CN105219739A

CN105219739A - 重组单纯疱疹病毒及它感染和制备它的宿主细胞以及它们的应用

Info

Publication number: CN105219739A
Application number: CN201510603370.9A
Authority: CN
Inventors: 于耕; 李劲风
Original assignee: BEIJING SOURCE OF GOD'S BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Wei Kang source Biotechnology Co. Ltd.
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种重组单纯疱疹病毒，包括单纯疱疹病毒载体和编码八因子的基因，该载体通过使单纯疱疹病毒缺失编码感染细胞多肽34.5和4的基因、以及可选择的缺失编码感染细胞多肽27的基因得到，所述基因插入到潜伏相关转录子编码区的启动子下游，和/或至少一处缺失了编码感染细胞多肽的基因处。还提供了制备和感染有如上病毒的宿主细胞、如上的病毒和宿主细胞在制备用于治疗血友病的药物中的应用。本发明编码八因子的基因能够稳定的表达，且作用效果好，治疗持续时间长，该重组单纯疱疹病毒可感染且不破坏已处于分化状态的骨骼肌细胞；作用时效较其他病毒载体长，可避免注射频率较高；并不整合到宿主细胞基因组上，更加安全。

Description

重组单纯疱疹病毒及它感染和制备它的宿主细胞以及它们的应用

技术领域

本发明涉及一种重组病毒、制备该重组病毒的宿主细胞，感染有该病毒的宿主细胞，以及所述重组病毒、制备该重组病毒的宿主细胞以及感染有该病毒的宿主细胞的应用。具体地说，本发明涉及一种重组单纯疱疹病毒、制备该重组单纯疱疹病毒的宿主细胞，感染有该重组单纯疱疹病毒的宿主细胞，以及所述重组单纯疱疹病毒、制备该重组单纯疱疹病毒的宿主细胞和感染有该重组单纯疱疹病毒的宿主细胞的应用。

背景技术

一、血友病概述

血友病(hemophilia)是一组性联隐性遗传的出血病。其临床上分为血友病A(凝血因子Ⅷ缺陷症)和血友病B(凝血因子Ⅸ缺陷症)两型，分别由凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变所致。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5000，血友病B的发病率约为1/25000；所有血友病男性患者中，血友病A约占80％～85％，血友病B约占15％～20％。女性血友病患者极其罕见。

临床上，血友病以关节、肌肉、内脏和深部组织自发性或轻微外伤后出血难止为特征。出血部位常见于负重的大关节(如膝、肘、踝、腕、髂、肩等)和肌肉软组织(腰方肌、上肢肌、下肢肌等)、内脏(如腹腔内、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等)、皮肤粘膜(如皮肤淤血、鼻出血、口腔出血、牙龈出血等)。致命性的出血有颅内出血、神经系统出血、咽喉部出血和无准备的创伤、手术出血等。

根据血友病人出血的严重程度和血浆中的FVIII活性/FIX活性的水平，血友病A分为重型(＜1％)、中型(1-5％)和轻型(5-40％)，出血的表现型与FVIII的缺陷程度有关。轻型的仅会在创伤或外科手术中血流不止，但是重型的会在创伤后频繁的或是自发的过度流血，尤其是关节或肌肉创伤。

目前，发达国家血友病患者基本能像正常人一样生活，而在我国，血友病患者仍处于致残率高、生活质量低、预期寿命短的状况中。

二、血友病的治疗

血友病的现代化治疗始于二十世纪七十年代，是随着血浆来源的FVIII浓缩液的工业技术发展而发展起来的。这类产品的普及使得患者可在家中进行治疗，这彻底改善了血友病的治疗，使得患者的生活质量和寿命有了显著的提升，然而，在十年后的二十世纪八十年代，大量的病人却死于血源性感染的HIV，且肝炎病毒可在血浆中传输，这使得寻找一个安全的血友病的治疗显得尤为重要。后来，纯化(冷沉淀、离子交换、凝胶渗透或单克隆抗体的免疫亲和色谱法)的实现和病毒灭活(溶剂洗涤、热治疗/巴氏消毒)或去除(超滤)技术提高了血源性八因子浓缩产品的安全性，在过去的25年间，肝炎或HIV病毒的血源性转移已不在发生。轻型的血友病患者可用DDAVP(1-去氨基-8-右旋-精氨酸加压素)输入治疗。DNA技术的快速发展，尤其是1984年FVIII基因的克隆，使得重组FVIII成为可能。在1989年发表了第一份两例使用重组FVIII产品的重症血友病患者的临床疗效。

A型血友病替代疗法最具挑战性的并发症是凝血因子抗体的抑制剂的出现，近25-30％的患者在治疗的前50天内受影响，抑制剂会使替代疗法失效，使病人无法达到安全有效的治疗水平，而且有提高发病率和死亡率的危险。而抑制剂的形成原因多种多样，如种族、MHC基因型、免疫应答基因的多态性等内因，及FVIII注射天数、首次注射FVIII年龄、FVIII浓缩产品的治疗方式等外因。必须使用绕道治疗(bypasstherapy)，也就是利用APCC(凝血素复合体浓缩液)或基因重组制造的活化第七因子(RecombinantActivatedFactorVII)，直接活化下游的凝血因子，促进凝血过程的开展。平时，为了减少抗体产生，应该避免使用产生抗体的凝血因子。不过，部分病人利用类似“减敏治疗”的作法，在长时间接触少量会发生抗体的凝血因子之后，不再产生任何抗体。当病人体内的抗体消失后，又可以利用补充凝血因子来治疗疾患，而不需要绕道治疗。

为了降低预防治疗注射的频率，现在实际上更专注于发展长效因子的产品，而实现这一目的的方法就是基因治疗，目前，已经通过融合载体蛋白(如IgG的Fc区)用基因工程的方法获得，根据I-II期的研究观察到FVIII产物半衰期延长，这可能使静脉注射量减少至50-100每年(标准是150-180)，目前人们对基因治疗的研究进展良好，以腺病毒为载体的基因治疗的潜在适用性在研究中，而在B型血友病中已有一例成功的报道。

但以腺病毒为载体的基因治疗被证明产生严重免疫事件的风险很高，目前在血友病的治疗中以腺相关病毒(AAV)载体为主要开发对象，不同研究团队开发的AAV载体持续表达时间不一，且AAV载体易被机体清除，使得FⅧ因子表达时间过短。

发明内容

本发明的第一个目的是为了克服上述缺陷，提供一种重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒包括单纯疱疹病毒载体和编码八因子的基因，所述单纯疱疹病毒载体是通过使单纯疱疹病毒缺失了编码感染细胞多肽34.5的基因和编码感染细胞多肽4的基因、以及可选择的缺失编码感染细胞多肽27的基因得到的，所述编码八因子的基因的插入位点包括插入在所述单纯疱疹病毒载体的潜伏相关转录子编码区(LAT区)，并且在LAT区的启动子下游，和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肽的基因处。该重组单纯疱疹病毒能够稳定持续的表达编码八因子的基因，作用效果好，且作用时间长，另外，该重组单纯疱疹病毒不会整合到宿主细胞基因组上，安全性较高。

优选的，所述单纯疱疹病毒分离自亚洲人种。

本发明的第二个目的是提供一种制备病毒的宿主细胞，所述病毒为以上所述的重组单纯疱疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因。

本发明的第三个目的是提供一种感染有病毒的宿主细胞，所述病毒为如上所述的重组单纯疱疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因。

本发明的第四个目的是提供如上所述的重组单纯疱疹病毒和/或如上所述的感染有病毒的宿主细胞在制备用于治疗和/或缓解血友病的药物中的应用。

本发明通过缺失单纯疱疹病毒编码感染细胞多肽34.5的基因和编码感染细胞多肽4的基因、以及可选择的缺失编码感染细胞多肽27的基因得到的，并在LAT区启动子的下游和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肽的基因处插入编码八因子的基因，实现了编码八因子的基因能够稳定的表达，且作用效果好，治疗持续时间长的目的，该重组单纯疱疹病毒可感染而且不破坏已经处于分化状态的骨骼肌细胞；作用时效较其他病毒载体长，可避免注射频率较高；并不整合到宿主细胞基因组上，因此更加安全。另外，在所述单纯疱疹病毒优选分离自亚洲人种的情况下，所制备的重组单纯疱疹病毒更适合亚洲人种的侵染和治疗。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒包括单纯疱疹病毒载体和编码八因子的基因，所述单纯疱疹病毒载体是通过使单纯疱疹病毒缺失了编码感染细胞多肽34.5的基因和编码感染细胞多肽4的基因、以及可选择的缺失编码感染细胞多肽27的基因得到的，所述编码八因子的基因的插入位点包括插入在所述单纯疱疹病毒载体的潜伏相关转录子编码区(LAT区)，并且在LAT区的启动子下游，和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肽的基因处。

根据本发明，所述编码ICP34.5的基因、编码ICP27的基因和编码ICP4的基因均为本领域技术人员所公知，并且也能够通过登录相关的数据库查到，例如，可以通过登录Genebank数据库查询到相关的核苷酸序列，这些均是本领域技术人员具有的常规技术手段，本发明在此不再赘述。

根据本发明，所述单纯疱疹病毒的LAT区被认为在HSV潜伏的建立、维持和激活过程中起重要作用。其具体的基因序列也为本领域技术人员所公知，并且也能够通过登录相关的数据库或相关的公开出版物查到，例如，可以通过登录Genebank数据库查询到相关的核苷酸序列，本发明在此也不再赘述。

本发明需要说明的是，术语“单纯疱疹病毒载体的LAT区”与术语“单纯疱疹病毒的LAT区”是等同的。

根据本发明，术语“八因子”也称为“凝血因子VIII”，其具体的氨基酸序列也能够通过登录相关的数据库或相关的公开出版物查到，本发明在此也不再赘述。

根据本发明，将ICP34.5基因和ICP4基因以及可选的ICP27基因敲除，同时在单纯疱疹病毒载体的LAT区和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肽的基因处插入所述编码八因子的基因能够有效实现本发明的目的，即，使目的基因稳定地表达，实现较好的作用效果以及较长的作用时间，并且本发明的发明人发现，同时删除编码ICP34.5的基因和编码ICP4的基因，能够获得更高的病毒载体目的产物的得率。

本发明的发明人发现，优选的，将所述目的基因插入到所述LAT区的启动子下游核苷酸的119499bp-122025bp处时，所述目的基因的表达效果能够得到进一步提高。其中，所述核苷酸的位置是以整个病毒的基因组5’端第1位核苷酸为起点为基准的。

根据本发明另一种优选的实施方式，所述编码八因子的基因的插入位点为所述单纯疱疹病毒载体的LAT区的启动子下游和至少一处缺失了所述编码感染细胞多肽的基因处。在这样优选的情况下，所制备的重组单纯疱疹病毒在感染宿主细胞后能够实现更好的作用效果。根据本发明，当所述编码八因子的基因插入到所述单纯疱疹病毒载体的LAT区的启动子下游时，所述编码八因子的基因可以不加启动子，而是直接利用LAT区的LAP1和LAP2启动子。

但为了保证能够有效地对编码八因子的基因进行独立地翻译，本发明的目的基因还优选包括启动子，起始密码子和终止密码子，在这样优选的情况下，在所述重组单纯疱疹病毒感染宿主细胞并进行自身基因的表达时，能够转录出独立的且完整的目的mRNA片段，从而能够有效且独立地对目的基因进行翻译。

所述启动子可以为本领域常规的各种启动子，优选选自CMV启动子、MMLV启动子和RSV启动子所组成的组中的强启动子。

所述编码八因子的基因还可以包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或其它荧光蛋白的基因)。所述编码八因子的基因还可以包括通常与转录序列相关的相关转录调控序列，例如聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。这些均为本领域技术人员所公知，本发明在此不再赘述。

根据本发明，以上编码ICP的基因的敲除可以采用本领域常规的各种方法，本发明对此并没有特别的限制，例如，通过同源重组的方式，通过定点敲除的方式。在了解了本发明的发明目的以及本发明使用的病毒载体的前提下，本领域技术人员根据其掌握的常规技术手段能够实现对所述编码ICP的基因的敲除。

另外，所述编码八因子的基因的插入也可以采用本领域常规的各种方法，所述插入的方式可以为直接在选定的插入位点插入所述目的基因，也可以通过同源重组的方式替换部分碱基序列从而插入所述目的基因，本发明优选后者。

优选的，所述编码八因子的基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。此处需要说明的是，根据如上的基因序列和密码子的偏好性所获得基因序列同属于本发明的保护范围。

单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus，HSV)呈球形，完整的单纯疱疹病毒由核心、衣壳、被膜(Tegument)和囊膜组成。该病毒的核心含有双链DNA，缠绕成纤丝卷轴。衣壳呈二十面体对称，直径为100纳米左右，由162个壳微粒组成。衣壳外由厚薄不匀的被膜覆盖。病毒最外层为典型的脂质双层囊膜。包括囊膜的病毒直径为150-200纳米。单纯疱疹病毒包括I型单纯疱疹病毒(HerpesSimplexVirusTypeI,HSV-1)以及II型单纯疱疹病毒。本发明的单纯疱疹病毒载体优选通过对I型单纯疱疹病毒进行基因改造获得。

根据本发明，所述I型单纯疱疹病毒优选分离自亚洲人种感染的I型单纯疱疹病毒，在该优选的情况下，本发明对亚洲人群更具有针对性。

第二方面，本发明提供了一种用于制备如上所述的重组单纯疱疹病毒的宿主细胞，其中，所述细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因。

重组单纯疱疹病毒与正常单纯疱疹病毒一样，也需要在宿主细胞内完成其生活史，因此所述重组病毒的传代增殖需要在宿主细胞中进行。所述宿主细胞可以是各种能够培养本发明病毒载体和/或重组病毒的宿主细胞，例如非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、仓鼠肾细胞(BHK细胞)、原代兔肾细胞、鸡胚细胞、羊膜细胞、人宫颈癌细胞(Hela细胞)以及人胚肺二倍体成纤维细胞(WI-38细胞)。

根据本发明，由于本发明提供的重组单纯疱疹病毒敲除掉了编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因，因此，在正常的宿主细胞中其不能够进行正常的繁殖。本发明通过将用于制备所述重组单纯疱疹病毒的细胞进行基因改造，使其宿主细胞能够表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因，从而能够为本发明的重组单纯疱疹病毒的繁殖提供必要的条件。

第三方面，本发明还提供了一种感染有病毒的宿主细胞，其中，所述病毒为本发明的重组单纯疱疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因和可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因。

所述宿主细胞的具体选择可以参照如上所列举的进行。

第四方面，本发明还提供了如上所述的重组单纯疱疹病毒、如上所述的用于制备病毒的宿主细胞和/或如上所述的感染有病毒的宿主细胞在制备用于治疗和/或缓解血友病的药物中的应用。优选的，所述血友病为A型血友病。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例和对比例中：

本发明的编码八因子的基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。

Vero细胞，用携带ICP4和/或ICP27编码基因的质粒转染Vero细胞，采用筛选抗生素G418筛选阳性克隆，扩增得到构建的宿主细胞。

实施例1

本实施例用于说明本发明重组单纯疱疹病毒的构建

按照申请号2004100064921，授权公告号CN1283803C的专利申请中记载的方法将野生型临床分离HSV-1病毒的ICP34.5基因和ICP4基因敲除，并在HSV-1载体的潜伏表达区(LAT区)启动子下游核苷酸119499bp-122025bp处插入携带CMV启动子的编码八因子的基因。在北京三博远志公司测序鉴定ENK基因正确插入到单纯疱疹病毒载体中。构建成功的病毒载体在能够表达ICP4基因的构建的Vero宿主细胞系上于37℃、5％CO₂下增殖，感染复数为0.1，收获后用0.65μm滤器去除细胞碎片，然后在13000rpm条件下高速离心纯化，得到的产品用于动物实验。

实施例2

本实施例用于说明本发明重组单纯疱疹病毒的构建

按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，敲除的基因为HSV-1病毒的ICP34.5、ICP27和ICP4基因。

实施例3

本实施例用于说明本发明重组单纯疱疹病毒的构建

按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，编码八因子的基因插入到的是HSV-1病毒的ICP34.5基因处。

实施例4

本实施例用于说明本发明重组单纯疱疹病毒的构建

按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，编码八因子的基因插入到的是HSV-1病毒的ICP4基因处。

对比例1

本对比例用于说明参比的重组单纯疱疹病毒的构建

按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，敲除的基因为HSV-1病毒的ICP4和ICP27，并且编码ENK的基因仅插入到ICP4基因处。

测试例

由于FVIII因子KO小鼠体内不存在任何凝血VIII因子，因此在FVIIIKO小鼠中可以很好的观察病毒载体对血友病A的生理改善情况，出血时间的变化是病理状态改善最直接的显示。

购买8-10周龄，20-24g的FVIII因子KO小鼠和正常小鼠。将54只FVIIIKO小鼠分为8组，每组6只FVIIIKO小鼠，另设6只正常小鼠做对照。试验小组分别是：第1组注射100μl的PBS，第2组注射100μl空白载体对照，第3-7组分别注射100μl的实施例1-4和对比例1所制备的重组单纯疱疹病毒，第8组不做任何处理。

在注射病毒30天时，通过小鼠剪尾测出血时间的方法检测注射病毒后FVIIIKO小鼠出血时间的变化。结果见表1

表1

组别	平均凝血时间(s)
		第1组(PBS)	1116
第2组(空白载体)	1152
		第3组(实施例1)	436
第4组(实施例2)	467
		第5组(实施例3)	587

第6组(实施例4)	553
		第7组(对比例1)	614
第8组(不注射任何物质)	1137
		第9组(正常大鼠)	196

由以上结果可以看出，相比于对比例1，本申请实施例1-4的重组病毒载体对小鼠凝血功能改善显著，此外，本申请实施例1的重组病毒载体对小鼠凝血功能改善最为显著。而PBS和空白载体对小鼠凝血功能基本没有改善。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒包括单纯疱疹病毒载体和编码八因子的基因，所述单纯疱疹病毒载体是通过使单纯疱疹病毒缺失编码感染细胞多肽34.5的基因和编码感染细胞多肽4的基因、以及可选择的缺失编码感染细胞多肽27的基因得到的，所述编码八因子的基因的插入位点包括插入在所述单纯疱疹病毒载体的潜伏相关转录子编码区，并且在所述编码区的启动子下游，和/或至少一处缺失了所述编码感染细胞多肽的基因处。

2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述编码八因子的基因还包括启动子、起始密码子和终止密码子。

3.根据权利要求2所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述启动子选自CMV启动子、MMLV启动子和RSV启动子所组成的组中。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述单纯疱疹病毒分离自亚洲人种。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述单纯疱疹病毒为I型单纯疱疹病毒。

6.一种用于制备权利要求1-5中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒的宿主细胞，所述细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因。

7.一种感染有病毒的宿主细胞，其特征在于，所述病毒为权利要求1-5中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因。

8.权利要求1-5中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒、权利要求6所述的用于制备病毒的宿主细胞和/或权利要求7所述的感染有病毒的宿主细胞在制备用于治疗和/或缓解血友病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述血友病为A型血友病。