CN105283553A - 蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法 - Google Patents

蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第二二聚化结构域的靶蛋白；其中该微泡包含靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。

Description

蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年8月30日提交的美国临时专利申请序列号61/872,115和2013年6月11日提交的美国临时专利申请序列号61/833,880的申请日的优先权，该美国临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。
引言
细胞修饰可用于多种不同的应用，包括研究、诊断和治疗应用。使用多种不同的方法，包括将外源核酸和/或蛋白质引入细胞中，可以实现细胞修饰。
蛋白质递送——在本领域中被称为蛋白质转导，是将肽或蛋白质基序跨越质膜递送到细胞中的过程。蛋白质递送方法包括显微注射和电穿孔。蛋白质递送方法还包括：通过与基于脂质的试剂形成复合物而进行转染；通过与基于聚合物或肽的试剂形成复合物而进行转染；通过纳入而将肽转导域(PTD)直接添加至感兴趣的蛋白质；病毒样颗粒介导的引入；和外来体介导的蛋白质引入。
目前的蛋白质递送方法的一个缺点是为了转染到所需靶细胞中需要产生纯化的蛋白质的贮存物(stock)。用于产生重组蛋白的标准方法可能呈现与溶解度、产率、正确折叠和翻译后修饰相关的问题。这些方法也不允许重组膜蛋白的递送。这些因素中有许多是重要的，因为它们直接涉及待转染的蛋白质的活性。对于直接递送而言，蛋白质的活性具有最高的优先级，以使递送的蛋白质将对细胞产生影响。
当前的方法的另一个缺点在于递送本身。由于不利的电荷差异以及低效递送和毒性，基于脂质和聚合物/肽的转染方法具有与蛋白质特异性包装效率相关的问题。电穿孔也已被证明具有与毒性、高水平的不一致性和对递送的蛋白质的量缺乏控制相关的问题。PTD的纳入已知会导致聚集和沉淀，这可能会不利地影响递送效率。最后，在病毒样颗粒(VLP)中递送蛋白质要求使用生成免疫应答的病毒衣壳蛋白进行包装。
发明内容
提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第二二聚化结构域的靶蛋白，其中该微泡包括靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。
附图简要说明
图1提供了如在下面的试验部分描述的制备和使用微泡的示意图。
图2A至2D示出了其中产生CRE重组酶微泡的本发明实施方案的多个方面并提供了其结果。
图3提供了微泡靶蛋白含量的测定的结果。
详述
提供了蛋白质富集的微泡及其制备和使用方法。该方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和具有第二二聚化结构域的靶蛋白，其中该微泡包括靶蛋白。还提供了可用于制备该微泡的细胞、试剂和试剂盒，以及例如在研究和治疗应用中使用该微泡的方法。
在更详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这当然可以变化。如本领域技术人员所理解的，本发明包括各种替代、修改和等同物。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求来限制。
当提供值的范围时，应当理解，本发明内包括在该范围的上限和下限之间的各居间值，精确至下限的单位的十分之一(除非上下文清楚地另外指出)，以及在该指定范围内的任何其他指定或居间值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内并且还包括在本发明内，服从在所指定的范围内任何具体排除的限值。当指定的范围包括限值的一个或两个时，排除那些包括的限值的一个或两个的范围也包括在本发明中。
某些范围在本文中以数值前加上术语“约”来呈现。术语“约”在本文中用于对其之后的确切数字以及与该术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其所呈现的上下文中提供该具体列举的数字的基本等效值的数字。
应当指出，如在本文中和在所附权利要求中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。应进一步指出，可以将权利要求撰写为排除任何可选的元素。这样，此声明旨在用作与权利要求元素的列举相关的排他性术语如“单独”、“仅”等的使用或“否定”限定的使用的在先基础。
本领域技术人员在阅读本公开内容后将会明白，在不偏离本发明的范围或精神的情况下，本文描述和说明的各单独实施方案具有分立的组成成分和特征，其可以容易地与任意其他几个实施方案的特征分离或组合。任何描述的方法可以以描述的事件的顺序或在逻辑上可能的任何其他顺序进行。
本说明书中引用的任何出版物和专利均通过引用并入本文，如同特定地且单独地指出每个单独的出版物或专利均通过引用而并入，并通过引用而并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用都是为了其先于申请日的公开内容且不应解释为承认本发明由于先前发明而没有资格先于此出版物。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地加以确认。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
制备蛋白质富集的微泡的方法
如上所概述的，本发明的方面包括制备蛋白质富集的微泡的方法。所谓“蛋白质富集的微泡”是指一种促融结构，其在脂双层包膜中包括一定量的一种或多种靶蛋白。如本文所用，术语“促融”是指微泡的以下性质，其提供微泡的膜与靶细胞的膜的融合。因为微泡是促融的，它们能够与靶细胞的脂双层膜融合，从而将其内含物(包括靶蛋白)递送至细胞内。在进一步描述蛋白质富集的微泡之前，现在较详细地综述其制备方法。
如上所概述的，本方法的方面包括在足以从细胞产生微泡的条件下保持产生微泡的细胞，其中该微泡包含一种或多种靶蛋白。该产生微泡的细胞具有包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白和包含第二二聚化结构域的靶蛋白。
包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白
在制备微泡的方法中使用的细胞包括具有第一二聚化结构域的膜结合蛋白。该细胞可以包括任何适宜的膜结合蛋白，该膜结合蛋白包括第一二聚化结构域。膜结合蛋白是能够例如经由结合相互作用与微泡的膜稳定地结合的蛋白质，其中该膜结合蛋白当与微泡膜相结合时可以被配置为使得该二聚化结构域与该微泡的胞质溶胶接触。膜结合蛋白可以在大小上不同，在一些情况下范围从5kDa至250kDa，诸如10kDa至100kDa，包括12kDa至50kDa。
该膜结合蛋白可以经修饰以包括单个二聚化结构域或者两个或更多个二聚化结构域(例如，如下文更详细地描述)。在一些情况下，两种或更多种膜结合蛋白可以包括在本发明的细胞和微泡中。所述两种或更多种膜结合蛋白中的每一种可独立地包括二聚化结构域以与靶蛋白形成二聚化的复合物。
感兴趣的膜结合蛋白包括但不限于，具有与细胞膜稳定地缔合，例如结合、整合等的结构域(即，膜结合结构域)的任何蛋白质，其中这样的结构域可以包括肉豆蔻酰化的结构域、法呢基化的结构域、跨膜结构域等。感兴趣的具体膜结合蛋白包括但不限于：肉豆蔻酰化蛋白质，例如，p60v-src等；法呢基化蛋白质，例如，Ras、Rheb和CENP-E、F，结合特定脂双层组分的蛋白质，例如膜联蛋白V，其通过结合磷脂酰丝氨酸——细胞膜双层的脂质组分，等等；膜锚定蛋白；跨膜蛋白，例如转铁蛋白受体及其部分；病毒膜融合蛋白，例如，如下所述，VSV-G，等等。
感兴趣的膜结合蛋白，除了包括膜结合结构域外，还包括第一二聚化结构域。第一二聚化结构域可以差异很大，并且可以是直接结合靶蛋白的第二二聚化结构域或通过二聚化介体结合第二二聚化结构域的结构域，例如，如下文更详细描述的。如需要，给定的膜结合蛋白可以包括单一类型的给定结构域(例如，二聚化结构域、膜结合结构域等)或给定结构域的多个拷贝，例如，2个或更多个、3个或更多个等；和/或多个不同的二聚化结构域。如需要，给定的膜结合蛋白分子中可以存在额外的结构域，例如，连接体结构域、检测结构域(例如，荧光蛋白，其他酶报道分子如萤光素酶等)等。在给定的膜结合蛋白中，膜结合结构域和二聚化结构域可以是彼此异源的，使得它们不会天然地彼此缔合。因此，这样的实施方案的膜结合蛋白不是天然存在的蛋白质。
所述细胞可包括单种膜结合蛋白或两种或更多种不同的膜结合蛋白，例如，在希望将两种或更多种不同的靶蛋白包装到微泡中时。因此，根据本发明的方面的产生微泡的细胞可包括单种膜结合蛋白或两种或更多种具有不同序列的不同的膜结合蛋白，例如3种或更多种，4种或更多种，5种或更多种，等等，其中在一些情况下，具有不同序列的不同膜结合蛋白的数目范围为1至10种，如1至5种，包括1至4种。
靶蛋白
如本文所用，靶蛋白(即，感兴趣的蛋白质或POI)可以是希望被转移到细胞中的任何多肽。靶蛋白可以在大小上不同，在一些情况下，其范围从5kDa至250kDa，诸如10kDa至100kDa，包括12kDa至50kDa。感兴趣的靶蛋白包括但不限于，核蛋白质、转录调节物、DNA结合和/或修饰酶、RNA结合和/或修饰酶、蛋白质修饰酶、荧光蛋白、细胞周期调控蛋白、激酶、结构蛋白、信号蛋白、凋亡蛋白、翻译调节物、肽抗原、胞质蛋白等。具体的感兴趣的靶蛋白包括但不限于在下文用途部分列出的靶蛋白。
在一些情况下，靶蛋白是内源性蛋白质。在一些情况下，靶蛋白是异源蛋白质。如本文所用，术语“异源的”是指该蛋白质不从在用于产生微泡的细胞的基因组中天然发现的基因来表达。靶蛋白还可以是野生型蛋白质的突变体，例如缺失突变体或点突变体，并且可以显示功能的增加或功能的丧失，例如野生型蛋白质的显性负性突变体。靶蛋白也可以是一个或多个蛋白质结构域的嵌合体，从而生成具有新功能的靶蛋白——例如，Tet反式激活蛋白，这是tet阻抑结构域和反式激活结构域的融合体，以生成通过结构域交换等获得的新的转录调节物或蛋白质。在某些实施方案中，靶蛋白不包括任何病毒膜融合蛋白或病毒膜融合蛋白的任何片段或保留促融性质的衍生物。具体的感兴趣的靶蛋白在下文用途部分中进一步描述。
所述细胞可包括单种靶蛋白或两种或更多种具有不同序列的不同的靶蛋白，其希望被包装到微泡中。因此，根据本发明的方面的产生微泡的细胞可以包括单种靶蛋白或两种或更多种具有不同序列的不同的靶蛋白，例如，3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种，等等，其中在一些情况下，不同的靶蛋白的数目范围为1至10种，例如1至5种，包括1至4种。
根据本发明的靶蛋白包括第二二聚化结构域。第二二聚化结构域可以差异很大，其中第二二聚化结构域是直接地或通过(例如，如下文更详细描述的)二聚化介体与膜结合蛋白的第一二聚化结构域二聚化(例如，直接地或通过介体，稳定地结合，例如通过非共价键合相互作用)的结构域。给定的靶蛋白可以包括单一类型的给定的结构域(例如，二聚化结构域)或给定结构域的多个拷贝，例如，2个或更多个，3个或更多个等。如需要，给定的靶蛋白分子中可以存在额外的结构域，例如，连接体结构域等。在给定的靶蛋白中，该蛋白质结构域和二聚化结构域可以是彼此异源的，使得它们不会天然地彼此缔合。因此，此类实施方案的靶蛋白不是天然存在的蛋白质。
二聚化结构域
所述膜结合蛋白和靶蛋白的二聚化结构域可以变化，其中这些二聚化结构域可以被配置为彼此直接结合或通过(例如，如下文更详细描述的)二聚化介体结合。由于膜结合蛋白和靶蛋白各自分别包括膜结合结构域或靶蛋白结构域与二聚化结构域两者，它们可以被看作具有彼此稳定地结合的至少两个不同的异源结构域的嵌合蛋白或融合蛋白。所谓“异源”，是指这些嵌合蛋白的至少两个不同的结构域不天然存在于同一分子中。因此，这些嵌合蛋白包含至少两个不同来源的不同的结构域。因为这些蛋白质的两个结构域彼此稳定地缔合，因此在细胞条件下，例如，在细胞的表面处的条件下，在细胞内部的条件下等，它们不会彼此解离。如需要，在给定的嵌合蛋白或融合蛋白中，两个结构域可以彼此直接地或通过氨基酸连接体缔合。氨基酸连接体可以具有任何适宜的氨基酸序列和长度。
关于二聚化结构域，这些结构域是直接地或经由二聚化介体参与结合事件的结构域，其中该结合事件导致膜结合蛋白和靶蛋白的所需多聚体复合物如二聚体复合物的产生。因此，第一和第二二聚化结构域是参与包含膜结合蛋白和靶蛋白的结合复合物的结构域。如需要，第一和第二二聚化结构域彼此特异性地结合或与二聚化介体结合。术语“特异性结合”、“特异性地结合”及类似用语指的是诸如第一二聚化结构域、第二二聚化结构域、二聚化介体等不同结构域相对于细胞中的其他分子或部分优先彼此结合的能力。在某些实施方案中，当这些结合对在结合复合物中彼此特异性地结合时，它们之间的亲和力的特征在于10-5M或更小、10-6M或更小、10-7M或更少、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-13M或更小、10-14M或更小或者10-15M或更小(应当注意，在某些实施方案中，这些值可应用于本说明书中其他地方所提到的其他特异性结合对相互作用)的KD(解离常数)。
如上所述，第一和第二二聚化结构域是能够在多聚体复合物如二聚体复合物中彼此结合的结构域。这样，可以选择能够彼此形成复合物的任何两个适宜的多肽结构域来用作第一和第二二聚化结构域。可以使用任何方便的方法，纳入第一和第二二聚化结构域分别作为膜结合蛋白和一种或多种靶蛋白的一部分。在一些情况下，膜结合蛋白和/或所述一种或多种靶蛋白是已被工程构建成包括二聚化结构域的融合蛋白。当存在于融合蛋白中时，二聚化结构域可以通过连接序列与膜结合蛋白和/或靶蛋白隔开。在其他情况下，二聚化结构域可以是包含在膜结合蛋白和/或一种或多种靶蛋白内的天然结构域。
可以使用任何方便的成组二聚化结构域。第一和第二二聚化结构域可以是同型二聚体的，使得它们由相同的氨基酸序列构成，或者是异源二聚体的，使得它们由不同的氨基酸序列构成。二聚化结构域可以变化，其中，感兴趣的结构域包括但不限于：靶生物分子的配体，例如与感兴趣的特定蛋白质特异性地结合的配体(例如，蛋白质：蛋白质相互作用结构域)，例如SH2结构域、Paz结构域、RING结构域、转录激活物结构域、DNA结合结构域、酶催化结构域、酶调节结构域、酶亚单位、用于定位到限定的细胞位置的结构域，针对定位结构域的识别结构域，所述结构域在http://pawsonlab.mshri.on.ca/index.php？option＝com_content&task＝view&id＝30&ltemid＝63/等处列出。
感兴趣的二聚化结构域包括但不限于以下系统的蛋白质结构域：iDimerize诱导型同型二聚体(例如，DmrB)和异源二聚体系统(例如，DmrA和DmrC)和iDimerize反向二聚化系统(例如，DmrD)(参见，例如，www.Clontech.com目录号635068、635058、635059、635060、635069、635088、635090和635055)(参见Clackson等(1998)RedesigninganFKBP-ligandinterfacetogeneratechemicaldimerizerswithnovelspecificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(18):10437-10442；Crabtree,G.R.和Schreiber,S.L.(1996)Three-partinventions:intracellularsignalingandinducedproximity.TrendsBiochem.Sci.21(11):418-422；Jin等(2000)Invivoselectionusingacell-growthswitch.Nat.Genet.26(1):64-66；Castellano等(1999)InduciblerecruitmentofCdc42orWASPtoacell-surfacereceptortriggersactinpolymerizationandfilopodiumformation.Curr.Biol.9(7):351-360；Crabtree等(1997)Proximityandorientationunderliesignalingbythenon-receptortyrosinekinaseZAP70.Embo.J.16(18):5618-5628；Muthuswamy等(1999)ControlleddimerizationofErbBreceptorsprovidesevidencefordifferentialsignalingbyhomo-andheterodimers.Mol.Cell.Biol.19(10):6845-6857)。
第一和第二二聚化结构域可以选自DmrA和DmrC结构域、DmrB结构域、DmrD结构域、二氢叶酸还原酶系统的二聚化结构域、TAg和p53的二聚化结构域以及SH2和PTRK蛋白的二聚化结构域。
同样感兴趣的二聚化结构域是转录激活结构域。感兴趣的转录激活结构域包括但不限于：H组核受体成员转录激活结构域、固醇/甲状腺激素核受体转录激活结构域、合成的或嵌合的转录激活结构域、聚谷氨酰胺转录激活结构域、碱性或酸性氨基酸转录激活域、VP16转录激活结构域、GAL4转录激活结构域、NF-κΒ转录激活结构域、BP64转录激活结构域、B42酸性转录激活结构域(B42AD)、p65转录激活结构域(p65AD)，或其类似物、组合或修饰。
如上所述，第一和第二二聚化结构域也可与二聚化介体结合，以产生膜结合蛋白和靶蛋白的所需复合物。换句话说，二聚化介体可以促进第一和第二二聚化结构域的复合，例如，其中第一和第二二聚化结构域与二聚化介体的不同区域特异性结合。可以采用任何方便的二聚化介体。二聚化介体是在细胞内条件下诱导膜结合蛋白和靶蛋白的接近性的化合物。所谓“诱导接近性”，是指两个或更多个(例如三个或更多个，包括四个或更多个)分子通过由二聚化介体化合物介导的结合事件在空间上彼此关联。空间关联的特征是包含二聚化介体和至少膜结合蛋白和靶蛋白分子的结合复合物的存在。在该结合复合物中，每个成员或组分与该复合物的至少一个其他成员结合。在此结合复合物中，各种组分之间的结合可能变化。例如，二聚化介体可以介导膜结合蛋白和靶蛋白分子的结构域之间的直接结合事件。介导的结合事件可以是在不存在介体的情况下不发生的事件，或在不存在介体的情况下以较小的程度发生的事件，使得该介体导致与不存在介体的对照情况相比提高的二聚体产量。例如，在二聚化介体的存在下，膜结合蛋白的第一二聚化结构域可与靶蛋白分子的第二二聚化结构域结合。该二聚化介体可以同时与膜结合分子和靶分子的结构域结合，从而产生结合复合物和期望的空间关联。在一些情况下，二聚化介体诱导膜结合蛋白分子和靶蛋白分子的接近性，其中这些分子在二聚化介体的存在下彼此直接结合。
可以使用充当二聚化介体的任何方便的化合物。多种化合物，包括天然存在的和合成的物质，可以用作二聚化介体。用于选择二聚化介体的适用且可容易观察或测量的标准包括：(A)配体是生理上可接受的(即，缺乏针对其所用于的细胞或动物的不适当的毒性)；(B)其具有合理的治疗剂量范围；(C)如有必要，它可以穿过细胞膜和其他膜(在一些情况下，其在此处可以能够从细胞外部介导二聚化)，和(D)与嵌合蛋白的靶结构域结合，其被设计为对该结构域具有合理的亲和力以用于所需的应用。第一期望的标准是，除其二聚化介体活性外，该化合物是相对生理惰性的。在一些情况下，该配体将是非肽和非核酸。
感兴趣的二聚化介体化合物包括小分子并且是无毒的。所谓小分子是指具有5000道尔顿或更小，例如2500道尔顿或更小，包括1000道尔顿或更小，例如500道尔顿或更小的分子量的分子。所谓无毒的是指该诱导物在1g或更多/kg体重，如2.5g或更多/kg体重，包括5g或更多/kg体重的浓度下，表现出基本上没有(如果有的话)毒性。
一种类型的感兴趣的二聚化介体是能够与FKBP蛋白和/或亲环蛋白结合的化合物(以及其同源和异源寡聚体(例如，二聚体))。这样的化合物包括但不限于：环孢菌素A、FK506、FK520和雷帕霉素及其衍生物。这类化合物的许多衍生物是已知的，包括雷帕霉素的合成类似物，其可以根据需要适用于本发明的方法中。
在一些实施方案中，二聚化介体是雷帕霉素的类似物(即，雷帕霉素类似物(rapalog))。任何合适的雷帕霉素类似物可以经修饰以在本发明方法中用作二聚化介体。如本文所用，术语“雷帕霉素类似物”是指一类包括雷帕霉素的各种类似物、同系物和衍生物的化合物以及在结构上与雷帕霉素相关的其他化合物。雷帕霉素类似物包括但不限于相对于雷帕霉素具有一个或多个以下修饰的雷帕霉素的变体：在C7、C42和/或C29处的甲氧基的去甲基化、消除或替代；在C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生化或替代；在C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生化；用5元脯氨酰环替代6元哌可酸酯(pipecolate)环；以及环己基环的一个或多个取代基的消除、衍生化或替代，或用取代的或未取代的环戊基环替代环己基环。当在本文中使用该术语时，雷帕霉素类似物不包括雷帕霉素本身，而且在一些情况下不包含C1与C30之间的氧桥。在本发明的实施方案中可以用作二聚化介体的雷帕霉素类似物包括但不限于在US7,067,526和US7,196,192中描述的那些化合物；这两篇专利的公开内容通过引用并入本文。雷帕霉素类似物的进一步的说明性实例在下列文献中公开：US6,693,189、US6,984,635、WO9641865、WO9710502、WO9418207、WO9304680、US5527907、US5225403、WO9641807、WO9410843、WO9214737、US5484799、US5221625、WO9635423、WO9409010、WO9205179、US5457194、US5210030、WO9603430、WO9404540、US5604234、US5457182、US5208241、WO9600282、WO9402485、US5597715、US5,362,735、US5200411、WO9516691、WO9402137、US5583139、US5324644、US5198421、WO9515328、WO9402136、US5563172、US5318895、US5147877、WO9507468、WO9325533、US5561228、US5310903、US5140018、WO9504738、WO9318043、US5561137、US5310901、US5116756、WO9504060、WO9313663、US5541193、US5258389、US5109112、WO9425022、WO9311130、US5541189、US5252732、US5093338、WO9421644、WO9310122、US5534632、US5247076和US5091389，其公开内容通过引用并入本文。
可并入膜结合蛋白和靶蛋白中以与此类二聚化介体一起使用的二聚化结构域可以变化。在一些情况下，该二聚化结构域可以选自天然存在的肽基-脯氨酰异构酶家族蛋白质或其衍生物，例如，突变体(包括点突变体和缺失突变体)。用于这些实施方案的感兴趣的结构域的例子包括但不限于：FKBP、FRB等。
FKBP二聚化结构域可包含FKBP结构域的所有或部分的肽序列。感兴趣的是能够与相应的二聚化介体例如雷帕霉素类似物结合的那些结构域，如通过直接结合测定(例如，荧光猝灭)、竞争性结合测定(例如，相对于FK506)、FKBP酶活性(旋转异构酶)的抑制或其他测定方法所测定的，其Kd值为例如100nM或更小，例如约10nM或更小，或甚至约1nM或更小。可以修饰感兴趣的FKBP结构域的肽序列以调节该结构域针对二聚化介体的结合特异性，例如，通过25个或更少，例如20个或更少、15个或更少、10个或更少，例如5个或更少，或3个或更少的氨基酸残基的替代、插入或缺失。感兴趣的FRB结构域包括能够与FKBP蛋白和二聚化介体例如雷帕霉素类似物的复合物结合的结构域。FRB融合蛋白可以与该复合物结合，如通过常规方法所测定的，其Kd值为约200μΜ或更小，例如约10μΜ或更小，2μΜ或更小，或甚至1μΜ或更小。FRB结构域具有足以保持对雷帕霉素类似物与FKBP融合蛋白的复合物的高亲和力的长度和组成。
另一种类型的感兴趣的二聚化介体化合物是烯基取代的环脂族(ASC)二聚化介体化合物。ASC二聚化介体化合物包含用烯基取代的环脂族环。在某些实施方案中，该环脂族环进一步被羟基和/或氧代基团取代。在一些情况下，被烯基取代的环脂族环的碳进一步被羟基取代。环脂族环体系可以是环己-2-烯酮环系的类似物。在一些实施方案中，ASC二聚化介体化合物包含环己烯或环己烷环，例如在环己烯酮基团(例如环己-2-烯酮)、环己酮基团、羟基环己烷基团、羟基环己烯基团(例如，环己-2-烯醇基团)或亚甲基环己烷基团(例如3-亚甲基环己-1-醇基团)中发现的；其中环脂族环被长度为约2至20个碳原子且包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不饱和键的烯基取代。在某些实施方案中，烯基取代基包括不饱和键的共轭系列。在具体的实施方案中，烯基取代基可以是4个碳原子的长度，并且包括2个共轭双键。在另一个实施方案中，烯基取代基与环脂族环系共轭。此类化合物的进一步细节公开于WO/2011/163029中；其公开内容通过引用并入本文。
当二聚化结构域是ASC诱导物化合物如脱落酸时，感兴趣的ASC结合二聚化结构域包括但不限于：细胞内蛋白质的pyrabactin抗性(PYR)/PYR1-样(PYL)/ABA受体调节组分(RCAR)的脱落酸结合结构域。PYR/PYL/RCAR脱落酸结合结构域是与脱落酸特异性结合的那些PYR/PYL/RCAR蛋白质(例如，pyrabactin抗性1、PYR1样蛋白质等)的结构域或区域。因此，ASC诱导物结合结构域包括全长的PYR1或PYL蛋白质(例如PYL1、PYL2、PYL3、PYL4、PYL5、PYL6、PYL、PYL8、PYL9、PYL10、PYL11、PYL12、PYL13)，以及与脱落酸结合的其部分或突变体，例如来自拟南芥的PYL1的氨基酸残基33-209。合适的ASC结合二聚化结构域的另外的实例包括PP2C诱导物结构域。该PP2C诱导物结构域是在A组2C型蛋白磷酸酶(PP2C)中发现的那些PYR/PYL结合结构域，其中PP2C具有PYL(+ABA)结合结构域。因此，ASC诱导物结合结构域包括全长PP2C蛋白质(例如，ABI1)，以及与脱落酸结合的其部分或突变体，例如来自拟南芥的ABI1的氨基酸残基126-423。在一些情况下，该PP2CASC诱导物结构域是磷酸酶阴性突变体，例如，PP2C的突变体，其保留其特异地结合PYR/PYL(+ABA)的能力，但具有降低的(如果不是不存在的话)磷酸酶活性。
另一种类型的感兴趣的二聚化介体化合物是N-草酰基-哌可基或N-草酰基-脯氨酰型化合物。N-草酰基-哌可基和N-草酰基-脯氨酰型化合物包括在WO1996/06097中描述的抑免蛋白(immunophilin)多聚化剂，其公开内容通过引用并入本文。
另一种类型的感兴趣的二聚化介体化合物是含有寡核苷酸配体的化合物。含有寡核苷酸配体的化合物包括在WO1993/03052中描述的多官能性寡核苷酸配体，其公开内容通过引用并入本文。
在一些情况下，二聚化介体是可修饰的二聚化介体。在一些情况下，二聚化介体是可修饰的(例如，MDM)。MDM是在合适的条件下可逆地诱导样品中的膜结合蛋白和靶蛋白的接近性的化合物，其中接近性可以通过施加刺激来逆转。对样品施加刺激修饰了MDM的可修饰基团，从而改变MDM的性质，使得修饰的MDM不再能够诱导或保持膜结合蛋白与靶蛋白的接近性。
所谓“可逆地诱导接近性”或“逆转接近性的诱导”是指由MDM介导的膜结合蛋白与靶蛋白的空间关联可在施加修饰MDM的适当的刺激(例如，光子、化学试剂或酶)时得到逆转。合适的刺激的施加导致二聚体复合物的膜结合蛋白与靶蛋白组分的解离。在一些情况下，该刺激可以被描述为一种修饰刺激，例如，导致可修饰基团的修饰的刺激。在某些实施方案中，刺激的施加不是施加MDM与膜结合蛋白和靶蛋白的结构域的结合的竞争性抑制剂。在某些实施方案中，刺激的施加不是样品的稀释。
对样品施加合适的刺激将会修饰可修饰基团，从而导致MDM的修饰，例如，改变其结合性质的MDM分子的性质的改变。在一些实施方案中，与未修饰的MDM的相应亲和力相比，经修饰的MDM对于膜结合蛋白和/或靶蛋白的二聚化结构域具有显著降低的亲和力，例如，降低2倍或更多，如3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、50倍或更多、100倍或更多或者甚至1000倍或更多的亲和力。在一些实施方案中，MDM(例如，雷帕霉素类似物衍生的或ASC衍生的MCIP)对二聚化结构域(例如，FKBP结构域或ASC结合结构域)的Kd值可以从约10nM或更小(例如，约3nM或更小，或约1nM或更小)升高至约20nM或更大，例如约30nM或更大，约40nM或更大，约50nM或更大，约100nM或更大，约200nM或更大，约500nM或更大，或甚至约1μΜ或更大。
在一些实施方案中，MDM包含可裂解的基团，其中刺激的施加裂解该可裂解基团。刺激的施加可以产生两种裂解的MDM产物，其中每种产物独立地保留仅针对第一和第二二聚化结构域之一的亲和力。在一些实施方案中，MDM包含将特异性结合第一二聚化结构域的第一结合部分与特异性结合第二二聚化结构域的第二结合部分连接起来的可裂解连接体，使得该连接体的裂解导致膜结合蛋白与靶蛋白的解离。在其他实施方案中，刺激的施加产生修饰的MDM，在其中第一和第二结合部分之一在性质上发生改变，使得它具有显著降低的对相应二聚化结构域的亲和力(例如，如本文所述)。在这样的情况下，其他结合部分的结合亲和力可能未受影响，或者，它也可以显著降低(例如，如本文所述)。
MDM可包含与第一二聚化结构域特异性结合的第一结合部分(A)和与第二二聚化结构域特异性结合的第二结合部分(B)，以及可修饰基团(X)。本发明的MDM可以由式(I)描述：
其中A是第一结合部分，B是第二结合部分，X是可修饰基团。在某些实施方案中，在式(I)中，X可以是A的一部分或B的一部分，或者X可以通过连接体连接至A和/或B。在一些情况下，MDM独立地特异性地结合第一和第二二聚化结构域，例如，可以通过MDM与第一或第二二聚化结构域的初始结合而发生三元复合物的形成。在其他情况下，MDM与第二二聚化结构域的特异性结合依赖于MDM/第一二聚化结构域复合物的预先形成。在这种情况下，所谓“依赖于”是指该第二靶分子对于MDM/第一二聚化结构域的复合物比对于单独的MDM具有更高的亲和力。在一些实施方案中，形成此类三元复合物的MDM包含与第一二聚化结构域特异性结合的第一结合部分(A)(例如，与FKBP结构域特异性结合的雷帕霉素类似物，或与PYLASC结合结构域特异性结合的烯基取代的环脂族(ASC)诱导物化合物)和与第二二聚化结构域特异性结合的第二结合部分(B)(例如，与FRB结构域特异性结合的雷帕霉素类似物，或与ABIASC结合结构域特异性结合的ASC诱导物化合物)，其中第二二聚化结构域的结合依赖于A与第一二聚化结构域的预先结合。在某些情况下，MDM/第一二聚化结构域的复合物与第二二聚化域特异性结合，而无需在MDM与靶蛋白之间形成直接的接触。在这样的情况下，MDM介导膜结合蛋白与靶蛋白的结合。
可修饰基团(X)可以被包括在MDM的结构中的任何方便的位置。在一些情况下，可修饰基团(X)为第一结合部分(A)的一部分或第二结合部分(B)的一部分。在一些情况下，X可以被包括在与第一二聚化结构域(例如，FKBP结构域或ASC结合结构域)特异性结合的结构的该部分内，或者可替代地，可以包括在与第二二聚化结构域(例如，FRB结构域或ASC结合结构域)特异性结合的结构的该部分内。在其他情况下，X可以与结合部分A和B隔开。因此，X可以位于该结构中不参与同第一或第二二聚化结构域的特异性结合相互作用的位置，例如，在连接A和B的连接体内。
感兴趣的MDM是如在2012年9月13日提交的美国临时专利申请号61/700,683(其公开内容在此通过引用并入本文)中描述的MCIP和与之一起描述的二聚化系统。
微泡诱导物
如本文所用，“微泡诱导物”是指促进(即，增强)从细胞产生微泡的试剂。在一些情况下，微泡诱导物是这样的分子：其不会成为微泡的一部分，但其中微泡诱导物的存在导致该细胞产生微泡。在另一些情况下，微泡诱导物成为产生的微泡的一部分。在一些情况下，微泡的产生可以通过微泡诱导物在哺乳动物细胞内的过表达来实现。在某些情况下，微泡诱导物在细胞中的过表达导致微泡脱落到围绕所转染的细胞的介质中。
微泡诱导物可以是蛋白质、小分子诱导物、内源性“细胞起泡”(例如，在凋亡过程中)等。蛋白质微泡诱导物包括但不限于：诱导膜出芽的蛋白质、病毒膜融合蛋白、泡形成的小分子诱导物等。
在一些情况下，微泡诱导物是诱导膜出芽以使得微泡的产量得到提高的蛋白质。如本文所用，表述“诱导膜出芽的蛋白质”是指可促进脂双层的变形并介导囊泡的形成的任何蛋白质。任何适宜的细胞或病毒蛋白质可用来诱导膜出芽。诱导膜出芽的感兴趣的细胞蛋白质包括但不限于，蛋白脂质蛋白质PLP1(Trajkovic等,2008Science,vol319,p1244-1247)、网格蛋白衔接子复合物AP1(Camus等,2007.MolBiolCellvol18,p3193-3203)、改变脂质性质的蛋白质如翻转酶(floippase)、爬行酶(scramblase)、促进经由非经典途径分泌的蛋白质如TSAP6(Yu等,2006CancerResvol66,p4795-4801)和CHMP4C(Yu等,2009,FEBSJ.vol276,p2201-2212)。诱导膜出芽的感兴趣的病毒蛋白质包括但不限于，tetherin/CD317拮抗剂如HIV的Vpu蛋白(Neil等,2008.Naturevol451,p425-4431)和各种病毒结构蛋白质如逆转录病毒GAG(Camus等,2007.MolBiolCellvol18,p3193-3203)和埃博拉病毒(Ebola)VP40(Timmins等,Virology2001)。
在一些情况下，微泡诱导物是病毒膜融合蛋白(例如，病毒融合糖蛋白)。病毒膜融合蛋白可以是I类病毒膜融合蛋白如流感病毒血凝素、II类病毒膜融合蛋白或III类病毒膜融合蛋白(例如，如Backovic等,Curr.Opin.Struct.Biol.2009,19(2):189-96；Courtney等,VirologyJournal2008,5:28所述)。在一些实施方案中，病毒膜融合蛋白是I类病毒膜融合蛋白。感兴趣的I类病毒膜融合蛋白包括但不限于杆状病毒F蛋白、核型多角体病毒(NPV)属的F蛋白，如甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)MNPV(SeMNPV)F蛋白和舞毒蛾(Lymantriadispar)MNPV(LdMNPV)F蛋白。微泡诱导物可以是III类病毒膜融合蛋白，其中感兴趣的III类病毒膜融合蛋白包括但不限于弹状病毒G(如疱疹性口炎病毒的促融蛋白G(VSV-G))、疱疹病毒gB(如单纯疱疹病毒1的糖蛋白B(HSV-1gB))、EBVgB、索戈托病毒G、杆状病毒gp64(如苜蓿银纹夜蛾(AutographaCalifornia)多NPV(AcMNPV)gp64)和Borna病病毒(BDV)糖蛋白(BDVG)。在某些情况下，病毒膜融合蛋白是VSV-G或杆状病毒gp64。
在某些实施方案中，微泡诱导物是VSV-G，如在GenBankAN：M35219.1中定义的VSV-G多肽，或任何功能性片段或其保留促融性质的功能性衍生物。如本文对于病毒膜融合蛋白所用的，术语“促融”是指能够诱导微泡的膜与靶细胞的质膜融合的病毒蛋白质。感兴趣的VSV-G促融多肽包括但不限于在美国专利公开号7,323,337、5,670,354、5,512,421、20100167377等中描述的那些。
感兴趣的还有囊泡形成的小分子诱导物。囊泡形成的小分子诱导物包括但不限于：引起细胞起泡的凋亡诱导物，例如星形孢菌素等。
在需要时，微泡诱导物可以使用任何方便的方案在细胞中提供。例如，细胞可以配置成在细胞中从编码序列表达微泡诱导物，或者可使用任何方便的方法将微泡诱导物添加至细胞。将微泡诱导物添加至细胞的方法包括但不限于：用编码微泡诱导蛋白质的构建体转染或转导细胞，以及使细胞与化学诱导物(例如，小分子)等接触。
产生微泡的细胞
可以使用任何方便的能够产生微泡的细胞。在一些情况下，该细胞是真核细胞。感兴趣的细胞包括真核细胞，例如动物细胞，其中动物细胞的具体类型包括但不限于：昆虫、蠕虫、禽类或哺乳动物细胞。可使用各种哺乳动物细胞，举例而言，包括马、牛、羊、犬、猫、鼠、非人灵长类动物和人类细胞。在各种物种中，可以使用各种类型的细胞，如造血、神经、神经胶质、间质、皮肤、粘膜、基质、肌肉(包括平滑肌细胞)、脾、网状内皮、上皮、内皮、肝、肾、胃肠、肺、成纤维细胞，以及其他细胞类型。感兴趣的造血细胞包括任何可能与红细胞、淋巴或髓单核细胞谱系有关的有核细胞，以及成肌细胞和成纤维细胞。感兴趣的还有干细胞和祖细胞，如造血、神经、基质、肌肉、肝、肺、胃肠和间质干细胞，例如ES细胞、epi-ES细胞和诱导的多能干细胞(iPS细胞)。具体的感兴趣的细胞包括但不限于：哺乳动物细胞，例如，HEK-293和HEK-293T细胞、COS7细胞、Hela细胞、HT1080、3T3细胞等；昆虫细胞，例如，High5细胞、Sf9细胞、Sf21等。其他感兴趣的细胞包括但不限于在美国公开号20120322147中描述的那些，其中关于细胞的公开内容通过引用并入本文。
如上所概述的，所述细胞是包含膜结合蛋白、靶蛋白以及在需要时包含微泡诱导物的细胞，例如，如上文更详细地描述的。因此，该细胞是已工程构建成包含膜结合蛋白和靶蛋白的细胞。将细胞工程构建成包含所需蛋白质的方案可以根据一个或多个不同的考虑如靶细胞的性质、分子的性质等而不同。该细胞可以包括具有在合适的启动子控制下的蛋白质编码序列的表达构建体，其中该启动子可以是诱导型启动子或组成活性的。编码序列将根据由其编码的蛋白质的特定性质而不同，并且将至少包括编码二聚化结构域的第一结构域和编码膜结合或靶结构域的第二结构域。这两个结构域可以直接连接或通过连接域彼此连接。编码这些融合蛋白的结构域与必需的转录介导或调节元件处于操作组合中，即，是可操作地连接的。可存在于表达模块中的必需的转录介导元件包括启动子(包括组织特异性启动子)、增强子、终止和聚腺苷酸化信号元件、剪接信号元件等。在一些情况下，感兴趣的是可诱导的表达系统。根据需要，在细胞中的各种表达构建体可以染色体整合或附加体维持(maintainedepisomally)。因此，在一些情况下，表达构建体在细胞中染色体整合。或者，根据需要，一个或多个表达构建体可以附加体维持。根据需要/期望地，表达构建体可在细胞中稳定地或瞬时表达。
细胞可以使用任何方便的方案制备，其中该方案可以根据细胞的性质、细胞的位置例如在体外或体内等而不同。当需要时，载体，例如质粒或病毒载体，可用于工程构建细胞，以根据需要表达各种系统组分，例如，膜结合蛋白和靶蛋白、任选的微泡诱导物等。感兴趣的方案包括在公开的PCT申请WO1999/041258中描述的那些方案，其中关于方案的公开内容通过引用并入本文。
根据细胞和/或表达构建体的性质，感兴趣的方案可以包括电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒感染等。方法的选择通常取决于被转化的细胞的类型和转化发生时的情况(即，在体外、离体或体内)。这些方法的一般讨论可见Ausubel等,ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded.,Wiley&Sons,1995。在一些实施方案中，使用脂转染胺(lipofectamine)和钙介导的基因转移技术。在本发明的核酸已经引入细胞中后，可以通常在37℃下，有时在选择下，将细胞温育约1-24小时的时间，以便允许嵌合蛋白的表达。在哺乳动物靶细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统来表达嵌合蛋白。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，感兴趣的嵌合蛋白编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译对照复合物，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后可通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)中将产生活的并能在感染的宿主中表达嵌合蛋白的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:355-359(1984))。表达的效率可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见Bittner等,MethodsinEnzymol.153:51-544(1987))。
当期望长期、高产率地产生嵌合蛋白时，可以使用稳定的表达方案。例如，可以工程构建稳定地表达嵌合蛋白的细胞系。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以用嵌合蛋白表达盒和选择性标记转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可以使工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合到染色体中并生长以形成转化灶，其进而可以克隆并扩大成细胞系。此外，可以借助于锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶或RGEN介导的方法，接着HR或同源重组到人或其他基因组的“安全港”区域中，来插入编码序列。感兴趣的安全港区域包括这样的区域：该区域是单拷贝、二倍体或非整倍体的，并且不邻近调节生长或者如果未被适当调节的话可能会引起癌性转化或其他非治疗性干扰的基因。
从产生微泡的细胞生成微泡
所述方法的方面包括在足以从细胞产生一个或多个微泡的条件下保持产生微泡的细胞，例如，如上所述的那些细胞，其中该微泡包括膜结合蛋白和靶蛋白的二聚化复合物。在本发明的方法中可以利用在足以产生微泡的条件下保持细胞的任何方便的方法。在一些情况下，将细胞保持从30分钟至1周，例如从1小时至3天、1小时至2天，包括1小时至24小时的一段时间。在一些情况下，将细胞保持从30分钟至72小时，例如2至72小时、6至72小时、12至72小时、24至72小时、36至72小时，包括48至72小时的一段时间。该细胞可在支持从细胞生成微泡的温度下保持，其中感兴趣的温度包括4至42℃，例如15至37℃。根据需要，细胞可以保持在合适的培养基中，其中感兴趣的培养基包括但不限于：DMEM、HAMF12、RPMI1640、无血清条件等。
根据细胞的性质，该方法的方面可以包括诱导膜结合蛋白、靶蛋白与微泡诱导物(如果存在)中的一种或多种的表达的步骤。这些蛋白质中的一种或多种的表达可由诱导型启动子如基于Lac的系统或基于Tet的系统的诱导型启动子来控制。在这样的情况下，该方法可以包括将表达诱导物引入到细胞中，例如，通过使细胞与包含诱导物的培养基接触等。
在需要时，该方法的方面可包括使细胞与微泡诱导物以足以导致从细胞产生微泡的方式接触。例如，在微泡诱导物是小分子诱导物时，该方法可以包括使细胞与包含足够浓度的微泡诱导物的培养基接触。在一些情况下，微泡的产生可以通过以下方式来诱导：改变细胞的细胞培养条件，例如改变温度，例如，改变至15至42℃的值，改变Ca2+浓度，例如，如Biochemistry.1998年11月3；37(44):15383-91所述，等等。
根据细胞的性质，该方法的方面可以包括将二聚化介体引入细胞中的步骤。可使用任何方便的方案将二聚化介体引入到细胞中。例如，根据产生微泡的细胞是在体外还是在体内，所采用的特定方案可以变化。对于体外方案，二聚化介体向细胞中的引入可使用任何方便的方案来实现。在一些情况下，样品包括保持在合适的培养基中的细胞，并且将二聚化介体引入到培养基中。对于体内方案，可使用任何方便的施用方案。根据二聚化介体的结合亲和力，期望的响应，施用的方式，例如静脉内、皮下、腹膜内、口服等，半衰期，存在的细胞的数目，可以使用多种方案。
在一些实施方案中，该方法还包括从细胞中分离微泡。可以使用任何方便的分离方案。适合的分离方案的实例包括但不限于：过滤、离心、沉淀、基于表面和/或抗体的捕获等。在一些情况下，转染后从细胞上清液中收获微泡。在某些情况下，可以通过根据本发明的细胞的细胞上清液的过滤(例如在0.45um孔过滤器上)和超速离心，例如，通过以110,000g超速离心1.5小时或以7500g离心16小时来分离微泡。在某些情况下，可将微泡冷冻并储存在-80℃下，而不会失去其将材料转移到靶细胞的能力。在一些实施方案中，微泡不包括任何编码感兴趣的靶蛋白的核酸。在某些实施方案中，微泡是不含病毒的。
可以在本方法期间的任何方便的时间，例如，在细胞保持步骤期间，或在任选的分离步骤之前或之后，且利用任何方便的方法，来评估微泡中的靶蛋白的量。
在某些实施方案中，给定的方法仅采用单个膜结合蛋白/靶蛋白对。在另外其他的实施方案中，给定的方法可以采用两个或更多个不同的膜结合蛋白/靶蛋白对，例如当希望产生其中包装有两种或更多种靶蛋白的微泡时。在另外其他的实施方案中，两种或更多种不同的靶蛋白可以配置用于二聚化成膜结合蛋白的共同二聚化结构域，使得一个具有单种膜结合蛋白与两种或更多种不同的靶蛋白。
蛋白质富集的微泡
本发明的方面还包括例如通过上述方法产生的蛋白质富集的微泡。该微泡可以包括在脂双层包膜内的例如如上所述的一种或多种膜结合蛋白和一种或多种靶蛋白。因为微泡是由例如如上所述的产生微泡的细胞所生成的，该微泡的脂双层组分包括用来生成该微泡的细胞的膜组分，例如，磷脂、膜蛋白等。另外，该微泡具有胞质溶胶，该胞质溶胶包括在用来生成该微泡的细胞中发现的组分，例如，溶质、蛋白质、核酸等，但不是细胞的所有组分，例如，它们没有细胞核。在一些实施方案中，该微泡被认为是外来体样的。微泡可以在大小上不同，并且在一些情况下具有30至300nm，例如30至150nm，并且包括40至100nm的直径。
在一些情况下，在微泡中，膜结合蛋白和靶蛋白存在于二聚化的复合物中。在一些情况下，第一和第二二聚化结构域在二聚化的复合物中彼此特异性结合。在其他情况下，例如，如上所述，第一和第二二聚化结构域通过二聚化介体彼此结合。在一些情况下，该微泡包含微泡诱导物，例如，病毒膜融合蛋白，如VSV-G。在一些实施方案中，膜结合蛋白的第一二聚化结构域与微泡的胞质溶胶接触。
给定的微泡可以富集单种靶蛋白质或两种或更多种不同的靶蛋白。当两种或更多种不同的靶蛋白存在于微泡中时，根据需要，每种靶蛋白可以与相同的膜结合蛋白二聚化，或者每种靶蛋白可以与其自身的膜结合蛋白二聚化。这样，在一些情况下，微泡可以包含具有共同的膜结合蛋白的二聚化复合物的群体，但在该群体中呈现两种或更多种不同的靶蛋白。在其他情况下，该二聚化复合物的群体可包括两种或更多种不同的靶蛋白，每种与不同的膜结合蛋白二聚化。因此，该微泡可以进一步包括包含第三二聚化结构域的第二靶蛋白。
微泡介导的蛋白质向细胞中的递送
如以上所概述的，本发明的方面包括将蛋白质引入到靶细胞中的方法。这样的方法包括，例如，如上所述，在足以使微泡与靶细胞融合并将包含在微泡中的靶蛋白递送到细胞中的条件下使靶细胞与微泡接触，其中，该微泡可存在于微泡群体的组成中(例如，其中微泡的数目为103至1016个，例如104至1013个，包括104至109个)。可以使用将细胞与微泡接触的任何方便的方案。例如，根据靶细胞是在体外还是在体内，所采用的特定方案可以变化。对于体外方案，可以在足以使微泡与靶细胞融合的条件下，用微泡将靶细胞保持在合适的培养基中。合适的培养基的实例包括但不限于：DMEM、HamF12、RPMI1640等。靶细胞和微泡可以保持足以使微泡与细胞融合的一段时间，其中，在一些情况下，该段时间为5分钟至72小时，诸如30分钟至2小时。靶细胞和微泡可以保持在合适的温度下，例如，范围从4℃至42℃，如15℃到37℃的温度下。对于体内方案，可使用任何方便的施用方案。取决于微泡和靶细胞的向性，期望的响应，施用方式，例如静脉内、皮下、腹膜内、口服等，半衰期，存在的细胞的数目，可以使用多种方案。
在一些实施方案中，该方法进一步包括破裂(即，解离)在微泡中的二聚化复合物。该二聚化复合物的解离可以导致细胞中的靶蛋白的更快释放，从而导致细胞中更快和或更大的生物应答。该二聚化复合物可以使用任何方便的方案来破裂。在一些实施方案中，该方法可以包括使微泡与增溶剂即二聚化破坏物化合物接触，以将微泡中靶蛋白与膜结合蛋白的复合物解离。可以使用任何方便的增溶剂化合物。感兴趣的增溶剂化合物包括但不限于D/D增溶剂化合物(Clontech,MountainView,CA)。通过以破裂(逆转)其自身缔合的方式与DmrD结构域结合，D/D增溶剂可以解离包括DmrD二聚化结构域的二聚体复合物。D/D增溶剂还解离包括DmrB同型二聚化结构域的复合物。
D/D增溶剂的结构
在其中二聚化复合物包括二聚化介体的那些情况下，例如，如上所述，可以将过量的介体引入到微泡中，以解离该复合物。当二聚化介体是可修饰的二聚化介体时，该复合物的解离可包括对微泡施加刺激以修饰可修饰的二聚化介体，从而解离靶蛋白和膜结合蛋白的二聚体复合物。在这样的实施方案中，靶细胞可以在向细胞施加刺激如光子、化学剂或酶之前保持任何方便的时间。这样，该方法的实施方案的其他方面包括对包含靶细胞和微泡的样品施加刺激，以分别修饰可修饰的二聚化结构域和破裂膜结合蛋白和靶蛋白的二聚化复合物。
在某些情况下，该方法进一步包括评价，即，评估，靶蛋白在细胞中的功能。一旦感兴趣的靶蛋白已被引入到靶细胞中，就可以评价通过向细胞中引入靶蛋白而引发的特定生物学事件的发生。可以使用任何方便的方法，在微泡与细胞接触之前、期间和/或之后的任何方便的时间，来进行细胞的评估。细胞的评估可以连续进行，或者通过在本方法的过程中在一个或多个时间点采样而进行。在一些实施方案中，该评估步骤在接触步骤之前进行。在某些实施方案中，该评估步骤在施加刺激之前进行。在某些情况下，使用基于细胞的试验进行评估，该试验测量由靶蛋白引发的生物学事件的发生。任何可观察到的感兴趣的生物性质可以在本方法的评估步骤中使用。
该方法的实施方案的特征在于提供所递送的蛋白质在靶细胞中的瞬时活性。所谓瞬时是指所递送的蛋白质在有限的一段时间内保持活性，并且在一些实施方案中，这段有限的时间是从10分钟至96小时，包括2小时至48小时。在另外其他的实施方案中，该蛋白质可以保持活性更长的一段时间，例如，96小时或更长，例如100小时或更长，包括200小时或更长。
用途
例如，如上所述，本发明的微泡、细胞和方法可用于多种应用中，其中将感兴趣的蛋白质引入到靶细胞中是有意义的。感兴趣的应用包括但不限于：研究应用、诊断应用和治疗应用。因此，可以使用本发明的方法递送的靶蛋白包括研究蛋白质、诊断性蛋白质和治疗性蛋白质。
研究蛋白质是其活性在研究方案中有用的蛋白质。因此，研究蛋白质是在实验程序中使用的蛋白质。该研究蛋白质可以是具有这样的用途的任何蛋白质，其中在一些情况下，研究蛋白质是也通过将其在细胞中从编码载体表达而在研究方案中提供的蛋白质结构域。研究蛋白质的具体类型的实例包括但不限于：可诱导的表达系统的转录调节剂、信号产生系统的成员，例如，酶及其底物、激素、激素原、蛋白酶、酶活性调节剂、微扰二聚物(perturbimer)和肽适体、抗体、蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂、基因组修饰蛋白质，如CRE重组酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas-9核酸酶、TAL效应物核酸酶等，细胞重新编程蛋白质，如Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin-28等，等等。
诊断性蛋白质是其活性在诊断方案中有用的蛋白质。因此，诊断性蛋白质是在诊断程序中使用的蛋白质。诊断性蛋白质可以是具有这样的用途的任何蛋白质。诊断性蛋白质的具体类型的实例包括但不限于：信号产生系统的成员，例如，酶及其底物、标记的结合成员，例如，标记的抗体及其结合片段、肽适体等。
感兴趣的蛋白质进一步包括治疗性蛋白质。感兴趣的治疗性蛋白质包括但不限于激素和生长及分化因子，包括但不限于：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺素(PTH)、生长激素释放因子(GHRF)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(angioproteinetins)、制管张素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(erythroproteinetin)(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子β超家族中的任一种，包括TGFβ，激活蛋白，抑制素，或任何骨形态发生蛋白(BMP)，包括BMP1-15，调蛋白(heregluin)/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的生长因子中的任一种，神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神经营养因子(neurturin)、聚集蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白的家族中的任一种、导蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
感兴趣的蛋白质进一步包括但不限于：纤维蛋白溶解蛋白质，包括但不限于，尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)和组织纤溶酶原激活物(tpA)；促凝血蛋白质，如因子VIIa、因子VIII、因子IX和纤维蛋白原；用于改变在血栓形成位点的止血平衡的纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、vonwillebrand因子、因子V、ADAMTS-13和纤溶酶原；等等。
同样感兴趣的蛋白质是转录因子，如jun、fos、max、mad、血清反应因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD、肌细胞生成蛋白、含有ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、维尔姆斯瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白，例如GATA-3，和翼状螺旋蛋白的叉头家族。
同样感兴趣的蛋白质是氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶(arginosuccinatesynthetase)、精氨琥珀酸裂解酶(arginosuccinatelyase)、精氨酸酶、富马酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetacetatehydrolase)、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸酯、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌养蛋白cDNA序列。
蛋白质可以根据本发明递送至的靶细胞可以差异很大。感兴趣的靶细胞包括但不限于：细胞系，HeLa、HEK、CHO、293等，小鼠胚胎干细胞、人干细胞、间质干细胞、原代细胞、组织样品等。
试剂盒
本发明的方面还包括试剂盒，其中该试剂盒包括在例如如上所述制备蛋白质富集的微泡的方法中使用的一种或多种组分。在一些情况下，试剂盒可以包括可用于制备产生微泡的细胞的遗传构建体。此类遗传构建体可以包括例如如上所述的膜结合蛋白的编码序列，其中该编码序列可以存在于表达盒中，其中该表达盒的启动子可以是或者可以不是诱导型的。存在于试剂盒中的遗传构建体可以包括例如如上所述的靶蛋白的编码序列，其中该编码序列可以存在于表达盒中，其中该表达盒的启动子可以是或者可以不是诱导型的。在另外其他的实施方案中，在试剂盒中提供的遗传构建体可以是被配置成接收靶蛋白的编码序列但是缺乏靶蛋白编码序列的表达盒。例如，该遗传构建体可以包括通过限制位点(例如，多克隆位点)与二聚化结构域隔开的启动子。存在于试剂盒中的遗传构建体可以包括例如如上所述的微泡诱导物的编码序列，其中该编码序列可以存在于表达盒中，其中该表达盒的启动子可以是或者可以不是诱导型的。根据需要，该遗传构建体可以存在于单独的载体上，或者可以组合到单个载体上，其中感兴趣的载体包括但不限于质粒、病毒载体等。在一些情况下，该试剂盒包括例如如上所述的产生微泡的细胞。在需要时，该试剂盒可以包括另外的试剂，例如微泡诱导物、二聚化介体、二聚化破坏物等。根据需要，该试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者其一些或全部可以在单个容器中预组合成试剂混合物。试剂盒还可以包括一定量的表达可检测蛋白质(例如，AcGFP等)的对照微泡作为对照。在需要时，该试剂盒还可以包括用于检测微泡的抗体、用于量化包含报道蛋白如萤光素酶的微泡的底物，或转染试剂或纯化系统，或用于浓缩微泡的纯化试剂盒。
除了上述组分，本发明的试剂盒还可以包括(在某些实施方案中)关于实施本方法的说明书。这些说明书可以以多种形式存在于本试剂盒中，其一个或多个可以存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是在试剂盒的包装中、在包装插页等中关于合适的介质或基底的打印信息，例如，信息打印于其上的一张或多张纸。这些说明书的另一种形式是在其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、压缩盘(CD)、便携式闪存驱动器、硬盘驱动器等。可以存在的这些说明书的又一种形式是网站地址，其可用于在远离的地点通过因特网访问信息。
阐述以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完全的公开内容和说明，并非旨在限制发明人视为其发明的范围，也并非旨在表示下面的实验是所进行的全部或仅有的实验。已努力确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但一些实验误差和偏差应该予以考虑。除非另外指出，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
试验
实施例I.
通过利用在iDimerize系统(Clontech,MountainView,CA)中包含的配体可诱导的异源二聚化结构域创建匹配的一对结合配偶体来测试蛋白质的定向包装。如图2A中所示，结合配偶体由与两个DmrA结构域融合的CherryPicker蛋白(膜靶向的红色荧光蛋白)和与单个DmrC结构域融合的CRE重组酶组成。如图1中所示，CherryPicker和CRE表达质粒与VSV-G表达质粒共转染至293T细胞中，并使之在A/C异源二聚化物(heterodimerizer)的存在或不存在下温育48-72小时以产生微泡。
收集微泡，并使用抗DmrC抗体，通过Western印迹法测定其相对CRE蛋白量。
此外，还在基于细胞的试验中测定微泡的CRE活性。将CRE微泡加入到细胞系，该细胞系需要CRE以通过去除侧翼为loxP位点的终止盒来表达LacZ标记。如图2B中所示，当施加到靶细胞时，CRE重组酶微泡与质膜融合，并将CRE重组酶排放到细胞中。如图2C中所示，CRE重组酶通过核定位信号转运到细胞核中，在细胞核中其可以进行LoxP位点之间的CRE介导的重组。CRE重组酶微泡用CherryPicker(Clontech,MountainView,CA)标记，以使处理过的靶细胞可通过荧光显微术容易地可视化。
Western分析表明，与没有A/C异源二聚化物时相比，在A/C异源二聚化物的存在下产生的微泡中存在更多的CRE酶。基于细胞的分析表明，A/C异源二聚化物是递送足够的CRE以诱导在靶细胞中的LacZ表达所需要的。
使用CRE重组酶Gesicle的快速且有效的基因组修饰也示于图2D中。带有整合的、LoxP条件的LacZ表达盒的细胞系用表达CRE重组酶的质粒转染6小时(中间的图像)，或用20μΙ包含CRE重组酶的微泡处理3小时(右侧的图像)。处理后24小时，使用来自Clontech(目录号631780)的β-半乳糖苷酶染色试剂盒针对LacZ表达对细胞进行染色。当由CRE重组酶切除上游的loxP侧翼的终止密码子时，仅表达β-半乳糖苷酶基因。结果表明，相比于CRE重组酶的质粒转染递送，使用微泡导致更快且更有效的切除。
实施例II.
配体依赖性富集成gesicle已经显示针对细胞质蛋白质(实施例：胞质溶胶AcGFP)，产生8-10倍的至gesicle中的靶蛋白包装效率的增加。CherryPicker和AcGFP表达质粒与VSV-G表达质粒共转染至293T细胞中，以在A/C异源二聚化物的存在或不存在下产生微泡。收集微泡，并使用抗DmrC抗体，通过Western印迹法测定其相对AcGFP蛋白量。类似强度的条带的密度计分析显示，在A/C异源二聚化物的存在下AcGFP的包装比不存在A/C异源二聚化物的情况下的包装具有高8-10倍的效率。结果示于图3中并在以下表1中提供：
表1
尽管存在所附的条款，但本公开内容也由以下条款限定：
1.一种制备包含靶蛋白的微泡的方法，该方法包括：
在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，该细胞包含：
(a)包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白；和
(b)包含第二二聚化结构域的靶蛋白；
其中所述微泡包含靶蛋白。
2.根据条款1所述的方法，其中所述微泡包含所述膜结合蛋白和所述靶蛋白的二聚化复合物。
3.根据条款2所述的方法，其中所述第一和第二二聚化结构域在所述二聚化复合物中彼此特异性结合。
4.根据条款2所述的方法，其中第一和第二二聚化结构域通过二聚化介体彼此结合。
5.根据条款4所述的方法，其中该方法进一步包括在所述细胞中提供所述二聚化介体。
6.根据条款5所述的方法，其中通过使所述细胞与所述二聚化介体接触在所述细胞中提供所述二聚化介体。
7.根据条款4-6所述的方法，其中所述二聚化介体是可修饰的二聚化介体。
8.根据条款7所述的方法，其中该方法包括修饰所述微泡中的二聚化介体以从所述复合物释放靶蛋白。
9.根据条款8所述的方法，其中所述修饰包括施加刺激。
10.根据前述任一项条款所述的方法，其中所述细胞进一步包含微泡诱导物。
11.根据条款10所述的方法，其中所述微泡诱导物选自病毒膜融合蛋白、化学诱导物、蛋白脂质蛋白质PLP1、网格蛋白衔接子复合物AP1、外翻酶(Floppase)、内翻酶(Flippase)、爬行酶、TSAP6和CHMP4C。
12.根据前述任一项条款所述的方法，其中所述细胞进一步包含：
第一表达盒，其包含含有第一二聚化结构域的膜结合蛋白的第一编码序列；和
第二表达盒，其包含启动子和第二二聚化结构域。
13.根据条款12所述的方法，其中所述第一和第二表达盒中的至少一个是在诱导型启动子的控制下。
14.根据条款13所述的方法，其中该方法进一步包括诱导所述启动子。
15.根据前述任一项条款所述的方法，其中该方法进一步包括产生所述细胞。
16.根据条款15所述的方法，其中所述细胞是通过将所述第一和第二编码序列中的至少一个引入所述细胞中而产生的。
17.根据条款16所述的方法，其中所述引入包括转染。
18.根据前述任一项条款所述的方法，其中该方法进一步包括从所述细胞中分离所述微泡。
19.根据前述任一项条款所述的方法，其进一步包括评估所述微泡中的所述靶蛋白的量。
20.根据前述任一项条款所述的方法，其中所述细胞进一步包含含有第三二聚化结构域的第二靶蛋白。
21.一种细胞，其包含：
第一表达盒，其包含含有第一二聚化结构域的膜结合蛋白的第一编码序列；和
第二表达盒，其包含启动子和第二二聚化结构域。
22.根据条款21所述的细胞，其中所述第二表达盒进一步包含靶蛋白的编码序列。
23.根据条款21或条款22所述的细胞，其中所述第一和第二二聚化结构域彼此特异性结合。
24.根据条款21或条款22所述的细胞，其中所述第一和第二二聚化结构域通过二聚化介体彼此结合。
25.根据条款24所述的细胞，其进一步包含所述二聚化介体。
26.根据条款24或条款25所述的细胞，其中所述二聚化介体是可修饰的二聚化介体。
27.根据条款21至26中任一项所述的细胞，其中所述第一和第二二聚化结构域选自DmrA和DmrC结构域、DmrB结构域、DmrD结构域、二氢叶酸还原酶系统的二聚化结构域、Tag和p53的二聚化结构域以及SH2和PTRK蛋白的二聚化结构域。
28.根据条款21至27中任一项所述的细胞，其中该细胞进一步包含微泡诱导物。
29.根据条款28所述的细胞，其中所述微泡诱导物选自病毒膜融合蛋白、化学诱导物、蛋白脂质蛋白质PLP1、网格蛋白衔接子复合物AP1、Floppase、翻转酶、爬行酶、TSAP6和CHMP4C。
30.根据条款29所述的细胞，其中所述微泡诱导物是III类病毒膜融合蛋白。
31.根据条款30所述的细胞，其中所述III类病毒膜融合蛋白是VSV-G。
32.根据条款21至31中任一项所述的细胞，其中所述第一二聚化结构域与微泡中的述胞质溶胶接触。
33.根据条款21至32中任一项所述的细胞，其中所述膜结合蛋白选自肉豆蔻酰化蛋白质、法呢基化蛋白质、膜锚定蛋白、跨膜蛋白和膜脂质结合蛋白。
34.根据条款21至33中任一项所述的细胞，其中所述第一和第二表达盒中的至少一个包含诱导型启动子。
35.一种微泡，其包含含有第一二聚化结构域的膜结合蛋白和含有第二二聚化结构域的靶蛋白。
36.根据条款35所述的微泡，其中所述膜结合蛋白和所述靶蛋白存在于二聚化复合物中。
37.根据条款36所述的微泡，其中所述第一和第二二聚化结构域在所述二聚化复合物中彼此特异性结合。
38.根据条款36所述的微泡，其中第一和第二二聚化结构域通过二聚化介体彼此结合。
39.根据条款38所述的微泡，其中所述二聚化介体是可修饰的二聚化介体。
40.根据条款35至39中任一项所述的微泡，其中所述微泡进一步包含微泡诱导物。
41.根据条款40所述的微泡，其中所述微泡诱导物包含病毒膜融合蛋白。
42.根据条款41所述的微泡，其中所述病毒膜融合蛋白是VSV-G。
43.根据条款35至42中任一项所述的微泡，其中所述膜结合蛋白选自豆蔻酰化蛋白质、法呢基化蛋白质、膜锚定蛋白、跨膜蛋白和膜脂质蛋白。
44.根据条款35至43中任一项所述的微泡，其中所述第一和第二二聚化结构域是异源二聚体的。
45.根据条款35至44中任一项所述的微泡，其中所述第一和第二二聚化结构域是同型二聚体的。
46.根据条款35至45中任一项所述的微泡，其中所述第一和第二二聚化结构域选自DmrA和DmrC结构域、DmrB结构域、DmrD结构域、二氢叶酸还原酶系统的二聚化结构域、TAg和p53的二聚化结构域以及SH2和PTRK蛋白的二聚化结构域。
47.根据条款35至46中任一项所述的微泡，其中该微泡进一步包含含有第三二聚化结构域的第二靶蛋白。
48.一种将靶蛋白引入细胞中所述的方法，该方法包括：
在足以使微泡与所述细胞融合并将所述靶蛋白引入所述细胞中的条件下，使所述细胞与微泡接触，该微泡包含：
(a)包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白；和
(b)包含第二二聚化结构域的靶蛋白。
49.根据条款48所述的方法，其中所述膜结合蛋白和所述靶蛋白存在于二聚化复合物中。
50.根据条款49所述的方法，其中所述第一和第二二聚化结构域在所述二聚化复合物中彼此特异性结合。
51.根据条款49所述的方法，其中所述第一和第二二聚化结构域通过二聚化介体彼此结合。
52.根据条款51所述的方法，其中所述二聚化介体是可修饰的二聚化介体。
53.根据条款52所述的方法，其中该方法进一步包括向所述微泡施加刺激以修饰所述二聚化介体以解离所述靶蛋白和所述膜结合蛋白的复合物。
54.根据条款48至53中任一项所述的方法，其进一步包括使所述微泡与二聚化破坏物接触以从所述膜结合蛋白解离所述靶蛋白。
55.根据条款48至54中任一项所述的方法，其中所述微泡进一步包含含有第三二聚化结构域的第二靶蛋白。
56.一种试剂盒，其包含：
第一表达盒，其包含含有第一二聚化结构域的膜结合蛋白的编码序列；和
第二表达盒，其包含启动子和第二二聚化结构域。
57.根据条款56所述的试剂盒，其中所述第一和第二表达盒存在于不同的载体上。
58.根据条款56所述的试剂盒，其中所述第一和第二表达盒存在于相同的载体上。
59.根据条款56至58中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和第二表达盒存在于细胞中。
60.根据条款56至59中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含微泡诱导物或包含微泡诱导物的编码序列的表达盒。
61.根据条款56至60中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含诱导型启动子的诱导物。
62.根据条款56至61中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒包含微泡纯化组分、滴定组分和对照中的一种或多种。
尽管为了清楚理解的目的已通过说明和实例的方式相当详细地描述了上述发明，但根据本发明的教导对本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可对本发明进行某些改变和修改。
因此，上文仅仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够想到各种设置，尽管这些设置没有在本文中明确地描述或示出，但它们体现了本发明的原理并包括在本发明的精神和范围内。此外，本文中叙述的所有实例和条件语言均主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及由本发明人为促进本领域而贡献的概念，并且应理解为不限于这些具体叙述的实例和条件。此外，本文中述及本发明的原理、方面和实施方案以及它们的具体实例的所有陈述均旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，意图在于，这样的等同物包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，所开发的执行相同功能的任何元件，而不论其结构如何。因此，本发明的范围并不旨在限于本文中示出和描述的示例性实施方案。而是由所附的权利要求书来体现本发明的范围和精神。

Claims (15)

1.一种制备包含靶蛋白的微泡的方法，所述方法包括：
在足以从细胞产生微泡的条件下保持细胞，所述细胞包含：
包含第一二聚化结构域的膜结合蛋白；和
包含第二二聚化结构域的靶蛋白；
其中所述微泡包含所述靶蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微泡包含所述膜结合蛋白和所述靶蛋白的二聚化复合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二二聚化结构域在所述二聚化复合物中彼此特异性结合。
4.根据权利要求2所述的方法，其中第一和第二二聚化结构域通过二聚化介体彼此结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述二聚化介体是可修饰的二聚化介体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法包括修饰所述微泡中的二聚化介体以从所述复合物释放靶蛋白。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述细胞进一步包含微泡诱导物。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述细胞进一步包含：
第一表达盒，其包含含有第一二聚化结构域的膜结合蛋白的第一编码序列；和
第二表达盒，其包含启动子和第二二聚化结构域。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述细胞中分离所述微泡。
10.一种细胞，其包含：
第一表达盒，其包含含有第一二聚化结构域的膜结合蛋白的第一编码序列；和
第二表达盒，其包含启动子和第二二聚化结构域。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述第二表达盒进一步包含靶蛋白的编码序列。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的细胞，其进一步包含二聚化介体。
13.一种微泡，其包含含有第一二聚化结构域的膜结合蛋白和含有第二二聚化结构域的靶蛋白。
14.根据权利要求14所述的微泡，其中所述微泡根据权利要求1至9中任一项所述的方法产生。
15.一种将靶蛋白引入细胞中的方法，所述方法包括：
在足以使微泡与所述细胞融合并将所述靶蛋白引入所述细胞中的条件下，使所述细胞与根据权利要求13或14所述的微泡接触。
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