CN105274083A - 一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用 - Google Patents

一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。本发明从茶(Camellia？sinensis)叶中筛选得到了能高效催化形成GABA的谷氨酸脱羧酶CsGAD，通过利用序列敲除方法获得切除了谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端31个氨基酸的序列即谷氨酸脱羧酶CsGADm，其具有更高的催化形成GABA的活性；谷氨酸脱羧酶CsGAD和谷氨酸脱羧酶CsGADm的催化活性分别达0.99±0.09、1.67±0.34mg？GABA/mg？protein/min。本发明利用植物来源的谷氨酸脱羧酶生物合成生产γ-氨基丁酸，具有来源安全、工艺简单、转化时间快、转化率高等优点，具有良好的应用前景。

Description

一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体来说涉及一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid或γ-aminobutanoicacid，简称GABA)是一种功能性氨基酸，广泛分布于动植物及微生物中的一种非蛋白氨基酸，是存在于哺乳动物脑、脊髓中的抑制性神经传递物质，对生物体生命活动起着不可替代的作用。GABA具有延缓衰老、降血压、调节激素分泌、治疗癫痫、治疗帕金森病的功能。此外GABA作为中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质，还可以镇痛、保肝、活肾、解酒毒、抗脑缺血、抗焦虑、抗心律失调、治疗哮喘、调节胃酸分泌等功能。2009年9月27日，卫生部批准GABA为新资源食品，作为新资源食品的GABA，由于化学合成GABA存在较大的安全性问题，不适合应用于食品的开发。因此，利用生物合成法生产GABA是一条相对安全与有效的途径。
目前生物合成法生产GABA均采用微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种，发酵生产GABA，主要利用的是微生物中自身所含有GABA合成基因。然而利用植物来源的GABA合成基因生物合成GABA相对很少。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中植物来源的GABA合成基因种类少、合成GABA效率低的不足，提供一种植物来源的、能高效催化合成GABA的谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。
申请人研究发现与其他植物相比，厌氧胁迫处理的茶(Camelliasinensis)叶具有产生高含量GABA的能力，并从茶叶中筛选出了具有高效转化形成GABA的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD，此外还发现谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列会抑制其转化形成GABA的活性，切除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白(谷氨酸脱羧酶CsGADm)能进一步提高其生物合成形成GABA的转化率，并最终获得基于植物源基因生物合成形成的GABA。
本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶CsGAD，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，其含有493个氨基酸残基。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD。
优选，所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其含有1482bp的碱基。
本发明的第三个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶CsGADm，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，其含有462个氨基酸残基。
本发明的第四个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶CsGADm的谷氨酸脱羧酶基因CsGADm。
优选，所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其含有1389bp的碱基。
本发明的第五个目的是提供所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD和/或谷氨酸脱羧酶CsGADm在催化生成γ-氨基丁酸(GABA)中的应用。
本发明利用序列敲除方法，改造了谷氨酸脱羧酶CsGAD。对谷氨酸脱羧酶CsGAD的修饰是通过切除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端的31个氨基酸序列而得到谷氨酸脱羧酶CsGADm，谷氨酸脱羧酶CsGADm的编码基因即谷氨酸脱羧酶基因CsGADm对应为切除了谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的3’端的93bp核苷酸后得到的序列。本发明的谷氨酸脱羧酶CsGAD具有较高的催化活性，达0.99±0.09mgGABA/mgprotein/min，谷氨酸脱羧酶CsGADm的催化活性更是大大提高，达1.67±0.34mgGABA/mgprotein/min。每50ml经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养的含有重组质粒pET-32a-CsGADm的EscherichiacoliRosetta重组菌菌液可产生24.2mg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白，1mg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白15min可完成转化35.28mgL-谷氨酸全部生成GABA，转化率达100％。本发明利用植物来源的谷氨酸脱羧酶生物合成生产γ-氨基丁酸，具有来源安全、工艺简单、转化时间快、转化率高等优点，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是重组谷氨酸脱羧酶CsGADm纯化蛋白的SDS-page结果，Marker的单位为KDa。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
申请人研究发现与其他植物相比，厌氧胁迫处理的茶(Camelliasinensis)叶具有产生高含量GABA的能力，并从茶叶中筛选出了具有高效转化形成GABA的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD，此外还发现谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列会抑制其转化形成GABA的活性，切除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白(谷氨酸脱羧酶CsGADm)能进一步提高其生物合成形成GABA的转化率。
以下对实施的具体步骤进行说明：
a)茶叶RNA的提取及cDNA的获得：
RNA提取用华越洋的超快型植物RNA提取试剂盒GK系列。具体步骤为：取0.05g用液氮磨碎的茶(Camelliasinensis)叶加入0.5ml裂解液，混匀，加入150μl去蛋白液(取下层)，加入100μl氯仿，混匀30s，离心(12000×g)5min，取上清350μl，加入等体积漂洗液，颠倒混匀，分两次上柱，离心(12000×g)30s，加入500μl洗柱液，离心(12000×g)30s，重复洗柱步骤，再次离心(12000×g)1min，将柱移至新离心管中，加50μl水，室温静置3min，离心(12000×g)1min，提取得到茶叶RNA，保存于-80℃。
将茶叶RNA逆转录成cDNA用TAKARA公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒。取出-80℃冻存的茶叶RNA，待融化后，根据说明书加入DNA酶后，42℃2min消化DNA，再加入反转录试剂，37℃15min，85℃5sec；得到逆转录的cDNA。
b)谷氨酸脱羧酶基因CsGAD和修饰后的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD(谷氨酸脱羧酶基因
CsGADm)的克隆：
利用生物信息学分析方法，根据已知的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计用于扩增谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的引物序列为：F：5'-GCGGCCGCATGGTTCTGTCAAAGACAACATCG-3'；R：5'-GTCGACTTAGCAAACACCATTAGTCTTCTT-3'。反应体系参照说明书，PCR扩增用Takara的PrimeSTARMaxPremix(2×)10μl，F和R引物各10μM，逆转录的cDNA模板0.1μl，加双蒸水补足20μl。PCR扩增程序为98℃30sec，1个循环；98℃15sec，55℃15sec，72℃30sec，33个循环；72℃10sec，1个循环。由此扩增得到谷氨酸脱羧酶基因CsGAD全长序列，把全长序列克隆连接到表达载体pET-32a(含有His标签，Novagen,Madison,WI,USA)得到重组质粒pET-32a-CsGAD，送公司测序，其插入的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的序列如SEQIDNO.1所示，确认序列正确后，将该重组质粒转入表达菌株EscherichiacoliRosetta(Novagen,Madison,WI,USA)，由此得到转化重组质粒pET-32a-CsGAD的EscherichiacoliRosetta重组菌；以空载pET-32a转入菌株EscherichiacoliRosetta的菌株为对照。
对谷氨酸脱羧酶CsGAD(其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示)的修饰是通过切除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端的31个氨基酸序列而得到谷氨酸脱羧酶CsGADm(其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)，谷氨酸脱羧酶CsGADm的编码基因即谷氨酸脱羧酶基因CsGADm(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)对应为切除了谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的3’端的93bp核苷酸后得到的序列。
设计用于扩增谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的引物序列为F：5'-GCGGCCGCATGGTTCTGTCAAAGACAACATCG-3'；R：5'-CCCAAGCTTTTATGACTCTTGGACTACAGC-3'。谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的PCR扩增体系(引物用谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的引物F和R)和程序与谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的相同。由此得到的PCR产物为谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的序列，把该序列克隆连接到表达载体pET-32a得到重组质粒pET-32a-CsGADm，送公司测序，其插入的谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的序列如SEQIDNO.2所示，确认序列正确后，将该重组质粒转入表达菌株EscherichiacoliRosetta，由此得到转化重组质粒pET-32a-CsGADm的EscherichiacoliRosetta重组菌。
c)谷氨酸脱羧酶CsGAD和谷氨酸脱羧酶CsGADm原核表达：
分别挑转化重组质粒pET-32a-CsGAD的EscherichiacoliRosetta重组菌或转化重组质粒pET-32a-CsGADm的EscherichiacoliRosetta重组菌单克隆，加5mlLB培养基，培养8h(37℃，230rpm)，取0.5ml转移到50ml新的LB培养基(1:100)，培养2h(37℃,230rpm)至OD值0.5，用0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Sigma-Aldrich,St.Louis,CA,USA)诱导，20℃培养6h，使融合了His标签的谷氨酸脱羧酶CsGAD或谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白表达，把菌液离心(4000×g)10min，收集菌体沉淀；
d)重组谷氨酸脱羧酶CsGAD和重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白的纯化：
将收集的菌体沉淀(含有谷氨酸脱羧酶CsGAD或谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白)重悬后超声破碎，用Lysisbuffer(含50mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪唑，用NaOH调pH8.0)重悬超声破碎后的菌液，离心(4℃,12000×g)10min，取上清即为粗蛋白；在粗蛋白液中加入0.1mlNi-NTA，孵育1h(4℃200rpm)，倒入空柱，用Washbuffer(含50mMNaH2PO4、300mMNaCl、20mM咪唑，用NaOH调pH8.0)8ml洗去杂蛋白，加Elutebuffer(含50mMNaH2PO4、300mMNaCl、250mM咪唑，用NaOH调pH8.0)0.5ml弃掉，再加入2.5ml收集。将2.5ml样品上样PD-10柱，用3.5ml25mMTris·HCl(pH7.5)缓冲液洗脱收集；由此得到纯化的重组谷氨酸脱羧酶CsGAD或重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白。重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白的SDS-page结果如图1所示，与理论大小符合。
e)纯化的重组谷氨酸脱羧酶CsGAD和重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白应用于高效生产γ-氨基丁酸：
每400μl反应体系包括0.2M吡啶盐酸溶液(pH5,含5mMEDTA·Na2和10mM二硫苏糖醇)、1mM磷酸吡哆醛(PLP)、0.6mML-谷氨酸和1μg纯化的重组蛋白(重组谷氨酸脱羧酶CsGAD或重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白)，30℃条件下反应15min。反应结束后，对反应液进行检测，根据转化产物的量计算蛋白的催化活性。结果如表1所示，重组谷氨酸脱羧酶CsGAD的催化活性为0.99±0.09mgGABA/mgprotein/min，而重组谷氨酸脱羧酶CsGADm的催化活性为1.67±0.34mgGABA/mgprotein/min；说明重组谷氨酸脱羧酶CsGAD具有较高的催化活性，而且经过修饰得到的重组谷氨酸脱羧酶CsGADm的催化活性更是大大提高。
表1重组谷氨酸脱羧酶CsGAD和重组谷氨酸脱羧酶CsGADm的催化活性
本发明中平均每50ml经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养的含有重组质粒pET-32a-CsGADm的EscherichiacoliRosetta重组菌菌液可产生24.2mg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白，1mg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白15min可完成转化35.28mgL-谷氨酸全部生成GABA，转化率达100％。

Claims (7)

1.一种谷氨酸脱羧酶CsGAD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
2.一种编码权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
4.一种谷氨酸脱羧酶CsGADm，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
5.一种编码权利要求4所述的谷氨酸脱羧酶CsGADm的谷氨酸脱羧酶基因CsGADm。
6.根据权利要求5所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGADm，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
7.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD和/或权利要求4谷氨酸脱羧酶CsGADm在催化生成γ-氨基丁酸中的应用。
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