CN105237641A - Vegf-b和vegf-b融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

VEGF-B和VEGF-B融合蛋白及其应用。本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种使用血管内皮生长因子治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的方法。本发明还提供一种靶向性血管生成剂，所述靶向性血管生成剂包括两个结构功能区域，分别为靶向性片段和血管生长因子片段，它将靶向作用于白色脂肪组织，对胰岛素抵抗及高血糖、肥胖等相关疾病的治疗具有科研和临床应用价值。

Description

VEGF-B和VEGF-B融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种使用血管内皮生长因子治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的方法。

背景技术

胰岛素抵抗是指胰岛素靶组织如肝脏、骨骼肌以及脂肪等对胰岛素敏感性降低，产生生物效应低于正常水平，导致胰岛素生物作用减弱或者下降，进而引起糖脂代谢稳态破坏或血管内膜功能紊乱。近年来，由于高脂饮食、不良的生活习惯及外界环境因素的影响，糖尿病、肥胖等代谢相关的疾病广泛发生，严重影响了人们的生活质量，已成为世界上最严峻的健康问题之一。胰岛素抵抗是2型糖尿病发生发展的重要环节，并贯穿疾病始终。此外，胰岛素抵抗是代谢综合征的基础，而代谢综合征直接导致2型糖尿病风险增加。目前，胰岛素抵抗已成为多学科共同的研究热点。

临床上治疗胰岛素抵抗主要使用胰岛素增敏剂。二甲双胍可以抑制肝脏的糖异生，降低肝糖输出，促进糖原合成并促进外周组织对葡萄糖的摄取和利用从而改善胰岛素抵抗。但服用二甲双胍可能会出现胃肠道反应、过敏反应等副作用。PPARγ激动剂噻唑烷二酮类药物(TZD)属于胰岛素增敏剂，通过增加外周组织对胰岛素的敏感性改善胰岛素抵抗，但因其具有提高心血管发病率的副反应，临床使用受到限制。目前，临床上尚无能够显著改善胰岛素抵抗且不造成明显副作用的药物。因此，研究新型安全有效的抗胰岛素抵抗药物十分必要。

本发明所涉及的VEGF-B属于血管内皮生长因子家族，是VEGF-A的同系物，和VEGF165有47％的相似性，和PIGF有37％的相似性。已经发现人VEGF-B经mRNA选择性剪切产生2种异构体，分别是含有167个氨基酸残基的VEGF-B₁₆₇和含有186个氨基酸残基的分泌形式VEGF-B₁₈₆。VEGF-B大量表达于肌肉、心脏和棕色脂肪组织，具有血管、神经保护作用，并且能够抑制凋亡，但VEGF-B的其他生物活性未见报道。

近年研究人员开始关注VEGF-B在代谢调控中的作用。2010年Nature报道(HagbergCE等，nature，2010，464(7290)：917-21)vegfb基因敲除的小鼠与野生型小鼠相比，在肌肉、心脏和棕色脂肪组织等部位脂质堆积降低，从而可改善代谢内稳态。其原理在于VEGF-B可以上调脂肪酸转运蛋白(FATPs)的表达，因此采用基因敲除的手段将vegfb基因沉默，即阻断了VEGF-B的通路可以减少脂质摄入从而达到改善代谢内稳态的效果。基于此原理，已有专利(US8383112)将VEGF-B作为靶点，保护了可以拮抗体内VEGF-B的抗体，通过抑制体内的VEGF-B通路作为治疗糖尿病的策略。

本发明提供了一种通过增加VEGF-B水平改善代谢疾病的方法，采用高脂饮食诱导肥胖小鼠模型，给予一定剂量的VEGF-B治疗后，小鼠体重下降，胰岛素抵抗症状显著改善。本方法与已有的文献和专利报道的治疗策略相反，说明本发明的治疗手段与已有报道是通过完全不同的作用机制达到近似的治疗效果。采用已有报道的治疗思路，需抑制VEGF-B通路，在药物的开发应用上存在一定的局限性。而采用本发明的治疗方法更易实施，另据文献(XuriLi等，TrendsinMolecularMedicine，2012，18(2)：119-127)报道，VEGF-B分子不易产生毒副作用，因此在糖尿病、肥胖等胰岛素抵抗相关疾病的治疗中有具有很好的应用前景。

在2010年的一篇文章(Md.NazirHossen等，JournalofControlledRelease，2010，147：261-268)中提出，多肽“KGGRAKD”能与生物药理活性物质相连接，靶向白色脂肪组织从而发挥相应的药理活性达到靶向治疗的目的。

发明内容

鉴于以上所述的治疗胰岛素抵抗药物缺乏，本发明的目的在于提供一种使用血管内皮生长因子治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种使用血管内皮生长因子治疗胰岛素抵抗及糖尿病、肥胖症等相关疾病的方法。血管内皮生长因子公认的作用为促进血管生成，但是本发明提供了其在治疗胰岛素抵抗方面的新活性。

其中，所述血管内皮生长因子是血管内皮生长因子B(VEGF-B)。

其中VEGF-B是由SEQIDNO.1或者SEQIDNO.2所示的序列，或其一部分，或由在所述氨基酸序列中的任何一个中一个或几个氨基酸被删除，添加和/或取代的氨基酸序列组成。

SEQIDNO.：1

PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRR

SEQIDNO.：2

PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDRAATPHHRPQPRSVPGWDSAPGAPSPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSALTPGPAAAAADAAASSVAKGGA

本发明第二方面提供一种包含血管内皮生长因子-B(VEGF-B)和靶向肽的融合蛋白。

上述融合蛋白其特征在于，血管内皮生长因子-B(VEGF-B)经由一个或多个氨基酸组成的接头肽(Linker)连接于靶向肽(Ba)，其中血管内皮生长因子-B(VEGF-B)、接头肽(Linker)和靶向肽(Ba)利用肽键从N末端到C末端或C末端到N末端的顺序连接，其结构通式：

VEGF-B-接头肽(Linker)-靶向肽(Ba)或者靶向肽(Ba)-接头肽(Linker)-VEGF-B

并且其中，

1)VEGF-B是由SEQIDNO.1或者SEQIDNO.2所示的序列，或其一部分，或由在所述氨基酸序列中的任何一个中一个或几个氨基酸被删除，添加和/或取代的氨基酸序列组成。

2)接头肽(Linker)中含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(式中，n是1～10的整数)，或式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n表示的氨基酸序列(式中，n是1～10的整数)。

3)靶向肽(Ba)中B表示5～20氨基酸的多肽序列，B_a中a表示1～5次基团B的重复。B的氨基酸序列如下所示：

X₁KGGRAKDX₂

其中X₁包含为天然氨基酸或非天然氨基酸的单个及多个氨基酸组合。

其中X₂包含为天然氨基酸或非天然氨基酸的单个及多个氨基酸组合。

优选的，其氨基酸序列如SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6所示。

SEQIDNO.3

PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRRGGGGSGGGGSGGGGSKGGRAKD

SEQIDNO.4

KGGRAKDGGGGSGGGGSGGGGSPVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRR

SEQIDNO.5

PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDRAATPHHRPQPRSVPGWDSAPGAPSPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSALTPGPAAAAADAAASSVAKGGAGGGGSGGGGSGGGGSKGGRAKD

SEQIDNO.6

KGGRAKDGGGGSGGGGSGGGGSPVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDRAATPHHRPQPRSVPGWDSAPGAPSPADITHPTPAPGPSAHAAPSTTSALTPGPAAAAADAAASSVAKGGA

本发明第三方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码能编码一种融合蛋白的氨基酸。

本发明第四方面提供一种表达载体，所述表达载体是含有所述多核苷酸的表达载体。

优选的，pET表达系统如pET28a。

本发明第五方面提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有表达载体、或者染色体中整合有所述的多核苷酸。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞(大肠杆菌)；真核细胞，如酵母细胞或者哺乳动物细胞。

本发明第六方面提供一种融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1.将靶向性血管生成剂编码序列克隆到表达载体中；

2.将表达载体转染或转化到宿主细胞，培养并筛选出阳性细胞株；

3.使用步骤2所得细胞表达纯化后，即得所述融合蛋白。

本发明第七方面提供一种融合蛋白用于治疗胰岛素抵抗及其相关疾病。

本发明第八方面提供一种药物组合物，含有上述融合蛋白及至少一种药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、增稠剂，并可被制备成如片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液或悬浮液的药剂类型。

本发明的原理：

本发明提供了使用VEGF-B治疗胰岛素抵抗及糖尿病、肥胖症等相关疾病的方法，在其基础上提供了一种活性更高的tPep-VEGF-B融合蛋白。其原理在于有研究(KaiSun等，JournalofClinicalInvestigation，2011，121(6)：2094-2101)表明脂肪组织处于持续的重建过程，在肥胖个体内，毛细血管的生长不能满足脂肪组织扩张的需要，导致血流的微循环失调，从而造成脂肪组织局部缺氧而诱发炎症，这是造成胰岛素抵抗的原因之一。文献(Hoon-KiSung等，CellMetabolism，2013，17：61-72))报道脂肪组织特异性提高VEGF-A水平可抑制脂肪组织缺氧、改善炎症状态最终降低血糖水平，逆转代谢失衡恢复内稳态。

本发明利用上述原理，将具有脂肪静脉血管细胞靶向性的靶向肽“KGGRAKD”与血管内皮生长因子-B(VEGF-B)通过一段连接肽((GGGGS)3)连接，形成融合蛋白tPep-VEGF-B，以原核表达方式进行表达，并经过纯化得到tPep-VEGF-B。该融合蛋白在上述VEGF-B活性的基础上可通过靶向肽的作用特异性促进脂肪组织血管生成减轻脂肪组织炎症，通过不同方面的机制共同作用，提高其抗胰岛素抵抗活性。实验结果表明带有靶向性的tPep-VEGF-B与单独的VEGF-B相比抗胰岛素抵抗活性提高了45％。

附图说明

本发明附图6张，分别为：

图1显示为实施例2所述的VEGF-B蛋白纯化结果图。第一泳道(标记为1)为分离纯化后的重组蛋白质样品，其中第二泳道(标记为M)为标准蛋白marker，每条蛋白条带自上而下的分子量分别为116KDa，66.2KDa，45KDa，35KDa，25KDa，18.4KDa，14.4KDa，目的蛋白在电泳中所得的分子量与理论分子量一致。

图2显示为实施例3所述的高脂诱导的肥胖小鼠进行治疗后，其胰岛素抵抗指数QUICKI。数理统计采用GraphPadPrism6软件，进行单因素方差分析。(**)P＜0.01。

图3显示为实施例5所述的tPep-VEGF-B蛋白纯化结果图。其中第一泳道(标记为M)为标准蛋白marker，每条蛋白条带自上而下的分子量分别为116KDa，66.2KDa，45KDa，35KDa，25KDa，18.4KDa，14.4KDa第二泳道(标记为2)为分离纯化后的重组蛋白质样品，其蛋白条带的分子量约25KDa，与理论分子量一致。

图4显示为实施例6所述的靶向性验证。图中显示为在分别给与Cy7NHS-VEGF-B和Cy7NHS-tPep-VEGF-B后，取小鼠三种不同的脂肪组织，验证tPep在体内的靶向性。图中三种组织分别为附睾白色脂肪组织(eWAT)，腹股沟白色脂肪组织(iWAT)和棕色脂肪组织(BAT)。左上和右上两张图为远红外(FIR)拍摄图片，左下和右下两张图为白光(WL)拍摄图片。

图5显示为实施例7所述的tPep-VEGF-B在高脂诱导的肥胖小鼠模型中，采用药物治疗期间小鼠的生长曲线。具体实验过程按实施例6开展。图中，横坐标为饲养并给药的时间，以天(day)做单位，纵坐标为小鼠体重，以克(g)为单位。分别有对照组、高脂组、罗格列酮组和tPep-VEGF-B(TVB-M)组。

图6显示为实施例7所述的高脂诱导的肥胖小鼠进行治疗后，其胰岛素抵抗指数QUICKI。数理统计采用GraphPadPrism6软件，进行单因素方差分析。(**)P＜0.01；(***)P＜0.001。

具体实施方式

本发明首先将人的血管生长因子VEGF-B克隆到表达载体上，从而表达出血管生长因子以备之后的药理活性研究，再构建VEGF-B与一段靶向脂肪组织的多肽通过柔性连接肽相连接，得到了具有生物活性的融合蛋白。本发明所提供的靶向血管生成剂中，tPep和VEGF-B之间包括连接肽，连接肽可以为本领域各种连接肽，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。优选的，所述连接肽有甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)组合而成，普遍采用GGGGS为单位的多单位连接实现，此类连接肽的设计原则已经是本领域人员的公知技术。

下面结合实施例，进一步详述本发明。以下实施例的目的在于对本发明进行进一步阐明，但并不意味着对本发明进行限制。说明书及实施例中采用的菌株、质粒和化学试剂等，如未特殊说明均按照常规实验条件进行操作，或者按供应商提供的说明书进行操作。

实施例1

血管生长因子VEGF-B的构建：

按照最优密码子将氨基酸序列转化成基因序列，通过相应的酶切位点插入到以下表达载体：pET22b、pET28a、pET32a。重组质粒转化到大肠杆菌DH10B中，经过琼脂糖平板结合抗性筛选，获得所需的质粒。经过菌落PCR和测序鉴定重组质粒的正确性。将测序正确的质粒，转化到表达宿主菌BL21(DE3)，完成血管生长因子VEGF-B的构建。VEGF-B的序列为：

SEQIDNO.：1

PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRR

实施例2

血管生长因子VEGF-B的表达纯化：

采用实施例1中构建完成的菌株，挑取单克隆菌落，采用LB培养基，在37℃摇瓶培养，采用IPTG诱导表达后，采用15％的SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量、蛋白的可溶性及目标蛋白在全长蛋白所占比例，以此筛选所需工程菌。将筛选到的菌株保存，并采用500mL容量的锥形瓶进行实验室水平摇瓶培养。在37℃，转速为220rpm的条件下进行摇瓶，种子液扩培约4h后，当OD600值在0.8～1.0之间时，加入IPTG进行诱导，IPTG最佳诱导浓度为0.2mM，继续诱导4h。

在发酵结束之后，在4℃条件下8000rpm离心5min，每升培养基可获得5g的湿菌体。采用pH8.0的20mMTris-HCl重悬菌体进行洗涤，再次以8000rpm离心5min。沉淀物以20mMTris-HCl，1mMEDTA，150mMNaCl，1％TritonX-100，pH8.0的洗涤缓冲液，按照1∶10(w∶v)的比例加入重悬菌体。重悬液体采用超声破碎仪进行破碎，超声功率300w，超声开3s，关3s，超声破碎总时间约为15min。采用革兰氏染色，油镜检测裂解情况。

在超声破碎后，4℃12000rpm离心15min，弃去离心上清液，保留沉淀，沉淀为包涵体。包涵体采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，2M尿素，pH8.0进行洗涤，洗涤之后12000rpm离心10min，收集沉淀。在沉淀中按照1∶10(w∶v)的比例加入变性液，变性液组成为20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，pH8.0，包涵体在变性液中缓慢搅拌12h至包涵体溶解。溶解后采用12000rpm条件离心30min，收集上清溶液采用Ni柱进行纯化。具体操作在AKTA上进行。Ni柱采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，pH8.0平衡后以1mL/min的流速上样，上样完毕后，采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，20mM咪唑，pH8.0的缓冲液除去非特异性吸附的杂蛋白，最后采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，300mM咪唑，pH8.0的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱溶液。将变性液按照1∶10体积比缓慢加入复性液中，立即搅拌均匀，放置在4℃环境中复性24h，复性液成分为20mMTris-HCl，2M尿素，1mMGSH，0.25mMGSSG，pH8.0。复性结束后，采用切向流超滤膜包进行超滤浓缩并对蛋白溶液体系进行置换，将其置换成为20mMTris-HCl，pH8.0中。采用SDS-PAGE检测蛋白质纯度为95％左右。

实施例3

实施例2中所得蛋白的药理活性验证。

选择4周龄的C57BL/6雄鼠，普通饲料喂养一周，适应环境，在5周时开始采用高脂饲料喂养至少8周。空白对照组采用普通饲料，高脂模型组采用高脂饲料，两天更换一次新的高脂饲料，检测一次小鼠体重、饮食量和饮水量。饲养温度为20±5℃，相对湿度为55±5％，保持正常的昼夜节律(light9：00～21：00，dark21：00～9：00)。将小鼠分为四组，分别为空白对照组、高脂模型组和VEGF-B组，在高脂喂养的同时给药，给药周期为8周。空白对照组和高脂模型组每天注射生理盐水，VEGF-B每天按照4mg/kg的计量腹腔注射。给药结束后，检测小鼠的空腹血糖及空腹胰岛素，计算胰岛素抵抗指数QUICKI指数，并采用GraphPadPrism6进行方差分析。QUICKI计算公式如下：QUICKI＝1/(Log(FINS)+Log(FPG))。结果见图2。

给药结束后的QUICKI指数：

组别	正常组	高脂模型组	VEGF-B组
				QUICKI	1.20±0.41	0.79±0.13	1.42±0.23

从上述QUICK指数中可得出，给药之后小鼠的QUICKI指数上升，高脂模型组与给药组相比有显著性差异，而给药组与正常组相比无显著性差异，可以说明VEGF-B具有改善胰岛素抵抗的作用。

实施例4

tpep-VEGF-B的分子构建：

所述靶向血管生成剂的氨基酸序列为：

SEQIDNO.：3

PVSQPDAPGHQRKVVSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVELMGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLECVPTGQHQVRMQILMIRYPSSQLGEMSLEEHSQCECRPKKKDSAVKPDSPRPLCPRCTQHHQRPDPRTCRCRCRRRSFLRCQGRGLELNPDTCRCRKLRRGGGGSGGGGSGGGGSKGGRAKD

此融合蛋白含有189个氨基酸，按照常规大肠杆菌密码子表，结合大肠杆菌密码子的偏爱性，设计并合成该重组靶向性血管生成剂氨基酸序列对应的核酸序列。

将该目的基因序列通过相应的酶切位点插入到以下表达载体中：pET22b、pET28a、pET32a。重组质粒转化到大肠杆菌DH10B中，经过琼脂糖平板结合抗性筛选，获得所需的质粒。经过菌落PCR和测序鉴定重组质粒的正确性。

将测序正确的质粒，转化到表达宿主菌BL21(DE3)，完成靶向性血管生成剂tPep-VEGF-B的构建。

实施例5

tpep-VEGF-B融合蛋白的制备：

采用实施例4所得的菌株，挑取单克隆菌落，采用LB培养基，在37℃摇瓶培养，采用IPTG诱导表达后，采用15％的SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量、蛋白的可溶性及目标蛋白在全长蛋白所占比例，以此筛选所需工程菌。将筛选到的菌株保存，并采用500mL容量的锥形瓶进行实验室水平摇瓶培养。在37℃，转速为220rpm的条件下进行摇瓶，种子液扩培约4h后，当OD600值在0.8～1.0之间时，加入IPTG进行诱导，IPTG最佳诱导浓度为0.2mM，继续诱导4h。

在发酵结束之后，在4℃条件下8000rpm离心5min，每升培养基可获得5g的湿菌体。采用pH8.0的20mMTris-HCl重悬菌体进行洗涤，再次以8000rpm离心5min。沉淀物以20mMTris-HCl，1mMEDTA，150mMNaCl，1％TritonX-100，pH8.0的洗涤缓冲液，按照1∶10(w∶v)的比例加入重悬菌体。重悬液体采用超声破碎仪进行破碎，超声功率300w，超声开3s，关3s，超声破碎总时间约为15min。采用革兰氏染色，油镜检测裂解情况。

在超声破碎后，4℃12000rpm离心15min，弃去离心上清液，保留沉淀，沉淀为包涵体。包涵体采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，2M尿素，pH8.0进行洗涤，洗涤之后12000rpm离心10min，收集沉淀。在沉淀中按照1∶10(w∶v)的比例加入变性液，变性液组成为20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，pH8.0，包涵体在变性液中缓慢搅拌12h至包涵体溶解。溶解后采用12000rpm条件离心30min，收集上清溶液采用Ni柱进行纯化。具体操作在AKTA上进行。Ni柱采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，pH8.0平衡后以1mL/min的流速上样，上样完毕后，采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，20mM咪唑，pH8.0的缓冲液除去非特异性吸附的杂蛋白，最后采用20mMTris-HCl，500mMNaCl，8M尿素，300mM咪唑，pH8.0的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱溶液。将变性液按照1∶10体积比缓慢加入复性液中，立即搅拌均匀，放置在4℃环境中复性24h，复性液成分为20mMTris-HCl，2M尿素，1mMGSH，0.25mMGSSG，pH8.0。复性结束后，采用切向流超滤膜包进行超滤浓缩并对蛋白溶液体系进行置换，将其置换成为20mMTris-HCl，pH8.0中。采用SDS-PAGE检测蛋白质纯度为95％左右。

实施例6

融合蛋白靶向性的验证。比较实施例2所得蛋白VEGF-B和实施例5所得的蛋白tPep-VEGF-B在体内的靶向性情况。

取1mg/ml的实施例2和实施例5的蛋白溶液，将其缓冲液置换为pH8.3的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中。将0.21mg的Cy7NHS溶于0.3ml的DMSO中，按照体积比10∶1的蛋白：Cy7NHS相互混合，并在室温中孵育5h进行偶联。偶联结束后，采用分子筛将未偶联在蛋白质上的小分子Cy7NHS除去，收集蛋白溶液。

选用C57BL/6J小鼠，分别尾静脉注射100ul的Cy7NHS-VEGF-B和Cy7NHS-tPep-VEGF-B，给药10min之后，将小鼠解剖，取三种不同的脂肪组织附睾白色脂肪组织(eWAT)，腹股沟白色脂肪组织(iWAT)和棕色脂肪组织(BAT)，采用布鲁克InVivoDXSPRO活体成像仪进行活体成像进行观察。

从图4中可以观察到，注射Cy7NHS-VEGF-B的eWAT的光强度与BAT的光强度基本等同，而注射Cy7NHS-tPep-VEGF-B的eWAT的光强度明显强于BAT的，说明在体内Cy7NHS-VEGF-B进入白色脂肪和棕色脂肪组织的量是等量的，没有靶向性，而Cy7NHS-tPep-VEGF-B大量进入白色脂肪，少量进入棕色脂肪组织，具有一定的靶向性。

实施例7

采用实施例5所得的蛋白进行药理学实验。

选择4周龄的C57BL/6雄鼠，普通饲料喂养一周，适应环境，在5周时开始采用高脂饲料喂养至少8周。空白对照组采用普通饲料，高脂模型组采用高脂饲料，两天更换一次新的高脂饲料，检测一次小鼠体重、饮食量和饮水量。饲养温度为20±5℃，相对湿度为55±5％，保持正常的昼夜节律(light9：00～21：00，dark21：00～9：00)。将小鼠分为五组，分别为空白对照组、高脂模型组、罗格列酮组、tPep-VEGF-B组和VEGF-B组，在高脂喂养的同时给药，给药周期为8周。空白对照组和高脂模型组每天注射生理盐水，罗格列酮组每天注射2mg/kg的罗格列酮，tPep-VEGF-B和VEGF-B每天按照4mg/kg的剂量腹腔注射。在给药期间，每隔三天称小鼠体重，并记录。给药结束后，检测小鼠的空腹血糖及空腹胰岛素，计算胰岛素抵抗指数QUICKI指数，并采用GraphPadPrism6进行方差分析。QUICK计算公式如下：QUICKI＝1/(Log(FINS)+Log(FPG))。QUICK的统计见图6。

开始给药时小鼠体重及给药结束后小鼠体重如下表所示：

组别	初始体重(g)	给药结束体重(g)
			正常组	21.0±1.4	27.6±1.1
高脂模型组	21.4±1.3	37.3±3.3
			罗格列酮组	20.9±1.0	34.1±1.8
tPep-VEGF-B组	21.1±1.2	29.3±3.4
			VEBF-B	21.0±0.9	33.0±3.0

在治疗期间，正常组小鼠体重仅增加6.6g，高脂模型组体重增加15.9g，而罗格列酮给药组增加13.2g，tPep-VEGF给药组增加8.2g，VEGF-B给药组增加12.0g。从小鼠的体重变化上可以看出，tPep-VEGF-B和VEGF-B均能显著降低肥胖小鼠体重，且tPep-VEGF-B的效果显著优于VEGF-B。

给药结束后QUICKI指数如下表所示：

组别	正常组	高脂模型组	罗格列酮组	tPep-VEGF-B组	VEGF-B组
						QUICKI	1.20±0.41	0.79±0.13	3.26±0.48	2.06±0.51	1.42±0.23

从QUICKI指数可以看出，tPep-VEGF-B和VEGF-B均能显著改善胰岛素抵抗，其中tPep-VEGF-B的QUICK指数比VEGF-B更高，说明tPep-VEGF-B改善胰岛素抵抗的效果比VEGF-B更强，且具有显著性差异。

Claims (8)

1.一种融合蛋白，其特征在于，VEGF-B、接头肽和靶向肽利用肽键从N末端到C末端或C末端到N末端的顺序连接，其结构通式：

VEGF-B-接头肽-靶向肽或者靶向肽-接头肽-VEGF-B。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其中VEGF-B是由SEQIDNO.1或者SEQIDNO.2所示的序列，或其一部分，或由在所述氨基酸序列中的任何一个中一个或几个氨基酸被删除，添加和/或取代的氨基酸序列组成。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的接头肽中含有由式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，式中，n是1～10的整数，或式Pro-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n表示的氨基酸序列，式中，n是1～10的整数。

4.如权利要求1中所述融合蛋白，其特征在于其靶向肽由Ba表示，其中Ba中B表示5～20氨基酸的多肽序列，a表示1～5次基团B的重复。

5.如权利要求4中所述融合蛋白，其特征在于所述的Ba中B的氨基酸序列如下所示：

X1KGGRAKDX2

其中X1包含为天然氨基酸或非天然氨基酸的单个及多个氨基酸组合；

其中X2包含为天然氨基酸或非天然氨基酸的单个及多个氨基酸组合。

6.权利要求1中所述融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示。

7.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的VEGF-B在制备治疗胰岛素抵抗及其相关疾病药物中的应用。

8.一种药物组合物，含有权利要求1所述的融合蛋白及至少一种药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、增稠剂，并可被制备成如片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液或悬浮液的药剂类型。