CN105358974B - 利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用核酸裂解片段的分子量进行物种分型鉴定的方法，包含以下步骤:进行一聚合酶连锁反应及一核酸酶裂解反应，将被检测物种的核酸序列裂解产生分子量大小不同的核酸裂解片段，以质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小，将被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与一资料库中预存的已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较，以确认两者之间相同的核酸裂解片段数量N，以及计算认定为相同的核酸裂解片段的数量N相对于已知物种的核酸裂解片段的总数M的一比值N/M，以所述比值N/M代表被检定物种与已知物种的一核酸序列相似度。
Description
技术领域
本发明涉及一物种鉴定方法，更具体而言是根据核酸裂解后片段的分子量大小，来进行物种鉴定的方法。
背景技术
生物物种或同种异型的辨识大部分都是以DNA序列定序的方法进行，此方法在临床应用时会遇到过程繁杂，效率低及费用高的问题。另一种方法是使用限制性片段长度多态性(RFLP)，然而此方法的精确性却不够高，因为在胶体电泳时，相近长度的核酸裂解片段将无法轻易的被分辨出来，或是相同长度但不同序列的核酸裂解片段也无法由胶体电泳而分辨出来。虽然后续有很多其他的方法被开发，例如：DNA microarray，Real time PCR，次世代DNA定序技术等，但是都存在技术不稳定导致结果的不确定(如：DNA microarray，Realtime PCR)及高费用(如：次世代DNA定序)。以人类乳突病毒DNA microarray分型方法为例，DNA探针设计时由于DNA序列的相似度较高区域导致杂交反应使得非专一性增加而误判；另外，当初产品设计时之检测类型的拘限，病毒发展之高变异性使得原方法无法定型等已成为目前急需解决的问题。
发明内容
本发明之目的，在于提供一种物种分型鉴定的方法，其利用核酸裂解后的片段分子量，而非利用胶体电泳或探针杂合反应，因此本方法稳定性及准确度高，不会因非专一性的杂合而发生误判，在辨识核酸裂解片段时，精准度非常高，一碱基的些微大小差距都能被备侦测，由于不同分子的分子量皆不同，因此同样核酸裂解片段长度，但是不同的序列，皆能被本发明所提供的方法所所侦测。此外在本发明的方法操作步骤简便，费用低廉且具有高效率。
为达上述目的并解决习知技术之缺点，本发明提供一种物种分型鉴定的方法，包括以下步骤：
(S10)进行一聚合酶连锁反应，通过至少一对特定引子，扩增一被检测物种的一段核酸序列；
(S20)进行一核酸酶裂解反应，通过至少一个核酸酶，将所述被检测物种的所述核酸序列裂解，而产生数段分子量大小不同的被检测核酸裂解片段；
(S30)以一质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小；
(S40)将所述被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与一资料库中预存的一已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较；
(S50)当所述被检测核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两者的分子量之间相差小于一特定道尔吞值时，则认定两者为相同的核酸裂解片段；以及
(S60)计算所述认定为相同的被检测核酸裂解片段的数量N相对于所述已知物种的已知核酸裂解片段的总数M的一比值N/M，并以所述比值N/M代表所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相似度。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述特定道尔吞值为2道尔吞。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，当所述步骤(S40)中的资料库中的已知物种为2个或以上时，在步骤(S60)后进一步包含以下步骤：
(S71)从所述资料库中多个物种的多个所述比值N/M中，随机取一较大的比值，做为一高相似度丛集的中心，随机取一较小的比值，做为一低相似度丛集的中心；
(S72)计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；
(S73)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述低相似度丛集；
(S74)计算出所述高相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的高相似度丛集的中心，计算出所述低相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；
(S75)再次计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；
(S76)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述低相似度丛集；及
(S77)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种；
其中当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种与之前不相同，则重复步骤(S74)、步骤(S75)及步骤(S76)直到被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述已知物种及所述另一所述已知物种接选自于所述高相似度丛集中的物种。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述第一特定值为XX％。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，在所述步骤(S40)前，先将资料库中预存的所述已知物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库中预存的另一已知相近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较，以确定两者之间具有那些重复的已知核酸裂解片段；接着在进行步骤(S40)时，使所述被检测物种的各被检测核酸裂解片段省略执行与所述重复的已知核酸裂解片段的比较作业。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述核酸序列为DNA序列。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，在所述步骤(S20)之前，先进行一转录反应，将DNA序列转录为RNA序列。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述核酸酶为RNase。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述RNase为RNase A，其针对所述RNA序列中的T位进行点裂解。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述被检测物种为微生物。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述微生物为细菌或病毒。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述被检测物种为动物。
根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述被检测物种为人类。
附图说明
本文所述的本发明，仅作为示例，参考附图，其中：
图1为本发明的物种分型鉴定方法的一实施例的流程图。
图2为本发明的物种分型鉴定方法中，所述的丛集分析的流程图。
图3为本发明的物种分型鉴定方法的另一实施例的流程图，其中包含一去重复步骤。
图4A-4B为HPV病毒型案例分布图，其显示分别以序列定序方法及本发明的物种分型鉴定方法鉴定HPV案例的结果。
具体实施方式
现在仅用参考下面非限制性的实施力的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是用做为例证的，不应以任何方式当作上述本发明总体的限制。在此一实施例中，利用分型鉴定人类乳突病毒HPV来解释本发明所提供的方法，然而此方法也可以被运用于其他物种的分型鉴定，例如微生物(细菌或病毒)、动物、人类(例如基因突变的检测)。
人类乳突状病毒(HPV)：
人类乳突病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种DNA病毒，属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。该类病毒感染人体的表皮与粘膜组织，目前约有170种类型的HPV被判别出来，有些类型的HPV入侵人体后会引起疣或癌症，但其他则没有任何症状。大概有30到40类型的HPV会透过性行为传染到生殖器及周边皮肤，而其中又有些会引起性器疣。若反复感染某些高危险性，且又没有疣等症状的HPV类型，可能发展成为癌前病变，甚至是侵袭性癌症。经研究99.7％的子宫颈癌，都是因感染HPV所造成。依照危险度来分，像是HPV-6、HPV-11、HPV-41、HPV-42、HPV-43、HPV-44，这些为低危险型HPV；至于HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33等高危险型HPV，易造成子宫颈癌。虽然HPV是造成子宫颈癌的主因，但不是所有的HPV都会发展成CIN和子宫颈癌，因此鉴定HPV的类型在临床诊断上显得十分重要。然而多型别感染在HPV流行病学中是一种非常常见的现象，且一个体在不同的时间段所感染的HPV型别可以有所不同，因此在一检体中可能包含多种HPV的病毒，而增加HPV的分型鉴定的困难度。而本发明中的一技术特征是在于提供一能够从一检体中鉴定出多个型别的病毒的方法。请参考图1，其为本发明的物种分型鉴定方法的一实施例的流程图。本发明的所提供的方法，包含以下步骤：(S10)聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)、(S15)SAP(shrimpalkaline phosphatase)消化酶反应、(S20)转录作用及核酸酶裂解反应、(S25)纯化、(S30)质谱仪检测核酸裂解片段大小、(S40)比较核酸裂解片段、(S50)确认相同核酸裂解片段、(S60)计算代表相似度的比值N/M、(S70)丛集分析、(S35、S40’)去重复步骤，如图1所示。
聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)：
以市售DNA萃取套件萃取DNA，例如QIAGEN Blood Mini 先以裂解溶液(Lysis buffer)溶解从患者内皮粘膜取样的细胞，使DNA从细胞内游离出来。在特定条件下DNA通过萃取套件所附的管柱(column)时会与管柱内的一硅胶膜(silica-gel membrane)结合而留在膜上，此时以酒精及冲洗液(wash buffer)清洗，再离心后去除杂质，最后以纯水将DNA溶出，而萃取DNA，(详细的萃取步骤请参阅DNA萃取套件的使用说明书)。以上DNA萃取方法为一实施范例，各种DNA萃取方法皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
萃取DNA后，再以PCR反应侦测是否有HPV的DNA片段，本发明中，使用MY09引子(primer)及MY11引子(primer)扩增L1外鞘(caspid)蛋白的基因中的一特定DNA片段作为目标，此片段为低变异性的一片段，因此所述引子能在各种不同型态的HPV的DNA中，辨识并扩增所述片段，此外此引子还包含T7序列，其用以做为之后转录作用(transcription)的启动子(promoter)。所述引子的正向(forward)序列为：
5’-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTGCMCAGGGWCATAAYAATGG-3
所述引子的反向(reverse)序列为：
5’-CGATTTAGGTGACACTATAGAAGAGAGGCTCGTCCMARRGGAWACTGATC-3’
之后，以市售的PCR套件进行PCR反应，例如Takara Ex Taq Hot Start Version每个单一反应的总体积为25uL，而各反应试剂及样本的浓度和体积，如表1所示，其中10X缓冲液含有20nM Mg2+。
表1：
依照以上表配制各反应试剂及样本的浓度和体积，进行35循环的PCR，而获得反应后PCR产物，其中变性反应(denature)、粘合反应(annealing)及延伸反应(extension)的温度如表二所示。
表2：
| 变性 | 粘合 | 延伸 | |
| 温度 | 94℃ | 60℃ | 72℃ |
同时另外以相同PCR方法，扩增Beta-actin基因中的一片段，做为阳性对照组(positive control)进行监控，确认实验过程和采样品质。在PCR反应完成后，取得PCR产物，使用毛细管电泳以确认PCR产物中包含所述DNA片段，例如E-gene HDA GT12Capillary再以市售软体分析，例如QUAxcel Screening 结果如表三所示。以上聚酶连锁反应(PCR)为一实施范例，各种聚酶连锁反应(PCR)皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
表3：
| 片段编号 | 片段大小 | 浓度 |
| 1 | 13 | n/a |
| 2 | 108 | 4.89 |
| 3 | 499 | 31.11 |
| 4 | 600 | n/a |
表3中，片段3为所述L1外鞘(caspid)蛋白的DNA片段。
SAP消化反应：
SAP(shrimp alkaline phosphatase)虾碱性磷酸酶，被利用于将DNA的5’端的磷酸根去除，以避免DNA的5’端连接至同一DNA片段的3’端，而维持DNA片段为线状。其所用的SAP消化反应的反应试剂的浓度及体积，如表四所示。
表4：
依照以上表配制各反应试剂的浓度和体积形成SAP混合溶液，将上述4ul SAP混合溶液加入384孔盘中，再加入2.5ul的PCR产物。以胶膜封好384孔盘后震荡,以1000RPM离心一分钟。加热至37℃进行20分钟，加热至85℃进行10分钟，冷却至4℃以保存SAP消化反应后所得到的产物。以上SAP消化反应为一实施范例，各种SAP消化反应皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
转录作用及核酸酶裂解反应：
利用T7DNA&RNA聚合酶于T7启动子(promoter)处启动体外转录作用(in vitrotranscription),反应使用去氧三磷酸胞苷(dCTP)与三磷酸尿苷、三磷酸腺苷及三磷酸鸟苷(UTP,ATP,GTP)作为聚合原料合成去氧与非去氧核醣核酸混合产物。在同一时间RNase A酵素在产物上的尿嘧啶(U)位置上进行RNA核酸酶裂解反应，将RNA切成不同大小的核酸裂解片段，由于相同病毒型的核酸序列相同或极相似，因此相同病毒型的核酸序列经过RNase核酸酶裂解反应后会产生相同或相似的核酸裂解片段大小。
上述的转录作用及裂解反应的实施方式，如下所表述。先依照表5所示的各反应试剂的浓度及体积，配制一转录裂解混合液。
表5：
将上述2.5ul的转录裂解混合液加入384孔盘的各孔洞中。将2ul的SAP消化反应后产物加入384孔盘的各孔洞中。以胶膜封好384孔盘后震荡,以1000RPM离心一分钟。加热至37℃进行3小时，冷却至4℃保存所得到的产物。以上转录作用及核酸裂解反应为一实施范例，各种转录作用及核酸裂解反应皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
纯化：
使用刮勺将6mg清洁树脂(Clean Resin)填入凹孔板(dimple plate)，静置20-30分钟，使之稍微干燥。在384孔盘的各孔洞中加入21.5ul水,及7ul的转录裂解产物，再离心30秒。将凹孔版倒扣到384孔盘上,将清洁树脂填入各孔洞中。以胶膜封好384孔盘后震荡,以1000RPM离心一分钟。旋转反应15分钟后,以3200g离心5分钟,准备进行点片。以上纯化步骤为一实施范例，各种纯化步骤皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
质谱仪检测核酸裂解片段大小：
纯化后的产物使用纳升点样仪美国Sequenom公司)，点至含基质的芯片(美国Sequenom公司)，并使用飞行时间质谱仪激发核酸裂解片段群于真空电场中飞行，通过感应器撷取各核酸裂解片段的分子量讯号，而衍伸出各核酸裂解片段的分子量大小。之后以一预建的核酸裂解片段资料库与被检测物种的核酸裂解片段进行比较分析和分型结果判断。
核酸裂解片段资料库：
在传统的方法中，例如以胶体电泳分离不同核酸裂解片段大小，最多只能分离大小差距在1-5个碱基以上的两核酸裂解片段，相同碱基数但是不相同序列的两核酸裂解片段，在胶体电泳中无法被分离。而在本发明中，是利用质谱仪测定各核酸裂解片段的分子量，而非利用胶体电泳来测定核酸咧解片段的大小。由于各种核苷酸皆有其各自分子量，如表6所述。
表6：
因此不但不同大小的核酸裂解片段会有不同大小的分子量，而且不同序列的片段也会有不同大小的分子量，由此可知，使用质谱仪做为核酸裂解片段的侦测方法将能精密地分辨差距在1个碱基以内的两核酸裂解片段，甚至是碱基数目相同但是序列不相同的两核酸裂解片段，因此其精密度将会远大于传统的胶体电泳的方法。
这种HPV病毒型的序列可以从美国NIH(National Institutes of Health)的NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Disease)网站(http:// pave.niaid.nih.gov/index.html#prototypes？type＝human)查得。
经由表6中的各种核苷酸的分子量，以及RNase会在尿嘧啶(U)位置上进行RNA裂解的特性(相对应于HPV的DNA的胸腺嘌呤(T)的位置)，可以推算出各HPV病毒型在经过核酸酶裂解反应之后，各核酸裂解片段的分子量，将各HPV病毒型的各核酸裂解片段分子量储存而建立起一HPV核酸裂解片段分子量的资料库，如表7A至7B所示。图2显示本发明中所述资料库的各HPV病毒型的核酸裂解片段大小。
表7A：
| 病毒型 | HPV001 | HPV002 | HPV003 | HPV004 | HPV005 | HPV006 | HPV007 | HPV008 | HPV009 | HPV010 |
| 片段1 | 1891.192 | 1851.167 | 1811.143 | 1891.192 | 1811.143 | 1851.167 | 1923.19 | 1811.143 | 1851.167 | 1867.166 |
| 片段2 | 1963.215 | 1867.166 | 1867.166 | 1907.191 | 1891.192 | 1931.216 | 1931.216 | 1851.167 | 1907.191 | 1891.192 |
| 片段3 | 2019.239 | 1891.192 | 1923.19 | 1931.216 | 1907.191 | 1963.215 | 1947.216 | 1923.19 | 1923.19 | 1923.19 |
| 片段4 | 2212.376 | 1907.191 | 1963.215 | 1947.216 | 1923.19 | 2332.449 | 1963.215 | 1947.216 | 1947.216 | 1963.215 |
| 片段5 | 2252.4 | 1923.19 | 2003.24 | 1963.215 | 1947.216 | 2380.447 | 2196.376 | 1987.24 | 1963.215 | 2003.24 |
| 片段6 | 2276.425 | 1963.215 | 2236.401 | 1979.214 | 1963.215 | 2509.587 | 2212.376 | 2196.376 | 1987.24 | 2196.376 |
| 片段7 | 2332.449 | 2003.24 | 2268.399 | 1987.24 | 1979.214 | 2565.611 | 2220.402 | 2252.4 | 2196.376 | 2220.402 |
| 片段8 | 2348.449 | 2100.328 | 2292.425 | 2019.239 | 1987.24 | 2613.609 | 2300.451 | 2292.425 | 2236.401 | 2268.399 |
| 片段9 | 2364.448 | 2156.352 | 2332.449 | 2220.402 | 2252.4 | 2637.634 | 2316.45 | 2348.449 | 2276.425 | 2316.45 |
| 片段10 | 2565.611 | 2172.351 | 2364.448 | 2236.401 | 2308.424 | 2693.658 | 2348.449 | 2525.586 | 2332.449 | 2324.423 |
| 片段11 | 2637.634 | 2252.4 | 2501.561 | 2276.425 | 2316.45 | 2758.747 | 2364.448 | 2597.609 | 2348.449 | 2364.448 |
| 片段12 | 2758.747 | 2292.425 | 2814.771 | 2332.449 | 2332.449 | 3159.98 | 2565.611 | 2605.635 | 2541.585 | 2501.561 |
| 片段13 | 2854.796 | 2324.423 | 2838.796 | 2581.61 | 2364.448 | 3649.288 | 2597.609 | 2621.635 | 2838.796 | 2565.611 |
| 片段14 | 3264.055 | 2332.449 | 3143.981 | 2597.609 | 2597.609 | 3762.376 | 2653.633 | 2653.633 | 2926.819 | 2613.609 |
| 片段15 | 3585.238 | 2348.449 | 3561.213 | 2693.658 | 2661.659 | 3778.375 | 2894.82 | 2661.659 | 3256.029 | 2814.771 |
| 片段16 | 3794.374 | 2501.561 | 3585.238 | 2718.723 | 2886.794 | 3850.398 | 2902.794 | 2814.771 | 3890.423 | 2950.844 |
| 片段17 | 3874.424 | 2581.61 | 3834.399 | 3722.351 | 2894.82 | 3913.2 | 3384.076 | 2830.77 | 3913.2 | 3175.979 |
| 片段18 | 3913.2 | 2653.633 | 3874.424 | 3913.2 | 2926.819 | 5921.705 | 3593.264 | 2894.82 | 4227.659 | 3200.005 |
| 片段19 | 3914.448 | 2693.658 | 3913.2 | 3994.497 | 3159.98 | 3913.2 | 2902.794 | 4790.03 | 3601.238 | |
| 片段20 | 3930.448 | 2814.771 | 5127.213 | 3913.2 | 5537.511 | 3529.215 | 4942.102 | 3913.2 | ||
| 片段21 | 4757.978 | 2838.796 | 5624.494 | 3930.448 | 7752.865 | 3913.2 | 4107.585 | |||
| 片段22 | 4878.052 | 3913.2 | 4846.054 | 3914.448 | 5640.494 | |||||
| 片段23 | 4123.584 | 6789.261 | 7006.423 | 5761.607 | ||||||
| 片段24 | 5745.608 | 7576.767 | ||||||||
| 片段25 |
表7B：
数据分析：
将被检测的HPV病毒型的各核酸裂解片段的分子量大小逐一与资料库中预存的各已知HPV病毒型的数个已知核酸裂解片段的分子量比较。当所述被检测的HPV病毒型的各核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两者的分子量之间相差小于一特定可容忍误差时，在此时施例中，设定该特定容忍误差为2道尔吞值，则认定两者为相同的核酸裂解片段。之后，计算一比值N/M，其中被认定为相同的核酸裂解片段的数量N(做为该比值的分子N)相对于资料库中一已知HPV病毒型的核酸裂解片段的总数M(作为该比值的分母)。并以所述比值N/M代表所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相似度，相似度越高者则样本中被鉴定的病毒越有可能此病毒型。
请参阅表8A及表8B，其为本发明的物种分型鉴定方法运用于HPV病毒型的鉴定时，病毒型鉴定结果的范例，其显示资料库中各病毒型与被检测病毒的相似度比值。病患1对于HPV006、HPV070、HPV075的相似度分别为88.89％、82.61％、及60.87％，即代表HPV006、HPV070、HPV075的各核酸裂解片段中，分别有88.89％、82.61％、及60.87％的核酸裂解片段是与病患1带有的HPV的核酸裂解片段相同。因此病患1所带有的HPV病毒型最有可能为HPV006，HPV070次之，HPV075的可能性则较低。
表8A
表8B
丛集分析：
由于多型别感染在HPV流行病学中是一种常见的现象，其指的是一个个体被感染了多种不同病毒型的HPV，且个体在不同的时间段所感染的HPV型别也可以有所不同。因此在同一检体中有可能含有多种HPV病毒型，更增加了辨识HPV病毒型的的困难度，于是本发明提供了一方法用于解决此问题。所述的方法将资料库中的各HPV病毒型与被检测的HPV病毒型别比较，从资料库中区分出具高相似度的病毒型的丛集，在所述高相似度丛集内的病毒型别即为高可能性的单一或复合感染的病毒型，当高相似度丛集内的HPV病毒型只有一个即为单一病毒型感染，当高相似度丛集内的HPV病毒型有多个即为复合型感染。
请参阅图2，其为本发明的物种分型鉴定方法中，所述的丛集分析的流程图。以下为高相似度丛集的筛选方法(S70)所包含之步骤：
步骤(S71)从所述资料库中多个病毒型的多个所述比值N/M中，随机取其中一较大的比值，做为一高相似度丛集的中心，并随机取其中一较小的比值，做为一低相似度丛集的中心；
步骤(S72)计算所述所有病毒型的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；
步骤(S73)若所述病毒型与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述病毒型被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述病毒型与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述病毒型被分配到所述低相似度丛集；
步骤(S74)计算出所述高相似度丛集中所有病毒型的所述比值N/M的平均值做为新的高相似度丛集的中心，计算出所述低相似度丛集中所有病毒型的所述比值N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；
步骤(S75)再次计算所述所有病毒型的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值，
步骤(S76)若所述病毒型与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述病毒型重新被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述病毒型与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述病毒型重新被分配到所述低相似度丛集；
步骤(S77)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的病毒型所之前相同，则所述高相似度丛集中的病毒型即判断为所述被检测检体中可能具有的病毒，而所述低相似度丛集中的病毒型即判断为不是所述被检测检体中的病毒；
其中当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的病毒型所之前不相同，则重复步骤(S74)、步骤(S75)及步骤(S76)直到被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的病毒型所之前相同，则所述高相似度丛集中的病毒型即判断为所述被检测检体中可能具有的病毒，而所述低相似度丛集中的病毒型即判断为不是所述被检测检体中的病毒。
请参阅表8A及表8B，其显示资料库中各病毒型与被检测病毒的相似度比值、所属丛集，图中丛集栏的O代表高相似度丛集，X代表低相似度丛集。以患者1的5个最高相似度的病毒型做为例子，其分别为HPV006、HPV070、HPV075、HPV130、HPV004，而其相似度分别为88.89％、82.61％、60.87％、57.89％、57.89％。在步骤S71中，随机取HPV075(60.87％)做为高相似度丛集中心及HPV130(57.89％)做为低相似度丛集中心。在步骤(S72)及(S73)中，由于HPV006(88.89％)、HPV070(82.61％)、HPV075(60.87％)距离高相似度丛集中心(60.87％)较近，所以被分配到高相似度丛集，而HPV130(57.89％)、HPV004(57.89％))距离低相似度丛集中心(57.89％)较近，所以被分配到低相似度丛集。在步骤(S74)中，计算出高相似度丛集中各病毒型的相似度的平均值为77.46％做为新的高相似度丛集中心，而低相似度丛集中各病毒型的相似度的平均值为57.89％做为新的低相似度丛集中心。在步骤S75及步骤S76中，由于HPV006(88.89％)、HPV070(82.61％)距离新的高相似度丛集中心(77.89％)较近，以被分配到高相似度丛集，而HPV075(60.87％)、HPV130(57.89％)、HPV004(57.89％))距离低相似度丛集中心(57.89％)较近，所以被分配到低相似度丛集。在步骤(S77)中，由于被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的病毒型所之前不相同，所以重复步骤(S74)、步骤(S75)及步骤(S76)。在步骤(S74)中，计算出高相似度丛集中各病毒型的相似度的平均值为85.75％做为新的高相似度丛集中心，而计算低相似度丛集中各病毒型的相似度的平均值为58.88％做为新的低相似度丛集中心。在步骤(S75)及步骤(S76)中，由于HPV006(88.89％)、HPV070(82.61％)距离新的高相似度丛集中心(85.75％)较近，以被分配到高相似度丛集，而HPV075(60.87％)、HPV130(57.89％)、HPV004(57.89％)距离低相似度丛集中心较近，所以被分配到低相似度丛集(58.88％)。在步骤(S77)中，由于被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的病毒型与之前相同，则所述高相似度丛集中的病毒型HPV006(88.89％)、HPV070(82.61％)，即为患者1可能带有的病毒，而所述低相似度丛集中的病毒型HPV075(60.87％)、HPV130(57.89％)、HPV004(57.89％)即为患者1不带有的病毒。由此可得知患者1为一复合型感染案例。以类似的方似将患者2的多个病毒型区分为两个丛集，其中高相似度丛集中只有HPV061(85％)此一病毒型，由此可知患者2为一单一感染的案例。
去重复步骤：
可选择地，本发明之物种分型的方法，还可包含一去重复步骤。其通过省略资料库中HPV病毒型的变异度低的核酸裂解片段的比较步骤，以减少干扰代表相似度的比值N/M的计算结果。真正相似病毒型的N/M比值并不会受到这个去重复步骤引响太大，相反的，较不相似的病毒型的N/M比值将会大幅降低，通过此步骤来突显出各病毒型的相似度的差异性，通过此方法增加相似度的准确性。
请参阅图3，其为本发明的物种分型鉴定方法的另一实施例的流程图，其中包含一去重复步骤。所述去重复步骤的实施方式如下：
(S35)在所述数据分析之前，先将资料库中所述已知病毒型的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库另一已知相近病毒型的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较，以确定两者之间具有那些重复的已知核酸裂解片段；
(S40')接着在进行数据分析的时候，使所述被检测的各被检测核酸裂解片段省略执行与所述重复的已知核酸裂解片段的比较作业。
举例而言，请参阅表8A及表8B，其显示资料库中各病毒型与被检测病毒的相似度比值、所属丛集及去重复步骤后的相似度比值。在病患1中，相似度最高的病毒型HPV006(88.89％)与相似度次高的病毒型HPV070(82.61％)的核酸裂解片段做比较，确认两者之间相同的核酸裂解片段，而在计算HPV006的比值N/M时，省略被认定为相同的核酸裂解片段，而重新计算得到一个去重复后的相似度比值N/M 83.33％。相似度次高的病毒型HPV070(82.61％)与相似度最高的病毒型HPV006(88.89％)的核酸裂解片段做比较，确认两者之间相同的核酸裂解片段，而在计算HPV070的比值N/M时，省略被认定为相同的核酸裂解片段，而重新计算得到一个去重复后的相似度比值N/M 76.47％。相似度第三高的病毒型HPV075(60.87％)与相似度最高的病毒型HPV006(88.89％)的核酸裂解片段做比较，确认两者之间相同的核酸裂解片段，而在计算HPV075的比值N/M时，省略被认定为相同的核酸裂解片段，而重新计算得到一个去重复后的相似度比值N/M 47.06％。相似度第四高的病毒型HPV130(57.89％)与相似度最高的病毒型HPV006(88.89％)的核酸裂解片段做比较，确认两者之间相同的核酸裂解片段，而在计算HPV130的比值N/M时，省略被认定为相同的核酸裂解片段，而重新计算得到一个去重复后的相似度比值N/M 38.46％。相似度第五高的病毒型HPV004(57.89％)与相似度最高的病毒型HPV006(88.89％)的核酸裂解片段做比较，确认两者之间相同的核酸裂解片段，而在计算HPV004的比值N/M时，省略被认定为相同的核酸裂解片段，而重新计算得到一个去重复后的相似度比值N/M 42.86％。HPV006其相似度比值N/M在去重复步骤后仅仅下降了5.56％，HPV070其相似度比值N/M在去重复步骤后也只下降了6.14％，然而HPV075、HPV130及HPV004在去重复步骤后的相似度比值N/M，却分别下降了13.81％、19.43％及15.03％。由此可看出真正相似的病毒型的相似度，较不会受到去重复步骤的影响而大幅下降。
然而为了简化所述去重复步骤，可以只对高相似度丛集中的病毒型执行所述去重复步骤。当高相似度丛集中的病毒型中有2个以上的高相似度病毒型时，则对所述的高相似度病毒型进行所去的去重复步骤以进行验证，当高相似度丛集中的病毒型中只有1个以下的高相似度病毒型时，则无需进行去重复步骤。
本发明的分型鉴定方法与传统的定序鉴定方法的结果比较：
如图4A-4B所示，其代表从168个病患的检体中，分别使用序列定序法及使用本发明所提供的物种分型鉴定法所鉴定出来的各病毒型的案例数量，其中横轴上的数字代表基因型，纵轴上的数字代表案例数量，深色柱状条代表由序列定序所测得的结果，浅色柱状条代表由本发明所提供的物种分型鉴定法所测得的结果，由于本发明所提供的方法还可以鉴定出复合感染的病毒型，因此案例总数为174件，较序列定序法的案例数168件来得多。而本发明所提供的物种分型鉴定方法与序列定序法的鉴定结果的关联性R为0.9675，其显示本发明的方法确实有效，幷且可以取代序列定序法。
应当理解的是，上述的描述仅旨在作为示例，许多其它的实施例在本发明所附的权利要求书所限定的范围内是可能的，例如使用本发明所提供的方法于不同种类的病毒、细菌或是其他物种。
Claims (11)
1.一种利用核酸裂解片段的分子量进行物种分型鉴定的方法，其特征在于：
所述方法包含步骤:
(S10)进行一聚合酶连锁反应，通过至少一对特定引子，扩增一被检测物种的一段核酸序列；
(S20)进行一核酸酶裂解反应，通过至少一个核酸酶，将所述被检测物种的所述核酸序列裂解，而产生数段分子量大小不同的被检测核酸裂解片段；
(S30)以一质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小；
(S40)将所述被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与一资料库中预存的一已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较；
(S50)当所述被检测核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两者的分子量之间相差小于2道尔吞值时，则认定两者为相同的核酸裂解片段；以及
(S60)计算所述认定为相同的被检测核酸裂解片段的数量N相对于所述已知物种的已知核酸裂解片段的总数M的一比值N/M，并以所述比值N/M代表所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相似度，
其中当所述步骤(S40)中的资料库中的已知物种为2个或以上时，在步骤(S60)后进一步包含以下步骤：
(S71)从所述资料库中多个物种的多个所述比值N/M中，随机取其中一较大的比值，做为一高相似度丛集的中心，并随机取其中一较小的比值，做为一低相似度丛集的中心；
(S72)计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；
(S73)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述低相似度丛集；
(S74)计算出所述高相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的高相似度丛集的中心，计算出所述低相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；
(S75)再次计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；
(S76)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述低相似度丛集；及
(S77)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种；
其中当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种与之前不相同，则重复步骤(S74)、步骤(S75)及步骤(S76)直到被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤(S40)前，先将资料库中预存的所述已知物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库中预存的另一已知相近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较，以确定两者之间具有那些重复的已知核酸裂解片段；接着在进行步骤(S40)时，使所述被检测物种的各被检测核酸裂解片段省略执行与所述重复的已知核酸裂解片段的比较作业。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：将资料库中预存的所述已知物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库中预存的所述另一已知相近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较时，所述已知物种及所述另一所述已知物种皆选自于所述高相似度丛集中的物种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸序列为DNA序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：在所述步骤(S20)之前，先进行一转录反应，将DNA序列转录为RNA序列。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述核酸酶为RNase。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述RNase为RNase A，其针对所述RNA序列中的U位进行点裂解。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述被检测物种为微生物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述微生物为细菌或病毒。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述被检测物种为动物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述被检测物种为人类。
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