CN115927466A

CN115927466A - 一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统及其应用

Info

Publication number: CN115927466A
Application number: CN202310032184.9A
Authority: CN
Inventors: 董淑娴; 张思桐; 王乾
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2023-01-10
Filing date: 2023-01-10
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统及其应用，所述报告系统以表达载体pLVX‑IRES‑puro为基本骨架，在所述pLVX‑IRES‑puro的启动子后插入目的基因CMA报告序列，所述CMA报告序列包含荧光蛋白、衔接在荧光蛋白N末端的含有五肽基序KFERQ的S‑Tag1、衔接在荧光蛋白C末端的含有五肽基序KDRVQ的S‑Tag2；其中，所述表达载体pLVX‑IRES‑puro的序列如SEQ ID NO.1所示。该报告系统表达效率更高，检测CMA的活性更加灵敏，可用于实时监测CMA在疾病发生发展中的活性变化。

Description

一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及生物荧光成像技术领域，具体涉及一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统及其应用。

背景技术

分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)是哺乳动物细胞中唯一的选择性自噬类型。它的选择性依赖于分子伴侣蛋白HSC70识别并结合目的蛋白的五肽基序，形成HSC70/底物蛋白复合物，移位至CMA活性溶酶体表面，随后底物蛋白复合物转移到单跨溶酶体相关膜蛋白2A型(LAMP2A)的尾部，触发其组装成多聚体分子转运通道，底物蛋白复合物通过该转运通道到达溶酶体腔进行降解。这种独特的转运机制和对底物的选择性是CMA动态清除蛋白质的基础。

但是，现有的检测分子伴侣介导的自噬活性报告系统表达效率低、对于CMA活性的监测不够灵敏，因此限制了其在CMA中的相关研究应用。因此，亟需一种表达效率更高、检测CMA的活性更加灵敏、准确的报告系统。

发明内容

本发明的目的是克服现有CMA活性报告系统表达效率低、检测不够灵敏的缺陷。

为了达到上述目的，本发明提供了一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，所述报告系统以表达载体pLVX-IRES-puro为基本骨架，在所述pLVX-IRES-puro的启动子后插入目的基因CMA报告序列，所述CMA报告序列包含荧光蛋白、连接在荧光蛋白N末端含有五肽基序KFERQ的S-Tag1、衔接在荧光蛋白C末端含有五肽基序KDRVQ的S-Tag2；

其中，所述表达载体pLVX-IRES-puro的序列如SEQ ID NO.1所示。

较佳地，所述荧光蛋白包含EGFP、mCherry、Dendra2中的任意一种。

较佳地，所述荧光蛋白是Dendra2，所述Dendra2的序列如SEQ ID NO.2所示。

较佳地，所述报告系统还包含若干个刚性linker，其中，所述含有五肽基序KFERQ的S-Tag1和所述荧光蛋白之间至少连接一刚性linker，所述含有五肽基序KDRVQ的S-Tag2和所述荧光蛋白之间至少连接一刚性linker。

较佳地，所述表达载体pLVX-IRES-puro至少包含复制起始位点Ori、启动子promoter、内部核糖体进入位点序列IRES和/或RRE、非融合抗性标记基因puro、氨苄抗生素抗性基因AmpR、逆转录病毒顺式调节元件HIV-1ψ、3’LTR增强子序列。

较佳地，所述启动子promoter是CMV启动子。

本发明还提供了包含如上任意一项所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统的重组细胞系。

较佳地，所述重组细胞系的宿主细胞至少包含小鼠和人的原代细胞、小鼠和人的肿瘤细胞、体外培养的连续细胞系中的任意一种。

本发明还提供了一种如上任意一项所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统的应用，所述检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统用于神经退行性疾病、视网膜退行性病变、癌症、衰老等病理生理过程中实时监测CMA活性的变化。

较佳地，所述检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统用于评估药物及基因改造对CMA活性的干预效果。

本发明的有益效果：

(1)较原有报告系统以表达载体pPS-CFP2-N为基本骨架相比，本发明报告系统以表达载体pLVX-IREX-puro为基本骨架，增加了内部核糖体进入位点序列IRES和RRE序列，有效增强了目的蛋白的翻译效率。

(2)原报告系统中连接在N端的S-Tag和荧光蛋白Dendra2之间含有Kozak基序，因此原报告系统中S-Tag-Dendra2和不含S-Tag的Dendra2独立表达，不含S-Tag的Dendra2无法展示CMA活性，故降低了可以展示CMA活性的S-Tag-Dendra2的比例，本报告系统中去除了荧光蛋白Dendra2前的Kozak基序，因而减少了Dendra2的独立表达，提高了被CMA靶向识别的S-Tag-Dendra2蛋白的比例及翻译效率。

(3)本报告系统在荧光蛋白Dendra2的C端插入了一段刚性linker和CMA靶向识别的五肽基序，使得CMA识别基序能够与荧光蛋白Dendra2稳定隔开，本发明在N末端和C末端分别插入CMA靶向识别的五肽基序，从而将CMA识别基序更好的暴露在荧光蛋白Dendra2的N末端和C末端，进一步增加了该荧光蛋白报告系统被HSC70识别的效率。

(4)由于CMA参与多种疾病的调控，故该报告系统可用于神经退行性疾病、视网膜退行性病变、癌症等病理过程及发育、衰老等生理过程中实时监测CMA的活性变化，也可用于评估药物或基因改造对CMA活性干预的有效性。该报告系统的结构相较于传统的报告系统结构做了改进，表达效率更高，检测CMA的活性更加灵敏。

附图说明

图1为本发明检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统pLVX-KFERQ-Dendra2-KDRVQ结构示意图。

图2为三种CMA报告序列的示意图，其中CMA reporter2是在CMA reporter1基础上进行的改进，CMA reporter3是在CMA reporter2基础上进行的改进。

图3为三种CMA报告系统分别转染人宫颈癌细胞系(Hela)后，进行血清饥饿、CMA激活剂和依托泊苷诱导处理后，CMA活性监测效果的生物荧光成像对比图和统计图。

图4为三种CMA报告系统分别转染小鼠原代胚胎成纤维细胞(MEF)后，进行血清饥饿、CMA激活剂和依托泊苷诱导处理后，CMA活性监测效果的生物荧光成像对比图和统计图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。本发明未提及的实验材料、实验仪器、实验方法均为本领域常规所用。

近年来，CMA越来越多的被发现参与到疾病的调控中，包括衰老相关性疾病如神经退行性疾病、视网膜退行性病变、癌症等等。现有的检测CMA活性的报告系统中连接在N端的S-Tag和荧光蛋白Dendra2之间含有Kozak基序，因此S-Tag-Dendra2和荧光蛋白Dendra2独立表达，降低了可以展示CMA活性的S-Tag-Dendra2的比例，因此导致可以展示CMA活性的S-Tag-Dendra2表达效率较低。因此，一个能够更加灵敏、准确检测CMA活性的报告系统对于研究CMA在疾病发生发展中的活性变化具有重要的意义。

术语解释：

内部核糖体进入位点序列IRES(Internal ribosome entry site,IRES)：是一种顺式作用的RNA序列，能够在翻译起始密码子上游的某些真核细胞和病毒信使RNA上介导40S核糖体亚基的内部进入。一般真核mRNA的翻译都需要5′帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5′端具有一段较短的RNA序列(约150-250BP)，这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列，在过表达载体中起着调控目的基因翻译起始，增强目的基因独立翻译效率的作用。

RRE(Rev Response Element,RRE)：HIV病毒的Rev响应元件，是一个高度结构化的长约350核苷酸的RNA片段，存在于HIV mRNA序列中。在HIV-1的辅助蛋白Rev存在的情况下，带有RRE的HIV-1mRNA会从细胞核输出到细胞质中，参与进一步的翻译与病毒包装。该元件对于病毒基因组有效运输到细胞质并高效包装是必需的。

因本申请对原有系统进行了改进，为了比较改进后的系统较原有系统是否有更好的识别效率，对荧光蛋白的荧光强度的要求就越高。荧光蛋白Dendra2的荧光强度较其他荧光蛋白如EGFP、mCherry更高；另外，荧光蛋白Dendra2是一个可实现光转换的荧光蛋白，在正常情况下它是绿光形态，但是给予其一个405nm的紫外光激发，荧光蛋白Dendra2会转换成红光，故既可以通过观察绿色荧光点来判断CMA活性，对于胞质中匀质Dendra背景强度过高致使不容易观察绿色荧光点的情况，也可以通过光转换方法观察红色荧光点来判断CMA活性，从而提供两个可以定量CMA活性的视觉。本申请荧光蛋白Dendra2的序列如SEQ IDNO.2所示。

针对现有报告系统的缺陷，本申请进行了改造，原来的报告系统命名为CMAreporter1。如图2所示，首先，去除了原报告系统中连接于N端S-Tag与荧光蛋白Dendra2中间的Kozak序列，在N端S-Tag和荧光蛋白Dendra2之间插入一段刚性linker，得到的报告系统命名为CMA reporter2。对CMA reporter2继续进行改造，在荧光蛋白Dendra2的C端插入一段刚性linker和CMA靶向识别的五肽基序KDRVQ得到报告系统CMA reporter3，如图1所示，以表达载体pLVX-IRES-puro为基本骨架，在所述pLVX-IRES-puro的启动子后插入目的基因CMA报告序列，所述CMA报告序列包含荧光蛋白、衔接在荧光蛋白N末端含有五肽基序KFERQ的S-Tag1、衔接在荧光蛋白C末端含有五肽基序KDRVQ的S-Tag2，所述表达载体pLVX-IRES-puro的序列如SEQ ID NO.1所示，得到报告系统pLVX-KFERQ-Dendra2-KDRVQ，所述报告系统pLVX-KFERQ-Dendra2-KDRVQ的序列如SEQ ID NO.3所示。表达载体pLVX-IRES-puro至少包含复制起始位点Ori、CMV启动子、内部核糖体进入位点序列IRES序列和/或RRE序列、非融合抗性标记基因puro、氨苄抗生素抗性基因AmpR、逆转录病毒顺式调节元件HIV-1ψ、3’LTR增强子序列。其中，CMV有较强的启动目的基因转录、增强目的蛋白翻译的功能，CMV启动子的序列如SEQ ID NO.4所示，内部核糖体进入位点序列IRES的序列如SEQ ID NO.5所示，RRE的序列如SEQ ID NO.6所示，3’LTR增强子的序列如SEQ ID NO.7所示。

改进的报告系统CMA reporter3结构是pLVX-KFERQ-Dendra2-KDRVQ，KFERQ和KDRVQ都可由其他类似于KFERQ五肽基序替代，因为这种基序不唯一。该CMA识别五肽基序氨基酸有一定的排列原则，其中谷氨酰胺Q是必需的，在基序最两端的任意一端，另外四个由以下三类氨基酸组成：一或两个带负电荷氨基酸(天冬氨酸D或谷氨酸E)、一或两个带正电荷氨基酸(赖氨酸K或精氨酸R)、一或两个疏水氨基酸(苯丙氨酸F，异亮氨酸I，亮氨酸L，缬氨酸V)组成。

针对三种报告系统CMA reporter1、CMA reporter2、CMA reporter3，分别检测在血清饥饿、DNA损伤刺激以及CMA激活剂等已知可以激活CMA的条件下对CMA活性展示的情况。

实验质粒和细胞：

pSPAX2(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)、PMD2.G(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、CMA reporter 1(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)、CMA reporter 2(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)、CMA reporter3(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)、293T细胞(来源于中科院)、人宫颈癌细胞系(来源于中科院)、小鼠原代胚胎成纤维细胞(分离小鼠的新鲜肺组织获得)。

实验方法：

通过三质粒转染系统将pSPAX2、PMD2.G、CMA reporter 1/CMA reporter2/CMAreporter3以2：1：3的比例分别转染至293T细胞中，转染后48小时分别收集慢病毒上清液，提前备好状态良好的人宫颈癌细胞系(Hela)和小鼠原代胚胎成纤维细胞(MEF)，均匀铺至细胞培养皿中过夜培养，培养18-24小时后，更换细胞培养基(含8ug/ml的polybrene)，分别将CMA reporter1、CMA reporter2、CMA reporter3、病毒上清液加入Hela和MEF细胞中，从而得到稳定表达上述报告系统的细胞系。

对表达不同报告系统的细胞系分别进行血清饥饿、CA(CMA激活剂，来源于selleck，CAS#S6797)、Etoposide(DNA损伤刺激)。对于血清饥饿进行16h的处理，对于CA激活剂是使用浓度为10uM的CA诱导处理细胞24h，对于DNA损伤刺激使用浓度为10uM的依托泊苷(来源于MCE，CAS#HY-13629)诱导处理细胞24h。处理结束后利用生物荧光成像技术进行CMA活性的监测。

实验结果：

如图3所示为人宫颈癌细胞系中观察的三种CMA报告系统中CMA活性的变化。根据量化统计结果，在血清饥饿、CA(CMA激活剂)、Etoposide(DNA损伤)等激活CMA的条件下，相比较于最初的CMA报告系统CMA reporter1，本申请中的每一步改造都显著增加了细胞中出现的Dendra2荧光蛋白点的数量，即CMA reporter3＞CMA reporter2＞CMA reporter1，实验结果表明本申请提供的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统显著提高了CMA活性检测的灵敏度。

如图4所示为小鼠原代胚胎成纤维细胞中观察的三种CMA报告系统中CMA活性的变化。根据量化统计结果，在血清饥饿、CA(CMA激活剂)、Etoposide(DNA损伤)等激活CMA的条件下，相比较于最初的CMA报告系统CMA reporter1，本申请中的每一步改造都显著增加了细胞中出现的Dendra2荧光蛋白点的数量，即CMA reporter3＞CMA reporter2＞CMAreporter1，实验结果表明本申请提供的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统显著提高了CMA活性检测的灵敏度。

本发明提供一种包含上述所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统的重组细胞系，所述的重组细胞系的宿主细胞包含小鼠和人的原代细胞如造血干细胞，间充质干细胞，T细胞，B细胞，巨噬细胞，神经细胞，成纤维细胞等，肿瘤细胞包括小鼠和人的肺癌细胞，肝癌细胞，结直肠癌细胞，胰腺癌细胞，宫颈癌细胞，卵巢癌细胞白血病细胞，黑色素瘤细胞等，体外培养的连续细胞系如人胚肾细胞，小鼠和人的小胶质细胞，小鼠单核巨噬细胞，人肝星形细胞等任意一种。

该检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统可用于神经退行性疾病、视网膜退行性病变、癌症、发育、衰老等病理生理过程中实时监测CMA活性的变化，以及评估药物或基因改造对CMA活性的干预效果。

综上所述，去除原报告系统中连接于N端S-tag与Dendra2中间的Kozak序列；在N端S-Tag和Dendra2之间插入了一段刚性linker；在Dendra2的C端插入了一段刚性linker和CMA靶向识别的五肽基序KDRVQ，得到新的CMA活性报告系统。进一步提高了翻译效率，增加荧光蛋白被HSC70识别的效率，该报告系统可用于实时监测CMA活性的变化，研究CMA在疾病发生发展中的活性变化，以及评估药物对CMA活性干预的有效性，具有重大的实际应用价值。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，其特征在于，所述报告系统以表达载体pLVX-IRES-puro为基本骨架，在所述pLVX-IRES-puro的启动子后插入目的基因CMA报告序列，所述CMA报告序列包含荧光蛋白、连接在荧光蛋白N末端的含有五肽基序KFERQ的S-Tag1、连接在荧光蛋白C末端的含有五肽基序KDRVQ的S-Tag2；

其中，所述表达载体pLVX-IRES-puro的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，其特征在于，所述荧光蛋白包含EGFP、mCherry、Dendra2中的任意一种。

3.如权利要求2所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，其特征在于，所述荧光蛋白是Dendra2，所述Dendra2的序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，其特征在于，所述报告系统还包含若干个刚性linker，其中，所述含有五肽基序KFERQ的S-Tag1和所述荧光蛋白之间至少连接一刚性linker，所述含有五肽基序KDRVQ的S-Tag2和所述荧光蛋白之间至少连接一刚性linker。

5.如权利要求1所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，其特征在于，所述表达载体pLVX-IRES-puro至少包含复制起始位点Ori、启动子promoter、内部核糖体进入位点序列IRES和/或RRE、非融合抗性标记基因puro、氨苄抗生素抗性基因AmpR、逆转录病毒顺式调节元件HIV-1ψ、3’LTR增强子序列。

6.如权利要求5所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，其特征在于，所述启动子promoter是CMV启动子。

7.一种包含权利要求1～6中任意一项所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统的重组细胞系。

8.如权利要求7所述的重组细胞系，其特征在于，所述重组细胞系的宿主细胞至少包含小鼠和人的原代细胞、小鼠和人的肿瘤细胞、体外培养的连续细胞系中的任意一种。

9.一种如权利要求1～6中任意一项所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统的应用，其特征在于，所述检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统用于神经退行性疾病、视网膜退行性病变、癌症、发育、衰老等病理生理过程中实时监测CMA活性的变化。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统用于评估药物或基因改造对CMA活性的干预效果。