CN105331630A - 一种增强玉米外源基因表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种增强玉米外源基因表达的方法，所述方法为将含MAR序列的载体转入玉米受体材料胚性愈伤组织中，增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默；所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17，核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。

Description

一种增强玉米外源基因表达的方法

技术领域

本发明涉及基因工程，具体地说，涉及一种增强玉米外源基因表达的方法。

背景技术

转基因技术的研究和应用，既需要研究开发出高效、易操作和低成本的外源基因遗传转化技术，也要求使已经整合到转基因受体生物染色体上的外源转基因能够高水平的稳定表达，以在受体生物上实习外源基因的功能，但是，外源转基因进入受体后常常发生表达量降低，甚至转基因沉默等现象，并没有达到预期表达水平。据报道，外源基因插入受体染色的位置效应，转录中基因沉默和转录后的基因沉默等影响了外源基因在转基因植物中表达效率(李宏，2004)。目前，提高外源基因表达主要采用选择强的启动子和诱导型启动子；选择强的终止子；使用增强子等方法；也可以选择适宜的转化方法；或者用叶绿体作为转化受体；筛选单拷贝后代植株；使用信号肽；使用病毒编码蛋白；外源基因的修饰与改造；消除DNA甲基化的影响；使用受体生物偏爱的密码子；包括使用核质结合区序列(MAR序列)等(StiefAetal，1989)。而研究证实，将MAR与外源基因作为共同单元，构建表达载体可以不受物种限制，并具有操作简单效率高的特点，可以使外源基因在当代稳定表达而且促进外源基因在后代的稳定遗传(Migueletal，2007)，赢得重视。

MAR序列是染色质上的一段与核基质结合的DNA序列，分布间隔为5-200kb，MAR的长度一般为300-1000bp，少数可达几个Kb。常含一些特征基序，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(TTWTWTTWTT)、酵母自主复制序列ARS、拓扑异构酶II识别位点和能形成蛋白质识别位点的松散DNA、弯曲DNA，富含AT区等。除了上述的一般特征外，不同的MARs还具有其特殊的结构序列或特征。一些基因两侧的MAR有着不同的属性，玉米adhI基因附近区域的MAR与核基质结合时能形成7-70kb的染色质环，在这个染色质区域adhI基因5’端的MAR对核酸酶的酶解尤其敏感，而它对adhI基因的表达调控又是必需的。西红柿hsc80基因的5’-MAR与3’-MAR有着截然不同的结合属性。β-菜豆蛋白基因5’-MAR与3’-MAR有着截然不同的调节属性(刘峰等，2003)。

MAR通过与核基质结合使外源基因形成Loop环，而MAR处于Loop环的边界处，每一个Loop环形成一个拓扑上独立的区域，环的大小不影响其对外源基因的表达，染色体的凝结与DNA的转录在此区域不受干扰的独立进行，从而造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性，从而使环内基因免受周围染色质的影响(XuMYetal，2010)。Loop结构模型暗示MAR序列可能作为一个边界元件阻止染色体的凝缩区域或外源基因附近的调控元件对外源基因表达的影响，既可以使基因上游调控序列和基因启动子相互靠近，又使环中的DNA序列靠近核基质，便于基因的启动子和增强子与RNA聚合酶和转录因子相互作用，降低其受周围染色质状态的影响，从而增强启动子的活性，提高基因的转录水平，减少基因沉默(Brouweretal，2002；Maximovaetal，2003)。

根据MAR序列在生物体内功能的不同，可以简单地把MAR序列分为3类：第一类位于基因的下游较远处，此类MAR序列和核基质的亲和力比较高，在整个细胞周期中都保持与核基质的结合状态，它们的作用是将染色质分成许多大小不等的环，这些DNA环除了作为染色质高级组织结构的基本成分，同时也是基因表达调控单位。第二类MAR序列通常位于基因的启动子区和上游调控序列的附近，与核基质亲和力较弱，只是在基因表达，启动转录时才与核基质暂时性地结合。第三类MAR和第二类MAR相同之处是它也只和核基质暂时性地结合，不同之处是它们位于DNA复制起始区附近，和DNA复制起始点相邻或在DNA复制起始点中，在DNA复制时便于复制叉的形成(Breyneetal，1994)。

MAR和核基质之间的相互作用具有进化上的保守性，MAR可以与异源的核基质相互作用(TetkoIVetal，2006)。张可伟等(2002)用水稻的核基质来验证来自烟草和拟南芥的MAR序列与核基质的结合情况效果理想，李旭刚等(2001)的研究结果显示来源于豌豆的MAR可以在烟草中提高外源基因的表达水平，表明不同生物种类的MAR与核基质是能够相互结合的，但并不是所有的MAR都能够与异源的核基质相互作用，如人β-珠蛋白基因中的MAR与烟草核基质之间的结合能力就很弱。但已报到的结果中MAR序列都是从双子叶植物即烟草、拟南芥、大豆等中克隆，其次验证基因表达的是GUS报告基因，只是对功能基因进行验证，而见对外源功能基因表达效率验证的报道。因此通过GUS报告基因结果分析，可以进一步设想分析验证MAR序列对外源抗虫、抗除草剂基因在玉米等单子叶粮食作物中表达的效率，以分析如何增强农产品作物的抗性，为粮食生产做出突出贡献。

黄慧珍等人(2005)从烟草DNA中克隆到的M17基因的AT％含量大于70％，有明显的90％AT等结构域，进一步的序列分析表明，M17大小为674bp，AT％含量为71.5％，均含有MARs的部分特征基序如：A-box，T-box，拓扑异构酶II识别位点，自主复制序列(ARS，autonomouslyreplicatingsequences)，碱基非配对区(BUR，baseunpairingregion)，MAR识别序列(MRS，MARrecognitionsequence)，复制起始点(ORI，originofreplication)，弯曲DNA序列(curvedDNAmotifs)等，M17与原烟草MAR的特征motif及其他序列特征并不相同，Blast分析认为与GenBank中已登录MARs无明显相似性，因此认为是新的MAR片段。现已登录GenBank，登录号为AY766247。

其中A-box＝AATAAAYAA，5个；T-box＝TTWTWTTWTT，7个；ARS＝WTTTATRTTTW，2个；TOPOII＝GTNWAYATTNATNNR，2个；BUR＝AATATATTT，1个；MRS＝TAWAWWWNNAWWRTAANNWWG，2个；ORI＝ATTAorATTTAorATTTTA，23个；curved＝AAAAN7AAAAN7AAAAorTTTAAA，3个；ATATTT，2个。

黄慧珍等人已经证实：在烟草中发现的新MAR序列M17，单侧连接M17的转化植株，其平均GUS活性提高2.43倍，两侧顺式重复连接M17的转化植株中GUS活性可提高3.14倍。与单侧连接的外源基因相比，两端顺式连接的外源基因与核基质的结合更稳定，可以富集更多的调控因子促进转录，所形成的空间拓扑结构也更有利于环内转录。

发明内容

目前对于MAR序列的研究，多数为将其转入同源受体以提高目的基因表达量，而对于转入异源受体(尤其是玉米)的研究相对较少，如今玉米已经成为我国第一大粮食作物，随着转基因玉米的推广，利用MAR序列增强转基因玉米外源的表达尚未报道。本发明的目的是利用从烟草基因组中克隆到已报道的MAR片段M17，以玉米HiII转化受体为材料，通过基因枪轰击法将构建好的含MAR序列的载体转入玉米受体材料胚性愈伤组织，探讨MAR序列转入异源受体(玉米)后对外源基因表达的调控作用。证实了MAR序列增强转基因玉米外源基因高效稳定表达的作用，为进一步开展玉米等粮食作物抗虫、抗除草剂基因工程奠定基础。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种增强玉米外源基因表达的方法，所述方法为将含MAR序列的载体转入玉米受体材料胚性愈伤组织中，增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默；所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

序列分析表明，它们具有90％AT-box，A-box，T-box，碱基非配对区域，拓扑异构酶II识别位点，弯曲DNA序列，复制起始序列和ATATTT等典型的MAR序列特征。

进一步地，所述载体为重组表达载体，所述重组表达载体中启动MAR序列转录的启动子为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子。

进一步地，所述载体为在pCAMBIA3301载体的多克隆位点处插入MAR序列后得到。

更进一步地，所述多克隆位点为NcoI和BstEII。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA2301或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述MAR片段构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。但从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

本发明还提供了MAR序列在增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默方面的应用，其特征在于，所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

作为优选，所述植物为单子叶植物，更优选为玉米。

本发明的有益效果在于：

本专利构建了含有从烟草中克隆的MAR序列(M17)的单侧和双侧植物表达载体，研究了MAR序列转入异源受体(尤其是玉米)后的功能表达，证实了MAR序列增强转基因玉米外源基因高效稳定表达的作用。为进一步分析验证MAR序列对外源抗虫、抗除草剂基因在玉米等单子叶粮食作物中表达的效率奠定基础，以分析如何增强玉米品作物的抗性。因此，通过转基因技术将MAR序列与外源基因结合构建表达载体后，转化玉米等重要的粮食作物，以获得高效、稳定抗逆性转基因玉米等重要的粮食作物具有重要意义，也为以后提高玉米等重要粮食的产量提供了研究方向。

附图说明

图1为M17的测序结果分析图。序列中A/T含量较高，序列大小在674bp。其中含有A-box，T-box，DNA解旋序列，复制起始点ORI等MAR序列特有的特征基序。

图2为植物表达载体的酶切鉴定图，1为NcoI单酶切p3301-M17-N，2为BstEII单酶切p3301-M17-B，3为NcoI单酶切双侧构建载体p3301-M17-N-B，4为BstEII单酶切双侧构建载体p3301-M17-N-B。选用的Marker为MarkerIII。

图3为用包裹金粉的质粒轰击玉米愈伤组织，在N₆E培养基培养一个星期后的照片，所采用的质粒为pCAMBIA3301空载体(标记为3301-空)，在BstEII酶切位点插入M17的pCAMBIA3301载体(标记为3301-B)，在NcoI酶切位点插入M17的pCAMBIA3301载体(标记为3301-N)，以及在BstEII和NcoI酶切位点同时插入M17片段的双侧构建pCAMBIA3301载体(标记为3301-双或3301-N-B)。

图4为用包裹金粉的质粒轰击玉米愈伤组织后，在含有草丁膦(2.5mg/L)的筛选培养基N₆S中进行筛选培养。所采用的质粒与标记同上。

图5为用包裹金粉的质粒轰击玉米愈伤组织后，经过在含草丁膦的抗性筛选培养基上进行数次继代后，我们挑选白色，干燥，松散的抗性愈伤组织，转入基因枪-再生Ⅰ培养基中进行培养。所采用的质粒与标记同上。

图6为提取的玉米愈伤组织DNA进行PCR鉴定图。1-12均为转基因玉米愈伤组织，1-4为转p3301-M17-B载体的玉米愈伤组织，5-8为转p3301-M17-N载体的玉米愈伤组织，9-12为转p3301-M17-N-B载体的玉米愈伤组织，CK为空白对照。

图7为RT-PCR的方法检测GUS的表达量图。在所有的转基因玉米愈伤组织中，双侧构建M17的p3301-M17-N-B中GUS的条带亮度无论和对照还是单侧构建的载体相比，亮度明显增加，而单侧构建的两个载体体现的GUS转录水平也高于对照即p3301空载体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1烟草MAR序列M17基因的克隆与表达分析

(一)、材料

1、野生型烟草NicotianatabacumL.，玉米再生系HiII

本研究所用的大肠杆菌菌株为DH5a(实验室自己保存)，含有CaMV35S启动子驱动的Gus基因的植物表达载体pCAMBIA3301(北京大学瞿礼嘉教授提供)；pMD18-T克隆载体(购自Takara生物公司)；各种常用抗生素；构建载体所需要的限制性内切酶；基因枪转化所需要用到的各类生化试剂。

2、培养基及常用溶液配制

(1)LB(Luria-Bertani)培养基(1L体系)

补水至1L(液体培养基无需加入琼脂粉)

(2)YEP培养基(1L体系)

补水至1L(液体培养基无需加入琼脂粉)

(3)卡那霉素溶液配制(50mg/ml)

称取2.5g卡那霉素，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。

0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存

(4)氨苄霉素配制(100mg/ml)

称取5g氨苄霉素，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。

0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存。

(5)利福平溶液配制(50mg/ml)

称取2.5g利福平置于50ml塑料离心管中，加入40ml甲醇，振荡充分混合溶解之后定容50ml，可以涡旋。

0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存。

配制时每毫升可加入3～5滴10NNaOH以助溶。若以DMSO做溶剂，可不滴加NaOH。

(6)IPTG配制(24mg/ml)

称取1.2gIPTG，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。

0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存。

(二)、方法

1.烟草MAR序列M17的克隆

1.1实验用到的引物

本实验所需引物由上海生工合成，P1-P4均为M17序列引物，其中P1-P2为含NcoI酶切位点的M17引物，P3-P4是含BstEII酶切位点的M17引物。

P1：5’-CATGCCATGGTGTCATATTTGGCT-3’

P2：5’-CATGCCATGGATCCCAACTATGG-3’

P3：5’-GGGTTACCTGTCATATTTGGCT-3’

P4：5’-GGGTTACCATCCCAACTATGG-3’

1.2烟草基因组DNA的提取(小量法)

1)取1-2g新鲜烟草叶片放入1.5ml离心管中，将离心管浸入液氮中，用研磨棒研磨成粉末。

2)在研磨好的粉末中加入500μLCTAB提取缓冲液，剧烈摇动混匀，65℃水浴锅。

3)每个离心管中加入预热的300μL提取液，轻轻混匀。

4)将样品于65℃水浴保持15～30分钟。(其间用手摇动三次)

5)冷至室温，加入200μL氯仿/异戊醇，轻轻充分混匀。

6)12000rpm，离心10分钟。

7)取上清液，加入250μL异丙醇，轻轻混匀。

8)12000rpm，离心10分钟，倒掉上清液，并用70％乙醇洗涤沉淀一次。

9)真空干燥10分钟，或室温干燥30分钟。

10)用50μLddH₂O溶解DNA。

11)加入1.5μLRNase(RNase10mg/m1)，37℃保温30分钟。-20℃长期保存。

1.3M17的克隆

利用人工合成的引物P1-P4，以烟草基因组DNA为模板进行扩增。

PCR反应体系(40μL)：

注：Prime引物稀释：5’primer5μL+3’primer5μL+ddH₂O240μL

按照以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40sec；56℃退火45sec；72℃延伸1min，30个循环；72℃保持5min，4℃保温。

1.4DNA片段的回收

按照回收试剂盒(天根公司)的使用说明进行：

(1)用干净的刀片将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，尽量切除多余部分，放入干净的离心管中。

(2)向胶块中加入3倍体积(即300μL)溶胶液BN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(3)在溶胶的同时，向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(4)胶块完全溶解后，静置2分钟，等待胶溶液温度降至室温上柱。

(5)将第2步所得溶液加入已平衡的吸附柱CA2中，室温放置2分钟，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(6)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，静置2分钟，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(7)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60秒，倒掉废液。

(8)将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。

(9)将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

(10)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μLddH₂O，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液

(11)将得到的30μL溶液继续悬空滴加到吸附柱，重复步骤10，所得到的即为回收片段，立即使用或者保存于-20℃长期保存。

1.5与pMD18-TSimplevector进行连接

将回收目的基因与pMD18-TSimplevector进行连接，命名为pMD18-T-M17N(含NcoI酶切位点)、pMD18-T-17B(含BstEII酶切位点)。经PCR鉴定，测序并分析。(测序分析结果参见附图说明中的图1)

采用以下连接体系进行连接反应：

混匀，放置16℃过夜。

1.6大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

(1)从于37℃培养16-20h新鲜平板上挑取一个单菌落，接种于15mlLB液体培养基的三角瓶中，37℃，190rpm振荡培养过夜(约14h)。

(2)取1.6ml菌液接到一个含有14.4mlLB液体培养基三角瓶中，37℃，210rpm培养90min。

(3)再取出10ml菌液转接到一个含有90mlLB液体培养基三角瓶中，37℃，210rpm培养10min

(4)将菌液分装到2个50ml离心管中，冰上放置10min，4℃，5000rpm离心7min，倒出培养液，回收菌体，将管倒置1min以便培养液流尽。(注意无菌操作)

(5)用冰预冷的0.1MCaCl₂(新鲜解冻的)0.5ml在冰上用枪吸打，使其沉淀悬浮。再补加0.1MCaCl₂至20ml。立即放在冰上静置30min(从接触CaCl₂开始计时)。4℃，5000rpm离心7min，回收菌体。加入2ml冰预冷的0.1MCaCl₂悬浮细胞(冰浴上操作)。

(6)分装：感受态细胞85μL，加上15μL纯甘油。100μL分装，-80℃保存。

1.7碱裂解法小量提取质粒DNA

相关溶液配制：

溶液一(用时置于冰上)：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(PH8.0)，高压灭菌，4℃保存。

溶液二(现用现配，1000μL量)：800μLddH₂O，100μL氢氧化钠(2mol/L)，100μLSDS(10％)，室温保存。

溶液三(用时置于冰上)：60μL乙酸甲(5mol/L)，11.5μL冰乙酸，28.5μLddH₂O，用醋酸调pH值到4.8，高压灭菌，4℃保存。

1)取培养的菌液1.5ml于1.5ml的小离心管，5000rpm离心2min，弃上清，再倒入1.5ml菌液，5000rpm离心2min，弃上清，用100μL枪吸收余液。

2)加入100μL溶液一，用漩涡震荡器剧烈震荡，使菌体充分悬浮。

3)加入200μL溶液二，温和颠倒4-10次，避免剧烈震荡，冰浴5min。

4)加入150μL溶液三，温和摇匀，冰浴5min。

5)室温12000rpm离心10min，小心吸上清至另一1.5ml离心管。

6)加入与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻摇1min，12000rmp离心5min，吸上清至另一离心管。

7)加入与上清等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻摇1min，12000rmp离心5min，吸上清至另一离心管。

8)加入两倍体积的无水乙醇，1/10体积的NaAc(pH5.3)，颠倒混匀，-20℃沉淀30min以上。

9)12000rmp离心10min，去上清，用500μL70％乙醇洗涤一次，洗涤离心2min后倒去乙醇，用枪吸尽多余乙醇，在超净台风干15min。

10)加入40μLddH₂O溶解DNA，加入1.5μLRNA酶，枪头打到液面下方，37℃消化30min，4℃保存备用，-20℃长期保存。

2、烟草MAR序列M17在玉米愈伤组织中的表达

2.1基因枪法所用培养基：

高渗培养基：N6基本培养基基本成分+2mg/L2,4-D+0.7g/LL-脯氨酸+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+0.1g/L水解酪蛋白+36.4g/L山梨醇+36.4g/L甘露醇+2.7g/L琼脂(pH5.8)，灭菌后加入AgNO₃0.85mg/L。

继代培养基：N6基本培养基基本成分+2mg/L2,4-D+0.7g/LL-脯氨酸+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+0.1g/L水解酪蛋白+2.7g/L琼脂(pH5.8)，灭菌后加入AgNO₃0.85mg/L。

基因枪-筛选培养基：N6基本培养基基本成分+1.5mg/L2,4-D+0.1g/L肌醇+5g/L蔗糖+10g/L甘露糖+2.7g/L琼脂(pH5.8)。

基因枪-再生Ⅰ培养基：MS基本培养基+50g/L蔗糖+5g/L甘露糖+0.1g/L肌醇+2.7g/L琼脂(pH5.8)。

基因枪-再生Ⅱ培养基：MS基本培养基+25g/L蔗糖+5g/L甘露糖+0.1g/L肌醇+2.7g/L琼脂(pH5.8)。

壮苗培养基：MS基本培养基+0.7g/LL-脯氨酸+0.8g/L天冬素+0.1g/L肌醇+20g/L蔗糖+10g/L葡萄糖+0.1g/L水解酪蛋白+0.5mg/LNAA+2.7g/L琼脂(pH5.8)。

表1MS微量元素贮存液(1000×)

表2MS大量元素贮存液(20×)

表3MS维生素贮存液(200×)

表4铁盐的配制方法(200×)

表5N₆维生素贮存液(200×)

表6MS基本培养基配方

PH5.8N6培养基大量元素储存液(20×)：

N6培养基微量元素储存液(1000×)：

N6基本培养基配方：

2.2常用溶液的配制

乙酰丁香酮(As)(100mM)：称取196.2mgAs，用5mlDMSO直接溶解，并定容至10ml，用0.22μm滤器超滤除菌，分装成每份1ml，避光贮于-20℃冰箱中备用。

2,4-D(1mg/ml)：取25mg的2,4-D，加入少量95％的酒精再加蒸馏水定容至250ml，4℃保存。

NAA母液(0.5mg/ml)：称取100mgNAA置于小烧杯内，用1M的KOH溶液溶解NAA，用水定容至200ml，4℃保存。

头孢霉素(cef)(100mg/ml)：称取1gcef溶于10ml超纯水中，用0.22μm滤器超滤除菌，配制好后，避光贮于-20℃冰箱中备用。

2.3基因枪转化(型号PDS-1000/He)转化玉米愈伤组织

2.3.1诱导愈伤组织

(1)取授粉后10-12天的玉米果穗，去除苞叶，切除穗顶端1厘米，在上部顶端轴心插入镊子尖端，有助于无菌条件下处理幼穗。

(2)在超净台上把穿有镊子的穗放入无菌的广口瓶内。如果必要可以在一个广口瓶内一次处理四穗。

(3)加700ml消毒溶液[50％商业漂白剂或5.25％次氯酸钠，并加一滴Tween20]淹没玉米穗。消毒20分钟。握住镊子末端，使消毒溶液流出，然后取出果穗放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗涤三次，在超净工作台上晾干。

(4)在超净台上，把穗子放在一个较大的培养皿上，用新的、解剖刀切除穗籽粒的表面1-2mm。在此过程，使用酒精灯间歇的杀菌器具。

(5)利用解剖刀插入窄的末端于胚乳和果皮间，暴露胚乳种子表面，由上而下剥离籽粒幼胚(面向玉米轴的底部)。这样不触坏幼胚，位于籽粒顶部，靠近籽粒底部。幼胚被轻轻的附在刀片顶端，幼胚的胚轴面要与N6E培养基表面接触(角质鳞片面朝上)，幼胚放置的密度大约为30个/皿。

(6)用封口膜密封培养皿，28℃暗培养7-10天，即可见愈伤组织。用于基因枪转化，需继代培养2周左右，待松散的Ⅱ型愈伤长出时，转化效果较好。

2.3.2实验材料的准备

(1)选取较好的松散的Ⅱ型愈伤，转移到高渗培养基中，集中在培养基的中心放置，摆成约3cm的圆形，基因枪轰击前4小时准备好。

(2)事先保存的表达载体的质粒DNA，通过DNA的凝胶电泳估计质粒DNA的浓度，如果浓度较大，可适当稀释至30-60ng/μL。

2.3.3金粉的制备

(1)称取金粉10mg(20枪用)，放入一支无菌的1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇，在振荡器上剧烈振荡10min，静置5min，10000rpm离心1min，去掉上清。重复上述步骤三次。

(2)加入1.0ml灭菌重蒸水，高强度振荡重新悬浮，静置1min，短暂离心3S，去掉上清，重复三次。

(3)加入0.25ml灭菌的重蒸水，重新悬浮后，平均分配至5支离心管中(每管50μL)，-20℃保存。

2.3.4微弹粒子的准备

(1)取50μL冷冻金粉溶液解冻，用手振荡均匀。

(2)在超净台中加入适量质粒DNA(60-100ng)用手振荡均匀，轻击管壁收集所有液滴到管底部。

(3)加入50μLCaCl₂，用枪头吸打一次，在低速漩涡器上振荡，边振荡边加入20μL亚精胺后，静置30S，用手振荡开，重新放到漩涡器上振荡10min。

(4)取下离心管，静置5-7min，2000rpm离心15S，小心吸去上清，加入250μL冰冻的无水乙醇到沉淀中，手指击打均匀，静置4-5min，离心2000rpm15S，小心吸去上清。重复上步操作，加入200μL无水乙醇，再洗涤一次，离心后，加入110-140μL无水乙醇，待用。

2.3.5轰击受体材料

(1)打开超净台，用70％乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部。将用酒精浸泡的载体膜、铁丝网、用异丙醇浸泡一下可裂膜，放在滤纸上自然风干，圆形钢圈在70％酒精中浸泡后取出在酒精灯上烧干。

(2)把灭好菌的载体膜装入圆形钢圈，在载体膜中心加上10μL用质粒DNA包裹好的微弹粒子，自然条件下晾干。打开气瓶，调节压力至2000psi。

(3)将可裂膜、铁丝网和载体膜安装进固定装置中。射击参数为：Gapdistance:20min；微弹载体飞行距离:10mm；微弹飞行距离:7cm；压力:1350psi；真空度:28inchesHg。把准备好的Ⅱ型愈伤放在托盘上，将托盘插入倒数第二档。

(4)打开基因枪的电源，打开真空泵，关闭基因枪的门，按下抽真空键(Vac)，当真空表读数达到28inchesHg时，使键置于保持(Hold)档。

(5)按下射击键(Fire)直到射击结束，按下放气键，使真空表读数归零。打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封好。

(6)轰击后的愈伤组织在高渗培养基上放置1小时后，倒入继代培养基，28℃暗培养。

(7)被轰击的愈伤组织在继代培养基N6E上培养7-10天后，倒入含有草丁膦(2.5mg/L)的筛选培养基N6S中筛选，28℃暗培养。每三周更换一次培养基，筛选2个月左右。筛选两个月后，挑选白色，干燥，松散的抗性愈伤，转入基因枪-再生Ⅰ培养基，暗培养2-3周后，当细胞开始变大后，转入基因枪-再生Ⅱ培养基，光照培养。分化出小苗后，转入壮苗培养基，待小苗根长出三根以上，植株有10多厘米高时洗去培养基，转入灭过菌的营养土与蛭石的混合土中。待小苗长势相对稳定后移入温室，使它开花结实。(轰击玉米愈伤组织结果参见附图说明图3，图4和图5。)

2.4玉米愈伤组织DNA的提取

(1)取约1-2g长势较好的白色松散抗性玉米愈伤组织于1.5ml离心管中研磨至稀糊状；

(2)加500μL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，加入1ul巯基乙醇，混匀；

(3)65℃水浴30分钟，期间轻摇离心管几次；

(4)取出离心管，待冷至室温(25℃)，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心充分摇动试管；

(5)室温下12000rpm离心10分钟；

(6)取上清到另一个离心管，加入等体积的异丙醇，缓慢颠倒离心管10次以上，-20℃放置15-30min；

(7)12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗2次，无水乙醇洗涤一次，超净工作台吹干。加入100ulddH₂O65℃水浴15-20min；

(8)加入5ul10mg/mlRNaseA小心混匀，37℃温育2h；

(9)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，室温下12000rpm离心10min，吸取上清液到另一个离心管，加1/10体积的3MNaAC(pH5.2)，2倍体积无水乙醇。放于-20℃沉淀DNA；

(10)12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗1次，无水乙醇洗涤一次，超净工作台吹干；

(11)溶于适量TE或ddH₂O中。

2.5阳性克隆的鉴定

利用人工合成的引物P1-P4，以玉米再生系HiII愈伤组织DNA为模板进行扩增。

PCR反应体系(10μL)：

注：Prime引物稀释：5’primer5ul+3’primer5ul+ddH₂O240ul

按照以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40sec；56℃退火45sec；72℃延伸1min，30个循环；72℃保持5min，4℃保温。(对愈伤组织阳性克隆的鉴定结果参见附图说明图6)

2.6RNA提取操作步骤

(1)将拟南芥叶片在液氮中磨碎，每1.5mlEppendorf管加入100mg左右样品。

(2)每管加入lmlTrizol(每100mg样品加lmlTrizol)。迅速混匀，室温下静置5-10min，使核酸蛋白复合物完全分离。

(3)4℃12000rpm离心10min，取上清。

(4)加入200ul的氯仿(每使用lmlTrizol加0.2ml氯仿)，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3-5min。

(5)4℃12000rpm离心15min，样品分为底层黄色有机相，中间层和上层无色水相三层，RNA主要在水相中，水相大致占用了60％的试剂体积。取上清转移至新1.5mlEppendorf管中。

(6)加入0.5ml异丙醇(每使用lmlTrizol加0.5ml异丙醇)，混匀，室温放置10min。

(7)4℃12000rpm离心10min，弃上清，RNA在管底和管侧形成胶状沉淀

(8)加入1ml75％乙醇(DEPC水配的乙醇溶液，每使用lmlTrizol至少加1ml乙醇)洗涤RNA沉淀(务必使沉淀悬浮起来)。

(9)4℃12000rpm离心5min，弃上清。

(10)室温放置晾干5-10min，加入30ulDEPC处理水，60℃放置10min溶解RNA。

(11)去除总RNA中混杂的DNA，具体如下：

以下混合溶液在37℃水浴40min降解DNA

(12)将反应体系37℃水浴40min

(13)加入60ulDEPC处理水，100ulTris饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。

(14)取上清，加入400ul氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rpm离心10min

(15)取上清，加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2)，加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30-60min

(16)12000rpm离心15min，回收沉淀，用70％乙醇洗涤两次，将RNA沉淀晾干后溶于30ulDEPC处理水。电泳检测后-70℃保存。

2.7反转录成cDNA

(1)每个200μLPCR管中加入0.1μg/μL的总RNA2μL，2μM锚定引物2μL，小心混匀，65℃水浴中保温5min；

(2)接着冰浴2min，离心将管内液体收集至管底；

(3)在冰上依次加入下表所列各种组分：

(4)混匀,离心将管内液体收集至管底，在PCR仪上42℃进行反转录90min；

(5)70℃10min使反转录酶失活；

(6)保存于-20℃。

反应完成后稀释10倍取1μL准备做PCR扩增

2.8GUS全长cDNA的克隆

200μLPCR管中一次加入以下组分：

注：

GUS-F:5’-GTCGCGCAAGACTGTAACCA-3’

GUS-R:5’-CGGCGAAATTCCATACCTG-3’

Prime引物稀释：GUS-Fprimer5ul+GUS-Rprimer5ul+ddH₂O240ul：

以反转录GUScDNA为模板，设计一对特异引物，严格控制循环数。本实验引物使用GUS-F和GUS-R,RT-PCR的循环数控制在30。PCR反应的循环参数为：94℃预变性3min，30cycles：94℃30sec；60℃40sec；72℃40sec，72℃延伸7min。重复实验3次以确保结果可靠。GUS表达量检测结果参见图7。

(三)结果与分析

1.烟草M17基因的克隆

2.载体的构建

为了更好地理解MAR-M17在植物中的功能，我们利用pCAMBIA3301构建了花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子调控下的表达植物载体。

以不含M17序列的植物表达载体pCAMBIA3301为对照，此载体只含有CaMV35S启动子控制的GUS基因。利用克隆的M17序列，以CaMV35S启动子控制的GUS基因为报告基因构建了3个带有M17的植物表达载体，其中p3301-M17-N和p3301-M17-B为一端分别连接带NcoⅠ酶切位点的M17和带BstEII酶切位点的M17的载体。具体操作如下：

用含NcoⅠ和BstEII酶切位点的引物分别扩增M17片断，并连接到T-easy载体。之后用NcoⅠ和BstEII分别单酶切含有M17的T-easy质粒，获得带有NcoⅠ和BstEII酶切位点的M17片断(命名为M17-N和M17-B)，再用相同的酶单酶切pCAMBIA3301获得带有NcoⅠ和BstEII的2个pCAMBIA3301载体，回收载体和目的片断，再进行连接，就得到了含目的基因M17-N,M17-B的2个单侧构建植物表达载体p3301-M17-N,p3301-M17-B。用同样的方法将带有NcoⅠ酶切位点的M17与经过NcoⅠ单酶切p3301-M17B获得的载体进行连接最终得到含有2个M17目的基因的p3301-M17-N-B的双侧构建载体。

连接后的载体经过酶切鉴定，鉴定结果表明得到正确的载体:

M17-N为带NcoI酶切位点的M17片段克隆；M17-B为带BstEII酶切位点的M17片段克隆

3.基因枪转化

转M17基因的质粒一共有4个：p3301空质粒，单侧构建M17的p3301-M17-N和p3301-M17-B，双侧构建M17的p3301-M17-N-B。将质粒稀释成100ng/μL进行轰击准备，将枪击后的愈伤组织恢复培养7d后转移到含有草丁膦的培养基上继代筛选5-6轮，每轮15-20d左右。然后再挑选白色，干燥，松散的抗性愈伤组织，转入基因枪-再生Ⅰ培养基，暗培养2-3周后，当细胞开始变大后，转入基因枪-再生Ⅱ培养基，光照培养。分化出小苗后，转入壮苗培养基。

4.RT-PCR检测

我们提取了转基因玉米愈伤组织的RNA，反转录为cDNA，用RT-PCR的方法检测GUS的转录情况，在所有的转基因玉米愈伤组织中，双侧构建M17的p3301-M17-N-B中GUS的条带亮度无论和对照还是单侧构建的载体相比，亮度明显增加，而单侧构建的两个载体体现的GUS转录水平也高于对照即p3301空载体。也就是说，M17除了在转化拟南芥中对GUS表达量有提高的作用，在转化玉米愈伤中也有一定的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种增强玉米外源基因表达的方法，其特征在于，所述方法为将含MAR序列的载体转入玉米受体材料胚性愈伤组织中，增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默；

所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体为重组表达载体，所述重组表达载体中启动MAR序列转录的启动子为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述载体为在pCAMBIA3301载体的多克隆位点处插入MAR序列后得到。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多克隆位点为NcoI和BstEII。

5.MAR序列在增强植物外源基因的高效稳定表达，减少基因沉默方面的应用，其特征在于，所述MAR序列为来自烟草的MAR片段M17，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米。