CN105339004B - 抗il-4/抗il-13双特异性抗体配制物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供稳定的药物抗体配制物，其包括冻干配制物，所述冻干配制物含有抗IL‑4/抗IL‑13双特异性抗体和缓冲系统，其中所述配制物的pH为约7，且其中所述配制物具有低盐浓度进而降低所述配制物的离子强度。所述配制物可任选地进一步包含非离子表面活性剂、糖和/或非离子稳定剂。所述配制物可用于治疗多种疾病。

Description

抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体配制物
发明领域
本发明提供稳定的药物抗体配制物，其包括冻干的配制物，所述冻干的配制物含有抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体和缓冲系统，其中所述配制物的pH为约7，且其中所述配制物具有低盐浓度进而降低所述配制物的离子强度。所述配制物可任选地进一步包含非离子表面活性剂、糖和/或非离子稳定剂。所述配制物可用于治疗多种疾病。
发明背景
基于其生物学功能，IL-4和IL-13是治疗上重要的细胞因子，且在许多疾病中起至关重要的作用，包括哮喘(Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005,Vo.5,161-166)。已表明IL-4能够抑制自身免疫性疾病，且IL-4和IL-13都展示增强抗肿瘤免疫响应的潜力。由于两种细胞因子都参与过敏性疾病的病理，对这些细胞因子的抑制可提供治疗效果。
为开发包含适于皮下施用的包含抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的药物配制物，所述抗体必须浓缩至约100mg/mL或更高。然而，在这样的高浓度下可引发许多复杂问题(complication)，包括粘度提高、pH偏移、溶液颜色变化和可视和亚可视颗粒的形成。抗体配制物由于在高浓度下高度易于聚集的事实而进一步复杂化。尽管典型的抗体在5℃历时4年的过程中通常形成5％以下高分子量聚集物(HMW)，但抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体在25℃以0.5-1％每小时且在5℃以0.1％每小时的速率形成HMW。事实上，该抗体具有如此强的聚集倾向，以至于其不能以目标浓度范围配制于液体中。最后，抗IL4/抗IL13双特异性抗体具有特别低的等电点，使其由于溶解度的问题更难以配制。举例来说，抗IL4/抗IL13双特异性抗体具有5.8-6.2的等电点，而大多数抗体具有8-10的等电点。
相应地，对于可解决这些复杂问题的改进和稳定的药物配制物存在需求。
发明概述
为满足这些或其他需要，本文提供了高度稳定的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体配制物。已惊讶地发现高度稳定的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体配制物可以为液体和冻干粉末的形式，其包含抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体和缓冲系统，其中所述配制物的pH为约pH7，且其中所述配制物具有低盐浓度进而降低所述配制物的离子强度。所述配制物可任选地进一步包含非离子表面活性剂、糖和/或非离子稳定剂。这些配制物可改善常规配制物，后者经常在配制物中增加抗体浓度时导致抗体的分子聚集(HMW)并形成可视和亚可视颗粒。具体地，本发明的配制物就可视颗粒、亚可视颗粒、低分子量蛋白和高分子量蛋白而言展现良好的稳定性。
本发明的一个实施方案提供稳定的抗体配制物，其包含：含有式VL1-接头-VL2的轻链和式VH1-接头-VH2的重链的双特异性抗IL-4/抗IL-13抗体或其抗原结合片段，其中VL1和VH1形成IL-13抗原结合结构域且VL2和VH2形成IL-4抗原结合结构域；和适于将所述配制物的pH维持在约pH7的缓冲系统；且其中所述配制物具有低盐浓度进而降低所述配制物的离子强度。
在具体的实施方案中，VL1包含SEQ ID NO:1的CDR序列；VH1包含SEQ ID NO:2的CDR序列；VL2包含SEQ ID NO:3的CDR序列；且VH2包含SEQ ID NO:4或5的CDR序列。在可替换的实施方案中，VL1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；VH1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；VL2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；且VH2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，所述轻链包含式N-VL1-接头-VL2-CL，其中CL是抗体的轻链恒定结构域，且其中重链包含式N-VH1-接头-VH2-CH1-CH2-CH3，其中CH2-CH3对应抗体的Fc结构域。在具体的实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含恒定区结构域。在具体的实施方案中，所述恒定区结构域选自下组：CH1、CH2、CH3和CL。
在具体的实施方案中，所述双特异性抗体或其抗原结合片段是人源化的IgG4双特异性抗体或其抗原结合片段。
在具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的浓度为约100mg/mL。
在本发明的一些实施方案中，所述缓冲系统包含至少两种缓冲剂。在具体的实施方案中，所述缓冲系统浓度为约10mM。在具体的实施方案中，所述缓冲系统包含Tris缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在具体的实施方案中，所述Tris缓冲剂的浓度为约3.7mM。在具体的实施方案中，所述磷酸盐缓冲剂的浓度为约6.3mM。在具体的实施方案中，所述Tris缓冲剂的浓度为约3.7mM且所述磷酸盐缓冲剂的浓度为约6.3mM。
在本发明的一些实施方案中，所述配制物进一步包含非离子表面活性剂。在具体的实施方案中，所述非离子表面活性剂的浓度为约0.05％至约0.2％(w/v)。在具体的实施方案中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯。在具体的实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯80。在具体的实施方案中，所述聚山梨酯80的浓度为约0.05％至约0.2％(w/v)。在具体的实施方案中，所述聚山梨酯80的浓度为约0.2％(w/v)。
在本发明的一些实施方案中，所述配制物进一步包含糖。在具体的实施方案中，所述糖的浓度为约5％(w/v)。在具体的实施方案中，所述糖是二糖。在具体的实施方案中，所述二糖是蔗糖。在具体的实施方案中，所述蔗糖的浓度为约5％(w/v)。
在本发明的一些实施方案中，所述配制物进一步包含非离子稳定剂。在具体的实施方案中，所述非离子稳定剂的浓度为约1％至约3％(w/v)。在具体的实施方案中，所述非离子稳定剂为氨基酸或糖。在具体的实施方案中，所述氨基酸是脯氨酸。在具体的实施方案中，所述糖是甘露糖醇。在具体的实施方案中，所述脯氨酸的浓度为约1％至约3％(w/v)。在具体的实施方案中，所述脯氨酸为约3％(w/v)。在具体的实施方案中，所述甘露糖醇的浓度为约3％(w/v)。
在本发明的一些实施方案中，所述配制物是冻干配制物。
在本发明的一些实施方案中，所述配制物就可视颗粒、亚可视颗粒、低分子量蛋白和高分子量蛋白而言展现良好稳定性。
本发明的一个实施方案提供稳定的冻干抗体配制物，其包含：约100mg/mL的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区；约10mM的缓冲系统，其中所述缓冲系统包含浓度约3.7mM的Tris缓冲剂和浓度约6.3mM的磷酸盐缓冲剂；约0.2％(w/v)聚山梨酯80；约5％(w/v)蔗糖；和约3％(w/v)脯氨酸；其中所述配制物的pH为约pH 7。
本发明的一个实施方案提供稳定的冻干抗体配制物，其包含：约100mg/mL的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区；约10mM的缓冲系统，其中所述缓冲系统包含浓度约3.7mM的Tris缓冲剂和浓度约6.3mM的磷酸盐缓冲剂；约0.2％(w/v)聚山梨酯80；约5％(w/v)蔗糖；和约3％(w/v)甘露糖醇；其中所述配制物的pH为约pH 7。
本发明的一个实施方案提供试剂盒，其包含含有本发明的配制物的容器和用于施用和使用所述配制物的说明。
本发明的一个实施方案提供用于治疗过敏性疾病、癌症、哮喘、与IL-4和/或IL-13的异常产生相关的疾病或与升高的TH-2介导的响应相关的疾病的方法，其包括向对其有需要的受试者施用本发明的配制物。
附图简述
图1是概要图，其显示例示性的双特异性抗IL-4/抗IL-13抗体分子，所述分子包含两条轻链和两条重链。两条轻链包含N-VLhB-B13-接头-VLh8D4-8-CL-C部分，而两条重链包含N-VHhB-B13-接头-VHh8D4-8-CH1-CH2-CH3-C部分。接头序列包含(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:6)。
图2阐述了例示性抗体的氨基酸序列，即B-B13抗IL-13抗体的人源化可变结构域(SEQ ID NO:1和2)和8D4-8抗IL-4抗体的人源化可变结构域(SEQ ID NO:3、4和5)。下划线表明作出的氨基酸改变。黑体表明CDR序列(SEQ ID NO:7-21)。
图3是展示摇动应激后测试#P5(pH-缓冲剂筛选)的颗粒污染的图组。
图4是展示测试#P6(pH-缓冲剂筛选)的数种应激后亚可视颗粒>1.5μm污染的图。
图5是展示测试#P6(pH-缓冲剂筛选)的数种应激后亚可视颗粒>10μm的污染图。
图6是展示测试#P6(pH-缓冲剂筛选)的热应激后HMW水平图。
图7是展示45℃2周后测试#P5(pH-缓冲剂筛选)的SEC色谱图。
图8是45℃2周后测试#P5(pH-缓冲剂筛选)的SDS-PAGE凝胶的照片。
图9是45℃2周后测试#P5和6(pH-缓冲剂筛选)的IEF凝胶的照片。
图10是展示对测试#P13(盐影响)进行应激程序后的图。
图11是展示机械应激后测试#P12(表面活性剂)的双目成像图。
图12是展示在5℃保存6周时测试#P12(表面活性剂)的HMW监测图。
图13是展示在5℃保存6周时测试#P12(添加剂)的HMW监测图。
图14是展示在5℃保存4周时测试#P20-FDS(添加剂)的HMW监测图。
图15是展示在5℃保存2周时测试#P21(添加剂)的HMW监测图。
图16是在Lead配制物中比较1％脯氨酸v.3％脯氨酸随时间的函数中单体含量逆转。
图17是配制物#P16-1在冷冻干燥过程中随温度的图。
图18是15mL模压玻璃小瓶中#P18-1结块的照片。
图19是展示冻干过程后测试#P14(添加剂)的HMW水平图。
图20是展示冻干后测试#P20(添加剂)的HMW水平的图。
图21是展示HMW水平的图(a)和未配制的DS(测试#9)上冷冻/融化循环后的照片(b)。
图22是展示重构后测试#P14(添加剂)的HMW水平的图。
图23是展示重构后测试#P20(添加剂)的HMW水平的图。
图24是展示结块保存和重构后测试#P17(添加剂)的HMW水平的图。
图25是展示结块保存和重构后测试#P20(添加剂)的HMW水平的图。
图26是展示首次筛选(测试#H04-150至172-pH-缓冲剂筛选)的DSC结果。
图27是展示组氨酸和琥珀酸盐配制物(测试#P-H04-144和148，#H04-150A1至A6)可视化方面的照片。
图28是展示在5℃(测试#H04-150 B1)和RT(测试#H04-163 A1、B1、B2和H04-172A1、A2)通过SEC对于缓冲剂筛选的HMW进化图。
图29是展示对磷酸盐/Tris缓冲剂(测试#H04-187)的pH筛选的DSC结果。
图30是展示通过SEC对磷酸盐/Tris缓冲剂(测试#H04-187)的pH筛选的HMW进化图。
图31是展示对于缓冲剂浓度筛选(测试#H04-185)的DSC结果的图。
图32是通过SEC在RT随着缓冲剂浓度的HMW进化的图(测试#H04-185)。
图33是展示通过SEC在RT对于NaCl的HMW进化的图(测试#H04-185)。
图34是展示通过SEC在RT对于甘氨酸vs蔗糖的HMW进化的图表(测试#H04-185)。
发明详述
本发明不限于本文描述的特定的方法学、方案、细胞系、载体或试剂，这是由于其在不脱离本发明的精神和保护范围下可能发生变化。此外，本文使用的术语学仅出于例示特定实施方案的目的，且并非意在限制本发明的保护范围。任何与本文公开相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践且本文仅描述了例示性的方法、装置和材料。
本文的全部专利和出版物出于描述和公开可与本发明一起或在其中使用的蛋白质、酶、载体、宿主细胞和其中报导的方法学的目的都通过提述以其全文并入。然而，本文不应理解为是对本发明没有资格由于在先发明而先于这些公开内容的承认。
A.定义
除非另外表明，本文使用的全部技术和科学术语具有由本领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
此处应该注意的是，除非上下文清楚另外表明，如在本发明和附加的权利要求中使用，单数形式"一个"、"一种"和"所述"也包括复数的指代物。
术语"约"或"大致"意为在给定值或范围的10％内，且更优选在5％内(或1％或更少)。
术语"将…施用"或"施用"指将存在于体外的物质(例如本发明的配制物)注射或以其他方式物理递送入患者的行为，如粘膜、皮内、静脉内、皮下、肌内递送和/或本文描述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当治疗某种疾病或其症状时，物质的施用通常在疾病或其症状发作后发生。当预防某种疾病或其症状时，物质的施用通常在疾病或其症状发作前发生。
在多肽背景中，术语"类似物"指与抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体具有相似或相同功能，但无需包含与抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体相似或相同的氨基酸序列的多肽，或与抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体具有相似或相同结构的多肽。具有相似氨基酸序列的多肽指满足至少下列之一的多肽：(a)具有与本文描述的抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽(例如SEQ ID NO:1-5)、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％和优选地至少90％、更优选至少95％，或更优选至少99％相同的氨基酸序列的多肽；(b)由在严格条件下与本文描述的编码抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的至少5氨基酸残基、至少10氨基酸残基、至少15氨基酸残基、至少20氨基酸残基、至少25氨基酸残基、至少40氨基酸残基、至少50氨基酸残基、至少60氨基酸残基、至少70氨基酸残基、至少80氨基酸残基、至少90氨基酸残基、至少100氨基酸残基、至少125氨基酸残基或至少150氨基酸残基的多肽(参见例如Sambrook等(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Maniatis等(1982)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；和(c)由与本文描述的编码抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％和优选地至少90％，更优选地至少95％、或最优选地至少99％相同的核苷酸序列编码的多肽。具有与抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体多肽、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体相似的结构的多肽指代具有与抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体多肽、抗IL-4/抗IL-13双特异性多肽的片段、抗IL-4/抗IL-13双特异性表位或抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体相似的二级、三级或四级结构的多肽。多肽结构可通过本领域的技术人员已知的方法确定，包括但不限于X射线晶体学、核磁共振和晶体电子显微术。
为确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分比同一性，将所述序列出于最佳比对目对齐(例如可将缺口引入第一个氨基酸序列或核酸序列，用于与第二氨基酸或核酸序列的最佳对齐)。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置由与在第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置相同。两序列间的百分数同一性是由序列共享的相同位置的数目的函数(即％同一性＝相同的重叠位置数/总位置数X100％)。在一个实施方案中，所述两序列在长度上相同。
两序列(例如氨基酸序列或核酸序列)间百分数同一性的确定也可使用数学算法实现。用于比较两序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268的算法，在Karlin and Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877中进行了修改。该算法并入Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST核苷酸程序参数设置实施，例如，设置为分数＝100、字长＝12以获得与感兴趣的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序参数设置实施，例如设置为分数50、字长＝3以获得与感兴趣的蛋白分子同源的氨基酸序列。出于比较目的，为获得缺口比对，可如Altschul等,1997,Nucleic acids Res.25:3389 3402所述应用缺口BLAST(Gapped BLAST)。可替换地，PSI BLAST可用于实施检测分子间远处关系的迭代搜索(同上)。当应用BLAST、缺口BLAST和PSI Blast程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数(参见例如万维网网站ncbi.nlm.nih.gov上的National Center for Biotechnology Information(NCBI))。应用的另一用于比较序列的优选、非限制性数学算法实例为Myers and Miller,1988,CABIOS4:11 17的算法。该算法并入ALIGN程序(版本2.0)，其为GCG序列比对软件包的部分。当应用用于比较氨基酸序列的ALIGN程序时，可使用PAM120重量残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。
两序列间的百分数同一性可使用与上文所述相似的具有或不具有允许的缺口的技术确定。在计算百分数同一性时，通常仅计数精确匹配。
"拮抗剂"或“抑制剂”指代能够抑制靶分子的一种或多种生物学活性的分子，如通过IL-4和/或IL-13的信号传导。拮抗剂可通过杀伤由配体激活的细胞或使由配体激活的细胞失能和/或通过干扰受体或配体活化(例如酪氨酸激酶活化)或配体与受体结合后的信号转导干扰受体与配体的结合，反之亦然。所述拮抗剂可完全阻断受体-配体相互作用或可基本上减少这种相互作用。在本发明的一些实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是人源化、拮抗性抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体，优选地为人源化、单克隆、拮抗性抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体。
术语"抗体"、"免疫球蛋白"或"Ig"在本文可交换使用。术语抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多重特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、内抗体、单链Fv(scFv)(例如包括单特异性、双特异性等)、驼源化抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体和上述任一种的表位结合片段。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即抗原结合结构域或包含与IL-4或IL-13抗原特异性结合的抗原结合位点的分子(例如抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的一个或多个互补决定区(CDR))。抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子。在优选的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是人源化的，如人源化单克隆抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体。在一些实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是IgG抗体、人IgG4抗体。
术语"抗原"指代能够由本发明的抗体结合的分子或分子部分。抗原可具有一个或多于一个表位。由本发明的抗体识别的抗原的实例包括但不限于血清蛋白，例如细胞因子如IL-4、IL5、IL9和IL-13、生物活性肽、细胞表面分子例如受体、转运体、离子通道、病毒和细菌蛋白。
术语“抗原结合位点”指代包含与抗原的部分或全部特异性结合或互补的区域的抗体部分。当抗原较大时，抗体可仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可由一种或多种抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合结构域由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)的组合生成。
术语"结合剂"意为与IL-4和/或IL-13或其变体或片段结合或特异性结合的任何分子，如抗体、siRNA、核酸、适配体、蛋白或小分子有机化合物。
术语“双特异性抗体”或“多种双特性异抗体(BsAb)”指代在单个分子内组合两种抗体的抗原结合位点的分子。因此，双特异性抗体能够同时结合两种不同抗原。除用于诊断目的应用外，BsAb也通过重新定向强效的效应物系统至疾病区域或通过增加抗体的中和或刺激活性为新治疗剂的应用铺平了道路。双特异性抗体可以是单克隆抗体，但优选为人抗体或人源化的抗体。用于制备双特异性抗体的方法也为本领域已知。
术语"副产品"包括不想要的产品，其削弱或减少治疗/预防结合剂如抗体在给定配制物中的比例。举例来说，典型的副产品包括抗体、抗体片段的聚集物，例如由抗体通过脱酰胺或水解产生的聚集物，或其混合物。通常，聚集物是分子量大于单体抗体的复合物。抗体降解产物可以包括举例来说，如通过脱酰胺或水解带来的抗体片段。通常降解产物为分子量小于单体抗体的复合物。在IgG抗体的情况中，这种降解产物小于约150kD。
术语"组合物"和"配制物"意在涵盖以任选地特定的量包含特定成分(例如抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体)的产物，以及任何通过以任选地特定的量组合特定成分直接或间接产生的任何产物。
术语"恒定区"或"恒定结构域"指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合但展现多种效应物功能，如与Fc受体的相互作用。该术语指相对免疫球蛋白的其他部分(可变结构域，其包含抗原结合位点)具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子部分。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域和轻链的CHL结构域。
术语"病症"指代可从使用本发明的配制物的治疗获益的任何病况。其包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物并且特别是人易于患有相关病症的病理病况。本文待治疗的病症的非限制性实例包括癌症、炎症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神经性疾病和代谢疾病。
术语"表位"指代位于抗原表面的区，如IL-4或IL-13多肽或IL-4或IL-13多肽片段，其能够与结合剂如抗体的一个或多个抗原结合区结合，且其在动物中具有抗原或免疫原活性，优选在哺乳动物中，且最优选地在人中，其能够引发免疫响应。具有免疫原活性的表位是多肽引发动物中抗体响应的部分。具有抗原活性的表位是如通过本领域已知的任何方法举例来说如免疫测定法所确定的抗体与之特异性结合的多肽的部分。抗原表位无需一定为免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面集合组成，如氨基酸或糖侧链，且具有特定的三维结构特性，以及特定的电荷特性。促成表位的多肽的区可以是多肽中连续的氨基酸或所述表位可以由多肽的两个或多个非连续的区共同形成。表位可以是也可以不是抗原的三维表面特征。在一些实施方案中，IL-4或IL-13表位是IL-4或IL-13多肽的三维表面特征。在其他实施方案中，IL-4或IL-13表位是IL-4或IL-13多肽的线性特征。抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体可特异性地与IL-4或IL-13的变性形式的表位、IL-4或IL-13的天然形式的表位或IL-4或IL-13的变性形式和天然形式两者的表位结合。
术语"赋形剂"指代通常用作药物的稀释剂、媒剂、防腐剂、结合剂、稳定剂等的惰性物质，其包括但不限于蛋白(例如血清白蛋白等)、氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如烷基磺酸盐、辛酸盐等)、表面活性剂(例如SDS、聚山梨酯、非离子表面活性剂等)、糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇等)。还参见Remington′s Drug Sciences(1990)Mack PublishingCo.,Easton,Pa.，其在本文通过提述以其全文并入。
在肽或多肽的上下文中，术语"片段"指代包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。这种片段可由氨基末端处的截短、羧基末端处的截短和/或从氨基酸序列内部缺失残基而产生。片段可由举例来说可替换的RNA剪接或由体内蛋白酶活性导致。在一些实施方案中，hIL-4或hIL-13片段包括含有IL-4或IL-13多肽或与IL-4或IL-13多肽特异性结合的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续残基、至少70个连续氨基酸残基、至少8个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。
短语和术语抗体或抗原的"功能性片段、变体、衍生物或类似物"等及其各种形式是具有与感兴趣的全长抗体或抗原共同的定性生物学活性的化合物或分子。举例来说，抗IL-4抗体的功能性片段或类似物是能与IL-4分子结合者或能预防或基本降低配体能力者，或为与IL-4结合的激动或拮抗抗体。
当用于指代抗体时，术语"重链"涉及五种不同类型，基于重链恒定结构域的氨基酸序列称为α、Δ、ε、γ和μ。这些不同的重链类型为本领域熟知且将分别导致五种抗体类型，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四种亚型，即IgG1、IgG1、IgG3和IgG4。优选地所述重链是人重链。
术语"铰链"或"铰链区"指代柔性多肽，其包含抗体第一和第二恒定结构域间的氨基酸。
非人(例如鼠类)抗体的"人源化"形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他靶结合亚序列)，与人抗体相比，其包含源自非人免疫球蛋白的序列。一般地，人源化抗体会基本上包含一个(通常两个)可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的CDR区与非人免疫球蛋白的那些对应，且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白模板序列的那些。人源化抗体还可至少包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常为所选人免疫球蛋白模板的那些。一般地，目标是获得在人中免疫原性最小的抗体分子。因此，也可以将一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸变为对人宿主免疫原性较小者，但基本上不减小所述一个或多个CDR对IL-4和/或IL-13的特异性结合功能。可替换地，FR可以是非人的，但将最具免疫原性的那些氨基酸用免疫原性较低的氨基酸替换。尽管如此，如上文讨论的CDR移植并非仅有的获得人源化抗体的方式。举例来说，由于框架残基通常并不具有决定CDR环三维结构和抗体对于其配体的整体亲和性的功能，因此仅修饰CDR区可能并不足够。因此，可以实践任何方式来修饰非人的亲代抗体分子成为对人具有较少免疫原性的抗体，且与人抗体的整体序列同一性并不总是必须。因此，也可实现人源化，举例来说，仅通过只对几个残基的取代，特别是暴露在抗体分子上而非埋于分子内且因此不能轻易到达宿主免疫系统的那些。参见，举例来说，Studnicka等,Prot Eng 7(6)805-814,1994；MolImm 44:1986-1988,2007；Sims等,J Immunol 151:2296(1993)；Chothia等,J Mol Biol196:901(1987)；Carter等,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285(1992)；Presta等,JImmunol 151:2623(1993),WO 2006/042333和美国专利5,869,619。可替换地，抗体可通过其他技术人源化，包括CDR移植(EPO0239400；WO 91/09967和美国专利5,530,101和5,585,089)、饰面(veneering)或表面重构(resurfacing)(EPO0592106；EPO0519596；Padlan,1991,Molec Imm 28(4/5):489-498；Studnicka等,1994,Prot Eng 7(6):805-814；和Roguska等,1994,PNAS 91:969-973)和链改组(chain shuffling)(美国专利5,565,332)。人抗体可通过多种本领域已知的方式制备，包括但不限于噬菌体展示方法，参见美国专利号4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，使用转基因动物如啮齿动物、使用嵌合细胞等。
“白细胞介素-4”(IL-4)涉及天然存在或内源性哺乳动物IL-4蛋白，也涉及具有与天然存在或内源性的对应哺乳动物IL-4蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白(例如重组蛋白、合成蛋白(即，使用合成有机化学的方法产生的))。相应地，如本文定义，术语包括成熟的IL-4蛋白、IL-4的多态性或等位基因变体和其他同种型，和上述的修饰或未修饰形式(例如脂质化、糖基化的)。天然存在或内源性IL-4包括野生型蛋白，如成熟的IL-4、多态性或等位基因变体和其他在哺乳动物(例如人、非人灵长类)中天然存在的同种型和突变体形式。举例来说，这些蛋白可从天然产生IL-4的来源回收或分离。这些蛋白和与天然存在或内源性的对应IL-4具有相同氨基酸序列的蛋白通过对应哺乳动物的名称指代。举例来说，当对应的哺乳动物为人时，蛋白指代人IL-4。数种突变IL-4蛋白为本领域已知，如公开于WO 03/038041的那些。
"白细胞介素-13"(IL-13)指代天然存在或内源性哺乳动物IL-13蛋白和具有与天然存在或内源性的对应哺乳动物IL-13蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白(例如重组蛋白、合成蛋白(即，使用合成有机化学的方法产生的))。相应地，如本文定义，术语包括成熟的IL-13蛋白、IL-13的多态性或等位基因变体和其他同种型(例如，通过可选的剪接或其他细胞过程产生)，和上述的修饰或未修饰形式(例如脂质化、糖基化的)。天然存在或内源性IL-13包括野生型蛋白，如成熟的IL-13、多态性或等位基因变体和其他在哺乳动物(例如人、非人灵长类)中天然存在的同种型和突变体形式。举例来说，如用于本文，IL-13涵盖人IL-13变体，其中成熟人IL-13的位置110处的Arg用Gin替代(成熟IL-13的位置110对应于前体蛋白的130)，其与哮喘(特应性和非特应性哮喘)有关，还涵盖其他IL-13变体(Heinzmann等，Hum Mol Genet.9:549-559(2000))。举例来说，这些蛋白可从天然产生IL-13的来源回收或分离。这些蛋白和与天然存在或内源性的对应IL-13具有相同氨基酸序列的蛋白通过对应哺乳动物的名称指代。举例来说，当对应的哺乳动物为人时，蛋白指代人IL-13。数种突变IL-13蛋白为本领域已知，如公开于WO 03/035847的那些。
"分离的"或"纯化的"结合剂如抗体基本上无来自所述结合剂源自的细胞或组织来源细胞材料或其他污染蛋白，或当化学合成时，基本上无化学前体或其他化学品。举例来说，词语"基本上无细胞材料"包括抗体制剂，其中所述抗体与从其中分离或重组产生所述抗体的细胞的细胞组分分开。因此，基本上无细胞材料的抗体包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重)异源蛋白(在本文也成为“污染蛋白”)的抗体制剂。当抗体重组产生时，其也优选地基本上无培养基，即培养基占蛋白制剂体积的少于约20％、10％或5％。当抗体通过化学合成产生时，其优选地基本上无化学前体或其他化学品，即其与化学前体或其他参与蛋白合成的化学品分开。相应地，这些抗体制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重)的化学前体或感兴趣的抗体之外的化合物。在优选的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是分离的或纯化的。
术语"Kabat编号"和类似术语是本领域认可的且指代在抗体的重链和轻链可变区或其抗原结合部分中对相比其他氨基酸残基更可变(即高变的)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat等(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)。对于重链可变区，高变区通常在CDR1的氨基酸位置31至35，CDR2的氨基酸位置50至65和CDR3的氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，高变区通常在CDR1的氨基酸位置24至34、CDR2的氨基酸位置50至56和CDR3的氨基酸位置89至97。
当用于指代抗体时，术语"轻链"指两种不同类型，基于恒定结构域的氨基酸序列称为κ和λ。轻链氨基酸序列为本领域熟知。在优选的实施方案中，所述轻链是人轻链。
术语“接头”指代连接抗体的抗原结合结构域的分子。接头可以是任何类型的接头分子。优选地，所述接头是多肽。在重链多肽和轻链多肽内所述接头可以彼此等同或不同。此外，所述接头可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。对于重链结构域的优选肽接头单元如对于轻链结构域为(G4S)2，即GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)。重链和轻链接头单元的数目可彼此等同(对称顺序)或不同(非对称顺序)。肽接头优选地足够长以提供足够的柔性程度来预防抗原结合部分彼此干扰活性，举例来说通过空间位阻，以允许合适的蛋白折叠，且如果需要的话，以允许抗体分子与相同细胞上两种或更多种(可能间隔较宽)的受体相互作用；而其优选地足够短以允许抗体部分在细胞中维持稳定性。因此，肽接头的长度、组成和/或构象可由本领域的技术人员轻易选择进而优化多价抗体的预期特性。
术语“低盐”和“低盐浓度”意为15mM或更少的相对低盐浓度，包括0的盐浓度或无盐。盐浓度由配制物中盐和缓冲剂的量确定。优选缓冲系统以低浓度存在于配制物中，即约15mM或更少，进而降低配制物的离子强度。可替换地，一些优选的实施方案不包含盐且无缓冲剂。还优选的是无额外的盐，如添加NaCl至配制物进而保持配制物的离子强度尽可能地低。
术语"管理"指受试者自疗法(例如预防剂或治疗剂)衍生的有益效果，其不导致感染的治愈。在一些实施方案中，对受试者施用一种或多种治疗(例如预防剂或治疗剂，如本发明的配制物)以"管理"IL-4或IL-13介导的疾病(例如癌症、炎症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神经疾病和代谢疾病)、其一种或多种症状，以便预防疾病的进展或恶化。
术语"单克隆抗体"指代从均质或基本上均质的抗体群获得的抗体，且每种单克隆抗体将主要识别抗原上的单表位。在优选的实施方案中，"单克隆抗体"是由单杂交瘤或其他细胞产生的抗体。术语"单克隆"不限于任何特定的用于制备抗体的方法。举例来说，单克隆抗体可通过杂交瘤方法如Kohler等；Nature,256:495(1975)中所述制备，或可从噬菌体文库分离。其他用于制备克隆细胞系和由此表达单克隆抗体的方法为本领域已知(参见举例来说，Chapter 11 in:Short Protocols in Molecular Biology,(2002)5th Ed.；Ausubel等,eds.,John Wiley and Sons,New York)。
如本发明中使用的术语"药物组合物"指代多种制剂的配制物。包含治疗上有效量的抗体的配制物是无菌的液体溶液、液体悬浮剂或冻干版本且任选地包含稳定剂或赋形剂。
术语"药物上可接受"意为由联邦或州政府的监管机构批准的或美国药典、欧洲药典或其他普遍认可的药典列举的可用于动物且更具体用于人。
"药物上可接受的赋形剂"意为任何与活性分子如单克隆抗体结合用于制备合适的或方便的剂型的惰性物质。"药物上可接受的赋形剂"是以采用的剂量和浓度对受体无毒性的赋形剂，且与包含单克隆抗体的配制物的其他成分相容。
术语"预防"指代由施用本文提供的疗法或疗法组合所致的IL-4或IL-13介导的疾病和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的全部或部分抑制(例如，预防剂或治疗剂如本发明的配制物的组合)。
术语"预防剂"指代任何可全部或部分抑制受试者中IL-4或IL-13介导的疾病和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的任何作用剂。在一些实施方案中，术语"预防剂"指代本发明的配制物。在一些其他实施方案中，术语“预防剂”指代非本发明配制物的作用剂。优选地，预防剂是已知可用于或已经或正在用于预防IL-4或IL-13介导的疾病和/或其相关症状，或阻碍IL-4或IL-13介导的疾病和/或其相关症状的发作、发展、进展和/或严重性的作用剂。在具体的实施方案中，所述预防剂是人源化抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体。
短语"重组抗体"包括通过重组方式制备、表达、生成或分离的抗体，如使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组、组合的人抗体文库分离的抗体，从就人免疫球蛋白基因而言为转基因和/或转染色体的动物(例如小鼠或牛)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或通过任何其他涉及人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方式制备、表达、生成或分离的抗体。这些重组抗体可具有源自免疫球蛋白序列的可变和恒定区(参见Kabat,E.A.等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)。然而在一些实施方案中，将这些重组抗体进行体外诱变(或者，当使用就人Ig序列而言为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可能在体内不天然存在于抗体生殖系储库内的序列(尽管源自生殖系VH和VL序列或与之相关)。
术语"糖"指代为多元醇的衍生物的一类分子。糖通常指碳水化合物且可包含不同量的糖(糖类)单位，例如单糖、双糖和多糖。
术语"特异性结合"或"特异结合"意为与抗原或其片段特异性结合，且与其他抗原并不特异性结合。举例来说，特异性与抗原结合的抗体可与其他具有较低亲和性的肽或多肽结合，如通过例如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIACORE或其他本领域已知的测定确定。特异性与抗原结合的抗体或其变体或片段可与相关抗原交叉反应。优选地，特异性与抗原结合的抗体或其变体或片段不与其他抗原发生交叉反应。可鉴别特异性与IL-4和/或IL-13抗原结合的抗体或其变体或片段，举例来说，通过免疫测定、BIAcore或其他本领域的技术人员已知的技术。通常，特异性或选择性反应将为背景信号或噪音的至少两倍，且更通常比背景多10倍。关于针对抗体特异性的讨论，参见例如Paul,ed.,1989,Fundamental Immunology Second Edition,Raven Press,New York at pages 332-336。
"稳定的"或"稳定化的"配制物是其中结合剂如抗体保存时在其中基本保持其物理稳定性、识别性、完整性和/或化学稳定性、识别性、完整性和/或生物学活性的配制物。本领域已有多种用于测量蛋白稳定性的分析技术且举例来说在Peptide and Protein DrugDelivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中进行了综述。稳定性可在所选温度和其他保存条件下在所选时间段测量。稳定性可通过至少一种选自下列的方法确定：目视检查、SDS-PAGE、IEF、HPSEC、RFFIT和κ/λELISA。举例来说，当对颜色和/或清澈度进行目视检查时，或如通过UV光散射、SDS-PAGE或通过(高压)尺寸排阻层析(HPSEC)测量时，如果其没有显示聚集、析出和/或变性征兆，则抗体在药物配制物中"保持其物理稳定性"。优选地，当使用本发明的配制物时，如通过HPSEC或任何其他合适的用于测量聚集形成的方法时，5％或更少，通常4％或更少，优选地3％或更少，更优选地2％或更少，且特别是1％或更少的抗体形成聚集物。举例来说，在一定保存条件下在一定预先确定的时间段之后，在特定配制物中如果抗体单体具有约90％的纯度，优选地约95％，特别是约98％，则认为抗体在该特定配制物中稳定。化学稳定性可通过检测和量化化学改变的蛋白形式进行评估。化学改变可涉及尺寸修饰(例如，剪切)，其可使用举例来说(HP)SEC、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)进行评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如，作为脱酰胺的结果发生)，其可举例来说通过离子交换层析评估。如果抗体在给定时间的生物学活性为制备药物配制物时的生物学活性的至少约90％(在测定误差内)，则抗体在药物配制物中于给定时间"保持其生物学活性，如举例来说如在抗原结合测定或病毒中和测定中所确定的。
术语"受试者"和"患者"可交换使用。如本文使用，受试者优选地是哺乳动物，如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类(例如猴和人)、最优选地为人。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选地为人，其患有IL-4和/或IL-13介导的疾病。在另一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选地是人，其处于发展出IL-4和/或IL-13介导的疾病的风险中。
关于抗体链多肽序列的短语"基本上相同"可理解为与参照多肽序列展现至少70％、80％、90％、95％或更多序列同一性的抗体链。关于核酸序列的术语可理解为与参照核酸序列展现至少约85％、90％、95％或97％或更多序列同一性的核苷酸序列。
"取代"变体是在天然序列中有至少一个氨基酸残基被去除或在相同位置用插入在其位点的不同氨基酸替换的那些。取代可以是单独的、其中仅取代分子中的一个氨基酸，或可以是多重的，其中在相同分子中取代两个或多个氨基酸。多重取代可以在连续的位点。此外，一个氨基酸可用多重残基替换，在这种情况中，这种变体包含取代和插入两者。"插入"变体是在紧邻天然序列中特定位置处的氨基酸插入了一个或多个氨基酸的那些。紧邻氨基酸意为与所述氨基酸的α-羧基或α-氨基功能基团连接。"缺失"变体是在天然氨基酸序列中去除了一个或多个氨基酸的那些。通常，缺失变体将在分子的特定区具有一个或两个缺失的氨基酸。
术语"治疗上有效的量"指代足以减少和/或改善给定疾病和/或其相关症状的严重性和/或持续时间的疗法(例如本发明的配制物)的量。该术语还涵盖对于减少或改善给定疾病的发展或进展、减少或改善给定疾病的复发、发展或发作和/或改善或增强另一疗法(例如非本发明配制物的疗法)的预防或治疗效果所必须的量。在一些实施方案中，本发明抗体治疗上有效量提供5-20ng/ml的局部浓度，且优选地约10-20ng/ml。在一些实施方案中，如本文使用的"治疗上有效的量"还指代为实现特定结果(例如抑制IL-4和/或IL-13细胞因子)的本发明抗体量。
术语"治疗剂"指代可用于治疗、管理或改善IL-4和/或IL-13介导的疾病和/或其相关症状的任何作用剂。在一些实施方案中，术语"治疗剂"指代本发明的配制物。在一些其他实施方案中，术语"治疗剂"指代非本发明配制物的作用剂。优选地，治疗剂是已知可用于或已经或正在用于治疗、管理或改善IL-4和/或IL-13介导的疾病或与其相关的一种或多种症状的作用剂。
术语"疗法"指代可用于预防、管理、治疗和/或改善IL-4和/或IL-13介导的疾病(例如癌症、炎症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神经性疾病和代谢疾病)的任何方案、方法和/或作用剂。在一些实施方案中，术语"多种疗法"和"疗法"指代生物疗法、支持性疗法和/或其他用于预防、管理、治疗和/或改善本领域技术人员(如医务人员)已知的IL-4和/或IL-13介导的疾病的疗法。
术语"治疗"指代由施用一种或多种疗法(包括但不限于一种或多种预防剂或治疗剂如本发明的配制物的施用)所致的IL-4和/或IL-13介导的疾病(例如癌症、炎症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神经性疾病和代谢疾病)的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善。
术语"可变区"或"可变结构域"指代轻链和重链的部分，通常在重链中约为氨基末端的120-130个氨基酸，且在轻链中约为100-110个氨基酸，其序列在抗体之间广泛不同且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列中的可变性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区，而在可变结构域中高度保守得多的区称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。如Kabat等(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest(U.S.Department of Health and Human Services,Washington,D.C.)第5版("Kabat等")中，氨基酸位置的编号根据EU Index。在优选的实施方案中，可变区是人可变区。
B.配制物和配制物组分
如之前表明，本发明的配制物包含抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体和缓冲系统，其中配制物的pH为约pH 7，且其中所述配制物具有低盐浓度进而降低配制物的离子强度。所述配制物可任选地进一步包含非离子表面活性剂、糖和/或非离子稳定剂。已发现本发明的配制物相比之前的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体配制物提供显著改进，所述之前的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体配制物经常在增加配制物中的抗体浓度时导致抗体的分子聚集并形成可视和亚可视颗粒。具体地，就可视颗粒、亚可视颗粒、低分子量蛋白和高分子量蛋白而言，本发明的配制物展现良好的稳定性。
i.抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体及其变体和片段
在一些实施方案中，本发明的配制物包括抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体。所述双特异性抗体与IL-4和/或IL-13或其变体或片段结合或特异性结合。IL-4和/或IL-13分子可来自任何物种。优选地，所述IL-4和/或IL-13分子来自人。IL-4和IL-13两者的氨基酸序列和蛋白结构为本领域熟知。
在一些例示性的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是人源化抗体，完全人抗体或其变体或其抗原-结合片段。优选的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体防止IL-4和IL-13与其受体结合，并抑制IL-4和IL-13生物学活性。
在特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-13结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的轻链可变区(VL)(下划线表示做出的氨基酸改变。粗体表示CDR；CDR1是SEQ ID NO:7 RASESVDSYGQSYMH；CDR2是SEQ ID NO:8 LASNLES；且CDR3是SEQ ID NO:9 QQNAEDSRT)。
抗IL-13 hB-B13 VL3(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0000892961170000201
在特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-13结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区(VH)(下划线表示做出的氨基酸改变。粗体表示CDR；CDR1是SEQ ID NO:10 GFSLTDSSIN；CDR2是SEQ ID NO:11 DGRID；且CDR3是SEQ ID NO:12 DGYFPYAMDF)。
抗IL13 hB-B13 VH2(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0000892961170000202
在特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-4结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链可变区(VL)(下划线表示氨基酸做出的氨基酸改变。粗体表示CDR；CDR1是SEQ ID NO:13 HASQNIDVWLS；CDR2是SEQ ID NO:14KASNLHTG；CDR3是SEQ ID NO:15 QQAHSYPFT)。
抗IL4 h8D4-8 VL1(SEQ ID NO:3)
Figure BDA0000892961170000203
在特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-4结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的重链可变区(VH)(下划线表示氨基酸做出的氨基酸改变。粗体表示CDR；CDR 1是SEQ ID NO:16 GYSFTSYWIH；CDR2是SEQ ID NO:17IDPSDGETR；且CDR3是SEQ ID NO:18 LKEYGNYDSFYFDV)。
抗IL-4 h8D4-8 VH1(SEQ ID NO:4)
Figure BDA0000892961170000211
在另一特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-4结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的重链可变区(VH)(下划线表示氨基酸做出的氨基酸改变。粗体表示CDR；CDR 1是SEQ ID NO:19 GYSFTSYWIH；CDR2是SEQ ID NO:20IDASDGETR；且CDR3是SEQ ID NO:21 LKEYGNYDSFYFDV)。
抗IL4 h8D4-8 VH2(SEQ ID NO:5)
Figure BDA0000892961170000212
在一些特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-13结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区；和与IL-13结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的轻链可变区。
在其他特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-4结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的重链可变区；和与IL-4结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链可变区。
在另一些特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-4结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的重链可变区；和与IL-4结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链可变区。
在更多特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含与IL-13和IL-4二者结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:2和4或2和5的重链可变区；和与IL-13和IL-4二者结合的、含有氨基酸序列SEQ ID NO:1和3的轻链可变区。
在最特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体包含与IL-13和IL-4两者结合的、含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区；和与IL-13和IL-4两者结合的、含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区(“Lead抗体”)。抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的实施方案的示意图示于图1，而例示性重链和轻链可变区示于图2。Lead抗体的分子量如通过质谱确定为198kDa。Lead抗体的等电点如通过等点聚焦确定为5.8-6.2。
在另外的最特定的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含式VL1-接头-VL2的轻链和式VH1-接头-VH2的重链，其中VL1和VH1形成IL-4抗原结合结构域且VL2和VH2形成IL-13抗原结合结构域。在一些实施方案中，VL1包含CDR序列SEQ IDNO:1；VH1包含CDR序列SEQ ID NO:2；VL2包含CDR序列SEQ ID NO:3；且VH2包含CDR序列SEQID NO:4或5。在另外的实施方案中，VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；VL1包含氨基酸序列SEQ ID NO:3；且VH1包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或5。
在一些实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段包含抗体抗原结合结构域间的接头。接头可以是任何种类的接头分子。优选地，所述接头是多肽。重链多肽和轻链多肽之间或之内的接头可以等同或彼此不同。此外，接头可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。优选的重链结构域的肽接头单位如用于轻链结构域的一样是(G4S)2，即GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)。最优选地，SEQID NO:2和4通过第一肽接头连接在一起，且SEQ ID NO:1和3通过第二肽连接在一起，其中第一和第二肽接头各包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。重链和轻链的接头单位数目可相等(对称顺序)或彼此不同(不对称顺序)。肽接头优选足够长以提供足够的柔性程度来防止抗原结合部分彼此干扰各自的活性，举例来说通过空间位阻，以允许适当的蛋白折叠，且如果必要的话，以允许抗体分子与在相同细胞上的两种或更多种(可能间隔较大的)受体相互作用；而其优选地足够短以允许抗体部分在细胞中维持稳定性。因此，肽接头的长度、组成和/或构象可由本领域的技术人员轻易选择进而优化多价抗体的预期特性。
在本发明优选的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。人源化抗体同种型的实例包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。优选地，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是IgG抗体。存在四种形式的IgG。优选地，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是IgG4抗体。在本发明更优选的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体是人源化IgG4抗体。
在一些实施方案中，所述抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段进一步包含恒定区，例如CH1、CH2、CH3和CL。
本发明配制物的一些实施方案还包含抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其抗原结合片段的变体。基于其高度相似性，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的变体可具有相似的物理化学性质，且因此也包括在本发明的保护范围之内。变体定义为与抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体至少95％，优选地至少97％，举例来说至少98％或99％同源，且能够竞争与IL-4和/或IL-13多肽、IL-4和/或IL-13多肽片段或IL-4和/或IL-13表位结合的氨基酸序列。优选地，所述变体将改善、中和或以其他方式抑制IL-4和/或IL-13生物学活性。确定与靶标结合的竞争可通过本领域的技术人员已知的常规方法完成。优选地所述变体是人或人源化抗体，且优选地为IgG4分子。在优选的实施方案中，变体的氨基酸序列与含有SEQ ID NO:2、4和5的氨基酸序列的同IL-13和IL-4两者结合的重链可变区；和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的同IL-13和IL-4两者的轻链可变区至少95％、96％、97％、98％或99％相同。术语"变体"指代包含与抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的氨基酸序列相比改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。所述变体可具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、修饰、添加和缺失。
修饰的实例包括但不限于糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割和与细胞配体或其他蛋白连接。氨基酸修饰可通过本领域已知的标准技术引入编码抗体的核酸中，所述标准技术如定点诱变、分子克隆、寡核苷酸定点诱变和随机PCR介导的诱变。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基用具有相似结构或化学性质的氨基酸残基替换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的氨基酸。本领域的技术人员清楚的是还可采用不同于上文使用的那种的氨基酸残基家族分类。此外，变体可具有非保守氨基酸取代，例如用具有不同结构或化学性质的氨基酸残基替换氨基酸残基。相似的微小变化还可包括氨基酸缺失或插入，或两者。确定哪些氨基酸残基可取代、修饰、插入或缺失而不废除免疫活性的指导可使用本领域熟知的计算机程序获得。计算机算法，如本领域的技术人员已知的Gap或Bestfit等，可用于最佳比对待比较的氨基酸序列并定义相似或相同的氨基酸残基。变体可具有与抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体相比相同或不同的(较高或较低的)结合亲和性，但仍能够特异性与IL-4和/或IL-13结合，且可具有与抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体相比相同、更高或更低的生物学活性。
本发明的实施方案还包括抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的抗原结合片段。术语"抗原结合结构域"、"抗原结合区"、"抗原结合片段"和相似的术语，指代抗体包含与抗原相互作用并赋予结合剂其针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分(例如互补决定区(CDR))。抗原结合区可源自任何动物物种，如啮齿类(例如兔、大鼠或仓鼠)和人。优选地，抗原结合区将是人来源的。抗原结合片段的非限制性实例包括：Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、dAb片段和由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。
在本发明优选的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体(或其变体或其抗原结合片段)将改善、中和或以其他方式抑制IL-4和/或IL-13的体内生物学活性。
在本发明优选的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体(或其变体或其抗原结合片段)是改善、中和或以其他方式抑制IL-4和/或IL-13的体内生物学活性的拮抗抗体。
与IL-13和IL-4两者结合的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体或其变体或片段，包括含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的鉴别、分离、制备和表征已详细描述于PCT公开WO 2009/052081，其在本文通过提述并入。
优选地，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体(或其变体或其抗原结合片段)以约5mg/mL至约200mg/mL，例如约50mg/mL至约150mg/mL、约75mg/mL至约125mg/mL和约100mg/mL的量存在于配制物中。可替换地，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体(或其变体或其抗原结合片段)在配制物中以约5mg/mL至约65mg/mL、约66mg/mL至约130mg/mL、约131mg/mL至约200mg/mL的量存在。举例来说，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体在配制物中可以约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL、约100mg/mL、约105mg/mL、约110mg/mL、约115mg/mL、约120mg/mL、约125mg/mL、约130mg/mL、约135mg/mL、约140mg/mL、约145mg/mL、约150mg/mL、约155mg/mL、约160mg/mL、约165mg/mL、约170mg/mL、约175mg/mL、约180mg/mL、约185mg/mL、约190mg/mL、约195mg/mL或约200mg/mL的量存在。
在一些例示性的实施方案中，抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体在配制物中以约100mg/mL的量存在。在另一例示性实施方案中，包含与IL-13和IL-4都结合的、含有SEQ IDNO:2和4或2和5的氨基酸序列的重链可变区和与IL-13和IL-4都结合的、含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区的人源化IgG4抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体在配制物中可以约100mg/mL的量存在。
ii.缓冲剂、缓冲系统、离子强度和pH
缓冲剂帮助维持配制物的pH在接近生理条件的范围。缓冲剂在配制物中优选以约1mM至约50mM的浓度存在。合适的用于与本发明使用的缓冲剂包括有机和无机酸两者，及其盐，如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。磷酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、三甲胺盐如Tris、HEPES且其他这样的已知缓冲剂也是适合的且可进行使用。优选地，在本发明的配制物中使用缓冲剂的组合，即两种或多种缓冲剂。两种或多种缓冲剂的组合在本文称为缓冲系统。
本发明的配制物包含缓冲系统。缓冲系统维持生理上合适的pH。此外，缓冲系统参与实现配制物的等渗性和化学稳定性。由于建立用于双特异性抗体的稳定抗体配制物的难度，优选的是使用组合缓冲系统进而利用两种或多种缓冲剂的优势。通过组合两种或多种缓冲剂的优势，能够建立更加稳定的抗体配制物。
优选地，缓冲系统在配制物中以约1mM至约50mM，例如约5mM至约25mM、约5mM至约15mM或约10mM的浓度存在。可替换地，缓冲系统在配制物中以约1mM至约15mM、约16至约30mM、约31至约45mM或约46mM至约50mM的浓度存在。举例来说，缓冲系统在配制物中可以约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM和约50mM的浓度存在。更优选地，缓冲系统在配制物中以约5mM至约15mM，且甚至更优选地约8mM至约12mM的浓度存在。在最优选的实施方案中，缓冲系统以约10mM的浓度存在。
优选地，缓冲系统包含Tris缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。优选地，Tris缓冲剂在配制物中以约1至约5mM的浓度存在。举例来说，Tris缓冲剂在配制物中以约1mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM的浓度存在。更优选地，Tris缓冲剂在配制物中以约2mM至约4mM，且甚至更优选的约3mM至约4mM的浓度存在。在最优选的实施方案中，Tris缓冲剂以约3.7mM的浓度存在。
优选地，磷酸盐缓冲剂在配制物中以约1至约10mM的浓度存在。举例来说，磷酸盐缓冲剂在配制物中以约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约10mM的浓度存在。更优选地，磷酸盐缓冲剂在配制物中以约3mM至约8mM，且甚至更优选地以约5mM至约7mM的浓度存在。在最优选的实施方案中，磷酸盐缓冲剂以约6.3mM的浓度存在。
在本发明最优选的实施方案中，缓冲系统包含浓度为约3.7mM的Tris缓冲剂和浓度为约6.3mM的磷酸盐缓冲剂。在缓冲系统中Tris缓冲剂和磷酸盐缓冲剂的这种组合极不寻常且并非本领域已知。
还优选的是缓冲系统在配制物中以低浓度即约15mM或更少存在，进而降低配制物的离子强度。这是由于随着配制物离子强度的增加，抗体聚集的动力学增加。需要减少的抗体聚集和/或抗体聚集的速度进而改进配制物的稳定性。
在一些实施方案中，本发明的配制物具有pH7左右的pH。优选地，配制物的pH为约5.0至约8.0。举例来说，配制物的pH可为约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9和约8.0。更优选地，配制物的pH可为约6.5至约7.5。在最优选的实施方案中，pH为约7.0。当配制物的pH为约pH 7时，配制物就可见颗粒、亚可见颗粒、低分子量蛋白和高分子量蛋白而言展现良好的稳定性。配制物的pH可通过本领域的技术人员已知的任何方式测量。优选的用于测量pH的方式为使用具有微电极的pH计。配制物的pH可使用本领域已知的任何方式调整。优选的用于改变配制物pH的化学剂是盐酸(HCl)和氢氧化钠(NaOH)。
在一些实施方案中，本发明的配制物具有高于抗体等电点(pI)的pH。等电点是在该处特定分子或表面不携带净电荷的pH。双特异性抗体的pI可通过本领域的技术人员已知的任何方式确定。优选地，双特异性抗体的pI通过变性等电聚焦确定。包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的pI为5.8-6.2。
iii.非离子表面活性剂
本发明的配制物可任选地进一步包含非离子表面活性剂。表面活性剂是稳定配制物中的生物学分子和/或一般药物赋形剂的化学化合物。表面活性剂一般保护分子和赋形剂免于气体/溶液界面诱导的应力，其可以以其他方式导致分子的聚集。表面活性剂还预防可视和亚可视颗粒形成。
优选地，非离子表面活性剂在配制物中以约0.01％至约1％(w/v)，例如约0.01％至约0.5％、约0.01％至约0.3％，或约0.01％至约0.2％的浓度存在。可替换地，非离子表面活性剂在配制物中以约0.01％至约0.05％(w/v)、约0.06％至约0.10％(w/v)、约0.11％至约0.15％(w/v)、约0.16％至约0.20％(w/v)、约0.20％至约0.30％(w/v)、约0.30％至约0.40％(w/v)、约0.40％至约0.50％(w/v)、约0.50％至约0.60％(w/v)、约0.60％至约0.70％(w/v)、约0.70％至约0.80％(w/v)、约0.80％至约0.90％(w/v)，或约0.90％至约1.0％(w/v)的浓度存在。举例来说，非离子表面活性剂在配制物中可以约0.01％(w/v)、约0.02％(w/v)、约0.03％(w/v)、约0.04％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.06％(w/v)、约0.07％(w/v)、约0.08％(w/v)、约0.09％(w/v)、约0.1％(w/v)、约0.2％(w/v)、约0.3％(w/v)、约0.4％(w/v)、约0.5％(w/v)、约0.6％(w/v)、约0.7％(w/v)、约0.8％(w/v)、约0.9％(w/v)和约1％(w/v)的量存在。在特定的实施方案中，非离子表面活性剂在配制物中以约0.05％至约0.2％(w/v)存在。
表面活性剂的实例包括但不限于聚山梨酯、甘油、二羧酸、草酸、琥珀酸、富马酸、邻苯二甲酸和其组合。本领域的技术人员能够了解可使用其他非离子表面活性剂，只要其是药物上可接受的，即适于施用至受试者。非离子表面活性剂优选地是聚山梨酯。聚山梨酯的实例包括聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65和聚山梨酯80。最优选地，非离子表面活性剂是聚山梨酯80。
在例示性的实施方案中，聚山梨酯80在配制物中以约0.01％至约1％(w/v)的量存在。举例来说，聚山梨酯80在配制物中可以约0.01％(w/v)、约0.02％(w/v)、约0.03％(w/v)、约0.04％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.06％(w/v)、约0.07％(w/v)、约0.08％(w/v)、约0.09％(w/v)、约0.1％(w/v)、约0.2％(w/v)、约0.3％(w/v)、约0.4％(w/v)、约0.5％(w/v)、约0.6％(w/v)、约0.7％(w/v)、约0.8％(w/v)、约0.9％(w/v)和约1％(w/v)的量存在。在特定的实施方案中，聚山梨酯80在配制物中以约0.03％至约0.2％(w/v)存在。举例来说，聚山梨酯80可以约0.01％至约1％(w/v)、约0.02％至约0.5％(w/v)和约0.03％至约0.2％(w/v)的量存在。在本发明最优选的实施方案中，聚山梨酯80在配制物中以0.2％(w/v)的量存在。
iv.糖
本发明的配制物可任选地进一步包含糖。通常，糖用作用于高分子量蛋白的稳定剂或作为冷冻保护剂或作为冻干保护剂。
优选地，糖在配制物中以约1％至约10％(w/v)，例如约2％至约8％(w/v)、约3％至约7％(w/v)、约4％至约6％(w/v)或约5％(w/v)的浓度存在。可替换地，糖在配制物中以约1％至约3％(w/v)、约3％至约6％(w/v)，或约6％至约10％(w/v)的浓度存在。举例来说，糖在配制物中以约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)或约10％(w/v)的量存在。在特定的实施方案中，糖在配制物中以约3％至约7％(w/v)，且更优选地约5％存在。
糖的实例包括但不限于单糖、双糖和多糖。糖的实例包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖、木糖醇、果糖和甘露糖醇。本领域的技术人员可以了解可使用其他糖，只要它们是药物上可接受的，即适于施用至受试者。优选地，糖是双糖。更优选地，糖是蔗糖。
在一些实施方案中，蔗糖在配制物中以约1％至10％(w/v)的量存在。举例来说，蔗糖在配制物中可以约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)或约10％(w/v)的量存在。优选地，蔗糖可以约3％至约7％(w/v)，或约4％至约6％(w/v)的量存在。最优选地，蔗糖在配制物中以约5％(w/v)的量存在。
v.非离子稳定剂
本发明的配制物可任选地进一步包含非离子稳定剂。稳定剂指代广泛类别的赋形剂，其在功能上覆盖的范围从膨胀剂到稳定治疗剂或帮助预防变性或粘附至容器壁的添加剂。稳定剂还最小化高分子量蛋白形成。
优选地，非离子稳定剂在配制物中以约1％至约10％(w/v)，例如约2％至约8％(w/v)、约2％至约5％(w/v)、约2％至约4％(w/v)或约3％(w/v)的浓度存在。可替换地，非离子稳定剂在配制物中以约1％至约2％(w/v)、约2％至约4％(w/v)、约4％至约6％(w/v)、约6％至约8％(w/v)或约8％至约10％(w/v)的浓度存在。举例来说，非离子稳定剂在配制物中可以约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)或约10％(w/v)的量存在。在特定的实施方案中，非离子稳定剂在配制物中以约1％至约5％(w/v)，更优选地约1％至约3％(w/v)和最优选地约3％(w/v)存在。
稳定剂的实例包括但不限于多羟基糖醇；氨基酸，如脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、阿拉伯糖醇、赤藓醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等等，包括环多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸多聚物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙醇酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10残基)；蛋白、如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、糖、单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双糖，如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖；多糖如右旋糖酐等。本领域的技术人员了解可使用其他非离子稳定剂，只要其为药物上可接受的，即适于施用至受试者。优选地，非离子稳定剂是氨基酸。更优选地，所述非离子稳定剂是脯氨酸或甘氨酸。最优选地，所述非离子稳定剂是脯氨酸。可替换地，所述非离子稳定剂是甘露糖醇。
在一些实施方案中，脯氨酸在配制物中以约1％至10％(w/v)的量存在。举例来说，脯氨酸在配制物中可以约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)或约10％(w/v)的量存在。优选地，脯氨酸可以约1％至约5％(w/v)，或约1％至约3％(w/v)的量存在。最优选地，脯氨酸在配制物中可以约3％(w/v)的量存在。
在一些可替换的实施方案中，甘露糖醇在配制物中以约1％至10％(w/v)的量存在。举例来说，甘露糖醇在配制物中可以约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)或约10％(w/v)的量存在。优选地，甘露糖醇可以约1％至约5％(w/v)，或约1％至约3％(w/v)的量存在。最优选地，甘露糖醇在配制物中可以约3％(w/v)的量存在。
v.其他赋形剂
此外，本发明的配制物可任选地进一步包含其他赋形剂，其包括但不限于用于注射的水、稀释剂、增溶剂、舒缓剂、附加缓冲剂、无机或有机盐、抗氧化剂、防腐剂、填充剂、螯合剂、张力剂等等。然而优选地，本发明的配制物不包含其他赋形剂，除上文所述的那些。其他药物上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂如描述于Remington′s Drug Sciences 16thedition,Osol,A.Ed.(1980)的那些可包括在配制物中，只要其不负面影响配制物的预期特性。在特定的实施方案中，配制物基本上无防腐剂，尽管在可替换的实施方案中，如需要可添加防腐剂。举例来说，冷冻保护剂或冻干保护剂可包括在冻干配制物中。
vi.液体或冻干配制物
本发明的配制物可以是液体配制物或冻干配制物。优选地，所述配制物是液体配制物。更优选地，所述液体配制物准备好可用于注射的。可替换地，所述配制物可以是冻干粉末。优选地，在临施用前将冻干粉末准备好与溶剂混合。
vii.例示性配制物
在本发明的一个例示性的实施方案中，本发明提供适于皮下施用的液体抗体配制物，所述配制物包含：
约100mg/mL的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区；
约10mM的缓冲系统，其中所述缓冲系统包含浓度约3.7mM的Tris缓冲剂和浓度约6.3mM的磷酸盐缓冲剂；
约0.2％(w/v)聚山梨酯80；
约5％(w/v)蔗糖；和
约3％(w/v)脯氨酸；
其中配制物的pH为约pH 7。
在本发明另一个例示性的实施方案中，本发明提供适于皮下施用的液体抗体配制物，所述配制物包含：
约100mg/mL的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区；
约10mM的缓冲系统，其中所述缓冲系统包含浓度约3.7mM的Tris缓冲剂和浓度约6.3mM的磷酸盐缓冲剂；
约0.2％(w/v)聚山梨酯80；
约5％(w/v)蔗糖；和
约3％(w/v)甘露糖醇；
其中配制物的pH为约pH 7。
在本发明可替换的例示性实施方案中，本发明提供适于皮下施用的稳定的冻干抗体配制物，所述配制物包含：
约100mg/mL的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区；
约10mM的缓冲系统，其中所述缓冲系统包含浓度约3.7mM的Tris缓冲剂和浓度约6.3mM的磷酸盐缓冲剂；
约0.2％(w/v)聚山梨酯80；
约5％(w/v)蔗糖；和
约3％(w/v)脯氨酸；
其中配制物的pH为约pH 7。
在本发明另一可替换的例示性实施方案中，本发明提供适于皮下施用的稳定冻干抗体配制物，所述配制物包含：
约100mg/mL的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区；
约10mM的缓冲系统，其中所述缓冲系统包含浓度约3.7mM的Tris缓冲剂和浓度约6.3mM的磷酸盐缓冲剂；
约0.2％(w/v)聚山梨酯80；
约5％(w/v)蔗糖；和
约3％(w/v)甘露糖醇；
其中配制物的pH为约pH 7。
vii.稳定性
本发明的配制物在2-8℃稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36个月或更长。在例示性的实施方案中，其在2-8℃稳定至少约6个月或更长。在其他例示性的实施方案中，其在2-8℃稳定至少约9个月。在进一步的例示性实施方案中，其在2-8℃稳定至少约1年或更长，更优选地约2年，甚至更优选地约3年。
C.施用模式
在本发明的一些实施方案中，所述配制物适于肠胃外、静脉内、肌内、皮内、皮下施用或其组合。本发明的配制物适于通过多种技术递送。在本发明优选的实施方案中，所述配制物皮下施用。举例来说，优选的是将包含100mg/mL的抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的配制物皮下施用。因此，所述配制物优选是无菌的。用于使配制物无菌的方法为本领域熟知且包括举例来说，通过无菌过滤膜过滤或在约120℃高压灭菌配制物的成分(除抗体外)约30分钟。
D.剂量和剂型
本发明配制物的有效剂量取决于很多不同的因素而变化，包括施用方式、靶位点、受试者的生理状态，无论受试者是人或动物，是否施用其他药物，且无论治疗是预防性的或是治疗性的。通常，受试者是人，但也可对非人哺乳动物包括转基因哺乳动物进行治疗。需对治疗剂量进行滴定以优化安全性和效力。优选地，剂量为100-200mg/小瓶。
本发明的配制物可在多种情况下施用。单次剂量间的时间间隔可以是每日、每周、每两周、每月或每年。时间间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调整剂量以获得一些血浆结合剂，如抗体、浓度。剂量和频率会取决于抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体在受试者中的半衰期发生变化。一般地，人抗体展示最长半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。
在进一步的实施方案中，本发明提供包含治疗上有效量的本发明配制物的药物单位剂型，通过施用所述剂型至受试者用于治疗受试者中的一种或多种疾病。在优选的实施方案中，受试者是人。人可以是成人或可以是婴儿。术语"药物单位剂型"指代适于作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位，每个单位包含预先确定的量的活性化合物，该量经计算以与需要的柠檬酸盐缓冲剂和pH产生预期的治疗/预防效果。
单位剂型可以是包含配制物的容器。合适的容器包括但不限于密封的安瓿、小瓶、瓶、注射器和试管。所述容器可由多种材料形成，如玻璃或塑料，且可具有无菌接入口(举例来说，所述容器可以是具有通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在优选的实施方案中，容器是小瓶。一般地，容器应维持配制物的无菌性和稳定性。
在具体的实施方案中，所述配制物包装在7、10、15或20mL的由透明、无色I型玻璃制成的小瓶中，其用塞子封闭(含氟聚合物涂覆的溴化丁基)，用具有凸缘(聚丙烯)的翻盖帽密封。
在特定的实施方案中，配制物二次包装进容器中，如保护小瓶免于光照的硬纸板盒子。
将用于体内施用的配制物必须无菌。其可举例来说通过无菌过滤膜过滤实现。举例来说，本发明的液体配制物可通过使用0.2μm或0.22μm过滤器过滤除菌。
E.治疗方法
本文进一步提供用于治疗IL-4和/或IL-13介导的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本发明的配制物至受试者。在一些实施方案中，IL-4和/或IL-13介导的疾病是癌症、炎症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病、呼吸疾病、神经性疾病和代谢疾病。
本发明的配制物可用于治疗、抑制或预防疾病，如过敏性疾病、Th2介导的疾病、IL-13介导的疾病、IL-4介导的疾病和/或IL-4/IL-13介导的疾病。这些疾病的实例包括霍奇金氏病、哮喘、过敏性哮喘、特异性皮炎、特应性过敏、溃疡性结肠炎、硬皮病、过敏性鼻炎、COPD3特发性肺纤维化、慢性移植排斥、博莱霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化、辐射诱导的肺纤维化、肺肉芽瘤、进行性系统硬化症、血吸虫病、肝纤维化、肾癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、哮喘、化脓性关节炎、疱疹样皮炎、慢性特发性荨麻疹、溃疡性结肠炎、硬皮病、肥厚性瘢痕、惠普尔氏疾病(Whipple′s disease)、良性前列腺增生症、其中IL-4受体发挥作用的肺病、其中IL-4受体介导的上皮屏障破坏发挥作用的病况、其中IL-4受体发挥作用的消化系统病症、对药物的过敏性反应、川崎病(Kawasaki disease)、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、Grave氏病、先兆子痫、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、自身免疫性淋巴增生综合征、免疫性溶血性贫血、巴雷特食管(Barrett′s esophagus)、自身免疫性葡萄膜炎、结核、囊性纤维化、过敏性支气管肺真菌病、慢性阻塞性肺病、博莱霉素(bleornycin)-诱导的肺病和纤维化、肺泡蛋白沉积、adull呼吸窘迫综合征、结节病、高IgE综合征、特发性嗜酸细胞增多综合征、自身免疫性水疱疾病、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、重症肌无力、慢性疲劳综合征、肾病。
术语"过敏性疾病"指代其中患者对正常非免疫原性的物质高度敏感且上升至发生免疫反应的病理状况。过敏性疾病通常由肥大细胞通过IgE的激活表征，其导致能够导致症状的炎症响应(例如局部响应、系统响应)，所述症状如良性的流涕至威胁生命的过敏性休克和死亡。过敏性疾病的实例包括但不限于过敏性鼻炎(例如花粉过敏)、哮喘(例如过敏性哮喘)、过敏性皮炎(例如湿疹)、接触性皮炎、食物过敏和荨麻疹(麻疹)。
术语"Th2介导的疾病"指代其中病理通过由CD4+Th2T淋巴细胞调节的免疫响应(Th2类型的免疫响应)(全部或部分)产生的疾病，其特征性地产生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13。Th2-类型的免疫响应与一些细胞因子(例如IL-4、IL-13)和一些种类的抗体(例如IgE)的产生相关，且与体液免疫相关。Th2介导的疾病通过Th2细胞因子(例如IL-4,IL-13)和/或一些种类的抗体(例如IgE)升高水平的存在表征，且包括举例来说，过敏性疾病(例如过敏性鼻炎、特异性皮炎、哮喘(例如变应性哮喘)、过敏性呼吸道疾病(AAD)、过敏性休克、结膜炎)、与升高的IL-4和/或IL-13水平相关的自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、宿主抗移植物疾病、肾病(例如肾炎综合征、狼疮性肾炎))，和与升高的IL-4和/或IL-13水平相关的感染(例如，病毒、寄生虫、真菌(例如白色念珠菌(C.albicans))感染)。一些癌症与升高的IL-4和/或IL-13水平相关或与IL-4诱导和/或IL-13诱导的癌细胞增殖相关(例如B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，头颈癌，乳腺癌和卵巢癌)。这些癌症可使用本发明的配制物治疗、抑制或预防。
术语"癌症"指代或描述哺乳动物特别是人中的生理病况，其通常通过不受调节的细胞生长表征。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。
术语"自身免疫性疾病"指代从个体自身组织出现且针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫性疾病或病症的实例包括但不限于炎症响应如炎性皮肤疾病，其包括牛皮癣和皮炎；过敏性病况如湿疹和哮喘；其他涉及T细胞的浸润和慢性炎症响应的病况；动脉粥样硬化；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化症和中枢神经系统(CNS)炎性病症。
在一些实施方案中，本发明的配制物可与一种或多种疗法(例如非本发明的配制物但目前在施用以预防、治疗、管理和/或改善IL-4和/或IL-13介导的疾病的疗法)组合施用。术语"组合"的使用并不限制疗法施用至受试者的顺序。第一疗法可在第二疗法施用之前(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时、或之后(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用至曾经具有、具有IL-4和/或IL-13介导的疾病或对其易感的受试者。任何额外的疗法可与其他额外的疗法以任何顺序施用。可与本发明的抗体组合施用的疗法的非限制性实例包括美国药典和/或Physician′s DeskReference列举的批准的抗炎性作用剂。
F.试剂盒
本发明的一些实施方案包括含有本发明配制物的试剂盒。所述试剂盒可进一步包含一个或多个包含药物可接受的赋形剂的容器，还包含在商业和使用者立场希望得到的其他材料，所述材料包括滤器、针头和注射器。与试剂盒组合的可以是习惯上包括在治疗、预防或诊断产品的商品包装中的说明，其包含关于举例来说适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌症和/或关于该治疗、预防或诊断产品使用的警告的信息。
实施例
为帮助阐述本发明，提供下列实施例。所述实施例并非意在以任何方式限制本发明的保护范围。一般地，除非另外表明，本发明的实践采用药物配制、化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学如抗体技术和多肽制备标准技术中的惯用技术，举例来说如Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),volume51,Ed.:Paul S.,Humana Press(1996)；Antibody Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series,169),Eds.:McCafferty J.等,Human a Press(1996)；Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology,Eds.Ausubel等,JohnWiley&Sons(1992)所述。
实施例2-6中使用的缩写为：
BD：生物技术开发
BsAb：双特异抗体
DLS：动态光散射
DoE：实验设计
DP：药物产品
DS：药物物质
DSC：差示扫描量热术
FCM：流动细胞显微镜术
FDS：配制的药物物质
FT-IR：傅里叶变换-红外
HAP：羟基磷灰石层析
HDPE：高密度聚乙烯
HMW：高分子量
HPLC：高效液相层析
IEF：等电聚焦
IgG：免疫球蛋白G
IL：白细胞介素
kDa：千道尔顿
LMW：低分子量
Nd：未确定
PEG：聚乙二醇
PES：聚醚砜
PS80：聚山梨酯80
PVDF：聚偏氟乙烯
Rpm：转每分钟
SC：皮下
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEC：尺寸排阻色谱
SLS：静态光散射
Sq：足量
TGA：热重分析
UF/DF：超滤/渗滤
USP：美国药典
UV-Vis:紫外-可见
w/v:重量/体积
WFI：注射用水
XRPD：X射线粉末衍射
包含与IL-13和IL-4都结合的、含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和与IL-13和IL-4都结合的、含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区的人源化IgG4抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体(“Lead抗体”)用于下列实施例进而确定最佳的配制物条件。
下列配制物研究(实施例2-6)的目的是理解Lead抗体在溶液中和在冻干状态中的表现(即，用来鉴别主要的降解途径)并确定为约100mg/mL的Lead抗体提供良好稳定性以供进一步的配制物开发的合适的缓冲剂-pH系统和添加剂。
下文展示在实施例2-6中使用的药物物质：
HAP纯化步骤(下游处理的最后步骤)之后的Lead抗体：
批次#RSN0169(研究#P5至P6)
配制物缓冲剂：磷酸钠缓冲剂75mM，pH 6.7
浓度：10.4mg/mL；
批次#RSN0169-SZW320、326和327(研究#P7至P13)
配制物缓冲剂：磷酸钠缓冲剂59mM，pH 6.9
浓度：4.5mg/mL；
批次#RSN0169-SZW 330(研究#P14)
配制物缓冲剂：磷酸钠缓冲剂55mM，NaCl 20mM，pH 6.8
浓度：4.4mg/mL；和
批次#RSN0152(研究#P15至P21)
配制物缓冲剂：磷酸钠缓冲剂55mM，NaCl 20mM，pH 6.8
浓度：3.9mg/mL。
对于每种配制物测试，在水中在UF/DF结尾调整Lead抗体浓度且随后进一步用合适的量的浓缩缓冲剂和添加剂溶液稀释直至预期的最终配制物(详情参见表1)。
表1-配制物调整的细节
Figure BDA0000892961170000391
b用浓缩缓冲剂和添加剂溶液稀释后的浓度
每种配制物在层流下无菌过滤(
Figure BDA0000892961170000392
GV，Millipore，0.22μm，PVDF)且组分酌情针对每个稳定性时间点分散入1型玻璃小瓶，除对于使用聚丙烯管的冷冻/融化研究之外。
对于实施例2-6中的配制物确定机械应激和热应激条件。
为评估摇动应激对配制物测试#P5-7的影响，小瓶使用Rota Test 74401在350rpm于室温摇动2至15h且随后进行分析。
为评估可注射性应激对配制物测试#P12、13、16-18和20的影响，当可获得小体积的样品时潜在的可注射性影响(即针内剪切应力)用HPLC注射器(Unimetrics Corporation100μL)评估，且当可获得较大体积的样品时用Terumo26G x 1/2-0.45x12mm注射器。
为评估热应激对配制物测试#P5-7和13的影响，将小瓶在45℃保存1和2周，且随后进行分析。用于热应激的相关温度通过DSC确定。测试#P5-7和13也在5℃保存2周，并随后进行分析。
为评估热应激对配制物测试#P12、15和21的影响，将小瓶在5℃保存3至6周，且随后每周进行分析。溶液冻干前，称为配制的药物物质(FDS)，对于测试#P16-18和20保存在5℃4至5周，且每周进行分析。对于测试#P14、16-18和20，重建溶液在冻干后在5℃保存24小时且随后进行分析。
实施例1–PH优化
配制物开发过程中的第一步是确定用于Lead抗体配制物的最佳pH。为确定最佳pH，使用Lead抗体的低浓度(1mg/ml，相对于100mg/ml)，因为该Lead抗体的低浓度足以确定最佳pH。表2展示在该研究中测试的配制物。
表2-测试#P5-pH筛选
Figure BDA0000892961170000401
在本研究中，配制物1不稳定是由于其导致Lead抗体的构象不稳定性。具体地，Lead抗体容易去折叠。此外，配制物9导致脱酰胺。因此，确定了对于Lead抗体配制物的最佳pH将在pH 7.0左右的较窄范围。
对于其他配制物参数的后续研究如缓冲剂、表面活性剂和稳定剂，包括了较高的Lead抗体浓度。这些后续的研究确认了当使用高浓度的Lead抗体时，上述关于Lead抗体配制物最佳pH的结论。
实施例2–缓冲系统/离子强度(盐)
缓冲剂
配制物开发过程的下一步是确定对于Lead抗体配制物的最佳缓冲剂。在数个不同的测试中，测试了数种不同的缓冲剂，如组氨酸、磷酸盐、Tris及其组合。
表3-测试#P6-1mg/ml的缓冲系统的筛选
Figure BDA0000892961170000411
表4-测试#P7-1mg/ml的盐的筛选
Figure BDA0000892961170000412
表5-测试#P13-100mg/ml的缓冲剂/盐筛选
Figure BDA0000892961170000413
表6-缓冲系统配方
Figure BDA0000892961170000414
Figure BDA0000892961170000421
当处理和复合配制物时，过滤的配制物测试和对照无可视和亚可视颗粒，且SEC分析显示由于初始DS包含5.5％的HMW，纯度≤92.0％。
通过DSC获得的开始和变性温度表明对于下列缓冲剂-pH系统更好的热稳定性：
●磷酸盐pH 6.5和7.0:#P5-5,P5-6,P6-2,P6-3
●Tris pH 7.0和7.5:#P6-5,P6-6
其中相比举例来说pH 4.5的48℃和组氨酸缓冲剂的59℃，初始温度约为61℃。
通过SLS获得的胶体稳定性表明下列缓冲剂pH系统更好的稳定性：
●磷酸pH 7.5:#P6-4
●Tris pH 7.0和7.5:#P6-5,P6-6
其中相比举例来说对于组氨酸缓冲剂的0.410-4mL.mol/g2和对于磷酸盐pH 7.0缓冲剂的1.510-4mL.mol/g2，第二维里系数接近3.0 10-4mL.mol/g2。
1小时30分钟的摇动应激后，观察到颗粒污染的不同水平(参见图3)。
就可是颗粒而言，对于测试#P5展现良好稳定性的缓冲剂-pH系统候选如下：
●磷酸pH 6.5、7.0和7.5：#P5-5、P5-6和P5-7
●Tris pH 8.0和8.5：#P5-8和P5-9
对于这两种pH在6.5和7.5之间的缓冲系统实施测试#6。显示最佳稳定性的候选如下：
●磷酸pH 7.0和7.5：#P6-3和P6-4
●Tris pH 7.0和7.5：#P6-5和P6-6
碱性pH对于最小化颗粒的形成看起来更好。
摇动应激和热应激(在45℃2周)是关于亚可视颗粒的缓冲剂-pH系统区别的相关方法。
提供良好稳定性的缓冲剂-pH系统候选为：
测试#5:配制物#P5-6至P5-9，即pH≥7.0
测试#6(参见图4和图5)：
-磷酸盐7.5：#P6-4
-Tris 7.5：#P6-6
随后为：
-磷酸盐pH 7.0：#P6-3
-Tris pH 7.0：#P6-5
需要注意的是对于所有的应激条件，组氨酸缓冲剂(#P6-1)展示了重要的去稳定化作用。
HIAC测量确认了可视化观察：碱性pH对于最小化颗粒形成更好。此外，在相同的pH，基于磷酸盐的配制物相比Tris缓冲-系统提供了较少的亚可视颗粒。
关于测试#5和6，热应激对于HMW和LMW两者都展示有趣的结果。注意到配制物#P5-1(pH 4.5)在45℃1周后完全降解；配制物#P5-2在45℃2周后也是如此。这两种样品将从下列分析中剔除。
关于HMW，在45℃2周后的结果与配制物#P5-6至P5-9(pH≥7.0)相似且对于#P5-5至P5-3更好，这是由于pH从6.5减少至5.5。对于测试#6，确认了该趋势且提供良好稳定性的缓冲剂-pH系统候选为(参见图6)：
●磷酸盐pH 6.5：#P6-2
●Tris pH 7.0：#P6-5
●组氨酸pH 6.5：#P6-5
因此，pH 6.5相比pH 7.0对于最小化HMW配制物提供了更好的稳定性，而pH 7.0本身优于pH 7.5。此外，在相同的pH(7.0和7.5)，基于Tris的配制物相比磷酸盐缓冲-系统提供略少的HMW。
对于LMW，配制物#P5-3至P5-5(pH≤6.5)在45℃2周后展现良好的稳定性。对于配制物#P5-6至P5-9(7.0≤pH≤8.5)，形成大量的LMW和出现在SDS-PAGE凝胶上的额外条带。LMW降解对于配制物#P5-9(Tris pH 8.5)更加明显(参见图7)，且对于#P5-7(磷酸盐pH7.5)尤其可见SDS-PAGE上的额外条带(参见图8)。注意到看起来降解产物对于磷酸和Tris缓冲系统是不同的。
测试#6确认了这些结论，且显示对于相同的pH，基于磷酸的配制物相比Tris缓冲-系统提供略多的LMW。
对于HMW和LMW，酸性pH看起来相比碱性的给出更好的稳定性，其中Tris相比磷酸盐缓冲-系统稍占优势。
通过IEF证明，45℃4周的热应激是迫使Lead抗体化学降解的相对方式(即酸性模式的改变)，且因此为Lead抗体选择提供良好稳定性的缓冲剂-pH系统(参见图9)。最不稳定的配制物是Tris pH 8.5(#P5-9)和磷酸盐pH7.5(#P6-4)，作为同工型模式，两者都给出2种额外的酸性形式且主要形式变得次要。展现良好稳定性的缓冲剂-pH系统候选是Tris pH7.0(#P6-5)。
总之，基于最初的状态分析和对测试#P5和6(1mg/mL溶液)的应激程序结果，已将pH设置为7.0。该选择是就可视和亚可视颗粒(碱性pH)而言的良好稳定性和就HMW和LMW(酸性pH)而言的稳定性间的折中。对于缓冲系统，磷酸盐和Tris两者对于所选pH都展示了优势：磷酸盐就可视/亚可视颗粒而言，而Tris就HMW和LMW而言。
注意到对于第一添加剂的评估，使用了缓冲系统磷酸盐10mM或Tris 10mM：
●确认上述对100mg/mL Lead抗体溶液的结果，
●并分别测试对两种缓冲系统的冷冻-干燥处理。
对上述结果进行了确认且两种缓冲系统(#P14-3和P14-8)在冻干处理过程中都展现良好的结果(参见图19)。
在pH 7.0，磷酸相比Tris具有较强的缓冲能力；然而，与Tris不同的是，其碱基在冷冻步骤中具有析出的趋势。为结合Tris和磷酸两者的优势，选择这两种缓冲系统的混合物：磷酸6.3mM和Tris 3.7mM。即使使用Tris缓冲剂或磷酸盐缓冲剂为本领域已知(分别使用每一种)，Tris缓冲剂和磷酸盐缓冲剂在缓冲系统中的组合是非同寻常的且并非本领域已知。
电导率(pH和缓冲剂的选择)
冻干前的溶液具有约300μS/cm的电导率，重构后其为DP赋予850μS/cm的理论电导率。
我们首先尝试了对于mAb常用的缓冲剂：组氨酸，在其pH 6.2和6.6的缓冲区和10mM的浓度。在pH 6.2，随Lead抗体在室温的析出出现了不溶性问题(参见图29)。在pH6.6，溶液在室温略为乳白色，第二维里系数为低的0.410-4mL.mol/g2。与大多数mAb不同的是，组氨酸对于Lead抗体并不是好的缓冲剂。
随后我们尝试了另一种常用的缓冲剂：在其pH 6.5、7.0和7.5的缓冲区和10mM浓度。对于pH 6.5和7.0，第二维里系数低于1.5 10-4mL.mol/g2，其意味着较低的胶体稳定性。对于pH 7.5，第二维里系数接近3.0 10-4mL.mol/g2，其意味着良好的胶体稳定性，然而热应激(45℃2周)展示了纯度的减少(HMW和LMW都增加)比pH 6.5和7.0时更加重要。磷酸盐是好的缓冲剂，然而在酸性pH，胶体稳定性较低，且在碱性pH，Lead抗体对热应激敏感。
为扩大缓冲剂的筛选，在其缓冲区中于pH 7.0和7.5且在10mM的浓度对Tris进行了测试。两种pH给出了具有接近3.0 10-4mL.mol/g2的维里系数的良好胶体稳定性。热应激(45℃2周)展示了纯度的减少(HMW和LMW都增加)对pH 7.5比对pH 7.0更重要。然而，pH 7.0的Tris在相同的pH相比磷酸盐提供在HMW方面好得多的稳定性和在LMW方面略好的稳定性。Tris pH7.0相比Tris pH 7.5和磷酸盐pH 7.0是更好的缓冲系统。尽管在该pH(pka＝8.1)为获得Tris良好的缓冲能力，所需的量将多于在商业产品中使用的最大量。
为优化用于Lead抗体的缓冲剂，选择磷酸盐6.5mM/Tris 3.7mM的组合以获得因磷酸盐(pka＝7.2)带来的在pH 7.0的良好缓冲能力，和因Tris带来的Lead抗体的良好稳定化。
如上文所述，尽管Tris缓冲剂或磷酸盐缓冲剂的使用是本领域已知(每种单独使用)，在缓冲系统中Tris缓冲剂和磷酸盐缓冲剂的组合是非同寻常的且并非为本领域已知。
离子强度/盐浓度
氯化钠(NaCl)与两种所选的缓冲剂-pH候选在浓度70mM对100mg/mL Lead抗体溶液进行了测试。
通过DSC获得的开始和变性温度以及通过SLS获得的胶体稳定性未表明NaCl对溶液稳定性的任何实质影响。配制物测试#P13的机械应激和相同配制物在5℃保存两周后，候选#P13-1和P13-3(即无NaCl)，在HMW形成方面展现出更好的稳定性(参见图10)。在图33中是相同的c/c。
增加盐浓度导致离子强度的增加，其导致Lead抗体聚集动力学的增加。因此，确定了配制物不应包含盐或渗透剂。此外，确定了最佳的配制物应该包含低浓度的缓冲剂进而具有低离子强度。
实施例3–表面活性剂
在配制物开发过程中的下一步是确定用于Lead抗体配制物的最佳赋形剂。所述赋形剂必须足以稳定Lead抗体，且与冻干相容。测试了数种不同的表面活性剂如聚山梨酯和泊洛沙姆(poloxamer)的多种浓度。
表7-测试#P12-在85mg/ml的添加剂筛选
Figure BDA0000892961170000461
表8-测试#P23-在100mg/ml的添加剂筛选
Figure BDA0000892961170000462
紧接着0.22μm过滤，配制物测试和对照无可视和亚可视颗粒。由于4.5mg/mL至100mg/mL的Lead抗体浓度，SEC分析展示了≤92.0％的纯度(初始DS包含了3.0％HMW)。
机械应激是区别配制物候选的有关方式。由于有限量的初始材料供应，不可能进行标准视觉观察且因此使用放大镜下在毛细管中的观察。对于可视/亚可视颗粒，对于测试#12展现良好稳定性的候选如下(参见图11)：
●PS80 0.1％：#P12-6
●PS20 0.1％：#P12-8
测试的表面活性剂中，与无表面活性剂的配制物相比无一对HMW形成具有影响，除了#P12-8(PS20 0.1％)，其在5℃保存6周以上具有轻微负面影响(参见图12)。
总之，在表面活性剂间不存在强大的差异。选择下列表面活性剂：PS80以预防可视/亚可视颗粒的形成。
随后，在Lead抗体配制物中测试了多种PS80浓度(参见表23)。对摇动应激，在350rpm(室温)测试了0.05-0.2％浓度的PS80 15小时。样品通过流动细胞显微术分析，且结果示于表9。表9展示在摇动应激方面，0.05-0.2％的PS80浓度对于全部浓度展示等同的稳定效果。因此，可在配制物中使用0.05-0.2％的PS80浓度。
表9–PS80浓度在室温于350rpm 15h
Figure BDA0000892961170000471
FCM：颗粒数每mL
实施例4–蔗糖
如上文所述，配制物开发过程中的下一步是确定用于Lead抗体配制物的最佳赋形剂。所述赋形剂必须足以稳定Lead抗体，且与冻干相容。以多种浓度测试了数种不同的糖，如蔗糖、海藻糖和甘露糖醇。
表10-测试#P14-用于冷冻干燥物的添加剂筛选
Figure BDA0000892961170000481
表11-测试#P15-在100mg/ml的添加剂筛选-DoE
Figure BDA0000892961170000482
Figure BDA0000892961170000491
表12-测试#P16-针对冷冻干燥物的添加剂筛选和过程开发
Figure BDA0000892961170000492
表13-测试#P17-FDS–在38mg/mL的添加剂筛选
Figure BDA0000892961170000493
Figure BDA0000892961170000501
表14-测试#P17-针对冷冻干燥物的添加剂筛选和过程开发
Figure BDA0000892961170000502
总之，基于以上研究，选择蔗糖作为赋形剂，这是由于其稳定Lead抗体。此外，已知蔗糖是冻干保护剂，因此其会改进冻干配制物。事实上，无蔗糖冻干导致HMW的增加(参见图19)。此外，发现5％蔗糖对于配制物是最佳的。
实施例5–稳定剂
如上文所述，配制物开发过程中的下一步是确定用于Lead抗体配制物的最佳赋形剂。所述赋形剂必须足以稳定Lead抗体，且与冻干相容。测试了数种不同的稳定剂如甘露糖醇、天冬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸和亮氨酸的多种浓度。其可见于下表和上文的表10-14。
表15-测试#P18-针对冷冻干燥物的添加剂筛选和过程开发
Figure BDA0000892961170000503
表16-测试#P20-FDS–在35mg/mL的添加剂筛选
Figure BDA0000892961170000504
Figure BDA0000892961170000511
表17-测试#P20-针对冷冻干燥物的添加剂筛选和过程开发
Figure BDA0000892961170000512
表18-测试#P21-在35mg/ml的添加剂筛选
Figure BDA0000892961170000513
Figure BDA0000892961170000521
c与#P21-1相同的配制物，但该样品在5℃保存时由于氮而惰性化
这些筛选的目的是找到添加剂以进一步在HMW形成方面稳定Lead抗体(测试#12、15、20-FDS和21)。由于Lead抗体对聚集的高敏感性，发现预期的长期保存温度(即5℃)与监测添加剂的效果相关。
完成实验设计(DoE)-筛选模型、一级、D-最佳矩阵以筛选不同糖、多元醇、氨基酸和溶剂对HMW形成的影响(测试#15)。该DoE的结果总结于表19中。
表19-测试#15(DoE)关于添加剂筛选的结果
Figure BDA0000892961170000522
发现对HMW具有作用的添加剂分别在测试#12和20-FDS中进行了测试：
●发现氨基酸甘氨酸(#P12-1和P20-4-FDS)和脯氨酸(#P20-3-FDS)在最小化HMW形成中具有最好的效果(参见图13和图14)，
●甘露糖醇(#P20-1-FDS)之后出现(参见图14)，
●随后是蔗糖(#P12-3)和海藻糖(#P12-4)，其效率低得多(参见图13)，
●最终，天冬氨酸8％(#P20-2-FDS)的积极效果并未在4％浓度得以确认(参见图14)。
在测试#21过程中也测试了数种其他添加剂：
●发现赖氨酸(#P21-5)对HMW形成具有轻微的积极效果(参见图15)，
●发现甘露糖醇(#P21-1)在该测试中是最好的。
发现了脯氨酸向配制物的添加具有两种效果：其通过减少在液体配制物中的聚集速率控制HMW形成，且其作为膨胀剂发挥作用以使饼状物在冻干配制物中更加精美。还发现了甘露糖醇向冻干配制物的添加使得饼状物精美。
接下来，在Lead抗体配制物中测试了多种脯氨酸浓度(参见表23)。测试了1％和3％的浓度。样品通过UPLC进行了分析，且结果示于表20和21和图16。表20和21展示1或3％的脯氨酸浓度可在配制物中使用。这些数据还证实了脯氨酸对HMW动力学的积极作用。此外，具有3％的脯氨酸的饼状物稍更精致(较少回缩)，其证实了脯氨酸作为压载物的作用(结果未显示)。
表20–1％脯氨酸
Figure BDA0000892961170000531
表21–3％脯氨酸
Figure BDA0000892961170000532
总之，尽管HMW形成已通过添加赋形剂即甘露糖醇和氨基酸如甘氨酸和脯氨酸显著降低，在100mg/mL的Lead抗体浓度的有益效果不足够强到实现令人满意的保质期。因此开发了冻干的配制物以及冻干过程。
实施例6–冻干配制物
对于冷冻/干燥过程，将5至5.5mL浓度20-38mg/mL的Lead抗体的预期FDS原型分散入15mL小瓶中(参见实施例表13和表14)。
冷冻/干燥过程对20至38mg/mL的预先浓缩的溶液进行，至最终配制物接近5至5.5mL，分散入15mL小瓶。
已使用了来自Usifroid的三种不同冻干系统类型：PL45(测试#14)、SMH-300(测试#17)和SMH-90(测试#16、18、20)。对于冻干循环的细节参见表22。冻干步骤间改变温度的斜率为1℃/min。
表22-用于每个测试的冻干循环
Figure BDA0000892961170000541
a在实验过程中根据产品温度测量设置
b循环仅在标准工作时间的小时过程中终止
获得的干燥物质随后以100mg/mL的目标浓度通过添加合适量的WFI(1.0至1.6mL)重构。
对于冻干测试#P16-20，1mL FDS溶液在-20℃冷冻，在室温融化一次且随后进行分析。
还测试了中间DS(HAP步骤–BD的结束)的冷冻和融化(测试#9)。对于该测试，将在50mL HDPE Nalgene瓶中的20mL DS在-20℃和-70℃两个温度下冷冻，在室温融化一次且随后进行分析。
实施了下列分析方法：
●对于外观的视觉观察(澄清度和颜色)
●用于量化亚可视颗粒的光线遮蔽(HIAC)
●关于蛋白纯度的SEC
●关于蛋白纯度的SDS-PAGE
●关于电荷异质性的IEF
●用于量化亚可视颗粒的FCM
●关于聚集的DLS
●关于变性温度的DSC
●关于胶体稳定性的SLS
●关于二级结构的FT-IR光谱学
●关于三级结构的荧光光谱学
●用于残留水百分数确定的Karl ficher(对于冷冻干燥物)
●用于饼状物的晶体/无定形基质的XRPD(对于冷冻干燥物)
配制物的选择和冻干过程的主要标准是：
监测下列参数：
●Lead抗体在冻干过程中的稳定性
●重构溶液的稳定性
●FDS的稳定性(冻干前的溶液)
●饼状物的精制程度(elegance)
●重构时间
●饼状物的稳定性
已选择了冷冻干燥循环以避免饼状物的崩塌(参见表22)：
●冷冻温度已被设置为低于完全固化的温度，即，稍低于玻璃转化温度(Tg’)，对于每种FDS候选(冻干前的溶液)，已通过DSC对其进行了测量(参见图17)。
●已设置主要干燥温度进而使样品的温度保持低于崩塌温度，其接近Tg’(参见图17)。
在多种冻干测试的过程中获得的饼状物都是精致的(参见图18)且重构时间在五分钟内。即使在开发过程中监测那些参数很重要，它们与区别配制物无关。
在冷冻步骤过程中，选择1℃/min的冷却速率以避免Lead抗体浓度和pH的显著偏移。选择第二干燥温度(参见表22)以获得通过Karl fisher测量的在饼状物中低于1％的残留水的水平。
Lead抗体的稳定化通过用于纯度的SEC和SDS-PAGE和用于颗粒形成的DLS和FCM评估。配制物间区分的相关标准是重构之前和之后的HMW水平和重构后计数的亚可视颗粒。
为评估冻干过程的影响，冻干之前和重构之后的HMW水平代表每种配制物，以及该水平相对冻干前水平的百分数增加(参见图19和图20)。虚线表明每图增加10％。提供良好稳定性的候选为：
●具有10％蔗糖的磷酸盐：#P14-2
●具有5％蔗糖+3％甘露糖醇的磷酸盐和Tris：#P14-3和P14-8
●具有3％甘露糖醇+1％甘氨酸的磷酸盐：#P14-6
●具有5％蔗糖+3％甘露糖醇的Tris/磷酸盐：#P20-1
●具有5％蔗糖+3％天冬氨酸的Tris/磷酸盐：#P20-2
●具有5％蔗糖+3％脯氨酸的Tris/磷酸盐：#P20-3
●具有5％蔗糖+3％甘氨酸的Tris/磷酸盐：#P20-4
注意到无任何赋形剂时(#P14-1)，Lead抗体对冻干过程强烈不稳定，如在冻干之前和之后观察到HMW约130％的增加。预期该结果作为冷冻/融化循环在DS上于-20℃和-70℃完成(测试#9)，其展示了Lead抗体的强力去稳定化(参见图21)–冷冻是冻干处理的第一步。
关于亚可视颗粒，通过FCM的重构溶液间的比较展示下列候选的更好的稳定：
●具有5％蔗糖+3％脯氨酸的Tris/磷酸盐:#P20-3
●具有5％蔗糖+甘氨酸3％的Tris/磷酸盐:#P20-4
注意：对于测试#14未确定
重构饼状物后为稳定Lead抗体，使用之前发现减缓聚集的赋形剂(参见关于为液体配制物筛选赋形剂的部分)。重构后Lead抗体的稳定化通过针对纯度的SEC和针对颗粒形成的DLS和FCM评估。配制物间进行区分的相关标准为：
●重构后24h的HMW水平(在5℃保存)
●机械应激后的颗粒数目。
关于重构后24h的HMW形成(在5℃保存)，提供最好稳定性的候选为(参见图22和图23)：
●具有3％甘露糖醇+1％甘氨酸的磷酸盐：#P14-6
●具有5％蔗糖+3％脯氨酸的Tris/磷酸盐:#P20-3
●具有5％蔗糖+3％甘氨酸的Tris/磷酸盐:#P20-4
随后：
●具有10％蔗糖的磷酸盐：#P14-2
●具有5％蔗糖+3％甘露糖醇的磷酸盐和Tris：#P14-3、P14-7和P14-8
●具有5％蔗糖+3％甘露糖醇的Tris/磷酸盐：#P20-1
为评估冷冻干燥物的稳定性，在制造后的即刻和一个月(测试#16-20)至两个月(测试#18-20)之后进行重构。冷冻干燥物候选在5℃(测试#16-20)和20℃(测试#17)保存。饼状物的稳定性通过针对纯度的SEC、通过针对颗粒形成的FCM和通过针对饼状物结构的XRPD评估。
关于HMW和可视/亚可视颗粒形成，当在5℃保存时，发现全部配制物是稳定的(参见图24和图25)。在5℃一个月后对于测试#17和20两者观察到的HMW水平的轻微增加在下列测试中未能再现(未显示)。此外，当保存在20℃时，观察到HMW水平的轻微增加(参见图24)。
FDS稳定性是确保DP质量的重要参数，其考虑在测试#16-18和20中。Lead抗体在处理的这个阶段的稳定化通过针对纯度的SEC和针对颗粒形成的DLS和FCM评估。发现在5℃的保存与监测添加剂对Lead抗体稳定性作用相关。对FDS完成的一次冷冻/融化循环也与配制物间的区别相关。
关于Lead抗体保存在5℃时的稳定性，结果描述于关于添加剂的部分中(参见图14)。最佳稳定性获得自：
●具有1.75％蔗糖+1.05％脯氨酸的Tris/磷酸盐：#P20-3-FDS
●具有1.75％蔗糖+1.05％甘氨酸的Tris/磷酸盐：#P20-4-FDS
随后：
●具有1.75％蔗糖+1.05％甘露糖醇的Tris/磷酸盐：#P20-1-FDS
关于一次冷冻/融化循环后Lead抗体的稳定性，通过FCM完成的颗粒计数展示下列配制物候选是稳定的：
●具有1.67％蔗糖+1％甘露糖醇的Tris/磷酸盐：#P17-2-FDS
●具有1.75％蔗糖+1.05％甘露糖醇的Tris/磷酸盐：#P20-1-FDS
●具有1.75％蔗糖+1.05％脯氨酸的Tris/磷酸盐：#P20-3-FDS
总之，考虑下列标准：在处理过程中Lead抗体的稳定性，饼状物的外观(aspect)和稳定性以及重构时间、重构溶液和FDS的稳定性，2种配制物候选脱颖而出：
●具有5％蔗糖+3％甘露糖醇的Tris/磷酸盐
●具有5％蔗糖+3％脯氨酸的Tris/磷酸盐
实施例2-6的结论
在预先配制物工作过程中，由于pH范围(≥7.0)、缓冲系统(Tris/磷酸盐)的选择且特别是由于表面活性剂的添加而管理可视/亚可视颗粒的形成：0.2％的浓度的聚山梨酯80。
然而，HMW的形成对于液体配制物来说仍是问题。尽管HMW形成通过最佳pH(7.0)的选择和一些赋形剂(即蔗糖、甘露糖醇和氨基酸如甘氨酸和脯氨酸)而显著减少，在100mg/mL的有益效果不足以预防HMW的形成来预期对于液体配制物满意的保质期。
因此冻干配制物随冻干处理开发。在冻干过程中为预防聚集，选择冷冻保护剂：浓度为5％的蔗糖。选择的用于液体配制物的稳定赋形剂在冻干过程中进行了测试以更好地稳定冻干前的液体(浓度:35mg/mL)和重构溶液(浓度:100mg/mL)。这些赋形剂中的一些与冻干过程相容且已选择了它们之中的两种：浓度在3％的甘露糖醇和脯氨酸。用于选择的主要标准是：饼状物的精致和稳定性以及FDS(冻干前的溶液)和重构溶液的稳定性。
处于长期稳定性中的两种配制物与一种赋形剂不同(参见表23)：
●原型1：脯氨酸
●原型2：甘露糖醇
表23-配制物的描述
Figure BDA0000892961170000581
额外的配制物研究(实施例7-8)
实施例7-8中使用的缩写为：
DP:药物产品
DS:药物物质
FD:配制物开发
FDS:配制的药物物质
FIM:在人中的首次
GRAS:一般认为是安全的
HDPE:高密度聚乙烯
HMW:高分子量
IEF:等电聚焦
IL:白细胞介素
LMW:低分子量
PC:聚碳酸酯
PES:聚醚砜
PP:聚丙烯
PVDF:聚偏氟乙烯
RT:室温
SC:皮下
Td1:变性的第一温度
TOR:制冷以外的时间(Time Out of Refrigeration)
总结
这些研究的目的(实施例7-8)是改进Lead抗体在液体状态中在形成HMW的高倾向性方面的FDS稳定性。
研究计划的定义基于之前在预先配制物研究中获得的知识(实施例2-6)且集中在室温的35mg/mL FDS中的HMW形成动力学。
使用的全部缓冲剂和赋形剂已在市场上的抗体产品中或其他用于胃肠外使用的产品中使用，特别是其全部是GRAS(一般认为是安全的)。pH范围为6.2-7.4。
将一共50种不同的配制物与表23描述的配制物并列比较。主要的结论为：
●pH值6.2左右减少Lead抗体溶解度：用琥珀酸盐和组氨酸分别观察到凝胶形成和析出
●此外，组氨酸应避免处于pH 6.6，因为溶液是乳白色的且热稳定性略差
●在6.6-7.4的pH范围，对HMW形成动力学不存在明确的pH效果
●增加离子强度对HMW形成动力学具有去稳定化效果
●磷酸盐和柠檬酸盐是测试的最佳缓冲剂，只要其处于低浓度如1.75mM
●全部测试的赋形剂中，最佳的稳定效果是用甘氨酸10和72mM和蔗糖2.4％获得的。然而，稳定效果不允许我们显著放慢HMW的形成
总之，实施例7-8的结果并未鉴别出新的可以显著改进表23中描述的配制物的赋形剂的组合。建议保持下列配制物(参见表24)：磷酸盐6.5mM/Tris3.7mM，pH 7.0，PS800.2％(w/v)，蔗糖5％(w/v)，脯氨酸3％(w/v)。
表24-配制物描述
Figure BDA0000892961170000601
介绍
Lead抗体是工程化的人源化双特异性抗体(BsAb)，其靶向细胞因子IL-4和IL-13。其分子量如通过质谱确定为198kDa，且其Ip如通过IEF确定范围为5.8-6.2。
主要的制造DS过程变化是针对阶段IIb实施，且计划在阶段I/IIa和阶段IIb DS和DP质量间进行比较研究。作为DS制造改变的一部分，决定以减少液体状态中HMW的形成为目的实施配制物研究。因此配制物潜在的改进可包括在比较研究中。
注意到在同一时间，对于阶段IIb的DP制造过程针对规模放大、FDS融化和DP剂量/小瓶变化至100mg/7mL小瓶而非150mg/15mL小瓶进行了优化。该研究与配制物开发平行实施。
用于该研究的目前的靶产物概貌(实施例7-8)规定药物产物的下列特性：
●施用途径：SC注射
●DP形式：冻干
●浓度：溶液以100mg/mL重构
●保质期：24个月
●保存温度：2℃-8℃
●剂量强度：100mg/小瓶
●首要的容器：7mL 1型管状透明玻璃小瓶
药物物质应在-20℃在1L的聚碳酸酯瓶中保存前以35mg/mL配制。在冷冻干燥前不实施额外的赋形剂或稀释剂。
对于FIM的预先配制和配制研究允许得出下列结论：
●避免酸性pH<6.0(低热和胶体稳定性)和碱性pH>7.5(在热应激下的LMW形成和电荷同工型变化)。
●可视/亚可视颗粒通过使用浓度为0.2％的聚山梨酯80与缓冲系统磷酸盐/Tris，pH 7.0的组合显著减少
●HMW形成动力学随Lead抗体浓度增加，且测试的配制物不足以预防HMW在100mg/mL形成，以使我们预期对于液体配制物满意的保质期。
●在液体状态中HMW的形成驱使朝向用略少于1/3的初始体积(冻干前)重构的冻干DP进行开发以从35mg/mL FDS实现100mg/mL。选择冷冻保护剂和冻干保护剂：浓度为5％的蔗糖。
●选择的用于阶段I和IIa的配制物如下：磷酸盐6.5mM/Tris 3.7mM，pH 7.0，PS800.2％(w/v)，蔗糖5％(w/v)，脯氨酸3％(w/v)。
●该配制物可通过组合鉴别为具有轻微积极效果的赋形剂即蔗糖、甘露糖醇和氨基酸如甘氨酸和脯氨酸来针对HMW的形成进行优化。
在液体状态中HMW的形成已鉴别为主要的降解途径。动力学随溶液温度(在DP中在5℃比在RT慢10倍)和Lead抗体浓度增加：
●在RT的35mg/mL FDS：ΔHMW＝+1.6％(7h)和+4.1％(24h)
●在RT的100mg/mL DP:ΔHMW＝+0.6％(1h)和+3.5％(5h)
目标
本研究的目标(实施例7-8)是增加Lead抗体在液体状态中在HMW形成方面的稳定性。为给该研究设置量化目标，提出了下列值：
●针对使用中的稳定性，在DP重构之后在RT 5h：ΔHMW<+1％(5h)，
●为便于DP制造，针对FDS的12h的TOR：ΔHMW<+1％(12h)。
这些目标值考虑到100mg/mL重构的DP的使用条件和当35mg/mL的FDS不在冷藏条件时的工艺制造条件。这些值应取决于质量目标产品概况调整。
研究设计
为该研究提出的方法(实施例7-8)是以35mg/mL的Lead抗体浓度在宽范围的配制物中筛选组合的赋形剂。
配制物的筛选聚焦于能够潜在影响HMW形成的稳定化赋形剂上。对于该研究做出下列决定：
●在筛选中保持PS80和蔗糖在配制物阶段I的浓度，因为在这些浓度并未证明对HMW形成具有负面影响且观察到了对制造过程和/或重构的强力积极影响。
●pH范围收紧在6.2-7.4，由于之前的研究显示了保持pH在pH 7左右的益处
●筛选了在该pH范围内的5种可注射的缓冲剂，单独或与数种赋形剂组合：其他缓冲系统和/或添加剂(主要为氨基酸、蔗糖(除已包含在阶段I配制物中的物质外)和盐)。
药物物质
在该研究(实施例7-8)中使用的DS描述于表25。
表25-DS描述
Figure BDA0000892961170000621
Figure BDA0000892961170000631
药物产品
在本研究中使用的DP(实施例7-8)用配制阶段I/IIa(磷酸盐6.5mM/Tris3.7mM，pH7.0，PS80 0.2％，蔗糖5％，脯氨酸3％)配制(参见表26)。
表26-DP说明
Figure BDA0000892961170000632
配方
用于实施例7-8中每个测试的配方列于下文表27。
表27-配方
Figure BDA0000892961170000633
Figure BDA0000892961170000641
a赋形剂的量以w/v的％表示
制造过程
实施例7-8中的配制物用通过UF/DF以在蔗糖2.1％中42mg/mL的浓度获得的Lead抗体的浓缩溶液制造。该Lead抗体溶液用赋形剂的浓缩贮存溶液稀释。
UF/DF过程
在UF/DF过程中(实施例7-8)，35mg/mL的初始蛋白溶液首先浓缩至40mg/mL，随后将缓冲剂交换。渗滤后，将蛋白溶液浓缩至比42mg/mL更高，其为目标终浓度(参见表28)。
各UF/DF使用的材料和过程条件描述于表28。在UF/DF结束时，将Lead抗体浓度在蔗糖2.1％溶液中调整至42mg/mL。
表28-UF/DF制造参数
Figure BDA0000892961170000651
配制物调整
将UF/DF后的Lead抗体溶液(实施例7-8)用合适的量的浓缩储存溶液稀释直至预期的最终配制物。制造的用于本研究的浓缩溶液的参照号和组成总结于表29。
表29-浓缩储存溶液的配方
Figure BDA0000892961170000652
Figure BDA0000892961170000661
a赋形剂的量以w/v的％表示
每种配制物在层流下无菌过滤(
Figure BDA0000892961170000662
GV)且将一部分酌情(1至2mL)分配入2mLI型玻璃小瓶并在每个稳定性时间点进行密闭(stoppered)。
应激条件
热应激
根据配制物测试，在实施例7-8中实施的热应激条件列于表30。
表30-热应激条件
Figure BDA0000892961170000671
a由于实验室空调作用，RT范围为21℃-29℃
b在标准的非GMP冷室(refrigerated chamber)实施
c GMP加热室(thermostic chamber)
分析方法说明
下列分析方法在实施例7-8中实施：
●对于外观的目视检测(澄清度和颜色)
-在7mL小瓶中的溶液以自然光观察
●针对蛋白纯度的HPLC-SEC
-在35℃的2柱PROSEC 300S-250x 4.6mm
-流动相：磷酸盐0.1M/NaCl 0.2M pH 7.0
-检测：280nm
-注射：10μL(浓度5mg/mL)
-流动：0.2mL/min
-总运行时间：40min
实施下列分析方法：
●针对蛋白纯度的UPLC-SEC
-柱：在40℃的1个Acquity BEH200 SEC(150x 4.6mm dp＝1.7μm)
-流动相：Na2HPO4 50mM/NaClO4 300mM，pH 7.0
-检测：280nm UV
-注射：1μL(5mg/mL的溶液)标准3014ET
-注射：2μL(2.0mg/mL的溶液)
-流动：0.3mL/min
-总运行时间：8min
监测了下列分析方法：
●针对变性温度的DSC：
-使用差示扫描量热法(DSC)以估计在不同配制物中的抗体的热稳定性
-用1℃/min的加热速率从25℃至100℃用VP-毛细管DSC实施热量测量。
-容量曲线(capacity curve)给出关于变性温度Td(℃)的信息(最大峰值)。
评估标准
●SEC：当区别等于或少于0.5％HMW时，认为结果是可比较的。
●DSC：当在Td1上的区别等于或小于0.4℃时，认为结果是可比较的。
UPLC vs HPLC方法
第一次筛选(测试#H04-150至172)在为阶段I建立的HPLC方法上实施。当连续分析大量样品时，观察到关于影响HMW水平确定的基线漂移的问题。
对于第二次筛选(测试#H04-185至190)，为获得精确的HMW水平进化，使用了UPLC方法，对于该方法未观察到基线的漂移。即使在将超过200个样品注射至相同的柱后，仍观察到标准品的相同色谱图。
用于SEC测量的参照
为了在HMW随时间的进化方面比较不同的系列，使用配制物阶段I作为参照：
●对于第一次筛选(测试#H04-150至172)，对于3个系列的每一个，通过用35mg/mL的DP冷冻干燥物的WFI#H04-016重构来获得FDS阶段I。
●对于第二筛选(测试#H04-185至190)，除之前的FDS阶段I(H04-016)，对于3个系列的每一个，使用随测试的配制物一起新鲜制造的另一FDS阶段I。此外，使用了第3FDS阶段I参照(#LT-10006-DS)：FDS并未冷冻干造，而只是被融化。
意外地，HMW动力学在多种参照间表现不同。为比较，与DP冷冻干燥物#H04-016一起测试了两种其他DP冷冻干燥物。DP冷冻干燥物内的区别在RT下40小时后变得显著。然而，融化的参照物#LT-10006-DS在室温从16h起显著不同于全部DP冷冻干燥物。DP冷冻干燥物呈现比融化的参照物#LT-10006-DS更快的HMW动力学，且因此并不能用于比较在该研究中制造的配制物(用于该研究的配制物从融化的FDS制造(参见关于制造过程部分)与配制物阶段I/IIa。
使用相同批次和新鲜制备的冷冻干燥的DP，未在融化的FDS和DP冷冻干燥物间观察到HMW动力学方面的显著区别。因此，在用于此研究的新鲜制造的配制物上观察到的HMW动力学也会在相同配制物冷冻干燥后观察到。
从那些测试得出的结论不能归纳至全部DP冷冻干燥物和全部融化的FDS。不同批次间HMW动力学的比较可能取决于不同参数且将需要具体和单独的研究。
结果和讨论
在实施例7-8中制造的全部配制物包含至少1.75％(w/v)的蔗糖和接近0.07％(w/v)的PS80。这些浓度是名义值且是基于应用至Lead抗体初始溶液的稀释因子。关于PS80浓度，假设在UF/DF过程中的PS80吸收是可忽略的。这些赋形剂浓度与配制物阶段I相同。
实施例7–缓冲剂筛选
在此实施例中的pH从6.2筛选至7.4，且测试了在该范围内的全部可注射缓冲剂：琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐和Tris。
A)缓冲剂和pH的类型
在第一次筛选中(测试#H04-150至172)，上述缓冲剂以10mM的浓度与在实施例8-添加剂筛选中将进一步详细说明的数种赋形剂组合测试。需要注意的是缓冲剂浓度固定在10mM且其对HMW形成的影响将参见关于缓冲剂浓度(实施例7)的部分。
DSC
DSC结果显示全部配制物与参照物具有可比性(Td1＝65.5℃)，除组氨酸配制物，其热稳定稍逊(Td1＝64.7℃至65.1℃)(参见图26)。
在初始时间的目视检测
全部配制物都是清澈的且与参照物具有可比性，除pH 6.2的配制物和pH 6.6的组氨酸配制物。
在pH 6.2，对测试的缓冲剂均观察到溶解度的减少：
●组氨酸配制物在RT析出(参见图27)
●琥珀酸盐配制物在室温稍显乳白色且在5℃可观察到凝胶的形成(参见图27)，这在溶液回到RT和轻微摇动时不可逆。琥珀酸盐可能具有螯合性质。
pH 6.6的组氨酸配制物在RT相比参照物稍微更显乳白色。
通过SEC的HMW进化
由于本文给出的结果来自3个不同系列，HMW进化只能与参照进行比较而不能直接比较。
●组氨酸pH 6.6与参照在RT是具有可比性的且在5℃略好(+2.4％对于单独的组氨酸和+3.2％在144h对于参照)。
●柠檬酸盐pH 6.6在RT略好于参照(+4.6％对于单独的柠檬酸盐和+5.2％在24h对于参照)且在5℃与参照具有可比性。
●磷酸盐pH 6.6在RT略好于参照(+8.2％对于单独的磷酸盐和+9.0％在48h对于参照)且在5℃与参照具有可比性。
●磷酸盐pH 7在RT和5℃与参照具有可比性。
●Tris pH 7在RT比参照略差(+7.8％对于单独的Tris和+7.0％在48h对于参照)且在5℃与参照具有可比性。
●Tris pH 7.4与参照在RT和5℃具有可比性。
参见图28。
关于HMW形成，在pH 6.6，磷酸盐和柠檬酸盐具有可比性，且在pH 7.0，磷酸盐比Tris稍微更加稳定(stablizing)。10mM的上述缓冲剂不能直接与配制物阶段I/IIa比较，因为用于此筛选的参照是从另一批次制造的冷冻干燥物(参见上文关于用于SEC测量的参照部分)。
结论
关于10mM浓度的缓冲系统筛选，可以得出的结论是：
●6.2左右的pH值(接近pI)减少Lead抗体溶解度：
-用琥珀酸盐在pH6.2观察到凝胶的形成
用组氨酸在pH6.2观察到析出。
●此外，组氨酸应避免在pH 6.6，因为所述溶液为乳白色且热稳定性稍逊。
●对于测试的缓冲剂，在范围6.6-7.4内对HMW形成的pH影响没有明显的趋势：组氨酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和Tris
●关于HMW形成，缓冲剂效果非常弱，尽管柠檬酸盐和磷酸盐在10mM看起来是最好的缓冲剂
B)pH对阶段I/IIa配制物的良好调谐
为在同一运行上确定pH对HMW形成的影响，对阶段I配制物在6.7-7.2的范围筛选pH(测试#H04-187)。
DSC
DSC结果显示全部配制物与参照都具有可比性(pH 7.0)(参见图29)。
通过SEC的HMW进化
当将pH从6.7增加至7.2时，存在降低HMW形成的微小趋势(参见图30)，然而这在RT仅24小时后变得显著(+4.1％对于pH 6.7和+3.4％对于pH 7.2)。
结论
使用缓冲剂磷酸盐2.2mM/Tris 1.3mM(配制物阶段I)，在RT 24h后在6.7-7.2的范围存在pH的微小影响。然而，这种影响是微弱的，这是由于其在最初的16h并不显著。这确认了在该pH范围pH对HMW形成的微弱影响。
C)缓冲剂浓度
柠檬酸盐和磷酸盐以小于10mM的浓度进行测试：0、1.75和5.25mM，进而研究缓冲剂浓度对HMW形成的影响(测试#H04-185)。pH设置为测试范围的中间点：pH＝6.8。全部配制物都以72mM包含甘氨酸以调整渗透压，且如在关于结果和讨论的部分开始时所述包含1.75％蔗糖和约0.07％的PS80。
DSC
DSC结果显示全部配制物与参照都是可比较的(配制物阶段I)(参见图31)。注意到无缓冲剂(185A2)的甘氨酸相比其他测试的配制物稳定性稍差(在Td1中约1℃的差别)。
通过SEC的HMW进化
对于两种测试的缓冲剂，当减少缓冲剂浓度时，存在HMW形成减少的微弱趋势，最佳结果在无缓冲剂和在1.75mM缓冲剂中获得(举例来说+7.8％对于柠檬酸盐10mM和+7.0％对于无缓冲剂在RT 48h)(参见图32)。1.75mM的柠檬酸盐和无缓冲剂与参照具有可比性(举例来说+7.1％对于柠檬酸盐和+7.0％对于无缓冲剂在RT 48h，而+6.8％对于参照)。
结论
减少缓冲剂浓度对HMW形成具有微弱的稳定化效果。该效果可能与离子强度有关。无缓冲剂和缓冲剂柠檬酸盐1.75mM就HMW形成而言是最佳候选，随后紧接着是磷酸盐1.75mM。那些用甘氨酸72mM测试的缓冲剂与配制物阶段I/IIa具有可比性。
实施例8–添加剂筛选
添加剂甘氨酸、脯氨酸、组氨酸和Tris的筛选已用缓冲筛选以组合完成(第一筛选：测试#H04-150至172)进而确定赋形剂间潜在的协同效应。添加剂氯化钠、苯甲酸钠、甘氨酸和蔗糖的筛选(第二筛选：测试#H04-185至190)已对磷酸盐或柠檬酸盐(自第一筛选选择的最佳缓冲剂)(实施例7)完成。
配制物包含1.75％蔗糖和约0.07％的PS80。
A)氯化钠和苯甲酸钠
测试了氯化钠和苯甲酸钠以分别评估离子强度和疏水相互作用对HMW形成的影响。这些添加剂以不超过配制物阶段I渗透压(FDS中165mOsm/kg)的浓度对磷酸盐1.75mMpH 6.8进行测试。
DSC
DSC结果展示NaCl配制物与参照具有可比性(Td1＝65.7℃对于NaCl且65.6℃对于参照)，而苯甲酸钠配制物热稳定性稍逊(Td1＝65.0℃)。
通过SEC的HMW进化
对于两种测试的添加剂，与参照相比对HMW形成存在明显的负面影响(举例来说+5.2％对于38.5mM NaCl，+5.2％对于37.8mM苯甲酸钠和+3.2％对于RT 24h中的参照)。对于两种赋形剂，进化相似，仅NaCl结果示于此处(参照图33)。
结论
如对于缓冲剂浓度可见，用NaCl或苯甲酸钠增加离子强度对HMW形成动力学具有明显负面影响。此外，并未观察到由于苯甲酸钠的添加造成的疏水相互作用对HMW动力学的影响。
B)甘氨酸、脯氨酸、组氨酸和Tris
这些添加剂(甘氨酸、脯氨酸、组氨酸和Tris)以10mM浓度进行测试(首次筛选：测试#H04-150至172)。
DSC
DSC结果显示具有上述添加剂的全部配制物与没有的配制物(仅缓冲剂)都具有可比性。
通过SEC的HMW进化
配制物间的差别微小，尽管RT 48h和5℃6天后可看到这种趋势：
●组氨酸缓冲剂：
-RT：
Figure BDA0000892961170000741
-5℃：
Figure BDA0000892961170000742
●柠檬酸盐缓冲剂：
-RT：
Figure BDA0000892961170000743
-5℃：
Figure BDA0000892961170000744
●磷酸盐缓冲剂:
-RT：
Figure BDA0000892961170000745
-5℃：
Figure BDA0000892961170000746
●Tris缓冲剂：
-RT：
Figure BDA0000892961170000747
-5℃：
Figure BDA0000892961170000748
结论
关于HMW形成，这些添加剂的效果微弱，尽管可以看到趋势：
●10mM甘氨酸具有微弱的积极效果
●10mM组氨酸和脯氨酸看起来无效果
●10mM Tris无稳定效果且甚至能够具有微弱的去稳定效果
C)蔗糖和甘氨酸
在第二筛选中(测试#H04-185)，额外量的2.4％蔗糖(除已经包含在全部配制物中的1.75％的蔗糖量，其给出共4.15％(w/v)的蔗糖)和72mM浓度的甘氨酸对所选的最佳缓冲剂进行了测试(参见关于缓冲剂筛选的部分)。将这些浓度最大化进而不超过配制物阶段I渗透压(FDS中165mOsm/kg)。
DSC
DSC结果显示全部蔗糖2.4％和甘氨酸72mM配制物与参照具有可比性(举例来说在蔗糖的情况中，Td1＝65.7℃用于磷酸盐1.75mM和65.6℃用于参照)。
通过SEC的HMW进化
当与用于柠檬酸盐1.75mM和无缓冲剂的仅包含蔗糖的配制物比较时，确认了甘氨酸有轻微积极的影响(参见图34)。然而，该积极影响仅在RT在48h后显著。
结论
关于HMW形成，在感兴趣的时间轴(<24h在RT)，对最佳缓冲候选测试的蔗糖和甘氨酸配制物与配制物阶段I具有可比性。
实施例7-8的结论
对于此项研究，制造了约50种配制物并与目前的阶段I/IIa配制物并排比较。pH筛选范围为6.2-7.4，包括在该pH范围的全部可注射缓冲剂，单独或与数种赋形剂(都为GRAS)组合的情况下，进而评估赋形剂间潜在的协同效应。
此处为主要结论：
●约6.2的pH值减少Lead抗体的溶解度：分别用琥珀酸盐和组氨酸观察到凝胶形成和析出；
●此外，组氨酸应避免pH 6.6，因为所述溶液为乳白色且热稳定性稍逊；
●在6.6-7.4之间的pH范围中，对HMW形成动力学无明显的pH影响；
●增加离子强度对HMW形成动力学具有去稳定化作用；
●磷酸盐和柠檬酸盐是测试的最佳缓冲剂，只要其处于低浓度如1.75mM；
●在全部测试的赋形剂中，最佳的稳定效果用甘氨酸10和72mM和蔗糖2.4％获得。然而稳定效果不允许我们显著减缓HMW形成；和
●脯氨酸在10mM无影响，可将其作为等渗剂使用(91mM的脯氨酸(FDS阶段I配制物中的脯氨酸浓度)未就HMW形成评估其效果(例如在具有或不具有脯氨酸的条件下评估FDS配制物阶段I)。
总之，实施例7-8的结果未鉴别新的能在HMW形成方面显著改善目前配制物的新的赋形剂组合。也就是说，实施例7-8中的结果确认了实施例1-6中的结果。建议保持目前的阶段I/IIa配制物用于阶段IIb研究。目前的配制物因此如下(参见表31)：磷酸盐6.5mM/Tris3.7mM，pH 7.0，PS80 0.2％(w/v)，蔗糖5％(w/v)，脯氨酸3％(w/v)。
表31-阶段I/IIa/IIb配制物说明
Figure BDA0000892961170000761
可实施对目前配制物的量的调整(无新赋形剂辅助的情况下赋形剂浓度的精细调谐)用于阶段III/商用配制物。
Figure IDA0000892961220000011
Figure IDA0000892961220000021
Figure IDA0000892961220000031
Figure IDA0000892961220000041
Figure IDA0000892961220000051
Figure IDA0000892961220000061
Figure IDA0000892961220000071
Figure IDA0000892961220000081

Claims (7)

1.一种稳定的抗体配制物，其包含：
100mg/mL的含有式VL1-接头-VL2的轻链和式VH1-接头-VH2的重链的双特异性抗IL-4/抗IL-13抗体，其中VL1和VH1形成IL-13抗原结合结构域且VL2和VH2形成IL-4抗原结合结构域，其中
VL1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
VH1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
VL2包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；且
VH2包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列；
其中所述接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和
适于将所述配制物的pH维持在约pH7的缓冲系统，其中所述缓冲系统包含约3.7mMTris缓冲剂和约6.3mM磷酸盐缓冲剂；且
其中所述配制物包含0.2％(w/v)聚山梨酯80、5％(w/v)蔗糖和约3％(w/v)甘露糖醇，其中所述双特异性抗体是人源化的IgG4双特异性抗体。
2.权利要求1的配制物，其中所述轻链包含式N-VL1-接头-VL2-CL的轻链，其中CL是抗体的轻链恒定结构域，且其中重链包含式N-VH1-接头-VH2-CH1-CH2-CH3，其中CH2-CH3对应抗体的Fc结构域。
3.权利要求1或2的配制物，其中所述配制物是冻干配制物。
4.权利要求1-3中任一项的配制物，其中所述配制物就可视颗粒、亚可视颗粒、低分子量蛋白和高分子量蛋白而言展现良好稳定性。
5.权利要求1-4中任一项的配制物，其为稳定的冻干抗体配制物，其包含：
约100mg/mL的双特异性抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列的轻链可变区。
6.一种试剂盒，其包含含有权利要求1-5中任一项的配制物的容器和用于施用和使用所述配制物的说明。
7.权利要求1-5中任一项的配制物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗过敏性疾病、癌症、哮喘、与IL-4和/或IL-13的异常产生相关的疾病或与升高的TH-2介导的响应相关的疾病。
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