CN105219659B - 一种蜜环菌的三叶草培养基的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蜜环菌的三叶草培养基的制备及其应用，该蜜环菌培养基包括将三叶草，葡萄糖，琼脂粉和蒸馏水。本发明生产蜜环菌的培养基原料来源广泛，简单易得、配制方便，安全性高，价格低廉，节约成本，另外，使用该培养基，蜜环菌生长增殖较快，将发酵时间有效缩短到10‑20天，且所生产的蜜环菌菌丝量多且粗壮，质量明显提高。

Description

一种蜜环菌的三叶草培养基的制备及其应用

技术领域

本发明属于菌种培养技术领域，具体是一种蜜环菌的三叶草培养基的制备及其应用。

背景技术

蜜环菌[Armillariella mellea]属于担子菌亚门、伞菌目，白菇科，蜜环菌属，是一种在夏、秋季发生，能兼性寄生于多种木本、草本植物的药食兼用真菌。据报道，蜜环菌中含有丰富的化学成分，如人体必需的8种氨基酸、微量元素、倍半萜类化合物、多糖、嘌呤类化合物等，其子实体有祛风活筋、强筋健骨、明目的功效，民间用于治疗癫痫、腰腿酸痛、佝偻病等。现代药理学研究证明，蜜环菌具有显著的镇静、抗炎、抗惊厥、免疫增强作用以及对脑、冠状和外周血管有一定扩张作用。除此之外，密环菌是兰科天麻属植物天麻的共生菌，为天麻生长提供必需的营养物质。天麻是传统的名贵中药，具有镇静、镇痛、抗惊厥、抗衰老、有助于记忆力，改善微循环及免疫功能等药理作用，近年来天麻的需求量日益增加。由于天麻主要依靠消化蜜环菌来摄取营养，所以蜜环菌菌丝体的大小、数量、粗壮程度将直接影响到天麻的产量和质量。

固态发酵是一种公知的蜜环菌培养方法，发酵的培养基多采用PDA培养基或者是在基础PDA培养基中加入碳源、氮源、微量元素、维生素等，但固态发酵的周期一般较长，所生产的密环菌品质参差不齐。故而，本发明针对如何提高密环菌固态发酵的效率及质量，对固态发酵的培养基进行了改进。

三叶草属车轴草属[Trifolium L.]一年生或多年生草本，全世界约有250种，我国目前栽培较多的为白三叶[Trifolium repens L.]、红三叶[T. pretense L.]、杂三叶[T. hybridum L.]和绛三叶[T. incarnatum L.]。其在园林绿化上具有极高的观赏价值。三叶草的主要活性成分有叶蛋白、异黄酮类化合物、绿原酸、挥发性物质等，叶蛋白又叫青草胶，属“功能性蛋白”，其营养成分十分丰富，蛋白含量45%~65%，其中可利用碳水化合物含量5%~20%，粗纤维含量0.5%~1.5%，脂肪7%~25%，灰分0.5%~1.5%，除此之外，叶蛋白还有18种氨基酸，且氨基酸组成比例较均衡，还含胡萝卜素、维生素E、维生素C、B族维生素等营养物质，营养价值可与鸡蛋、牛乳相媲美。故而三叶草是很好的牧草资源，常作为家禽、家畜的优质饲草作物。三叶草具有抗旱、耐寒, 适应性强等特性, 其根部有根瘤菌, 具有固氮作用，在我国广泛种植，故而取材来源极其广泛。与常用于培养基制备的土豆相比，土豆一年只能收获一次，而三叶草为多年生草本，其对土地的使用效率远高于土豆。同时，中国农业部已将土豆定位为中国第五大主粮，对土豆食用需求与日俱增，使用三叶草制备培养基能大量减少土豆的使用。另外三叶草本身具有一定的固氮作用，氮源含量远高于土豆，更利于真菌的生长。

三叶草中营养丰富，是否能代替常规所用的土豆，将其应用到固态培养基中，改善密环菌固态培养的缺陷，值得进一步进行探讨。

发明内容

本发明针对现有密环菌固体发酵所用培养基存在的局限性，提供了一种以三叶草代替PDA培养基中的马铃薯的新型固体培养基的制备及其应用。该培养基其原料简单易得、配制简单，培养时间大大缩短，同时提高密环菌菌丝体的质量。

本发明的目的在于提供三叶草水提取物在制备密环菌培养基中的用途。

所述水提取物通过包括如下步骤的方法制备得到的：称取适量的三叶草，加蒸馏水煮沸过滤，取滤液。本发明还提供一种密环菌培养基，其原料包括以下成分：三叶草水提取物，葡萄糖，琼脂粉，蒸馏水。

所述三叶草是车轴草属[Trifolium L.]一年生或多年生草本，白三叶[Trifolium repens L.]、红三叶[T. pretense L.]、杂三叶[T. hybridum L.]和绛三叶[T. incarnatum L.]的地上部分。

本发明的目的在于还提供一种新的固态蜜环菌菌种培养基的制备方法，具体包括以下步骤：

1、采集三叶草地上部分，去除杂质，120℃，30min杀青，在电热烘箱中50℃烘至恒重，得到干三叶草；

2、称取干三叶草20-100重量份，加蒸馏水1000体积份，煮沸10-50min，过滤，取滤液并加蒸馏水补足1000体积份，得到三叶草水提取物；

3、在三叶草水提取物中加无水葡萄糖0-80重量，琼脂粉10-40重量份，121℃灭菌30min，得蜜环菌的三叶草培养基。

本发明所述的重量份与体积份之间的关系是g/ml，即重量份的单位取g时，相应的体积份的单位是ml。

4、 优选的，干三叶草为60重量份，煮沸时间为10min，葡萄糖为20重量份，琼脂粉为20重量份。

5、更优选的，干三叶草为60g，煮沸时间为10min，葡萄糖为20g，琼脂粉为20g。

在本发明中，所用的三叶草中含有大量的氮源，蜜环菌对氮源的需求较高，三叶草内的氮源能够极大的促进蜜环菌的生长，三叶草中可溶性碳源有所欠缺，通过补加葡萄糖的方法增加碳源含量，同时三叶草中还含有各种可溶性的矿物质，能够为蜜环菌的生长提供不可或缺的营养成分。三叶草中含有抗氧化成分能够在一定程度上抑制菌索的老化。

优选地，上述密环菌培养基中，各原料的质量百分含量为：

三叶草 2.0~10.0%；

无水葡萄糖 0~8.0%；

琼脂 1.0%~4.0%；

蒸馏水 余量。

本发明还提供了上述培养基在培养蜜环菌菌株中的应用，所述蜜环菌为担子菌亚门、伞菌目，白菇科，蜜环菌属蜜环菌[Armillariella mellea]。

本发明还提供了一种培养蜜环菌的方法，使用上述蜜环菌的三叶草培养基，培养温度为28±2℃，培养时间为10天~20天。其他步骤按常规培养方法进行。

本发明还提供了用上述培养蜜环菌的方法培养好的培养物在制备天麻共生菌菌种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和积极效果（见图1， 图2）：

1、原料来源广泛，简单易得、配制方便，安全性高

本发明生产密环菌的培养基所用的原料为三叶草、葡萄糖、琼脂和蒸馏水，三叶草在我国各地均有种植，来源广泛，其余原料均为常规的食品原料，廉价、易得，不含其它添加剂，安全性高；另外配置方法操作方便，对人员和设备都没有特殊要求，使用很方便，易于推广。

2、蜜环菌生长繁殖较快、质量明显提高

使用本发明的培养基，蜜环菌生长增殖较快，将发酵时间有效缩短到10-20天，且所生产的蜜环菌菌丝菌丝量多且粗壮，质量明显提高。

3、培养基成本较低

本发明选用三叶草代替普通培养基中的土豆、大豆粉等粮食，节约粮食，同时三叶草廉价易得，成本大幅度降低，符合国家节能减排的要求。

综上，经本法制得蜜环菌培养基及其用途，至今为止，还没发现任何相关报道。

附图说明

图1 蜜环菌在三叶草培养基中的形态。

图2 蜜环菌在PDA中的形态。

图3培养基组成。

图4 不同培养基对蜜环菌生长的影响。

图5不同煮沸时间对蜜环菌生长的影响。

图6不同葡萄糖浓度对蜜环菌生长的影响。

具体实施方式

实施例1 三叶草培养基中三叶草含量对蜜环菌的生长影响

1、实验材料

菌种：蜜环菌(CFCC5898)Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm.购于中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）；

试剂：葡萄糖；琼脂粉；三叶草采于四川省成都市温江区；鲜土豆购于四川省成都市温江区；

2、实验方法

1）采集白三叶草地上部分，去除杂质。120℃，30min杀青，在电热烘箱中50℃烘至恒重，称出总干重。

1）称取干三叶草和鲜土豆，加蒸馏水1000ml，煮沸30min，过滤，取滤液加蒸馏水补足1000ml。

2）在三叶草水中加无水葡萄糖20g，琼脂粉20g。121℃,30min灭菌（见图3）。

3）灭菌完成后，将培养基置于超净台中紫外照射10min，待培养基冷却到不烫手时，将培养基倒入90mm的培养皿中，每皿大约15ml-20ml。

4）待培养基完全冷却后，用接种勺将斜面保存的蜜环菌菌种，转接到培养皿中。28℃培养10d后用游标卡尺量取菌索长、菌索粗。20d后收获菌丝体，烘干，称得干菌丝体重（见图4）。

3、实验结果

如图4所示，在三叶草使用量为60g/1000ml时，培养10d菌索生长情况最好，培养20d后，测得干菌丝重量，以三叶草用量100g/1000ml时，重量最大。而PDA中菌索生长情况，比最低浓度的三叶草培养基快，低于其他浓度的培养基。可见，三叶草使用量为40g时的培养基效果已经优于土豆用量为200g的PDA培养基效果。使用三叶草代替土豆，在缩短了蜜环菌的培养时间，显著提高蜜环菌质量的同时还大大节约了培养成本。

实施例2 三叶草不同水煎时间对蜜环菌生长的影响

1、实验材料

菌种：蜜环菌（CFCC5898）Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm.购于中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）；

试剂：葡萄糖；琼脂粉；三叶草采于四川省成都市温江区；鲜土豆购于四川省成都市温江区；

2、实验方法

1）采集白三叶草地上部分，去除杂质。120℃，30min杀青，在电热烘箱中50℃烘至恒重，称出总干重。

2）称取五组干三叶草各60g，分别加蒸馏水1000ml，煮沸，过滤，取滤液加蒸馏水补足1000ml。

煮沸时间分别为：10min、20min、30min、40min、50min

3）在三叶草水中加无水葡萄糖20g，琼脂粉20g。121℃，30min灭菌。

4）灭菌完成后，将培养基置于超净台中紫外照射10min，待培养基冷却到不烫手时，将培养基倒入90mm的培养皿中，每皿大约15ml-20ml。

5）待培养基完全冷却后，用接种勺将斜面保存的蜜环菌菌种，转接到培养皿中。28℃培养10d后用游标卡尺量取菌索长、菌索粗。20d后收获菌丝体，烘干，称得干菌丝体重。

3、实验结果（见图5）

如图5所示，三叶草水煎，煮沸时间在10min-50min之间，煮沸时间对蜜环菌的影响不大。

实施例3 不同葡萄糖添加量对蜜环菌生长的影响

1、实验材料

菌种：蜜环菌（CFCC5898）Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm.购于中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）；

试剂：葡萄糖；琼脂粉；三叶草采于四川省成都市温江区；鲜土豆购于四川省成都市温江区；

2、实验方法

1）采集白三叶草地上部分，去除杂质。120℃，30min杀青，在电热烘箱中50℃烘至恒重，称出总干重。

2）称取五组干三叶草各60g，分别加蒸馏水1000ml，煮沸，过滤，取滤液加蒸馏水补足1000ml。

3）在三叶草水中加葡萄糖分别为0g、20g、40g、60g、80g。分别再加入琼脂粉20g，121℃,30min灭菌。

4）灭菌完成后，将培养基置于超净台中紫外照射10min，待培养基冷却到不烫手时，将培养基倒入90mm的培养皿中，每皿大约15ml-20ml。

5）待培养基完全冷却后，用接种勺将斜面保存的蜜环菌菌种，转接到培养皿中。28℃培养10d后用游标卡尺量取菌索长、菌索粗。20d后收获菌丝体，烘干，称得干菌丝体重。

3、实验结果（见图6）

如图6所示葡萄糖浓度在20g/1000ml时，蜜环菌生长最旺盛，大于20g/1000ml时，蜜环菌生长受到抑制，在浓度为80g/1000ml时，蜜环菌无法生长，高糖抑制。

Claims (4)

1.一种蜜环菌的白三叶草培养基，其特征在于，所述培养基的制备方法为：（1）采集白三叶草地上部分，去除杂质，120℃，30min杀青，在电热烘箱中50℃烘至恒重，得到干白三叶草；（2）称取干白三叶草20-100重量份，加蒸馏水1000体积份，煮沸10-50min，过滤，取滤液加蒸馏水补足1000体积份，得到白三叶草水提取物；（3）在白三叶草水提取物中加无水葡萄糖0-60重量份，琼脂粉10-40重量份，121℃灭菌30min，得到蜜环菌的白三叶草培养基；所述的重量份为g时，体积份为ml。

2.根据权利要求1所述的蜜环菌的白三叶草培养基，其特征在于，干白三叶草的重量为60重量份，煮沸时间为10min，葡萄糖为20重量份，琼脂粉为20重量份 。

3.权利要求2所述的白三叶草培养基在培养蜜环菌中的应用。

4.一种培养蜜环菌的方法，其包括以下步骤：将权利要求2所述的白三叶草培养基置于培养皿中，加入蜜环菌进行培养，培养温度为28±2℃，培养时间为10天~20天。