由图7示出。洋葱组织的粉碎时通过添加蒜氨酸酶，#6、#10的催泪成分(LF)生成量变为与对照相同的程度。根据该结果，确认粉碎#6、#10时生成的催泪成分(LF)量少是因为蒜氨酸酶被抑制，LFS自身没有问题地发挥作用。

应予说明，本发明人等将由#6系统得到的种子命名为Allium cepa HFG-01，2014年2月19日在英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(NCIMB Ltd.Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,United Kingdom)以NCIMB 42219进行国际保藏。应予说明，该保藏证记载的住所是本申请申请人的开发研究所，保藏人与本申请申请人是同一人。

[实施例5]

由M4洋葱球诱导愈合组织

将M4洋葱球(上述#6系统)从外叶除去，取出中心部的幼芽(含有圆盘茎的萌芽叶部分，图8)，使用1％次氯酸钠水溶液杀菌30分钟。利用灭菌水清洗杀菌的幼芽2次后，无菌条件下，将受到杀菌损伤的部分(最外叶和圆盘茎的部分)用手术刀去除。然后，将萌芽叶部分制为厚度0.5mm左右的轮切片，制成切片，在愈合组织诱导培养基上着床。此时使用的愈合组织诱导培养基是含有50μM 4-FPA、1μM N6(2-异戊烯基)腺嘌呤(以下记载为“2iP”)、0.1M蔗糖、0.1％酪蛋白水解产物、0.2％绞兰胶的Murashige&Skoog(以下记载为“MS”)培养基，pH调整为5.8。培养在25℃、12小时照明下(40μmol/m²/s)进行。培养开始后1周产生切片的肥大化，开始愈合组织化。培养开始起2周后，将肥大化的切片切分为5mm见方左右大小，在新的愈合组织诱导培养基上种植。传代培养开始约2周后，发现良好的愈合组织增殖，此后，每隔4周～6周在愈合组织传代培养基(含有50μM 4-FPA、1μM 2iP、0.1M蔗糖、0.3％绞兰胶的MS培养基)上移植进行传代培养，得到愈合组织。本发明人等将该愈合组织命名为HFG-01C，于2013年12月25日在独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(邮编292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8120号室)以保藏编号FERM BP-22260进行国际保藏。

[实施例6]

来自愈合组织的再分化和植物体的制造

(1)再分化

将由实施例5得到的愈合组织在再分化培养基(含有1μM 2iP、0.1M蔗糖、0.3％绞兰胶的MS培养基)中进行培养(25℃、12小时照明下(40μmol/m²/s))。培养开始后一个月左右开始发现滑面状的结构体(图9)。将包含该结构体的培养物每隔4周～6周移植到新的再分化培养基上。从进行2次左右向再分化培养基的移植后的产物，分化出嫩芽。

(2)生根

上述(1)得到的分化的嫩芽在含有0.1M蔗糖、0.2％绞兰胶、0.5％琼脂的MS培养基进行培养(25℃、12小时照明下(40μmol/m²/s))。培养开始后一个月发现根的分化(图10)，由组织得到植物体。

根据以上结果，可知由M4洋葱球能够诱导愈合组织，并能够培养增殖该愈合组织，此外通过得到的愈合组织的再分化，能够得到植物体。

[实施例7]

利用来自M4洋葱球的群体交配进行采种(M5子代的制造)

由7球的M4洋葱球(#6系统)的群体交配得到610粒M5种子。此外，由17球的M4洋葱球(#10系统)的群体交配得到421粒M5种子。

[实施例8]

M4洋葱球(#6系统、#10系统)的蒜氨酸酶基因的解析

为了阐明上述#6系统和#10系统中，蒜氨酸酶基因的表达被抑制的原因，将#6系统的洋葱和常见的洋葱(蒜氨酸酶基因的表达没有被抑制且具有辛辣味或催泪性)中的表达基因的差异，按照下述方法使用下一代测序仪进行全面解析。

将M4洋葱球(上述#6系统)(3球)和作为对照球的与#6系统品种相同且重复相同次数的自体繁殖的具有辛辣味的洋葱球(3球)在液氮中急速冷冻后，-80℃冷冻保存。

剥去冷冻的各洋葱球的皮，称取洋葱组织100mg，使用RNeasy Plant Mini kit(Qiagen公司制)，按照添付的手册采取total RNA。接着对采取的total RNA使用RNeasyMini Kit(Qiagen公司制)和RNase-Free DNase Set(Qiagen公司制)进行DNase处理。处理后的total RNA，利用Nanodrop(NanodropTechnologies公司制)、和Agilent2100Bioanalyzer(Aglent Technologies公司制)进行浓度测定·品质的确认。品质确认中，确认样品的A260/A280为1.8以上，且RNA Integrity Number为8.0以上，使用TruSeqRNA Sample Prep Kit(illumina公司制)按照添付手册，制备序列文库。制备的序列文库，使用下一代测序仪HiSeq(illumina公司制)，在下述的条件下进行序列解析。

(序列条件)

解析方法:Paired End，样本数:6，通道数:3，读取碱基长度:100碱基/前导序列

(数据处理)

对得到的数据，实施下述列举的信息处理。

·使用被称为Chastity的计算式，将荧光纯度低的数据除去。“Chastity”是在来自4种碱基的信号值内，将最大信号值作为I1，第二大的信号值作为I2时，由“I1/(I1+I2)”所示的式表示，本实施例中在“I1/(I1+I2)>0.6”的条件下进行数据的选择。

·将选择的数据按照各样本固有Index信息分配给每个样本。

·将含有接头序列的前导序列除去，进一步提取含有90％以上的QualityValue20以上的碱基的前导序列对。使用这些各样本的全部数据，使用Trinity(URL:http://trinityrnaseq.sourceforge.net/index.html version 2013-02-25)进行Denovo组装。

·对于组装数据(推定Transcript序列)，进行利用BLAST检索的注释赋予。注释的程序中使用BLASTX，在数据库中使用将NCBI的RefSeq-Fungi、RefSeq-Microbial、RefSeq-Plant的氨基酸序列以及NCBI的分类上以Allieae注册的氨基酸序列和把基因序列转换为氨基酸序列的序列进行整合的数据库。

BLASTX的参数为evalue 1E-5/num_alignments 100/outfmt"6qseqid sseqidpident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore qlenslen stitle qcovs qcovhsp"/

其他使用默认条件。

·对于推定Transcript序列，为了表达解析，使用Trinity将各样本的数据绘图。

·根据绘图结果，使用edgeR实施2组间的表达比较检测，提取两组间表达量有差异的基因序列。显著差异以p值为0.05以下，且FDR(False Discovery Rate)为0.01以下作为基准。

解析的结果，在用BLASTX的注释中，被注释为洋葱的蒜氨酸酶、蒜氨酸酶样、蒜氨酸酶前体等蒜氨酸酶的基因全部共有29个(图11)。

其中在上述的显著差异水平#6系统的洋葱球(3个)中表达被抑制，相反，对照洋葱球(3个)中确认表达的蒜氨酸酶基因仅能确认一个(以下，将该蒜氨酸酶基因简便地记载为“蒜氨酸酶基因1”)。由该蒜氨酸酶基因1编码的氨基酸序列由图12示出。

蒜氨酸酶基因1(图11中，由基因编号1示出)，在对照洋葱球中，在被注释为蒜氨酸酶的29个基因中表达量最高。基于这些结果，表明蒜氨酸酶基因1，在洋葱细胞的蒜氨酸酶基因中，是对该细胞的蒜氨酸酶活性的大小最有贡献的蒜氨酸酶基因。

目前为止，13种洋葱的蒜氨酸酶已在GenBank注册(Accession编号AAA32639.1、AAA92463.1等)。这被认为是由于洋葱蒜氨酸酶基因是多拷贝基因，洋葱植物的根和球中利用性质不同的蒜氨酸酶，除此以外，洋葱中各种基因的碱基序列每个品种略有不同(Kinget al.:A low-density genetic map of onion reveals a role for tandenduplication in the evolution of an extremely large diploid genome.Theoreticaland Applied Genetics,96,52-62(1998)；Do et al.:Genomic organization of a novelroot alliinase gene,ALL1,in onion.Gene,325,17-24(2004)；Masamura et al.:Chromosomal organization and sequence diversity of genes encodinglachrymatory factor synthase in Allium cepa L.Genes|Genomes|Genetics 2:643-651(2012))。除了蒜氨酸酶基因存在多个以外，各个蒜氨酸酶基因对洋葱细胞的蒜氨酸酶活性的强弱的贡献程度是不清楚的，所以想要制造抑制蒜氨酸酶基因的洋葱时，不能判断选择哪个蒜氨酸酶基因作为缺失或者抑制的对象，或者使何种蒜氨酸酶基因缺失或者抑制时能有效缺失或者抑制蒜氨酸酶基因的表达，目标蒜氨酸酶基因的锁定是困难的状况。

另一方面，根据上述结果表明，洋葱基因组中多个存在的蒜氨酸酶基因中确定对洋葱细胞的蒜氨酸酶活性的强度最有贡献的蒜氨酸酶基因、而且该基因(蒜氨酸酶基因1)的表达显著低的洋葱中，基本没有感觉到辛辣味。

即，洋葱球中蒜氨酸酶基因1是主要的蒜氨酸酶基因，而且仅缺失或者抑制其表达，能够显著缺失或者抑制洋葱球的整体的蒜氨酸酶基因的表达，由此明显能够抑制洋葱的辛辣味、催泪性。

将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接作为参考援引入本说明书。

Claims

1.一种加工食品，含有洋葱植物体或其后代、或者其部分，该洋葱植物体或其后代、或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1，该蒜氨酸酶基因编码以下(a)或(b)的多肽:

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽；

(b)与序列编号5所示的氨基酸序列具有95％以上的同源性且具有蒜氨酸酶活性的多肽。

2.根据权利要求1所述的加工食品，其中，洋葱细胞破碎时的辛辣成分和催泪成分的生成与以往品种相比降低。

3.洋葱植物体或者其部分的制造方法，其特征在于，该洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1，该制造方法包括以下工序:

(i)对洋葱种子进行突变诱导处理的工序，

(iii)从得到的洋葱植物体或者其部分，选拔显示以下特性的洋葱植物体或者其部分的工序:

蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1，该蒜氨酸酶基因编码以下(a)或(b)的多肽，

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽；

4.根据权利要求3所述的方法，其中，工序(iii)进一步包括选拔显示以下的一个或多个特性的洋葱植物体或者其部分的工序，

b)洋葱细胞破碎时的丙酮酸的生成与以往品种相比降低；

c)洋葱细胞破碎后的残存PRENCSO量与以往品种相比多；以及

d)洋葱细胞破碎时的催泪因子LF的生成与以往品种相比降低。

5.根据权利要求3所述的方法，进一步包括以下工序(iv)，即重复进行一次或多次对选拔的洋葱植物体进行自体繁殖交配并将得到的洋葱植物体或者其部分付诸于工序(iii)的工序。

6.根据权利要求1所述的加工食品，其中，洋葱植物体的部分是以NCIMB 42219进行国际保藏的种子。

7.根据权利要求1所述的加工食品，其中，洋葱植物体的部分是以FERM BP-22260进行国际保藏的愈合组织。

8.一种加工食品，含有洋葱植物体或者其部分，该洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1，该洋葱植物体或者其部分是通过包括以下工序的方法而制造得到的，

(i)对洋葱种子进行突变诱导处理的工序，

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽；

9.根据权利要求8所述的加工食品，其中，工序(iii)进一步包括选拔显示以下的一个或多个特性的洋葱植物体或者其部分的工序，

b)洋葱细胞破碎时的丙酮酸的生成与以往品种相比降低；

c)洋葱细胞破碎后的残存PRENCSO量与以往品种相比多；以及

d)洋葱细胞破碎时的催泪因子LF的生成与以往品种相比降低。

10.根据权利要求8所述的加工食品，所述方法进一步包括以下工序(iv)，即重复进行一次或多次对选拔的洋葱进行自体繁殖交配并将得到的洋葱付诸于工序(iii)的工序。

11.洋葱植物体或者其部分的制造方法，其特征在于，其蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1，该制造方法包括将第一洋葱植物体与第二洋葱植物体进行交配，

所述第一洋葱植物体的蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1，该蒜氨酸酶基因编码以下(a)或(b)的多肽:

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽；

12.一种加工食品，含有洋葱植物体或者其部分，该洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1，该洋葱植物体或者其部分是通过以下方法而制造得到的，该方法包括将第一洋葱植物体与第二洋葱植物体进行交配，

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽；

13.一种加工食品，含有洋葱植物体或其后代、或者其部分，该洋葱植物体或其后代、或者其部分是由蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1且该蒜氨酸酶基因编码以下(a)或(b)的多肽的洋葱植物体的部分而得到的，

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽；

14.根据权利要求13所述的加工食品，其中，所述洋葱植物体或其后代、或者其部分是由以蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1为特征的洋葱植物体的种子或者愈合组织而得到的。

15.根据权利要求14所述的加工食品，其中，种子是以NCIMB 42219进行国际保藏的种子。

16.根据权利要求14所述的加工食品，其中，愈合组织是以FERMBP-22260进行国际保藏的愈合组织。

17.测定洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达量来评价该洋葱植物体或者其部分的辛辣味的方法，

该蒜氨酸酶基因编码以下(a)或(b)的多肽:

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽，

(b)与序列编号5所示的氨基酸序列具有95％以上的同源性且具有蒜氨酸酶活性的多肽；

该蒜氨酸酶基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1时，则评价该洋葱植物体或者其部分的辛辣味降低。

18.与以往品种相比辛辣成分和催泪成分的生成降低了的洋葱植物体或者其部分的选择方法，其特征在于，包括测定洋葱植物体或者其部分的蒜氨酸酶基因的表达量，选择该基因的表达与以往品种相比被抑制到小于50分之1的洋葱植物体或者其部分，

该蒜氨酸酶基因编码以下(a)或(b)的多肽:

(a)氨基酸序列为序列编号5的多肽，