CN105315353B - 一种利用表面展示外源蛋白合成的二氧化钛粉体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种利用表面展示外源蛋白合成的二氧化钛粉体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于仿生合成领域,具体涉及一种利用表面展示外源蛋白合成的二氧化钛粉体及其制备方法和应用。所述二氧化钛粉体由内层的二氧化钛和包覆在其外层的碳化物组成;所述碳化物为表面展示有外源蛋白INP‑nR5的细菌经高温热处理后的碳化产物。本发明利用细菌表面展示外源蛋白INP‑nR5合成二氧化钛粉体,通过改变外源蛋白INP‑nR5的重复序列片段,可以获得外层包覆有碳的棒状二氧化钛粉体;所述棒状二氧化钛粉体具有介孔结构、颗粒粒径小、外层包覆有碳,将其应用于制备锂离子电池负极材料,显示出了良好的储锂性能。
Description
技术领域
本发明属于仿生合成领域,具体涉及一种利用表面展示外源蛋白合成的二氧化钛粉体及其制备方法和应用。
背景技术
生物矿化是指生物体合成高度精细的有机-无机杂化结构的过程,其实质是生物体内矿物生长的过程。在矿物生长的过程中,生物体内蛋白质起着至关重要的作用,例如骨骼中的非胶原蛋白、贝壳中蛋白聚糖、硅藻中硅蛋白等。这些蛋白质不仅在生物体内的矿物形成过程中起到作用,而且还能用于体外合成其它非生物体无机材料。将蛋白质用于指导无机材料的合成,利用蛋白质来指导无机材料的合成具有以下几个优势:第一,相比于传统的材料合成工艺技术,其反应条件更加温和;第二,对材料的合成精细可控,因为蛋白质可影响产物的尺寸、形貌、化学性质等;第三,可赋予材料高度特异性或多功能性。
将蛋白质用于合成非生物体材料研究最多的是生物体海绵中的硅蛋白(silicaprotein,silicatein)和硅藻细胞壁中的亲硅蛋白(silica affinity,silaffin)。亲硅蛋白,在硅藻细胞壁中含量丰富,含有大量的赖氨酸和精氨酸。Nils Kroger等人首次使用亲硅蛋白的碳端(rSilC)在室温下获得了二氧化钛金红石相。随后,他们将rSilC蛋白质通过层层自组装技术吸附在膜上,而rSilC分子本身聚集在一起形成纳米畴,这样就可以作为模板来形成以及稳定纳米尺度的TiO2颗粒,还能有效阻止颗粒间的聚集(BioenabledSurface-Mediated Growth of Titania Nanoparticles,Adv.Mater.2008,20,3274–3279)。亲硅蛋白本身还有很多重复片段,单个片段含有19个氨基酸,称为R5。
若直接从生物体提取蛋白质的步骤繁琐,产量少,纯度也不高。分子生物的发展解决了这一问题,因为采用该技术可以合理的设计所需要的蛋白质,再通过表达纯化来获得高纯度的目的蛋白质。不过表达纯化也有缺点,可能目的蛋白质具有疏水性,在纯化后易于团聚形成包涵体。表面展示技术能有效的克服这一困难,将目的蛋白质展示在生物体表面后,生物体本身也可以作为模板,这样获得的产物不再是单一的颗粒,而是具有多尺度的空间结构。
表面展示分为噬菌体表面展示和细菌表面展示。研究工作大多通过基因工程改造,使得目的蛋白质展示在噬菌体衣壳蛋白上,或者大肠杆菌外膜上。细菌表面展示相比于噬菌体表面展示,具有以下优势:第一,更准确的控制蛋白质在表面的分布密度,这样更利于控制材料在表面的形成;第二,可以随意选择有模板活性的目的蛋白质展示;第三,具有更加宽泛的温度适应性,更有利于化学反应;第四,可宏量制备。目前,还没有专利或研究论文报道使用表面展示的方法来制备二氧化钛,并将其应用于锂离子电池。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,目的在于提供一种利用表面展示外源蛋白合成的二氧化钛粉体及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案为:
一种细菌表面展示外源蛋白INP-nR5,包括冰核蛋白域INP和功能蛋白域nR5,其中n为5、3、2、1;所述外源蛋白INP-5R5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述外源蛋白INP-3R5的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述外源蛋白INP-2R5的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述外源蛋白INP-R5的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
一种利用上述细菌表面展示外源蛋白INP-nR5合成的二氧化钛粉体,由内层的二氧化钛和包覆在其外层的碳化物组成;所述碳化物为表面展示有外源蛋白INP-nR5的细菌经高温热处理后的碳化产物。
上述方案中,所述二氧化钛粉体为棒状结构的二氧化钛粉体,具有介孔结构,所述介孔的孔径为3~5nm。
上述方案中,所述二氧化钛粉体的粒径为5nm~20nm。
上述利用细菌表面展示外源蛋白INP-nR5合成二氧化钛粉体的制备方法,包括如下步骤:
(1)采用PCR扩增方法获得外源蛋白INP-5R5的编码基因,并通过限制性内切酶作用,使编码基因和pET-28a质粒环暴露出相同的粘性末端,再在DNA连接酶的作用下将两者连接,构建得到含外源蛋白INP-5R5的重组质粒pET(INP-5R5);采用反向PCR技术在已经构建好的重组质粒pET(INP-5R5)上删除其中的R5片段,分别获得含外源蛋白INP-R5的重组质粒pET(INP-R5)、含外源蛋白INP-2R5的重组质粒pET(INP-2R5)、含外源蛋白INP-3R5的重组质粒pET(INP-3R5);
(2)将重组质粒pET(INP-5R5)、pET(INP-3R5)、pET(INP-2R5)或pET(INP-R5)转入感受态细胞大肠杆菌中,并使外源蛋白5R5、3R5、2R5或R5在大肠杆菌外膜展示表达;
(3)将外源蛋白表达后的大肠杆菌加入到二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛溶液中,在磁力搅拌条件下反应,反应完成后的产物离心、洗涤后冷冻干燥,冷冻干燥后的产物通过高温热处理后得到二氧化钛粉体。
上述方案中,步骤(3)所述磁力搅拌条件反应为:首先在30℃~37℃条件下反应20h~24h,再升温至80℃继续反应20h~24h。
上述方案中,步骤(3)所述高温热处理为:将冷冻干燥后的产物置于空气气氛或Ar气氛中,550℃~650℃条件下处理4~8h。
上述利用细菌表面展示外源蛋白INP-nR5合成的二氧化钛粉体在锂离子电池中的应用。
本发明所述的二氧化钛粉体与超级导电碳、PVDF以质量比7:2:1混合均匀后,可以作为锂离子电池负极材料使用。
本发明中采用分子生物技术将跨膜蛋白(INP)与功能蛋白(5R5)结合起来得到重组蛋白INP-5R5,该蛋白质包含冰核蛋白域(INP)和功能蛋白域(5R5),冰核蛋白域能实现跨膜运动,并锚定在细菌外膜上,功能蛋白域(5R5)可以与外界环境接触;功能蛋白域能与环境中的钛源相互作用(主要是静电作用)可吸引二氧化钛前驱体沉积在细菌表面;再通过热处理方法,获得粒径小、分布均匀的二氧化钛粉体。同时,本发明通过改变与环境接触的功能蛋白域的重复片段数目(3R5、2R5、R5),还可获得不同粒径的二氧化钛粉体。
本发明的有益效果:本发明利用细菌表面展示外源蛋白INP-nR5合成二氧化钛粉体,通过改变外源蛋白INP-nR5的重复序列片段,可以获得外层包覆有碳的棒状二氧化钛粉体;所述棒状二氧化钛粉体具有介孔结构、颗粒粒径小、外层包覆有碳,将其应用于制备锂离子电池负极材料,显示出了良好的储锂性能。
附图说明
图1为本发明实施例1中外源蛋白INP-5R5在大肠杆菌表面展示后SDS-PAGE图谱,泳道1为marker,泳道2为对照组,泳道3为外源蛋白INP-5R5。
图2为本发明实施例2中外源蛋白INP-R5、外源蛋白INP-2R5、外源蛋白INP-3R5在大肠杆菌表面展示后SDS-PAGE图谱,泳道1为marker,泳道2、4、6为对照组,泳道3、5、7分别为外源蛋白INP-R5、外源蛋白INP-2R5、外源蛋白INP-3R5。
图3为本发明实施例3制备得到的二氧化钛粉体的XRD。
图4为本发明实施例3制备得到的二氧化钛粉体的孔吸附曲线。
图5为本发明实施例3制备得到的二氧化钛粉体的FESEM。
图6为本发明实施例4制备得到的二氧化钛粉体的FESEM。
图7为本发明实施例4制备得到的二氧化钛粉体的Raman。
图8为本发明实施例4制备得到的二氧化钛粉体的HRTEM,其中1为碳,2为二氧化钛。
图9为本发明实施例5制备得到的二氧化钛粉体的FESEM。
图10为本发明实施例6制备得到的二氧化钛粉体的FESEM。
图11为本发明实施例7制备得到的二氧化钛粉体的FESEM。
图12为本发明实施例8中锂离子电池的倍率性能。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1构建重组质粒pET(INP-5R5)
(1)获取INP-5R5融合蛋白的编码基因,编码基因序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)以INP-5R5融合蛋白的编码基因为模板,分别设计上游引物和下游引物,并且上游引物中含有Nco I酶切位点(下划线表示Nco I酶切位点),下游引物中含有Hind III酶切位点(下划线表示HindIII酶切位点);进行PCR反应;
上游引物:5’—ATACCATGGGGACCCTGGACAAAGCGC—3’;
下游引物:5’—GGTGAAGCTTCAGGATACGACGTTTAG—3’;
PCR反应条件是:95℃热处理10min,95℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,循环10次,这10次循环,采用梯度退火模式,每循环一次退火温度降1℃;10次循环后,再将退火稳定恒定为55℃,循环10次;最后72℃延伸10min。
(3)利用Nco I和Hind III限制性内切酶将PCR产物和pET-28a载体质粒进行双酶切,置于37℃反应1h,然后使用PCR产物纯化试剂盒将上述酶切产物纯化;将纯化后产物混合,并加入T4 DNA连接酶于24℃过夜来获得pET(INP-5R5)重组质粒;将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌中,通过菌落PCR来初步筛选连接成功的菌落。将含有重组质粒pET(INP-5R5)的菌落扩大培养,提取质粒,送样测序。
将测序正确的含有重组质粒pET(INP-5R5)的菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养,当OD 600达到0.5时,加入终浓度为1mM的IPTG,30℃诱导表达3h,然后离心收集菌体。诱导表达产物外源蛋白INP-R5可通过SDS-PAGE来验证,电泳结果见图1,外源蛋白INP-R5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2构建重组质粒pET(INP-3R5)、pET(INP-2R5)、pET(INP-R5)
(1)分别设计上游引物和下游引物,以获得的重组质粒pET(INP-5R5)为模板,进行反向PCR反应删除其中的R5基因片段;
上游引物:5’—GTTAAATCTTCTAAAAAATCTGGTTCTTAC—3’
下游引物:5’—AGAAGATTTAACTTCGATCCAGTCGTCGTCTTC—3’
PCR反应条件为:95℃热处理10min,95℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸7min,循环10次,这10次循环,采用梯度退火模式,每循环一次退火温度降1℃;10次循环后,再将退火稳定恒定为55℃,循环10次;最后72℃延伸20min。
(2)使用PCR产物纯化试剂盒将上述反向PCR产物纯化,纯化后产物直接转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌中,通过菌落PCR来初步筛选连接成功的菌落。将正确的菌落扩大培养,提取质粒,送样测序,从中获得重组质粒pET(INP-3R5)、重组质粒pET(INP-2R5)、重组质粒pET(INP-R5)。外源蛋白INP-3R5的碱基序列如SEQ ID NO.3所示;外源蛋白INP-2R5的碱基序列如SEQ ID NO.5所示;外源蛋白INP-R5的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
将测序正确的含有重组质粒pET(INP-3R5)、pET(INP-2R5)、pET(INP-R5)的菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养,当OD 600达到0.5时,加入终浓度为1mM的IPTG,30℃诱导表达3h,然后离心收集菌体。诱导表达产物可通过SDS-PAGE来验证,电泳结果见图2,外源蛋白INP-3R5的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;外源蛋白INP-2R5的碱基序列如SEQ ID NO.6所示;外源蛋白INP-R5的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例3
一种利用表面展示外源蛋白合成二氧化钛的制备方法,包括如下步骤:
(1)在烧杯中加入10ml去离子水,加入表面展示外源蛋白5R5的细菌,再加入二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(TiBALDH)溶液,使其最终浓度为5mM;将混合后产物置于磁力搅拌器中,设置温度为37℃,转速200rpm,反应24h;之后,温度升高至80℃,转速不变,反应24h。反应结束后通过离心的方式进行固液分离,用超纯水洗涤固体产物3次,并进行冷冻干燥处理;
(2)将冷冻干燥后产物放置于管式炉中,通入空气气氛,并在600℃保温4h,其中升温速率为4℃/min,热处理结束后得到二氧化钛粉体。
本实施例制备得到的二氧化钛粉体的X射线衍射图(XRD)见图3,孔吸附曲线见图4场发射扫描电镜图(FESEM)见图5;从图3可以看出二氧化钛粉体为纯相锐钛矿二氧化钛;从图4可以看出介孔结构的孔径为3~5nm;从图5可以看出二氧化钛粉体为棒状结构,并且由5-7nm左右的颗粒组装而成。
实施例4
一种利用表面展示外源蛋白合成二氧化钛的制备方法,包括如下步骤:
(1)在烧杯中加入10ml去离子水,加入表面展示外源蛋白5R5的细菌,再加入二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(TiBALDH)溶液,使其最终浓度为5mM;将混合后产物置于磁力搅拌器中,设置温度为37℃,转速200rpm,反应24h;之后,温度升高至80℃,转速不变,反应24h。反应结束后通过离心的方式进行固液分离,用超纯水洗涤固体产物3次,并进行冷冻干燥处理;
(2)将冷冻干燥后产物放置于管式炉中,通入Ar气氛,并在600℃保温4h,其中升温速率为4℃/min,热处理结束后得到二氧化钛粉体。
本实施例制备得到的二氧化钛粉体的场发射扫描电镜图(FESEM)见图6;从图6可以看出二氧化钛粉体为棒状结构,并且由5-7nm左右的颗粒组装而成。图7为二氧化钛粉体的Raman图谱,图中在1370cm-1和1592cm-1处的峰分别对应无序碳和石墨碳峰,说明产物中含有碳;图8为二氧化钛粉体的显微图,从图中可以看出,二氧化钛的外层包覆着碳。
实施例5
一种利用表面展示外源蛋白合成二氧化钛的制备方法,包括如下步骤:
(1)在烧杯中加入10ml去离子水,加入表面展示外源蛋白3R5的细菌,再加入二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(TiBALDH)溶液,使其最终浓度为5mM;将混合后产物置于磁力搅拌器中,设置温度为37℃,转速200rpm,反应24h;之后,温度升高至80℃,转速不变,反应24h。反应结束后通过离心的方式进行固液分离,用超纯水洗涤固体产物3次,并进行冷冻干燥处理;
(2)将冷冻干燥后产物放置于管式炉中,通入空气气氛,并在600℃保温8h,其中升温速率为10℃/min,热处理结束后得到二氧化钛粉体。
本实施例制备得到的二氧化钛粉体的场发射扫描电镜图(FESEM)见图9;从图9可以看出二氧化钛粉体为棒状结构,并且由10nm左右的颗粒组装而成。
实施例6
一种利用表面展示外源蛋白合成二氧化钛的制备方法,包括如下步骤:
(1)在烧杯中加入10ml去离子水,加入表面展示外源蛋白2R5的细菌,再加入二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(TiBALDH)溶液,使其最终浓度为5mM;将混合后产物置于磁力搅拌器中,设置温度为37℃,转速200rpm,反应24h;之后,温度升高至80℃,转速不变,反应24h。反应结束后通过离心的方式进行固液分离,用超纯水洗涤固体产物3次,并进行冷冻干燥处理;
(2)将冷冻干燥后产物放置于管式炉中,通入空气气氛,并在600℃保温8h,其中升温速率为10℃/min,热处理结束后得到二氧化钛粉体。
本实施例制备得到的二氧化钛粉体的场发射扫描电镜图(FESEM)见图10;从图10可以看出二氧化钛粉体为棒状结构,并且由15nm左右的颗粒组装而成。
实施例7
一种利用表面展示外源蛋白合成二氧化钛的制备方法,包括如下步骤:
(1)在烧杯中加入10ml去离子水,加入表面展示外源蛋白R5的细菌,再加入二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛(TiBALDH)溶液,使其最终浓度为5mM;将混合后产物置于磁力搅拌器中,设置温度为37℃,转速200rpm,反应24h;之后,温度升高至80℃,转速不变,反应24h。反应结束后通过离心的方式进行固液分离,用超纯水洗涤固体产物3次,并进行冷冻干燥处理;
(2)将冷冻干燥后产物放置于管式炉中,通入空气气氛,并在600℃保温8h,其中升温速率为10℃/min,热处理结束后得到二氧化钛粉体。
本实施例制备得到的二氧化钛粉体的场发射扫描电镜图(FESEM)见图11;从图11可以看出二氧化钛粉体为棒状结构,并且由20nm左右的颗粒组装而成。
实施例8应用
将实施例3-7中制备得到的棒状二氧化钛粉体分别与超级导电碳、PVDF以质量比7:2:1加入玛瑙研钵中研磨30min;在研磨过程中需要逐滴加入NMP液体,使三种物质形成的浆料混合均匀的同时保证一定的粘度。研磨结束后将浆料涂抹在铜箔上,先在60℃鼓风干燥箱中放置1h,然后再放入真空干燥箱中120℃保温12h,最后在手套箱中组装电池。
将组装得到了5组电池进行电池性能测试,在电池测试过程中,电压设置范围1-3V,电流密度设置为0.2C,0.5C,1C,2C,5C,10C,1C。图12为电池在不同电流密度下的充放电图谱,从图中可以看出:每组试样在经历大电流密度10C充放电后,还能回到电流密度1C下正常运行,且比容量不衰减。试样的放电比容量随颗粒尺寸的减小而逐渐增大,其中颗粒尺寸最小且包覆碳的试样性能最好,电流密度1C下放电比容量达到225mA h g-1。
综上所述,本发明制备得到的棒状二氧化钛粉体具有介孔结构、颗粒粒径小、外层包覆有碳,将其应用于制备锂离子电池负极材料,显示出了良好的储锂性能。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例,而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种细菌表面展示外源蛋白INP-nR5,其特征在于,包括冰核蛋白域INP和功能蛋白域nR5,其中n为5、3、2、1;所述外源蛋白INP-5R5的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示;所述外源蛋白INP-3R5的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示;所述外源蛋白INP-2R5的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述外源蛋白INP-R5的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
2.一种利用权利要求1所述细菌表面展示外源蛋白INP-nR5合成的二氧化钛粉体,其特征在于,由内层的二氧化钛和包覆在其外层的碳化物组成;所述碳化物为表面展示有外源蛋白INP-nR5的细菌经600℃高温热处理后的碳化产物。
3.根据权利要求2所述的二氧化钛粉体,其特征在于,所述二氧化钛粉体为棒状结构的二氧化钛粉体,具有介孔结构,所述介孔的孔径为3~5nm。
4.根据权利要求2所述的二氧化钛粉体,其特征在于,所述二氧化钛粉体上的颗粒粒径为5nm~20nm。
5.利用细菌表面展示外源蛋白INP-nR5合成权利要求2~4任一所述二氧化钛粉体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)采用PCR扩增方法获得外源蛋白INP-5R5的编码基因,并通过限制性内切酶作用,使编码基因和pET-28a质粒环暴露出相同的粘性末端,再在DNA连接酶的作用下将两者连接,构建得到含外源蛋白INP-5R5的重组质粒pET(INP-5R5);采用反向PCR技术在已经构建好的重组质粒pET(INP-5R5)上删除其中的R5片段,分别获得含外源蛋白INP-R5的重组质粒pET(INP-R5)、含外源蛋白INP-2R5的重组质粒pET(INP-2R5)、含外源蛋白INP-3R5的重组质粒pET(INP-3R5);
(2)将重组质粒pET(INP-5R5)、pET(INP-3R5)、pET(INP-2R5)或pET(INP-R5)转入感受态细胞大肠杆菌中,并使外源蛋白5R5、3R5、2R5或R5在大肠杆菌外膜展示表达;
(3)将外源蛋白表达后的大肠杆菌加入到二(2-羟基丙酸)二氢氧化二铵合钛溶液中,在磁力搅拌条件下,设置温度为37℃,反应24h,之后,温度升高至80℃,反应24h,反应完成后的产物离心、洗涤后冷冻干燥,冷冻干燥后的产物通过600℃高温热处理后得到二氧化钛粉体。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述磁力搅拌条件反应为:首先在30℃~37℃条件下反应20h~24h,再升温至70℃~80℃继续反应20h~24h。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述高温热处理为:将冷冻干燥后的产物置于空气气氛或Ar气氛中,处理4~8h。
8.权利要求2~4任一所述二氧化钛粉体在锂离子电池中的应用。
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