CN105213448A - 一种抗心肌肥厚的中药制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗心肌肥厚的中药制剂,由以下重量份的成分组成:人参茎叶提取物78~98份、川芎提取物64~84份;优选为人参茎叶提取物88份、川芎提取物74份。所述的人参茎叶提取物和川芎提取物均采用醇提法进行提取。所述中药制剂其大鼠用的给药量为人参茎叶醇提取物78~98mg/kg/d、川芎醇提取物64~84mg/kg/d,优选为人参茎叶醇提取物88mg/kg/d、川芎醇提取物74mg/kg/d该中药制剂配方合理,无明显的急性毒性,可以有效地抗心肌肥厚。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗心肌肥厚的中药制剂及其制备方法,属于中药技术领域。
背景技术
心肌肥厚是一种产生较缓慢但较有效的代偿功能,主要发生在长期压力负荷过重的情况下,心肌总量增加,收缩力加强,使心脏得以维持正常的血循环,同时有相当的储备力。但这种代偿功能也有其不利之处,主要因为肥大的心肌需氧增加,而冠状动脉的供血量往往不能予以满足,造成心肌缺血,这将最后导致心肌收缩力的减退。心肌肥厚是心血管意外事件发生的独立危险因素,它比吸烟、高胆固醇血症等危害大。研究发现,随着左室肥厚的发生、发展,猝死、室性心律失常、心肌缺血、心力衰竭等心血管事件的发生率增加6~10倍。因此,积极治疗心肌肥厚,必将减少心血管事件的发生,以满足人类对长寿的渴望。心肌肥厚是心肌病、高血压、心肌梗死、瓣膜病等许多心血管疾病共有的病理过程,是对各种心血管刺激因子如血流动力学负荷、血管紧张素、生长因子以及激素等的适应性代偿反应,能降低室壁张力,维持甚至增加心排血量。但是,长期应激导致的持续性病理性心肌肥大可发展为心脏扩大、充血性心力衰竭和猝死。因此,心肌肥厚被认为是心血管疾病的独立危险因素和不良预后信号。
有临床研究表明,采用血管紧张素转换酶抑制剂或β-受体阻滞剂类药物防治慢性心衰,即使在治疗的早期,有些药物对血流动力学的改变不明显,但对心肌仍有长期的生物学效应。培哚普利(1mg.kg.d)治疗3个月,结果显示肥厚模型大鼠钙调神经磷酸酶活性及表达水平显著降低,表明ACEI类药物可逆转心肌肥厚,同时也部分抑制了钙调神经磷酸酶信号通路。美托洛尔、卡维地洛、比索洛尔都能有效地改善和部分逆转左室肥厚。内皮素受体拮抗剂及他汀类药物等,国内外均有动物试验及临床研究证实它们减缓或逆转心肌肥厚。从目前治疗治疗心肌肥厚的主要药物来看主要是化学合成药物,众所周知,化学药物在治疗疾病的同时还对人体的危害比较大,所以采用低毒性的药物来代替化学合成药物来抗心肌肥厚具有十分重要的意义。
申请号为200710038185.5的发明专利“玄参在制备防治心肌肥大、肥厚性心肌病和慢性心力衰竭药物中的应用”一文中公开了用其水提物或乙醇提取物可明显抑制三种模型动物心肌肥大,心室重构。申请号为200910045755.2的发明专利“钩藤提取物及其在制备降血脂及抗心肌肥厚药物中的用途”一文中公开了钩藤提取物具有抑制左心室肥厚的作用,可用于制备防治左心室肥厚药物,尤其是高血压引起的左心室肥厚。但是以上专利都是说明这种成分可以作为治疗心肌肥厚药物的一种成分,没有说明这种单一成分就能完全解决治疗心肌肥厚的问题。
申请号为200810043592.X的发明专利“鱼腥草素钠在制备防治心肌肥大和/或心室肥厚药物中的用途”一文中公开了鱼腥草素钠可降低模型动物左心指数和全心指数的增大,抑制体外心肌细胞的肥大,能降低血浆cAMP浓度、心肌组织AngII和ET-1含量、血清TNF-α和ALD含量,还可降低血压和减慢心率,有抗心肌肥大、心室肥厚作用。但是鱼腥草素钠也属于人工合成品。目前还没有一种天然中药制剂来解决心肌肥厚的问题。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种抗心肌肥厚的中药制剂及其制备方法,采用纯天然中药制剂,能够有效的解决心肌肥厚的问题。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种抗心肌肥厚的中药制剂,由以下重量份的成分组成:人参茎叶提取物78~98份和川芎提取物。
优选地,前述抗心肌肥厚的中药制剂,由以下重量份的成分组成:人参茎叶提取物88份和川芎提取物74份。
前述抗心肌肥厚的中药制剂中,所述的人参茎叶提取物中含总皂苷38~50%(超出上限效果更好),所述的川芎提取物中含总酚酸30.0~37%(超出上限效果更好)。
前述抗心肌肥厚的中药制剂中,所述的人参茎叶提取物和川芎提取物均采用醇提法进行提取。
前述抗心肌肥厚的中药制剂中,所述中药制剂其大鼠用的给药量为人参茎叶醇提取物78~98mg/kg/d和川芎醇提取物64~84mg/kg/d。
优选地,所述中药制剂其大鼠用的给药量为人参茎叶醇提取物88mg/kg/d和川芎醇提取物74mg/kg/d。
还公开了一种抗心肌肥厚的中药制剂的制备方法,包括如下步骤:分别从人参茎叶中提取总皂苷得到人参茎叶提取物,从川芎中提取总酚酸得到川芎提取物,然后将人参茎叶提取物、川芎提取物按照权利要求1所述的比例进行混合均匀,最后制成不同的剂型(所述中药制剂经过常规加工直接或间接加入药学上可接受的辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂)。
前述抗心肌肥厚的中药制剂的制备方法中,所述的从人参茎叶中提取总皂苷的具体方法为:取人参茎叶粗粉,加入70%乙醇76℃下热回流提取两次,所述70%乙醇的用量按照1kg人参茎叶粗粉加入10L70%乙醇的比例加入,每次4小时,粗滤,将得到的提取液进行合并、浓缩,回收乙醇,得浸膏,然后将浓缩得到浸膏用6~8倍水溶解,离心,取上清液,调整其密度在25℃时为1.08~1.1,再经D101大孔树脂吸附后,分别经9倍柱体积的水、9倍柱体积的30%乙醇、10倍柱体积的70%乙醇和5倍柱体积的95%乙醇依次梯度洗脱,最后收集70%乙醇洗脱液,于旋转蒸发器中浓缩至稠膏,回收乙醇,70~80℃烘干,即得。
前述抗心肌肥厚的中药制剂的制备方法中,所述的从川芎中提取总酚酸的具体方法为:取川芎粗粉,加入80%乙醇75℃下热回流提取3次,所述80%乙醇的用量按照1kg川芎粗粉加入8L80%乙醇的比例加入,每次3小时,第一次回流前浸泡13~17小时,趁热减压过滤,回收乙醇至无醇味,得川芎粗醇提取物;每千克粗提取物用500ml水充分溶解,上D101大孔树脂柱子,以15倍柱体积的蒸馏水流动洗脱,流速2~3ml/min,直至无茚三酮阳性反应和molish阳性反应;再以8倍柱体积的50%乙醇流动洗脱,流速2~3ml/min,将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并收集为Ⅰ段,第5个柱体积为Ⅱ段,将两段合并,最后以95%乙醇连续回流,充分溶解,趁热抽滤,清除残余的多糖杂质,减压浓缩,真空干燥,即得。
肥厚性心肌病可引起心前区疼痛,甚则胸痛彻背,和气短喘息不得卧为主的症状与中医学的胸痹心痛相类似。气虚血瘀是胸痹心痛的主要证型之一。它多因正气亏虚,进而导致气滞、瘀血痹阻心脉等引起,证见心痛如刺,痛有定处,胸闷气短,心悸乏力,舌淡、暗红有瘀斑、苔薄,脉细涩或结代,治法是补气活血。方用人参大补元气,为君药;川芎,活血行气,祛风止痛,为臣药。两药合用具有使正气充足,推动气血动行,去除气滞血瘀的病理产物,从而减轻气虚血瘀所导致的症候。
从现代医学的角度看,我们采用缩窄大鼠腹主动脉所致左心室肥厚模型进行实验的结果表明,人参茎叶醇提物的上述剂量具有明显的抗心肌肥厚作用,川芎醇提物的该一作用较弱,二者合用作用呈大致的相加,但前者应视为主药。从理论上看,单纯通过增加人参茎叶醇提物的量也可达到二药合用所产生的作用强度,但二药合用在保证产生较好作用的前提下可避免因为增加某一药物的量而可能出现的副作用,且二药用于搭配的量都接近最小有效量,因此上述配方是合理的。
本发明通过系统的药理实验得出:如以实验室提取的产物实验,人参茎叶提取物50mg/kg+川芎提取物80mg/kg可视为两药抗心肌肥厚的合理优选配方。其中,人参茎叶醇提取物应视为配方中的主药,其量应保证在50mg/kg左右。然后再以上述配方作为基础,继续进行中试试验,探索中试提取产物抗心肌肥厚合理优选配方为:人参茎叶醇提取物88mg/kg/d和川芎醇提取物74mg/kg/d。该配方未见明显急性毒性,可以有效的抗心肌肥厚。
附图说明
图1是本发明不同剂量实验室提取人参茎叶醇提取物对大鼠心肌肥厚模型左室肥厚指数LVHI(mg/g)的影响。
图2是本发明不同剂量实验室提取人参茎叶醇提取物对大鼠心肌肥厚模型LVW/RVW(右室重/左室重)的影响。
图3是本发明不同剂量实验室提取川芎醇提取物对大鼠LVHI的影响。
图4是本发明不同剂量实验室提取川芎醇提取物对大鼠LVW/RVW的影响。
图5是本发明实验室提取人参茎叶醇提取物及川芎醇提取物低于“最小有效量”组合对大鼠LVHI的影响。
图6是本发明实验室提取人参茎叶醇提取物及川芎醇提取物低于“最小有效量”组合对大鼠LVW/RVW的影响。
图7是本发明实验室提取人参茎叶提取物50mg/kg与川芎醇提取物按不同剂量比搭配对大鼠LVHI的影响。
图8是本发明实验室提取人参茎叶提取物50mg/kg与川芎醇提取物按不同剂量比搭配对大鼠LVW/RVW的影响。
图9是本发明从人参茎叶中提取总皂苷的工艺流程图。
图10是本发明从川芎中提取总酚酸的工艺流程图。
图11是本发明人参茎叶总皂苷标准曲线。
图12是本发明川芎总酚酸标准曲线。
图13是本发明中试提取产物各给药方案对模型大鼠LVHI的影响。
图14是本发明中试提取产物各给药方案对模型大鼠LVW/RVW的影响。
图15是本发明中试提取产物给药后各组大鼠心肌ANFmRNA表达的变化。
图16中试提取产物各给药方案对模型大鼠心肌细胞直径的影响。
图17中试提取产物各给药方案对模型大鼠心肌细胞直径的影响(H.E.染色,400×,照片)。
图中,*<0.05,**<0.01vs假手术组(Sham);#<0.05,##<0.01vs模型组(Model),△<0.05,△△<0.01vs人参50(T50);n=8;人参25(人25)、人参33(人33)、人参50、人参100分别为人参茎叶醇提取物25mg/kg、33mg/kg、50mg/kg、100mg/kg;C40(c40)、C53(c53)、C80(c80)分别为川芎醇提取物40mg/kg、53mg/kg、80mg/kg。T:人参茎叶醇提取物;C:川芎醇提取物;TC:人参茎叶醇提取物+川芎醇提取物。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。如果没有特殊说明,本发明所采用的仪器、试剂均可在市场中购买得到。
本发明通过以下具体实施方式实现。
一、两种有效成分的实验室提取及纯化
1、从人参茎叶中提取总皂苷得到人参茎叶提取物
取人参茎叶粗粉,按照1kg人参茎叶粗粉加入10L70%乙醇的比例,加入70%乙醇热回流提取两次,每次4小时,粗滤,将得到的提取液进行合并、浓缩,回收乙醇,得浸膏,然后将浓缩得到浸膏用6~8倍水溶解,离心,取清液,调整其密度为1.08~1.1,再经D101大孔树脂吸附后,分别经9倍柱体积的水、9倍柱体积的30%乙醇、10倍柱体积的70%乙醇和5倍柱体积的95%乙醇依次梯度洗脱,最后收集70%乙醇洗脱液,于旋转蒸发器中浓缩至稠膏,回收乙醇,70~80℃烘干,即得人参茎叶醇提取物。
2、从川芎中提取总酚酸得到川芎提取物
取川芎粗粉,按照1kg川芎粗粉加入8L80%乙醇的比例,加入80%乙醇热回流提取3次,每次3小时,第一次回流前浸泡过夜,趁热减压过滤,回收乙醇至无醇味,得川芎粗醇提取物;粗醇提取物加水充分分散,上D101大孔树脂柱子,以15倍柱体积的蒸馏水流动洗脱,流速2~3ml/min,直至无茚三酮阳性反应和molish阳性反应;再以5倍柱体积的50%乙醇流动洗脱,流速2~3ml/min,将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并收集为Ⅰ段,第5个柱体积为Ⅱ段,将两段合并,最后以无水乙醇连续回流,充分溶解,趁热抽滤,清除残余的多糖杂质,减压浓缩,真空干燥,即得川芎醇提取物。
上述有效成分提取的目的是为下一步在较大型设备中进行“中试”提取提供基础方法;提取物用于第一阶段药理实验,摸索二药组成抗心肌肥厚配方中的合适比例,为下一步用“中试”产物构建合理配方提供基础。
(二)利用实验室提取产物进行药理实验,找出两种产物混合治疗心肌肥厚时的合理配方
实验在贵州省遵义医学院基础药理重点实验室(省级)进行,以缩窄大鼠腹主动脉所致心肌肥厚为病理模型,判断心肌肥厚程度的指标为:心肌肥厚指数(左心室+间隔重/体重,LVHI),左心室重/右心室重(LVW/RVW)。
1.实验材料与方法
1.1实验药品
人参茎叶醇提取物(含总皂苷74.5%)由遵义医学院药学院提取
川芎醇提取物(含总酚酸37%)由医学院药学院提取
1.2实验动物
SD(Spragy-Dawley)雄性大鼠,体重180-220g,月龄2-3个月,由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供,清洁级。合格证号:SCXK(渝)2007-0005,由专用大鼠饲料喂养,每天给予12小时光照,室温22-25℃。
1.3实验方法
1.3.1大鼠左心室肥厚模型的制备
将大鼠分笼饲养,适应环境一周后,用BESN-Ⅱ四通道动物无创测压系统测量大鼠血压三次,将血压符合标准的大鼠随机分组,每组十只,并用苦味酸溶液标记。用4%的戊巴比妥钠以40mg/kg腹腔注射麻醉后,将大鼠仰卧位固定于小木板上,剪去腹部鼠毛,用碘伏消毒,于腹部正中剑突下作一长2~3cm的纵行切口,入腹腔后牵开腹部脏器以暴露术野,探寻腹主动脉在腹主动脉发出右肾动脉的分支点的上方约3mm处,分离出一小段腹主动脉,然后用4#缝合线将一根直径为0.8mm的钢丝和该段腹主动脉一起结扎,再迅速抽出钢丝,造成腹主动脉在结扎点处内径缩窄,即腹主动脉在结扎点处恢复再通的内径为所用钢丝的外径。依次还纳各脏器,缝合腹壁,术毕。肌肉注射苄星青霉素1ml(12万u/支)预防感染,待大鼠清醒后置鼠笼喂养,术后所有动物饮用自来水。
1.3.2实验动物分组及给药
本次研究实验分为两个阶段进行,第一阶段目的在于是找出人参茎叶提取物、川芎醇提取物各自的最小有效量。第二阶段根据第一阶段所得各单味药的最小有效量进行不同比例的搭配,找出两药的合理配方。灌胃给药25天,假手术组给予相应量的蒸馏水,溶媒假手术组及模型组给予等体积的1%的羧甲基纤维素钠溶液。具体分组如下:
第一阶段分组:
(1)第一次实验:
假手术组;模型组;三个给药组:人参茎叶醇提取物25mg/kg、人参茎叶醇提取物50mg/kg、人参茎叶醇提取物100mg/kg。
(2)第二次实验:假手术组;模型组;两个给药组:川芎醇提取物40mg/kg、川芎醇提取物80mg/kg。
第二阶段分组:
(1)第一次实验:假手术组;模型组;四个给药组:人参茎叶醇提取物25mg/kg;人参茎叶醇提取物25mg/kg+川芎醇提取物40mg/kg;人参茎叶醇提取物33mg/kg;人参茎叶醇提取物33mg/kg+川芎醇提取物53mg/kg。
(2)第二次实验:假手术组;模型组;溶媒组;三个给药组:人参茎叶醇提取物50mg/kg;人参茎叶醇提取物50mg/kg+川芎醇提取物40mg/kg;人参茎叶醇提取物50mg/kg+川芎醇提取物80mg/kg。
1.3.3大鼠体重变化的观察
自手术当天起,每5天称量大鼠体重一次,直到给药的最后一天,并记录其体重变化数据,并根据体重变化调整给药量。
1.3.4取材
给药最后一天,称取大鼠体重(BW)后以戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉,立即取其心脏,去除心房及大血管,用生理盐水洗净,用滤纸蘸干生理盐水,称量全心重量,分离右心室(RV)和左心室+室间隔(LVW),分别称重,并记录其数据,计算左心肥厚指数(LVHI,LVW/BW),左/右室重量比(LVW/RVW)。
1.4统计学处理
所有数据以mean±SD(x±s)表示,全部数据采用SPSS13.0软件进行ANOVA统计学处理,以P<0.05认为有差异,P<0.01认为有显著性差异。
2实验结果
2.1第一阶段第一次实验
由表1、图1和图2可知,模型组的LVW/RVW和LVHI均较假手术组明显增大(p<0.01),人参茎叶醇提取物各剂量组对LVHI均明显减轻(vs模型组P<0.05);但对LVW/RVW的影响,其在25mg/kg/d时作用不甚明显,而50mg/kg/d和100mg/kg/d均可显著降低LVW/RVW。
表1不同剂量人参茎叶醇提取物对大鼠LVHI(mg/g)和LVW/RVW的影响
*P<0.05,**P<0.01vs假手术组;#P<0.05,##P<0.01vs模型组,n=8
2.2第一阶段第二次实验
与上述实验相同,模型组的LVW/RVW和LVHI均较假手术组明显增大(P<0.01)。与模型组相比,川芎醇提取物80mg/kg组的LVHI明显降低(P<0.05),其他剂量组未见显著改变。对LVW/RVW的影响也有同样的趋势(表2、图3和图4)。
表2不同剂量川芎醇提取物对大鼠LVHI和LVW/RVW的影响
*P<0.05,**P<0.01vs假手术组;#P<0.05,##P<0.01vs模型组,n=8
2.3第二阶段第一次实验
根据第一阶段的实验结果可知,人参茎叶药醇提取物及川芎醇提取物的最小有效量分别为50mg/kg和80mg/kg左右。本次实验分别取二者最小有效量的1/2和1/3相加,观察期效果。结果表明,该两种方案均无明显抗心肌肥大效应(给药各组vs模型组P>0.05)(图5,图6)。
表3人参茎叶醇提取物及川芎醇提取物低于“最小有效量”组合对大鼠左室重/体重(LVHI)和左室重/右室重(LVW/RVW)的影响(x±s,n=8)
*P<0.05,**P<0.01vs假手术组,n=8
2.4第二阶段第二次实验
模型组的LVHI和LVW/RVW均模型高于假手术组(p<0.01),人参茎叶提取物50mg/kg使该二指标均低于模型组(P<0.05),两药的“最小有效量”联合给药使该二指标进一步降低(P<0.01),对LVHI的影响低于人参叶总皂苷单用(P<0.05),对LVW/RVW的影响也有同样的趋势。但人参茎叶提取物50mg/kg与川芎醇提取物“最小有效量”的1/2量联合给药并未优于人参叶总皂苷单用(表4、图7和图8)。
表4人参茎叶提取物50mg/kg与川芎醇提取物按不同剂量比搭配对大鼠LVHI和LVW/RVW的影响
*P<0.05,**P<0.01vs假手术组;#P<0.05,##P<0.01vs模型组,△P<0.05,△△P<0.01vs人参50,n=8
3结果分析
第一阶段的实验结果表明,人参茎叶醇提取物能呈剂量依赖性地抑制缩窄腹主动脉所致大鼠左心室肥厚。当其剂量为25mg/kg/d时效果虽不甚明显,但其剂量为50mg/kg/d时,该组LVHI和LVW/RVW两项指标均明显低于模型组,显示了很清晰的抗心肌肥厚作用,加大剂量至100mg/kg/d,其作用进一步加大;另方面,川芎提取物80mg/kg/d也能降低模型大鼠的LVHI,但二者对LVW/RVW则无统计学显著意义的抑制。上述结果表明,人参茎叶提取物50mg/kg/d可视为其抗心肌肥厚的“最小有效量”,而川芎提取物80mg/kg/d视为它们的接近“最小有效量”的剂量。其中,人参茎叶醇提取物应视为配方中的主药,其量应保证在50mg/kg左右。上述配方可作为探索中试提取产物抗心肌肥厚合理配方的基础。
三、两药有效成分按“中试”规模的提取和纯化
本工作在贵州省百灵制药有限公司技术中心进行,利用该中心的较大型设备(通常用于中试的设备),加大投药量,为将来可能投产提供有参考价值的工艺流程。
1.两药中试规模提取的给药流程
1.1分别从人参茎叶中提取总皂苷,从川芎中提取总酚酸,具体工艺流程见图9、图10。
2.两种中试提取物有效成分的纯化方法
2.1人参茎叶醇提取物中总皂苷的纯化方法(柱层析法)
层析柱有效面积:150×1000mm,填料:D101大孔树脂7.5L
样品:取人参茎叶醇提取物700g,用水溶解,500rpm离心5min,得上清液600ml,沉淀物共计141g(干燥物质)。
装柱参数:H树脂=54cm,V柱体积=4L,洗脱速度≈50mL/min。
柱层析情况:
装柱完毕后,先预处理D101大孔树脂的柱子:95%醇洗→5%盐酸洗至无醇味→水洗至中性→5%碱(氢氧化钠)冲洗→水冲至中性→上样。
纯化洗脱情况
梯度一:水9倍柱体积
梯度二:30%乙醇9倍柱体积
梯度三:70%乙醇10倍柱体积
梯度四:95%乙醇5倍柱体积
最后,缷柱,回收树脂。
结果:将70%乙醇液置于旋转蒸发器中浓缩,回收溶剂,烘干,得产物262.5g。
2.2川芎醇提取物中总酚酸的纯化方法(柱层析法)
层析柱有效体积:150×1000mm;填料:D101大孔树脂7L;
样品:川芎醇提取物1000.0g,用1000ml水溶解;
装柱参数:H树脂=54cm,柱体积=4L,洗脱速度≈60ml/min;
柱层析情况:
先预处理D101大孔树脂的柱子(同人参茎叶总皂苷中方法);
富集洗脱情况:
梯度一:水15倍柱体积(第14、15个柱体积时检验的确无茚三酮阳性和molish阳性反应)。
梯度二:50%乙醇8倍柱体积(将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并为Ⅰ,第5个柱体积为Ⅱ,第6~8个柱体积单独回收。经TLC(薄层色谱)检视,Ⅰ所得成分较多,Ⅱ点板显色情况较弱,6与Ⅱ相似点板显色更弱,第7-8各柱体积TLC检视几乎无结果)。
梯度三:95%乙醇冲洗至无色。
最后,下柱回收树脂。
将50%乙醇洗脱所得的Ⅰ、Ⅱ合并,置于旋转蒸发器中浓缩,加2~3倍无水乙醇回流2h,趁热抽滤,浓缩滤液,低温真空干燥即得样品156.4g。
三、两种中试提取产物有效成分含量的测定
3.1人参茎叶醇提取物中总皂苷含量的测定方法
对照品溶液配制:取人参皂苷Re对照品适量,精密称定→加甲醇制成1mg/mL的溶液,作为对照溶液。
标准曲线的制备:精密吸取对照品溶液20ul、40ul、80ul、120ul、160ul、200ul→分别置于具塞试管中→在低温下挥去溶剂→加入1%香草醛高氯酸试液0.5ml→置于60度恒温水浴中充分混合均匀后加热15min→立即用冰水冷却2min→加入77%硫酸溶液5ml→摇匀→以相应试剂作空白→照紫外分光光度法,在540mm波长处测定其吸光度→以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标回归方程为Y=19.009X-0.0503,R2=0.9972。结果表明:人参皂苷Re在0.003-0.03μg/ul范围内呈良好线关系,见表5和图11。
表5人参皂苷Re浓度与吸光度
测定法:取样品6份约49.5mg,精密称定→置于25ml量筒中→加入甲醇适量溶解并稀刻度,摇匀→精密量取50ul,照标准曲线制备项下的方法,自“置于具塞量筒中”起依法操作→测定吸光度,见表6,照标准曲线上读出样品液中人参皂苷Re的量,计算结果乘以0.84,即得。
表66份人参皂苷样品吸光度
3.2川芎醇提取物中总酚酸的测定
对照品溶液配制:精密称取AWS(川芎的主要单体)对照品2.35mg→置于25mL容量瓶中→加甲醇溶解并定容,即得0.094mg·mL-1AWS溶液。
供试品溶液配制:取6份川芎浸膏(13mg/份),精密称定→置于25mL容量瓶中→用少许甲醇超声溶解→定容至刻度,摇匀,作为样品液。
总酚酸标准曲线:精密吸取AWS对照品溶液(0.094mg/mL)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL→注入10mL容量瓶中→加甲醇至2mL→加0.3%十二烷基硫酸钠0.8mL,0.6%三氯化铁-0.9%铁氰化钾(体积比为1:0.9)的混合液0.4mL,混匀→在暗处放置5min,加0.1mol/L盐酸溶液至刻度,摇匀→放置暗处20min→以显色剂作空白,在734nm波长下测定其吸光度。以阿AWS量体积浓度为横坐标,吸光度为纵坐标作出标准曲线,得回归方程为Y=247.64X+0.02,R2=0.9937。结果表明:AWS在0.94-94μg/mL范围内呈良好线关系,见表7和图12,样品液吸光度见表8。
表7总酚酸浓度与吸光度
表86份样品液吸光度
四、以两种中试提取、浓缩产物构建合理的抗心肌肥厚配方
实验在贵州省遵义医学院基础药理重点实验室(省级)进行,以缩窄大鼠腹主动脉所致心肌肥厚为病理模型,判断心肌肥厚程度的指标为:左室肥厚指数(左心室+间隔重/体重,LVHI),左心室重/右心室重(LVW/RVW),心房利钠因子(ANF)mRNA表达,形态学观察(同时,进行心肌细胞直径测量)。
1.实验材料与方法
1.1实验药品、试剂和仪器
主要实验仪器:
实时荧光定量PCR仪美国BIO-RAD公司,型号:IcyclerIQ
1.2实验动物
SD(Spragy-Dawley)雄性大鼠,体重180-220g,由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供,清洁级。合格证号:SCXK(渝)2012-0005,由大鼠颗粒饲料喂养,室温22-25℃,每天给予12小时光照。
1.3实验方法
1.3.1大鼠左室肥厚模型的制备(见第二部分1.3.1)
1.3.2大鼠给药与分组
将造好模的雄性SD大鼠约80只(每只体重约180-220g),随机均分8组给药。为了在有效成分大致相等的情况下观察中试产物的作用,本次实验的给药剂量基本以上次用实验室产物实验的剂量为依据,按下列公式计算并略作调整:中试产物给药量=实验室产物剂量×实验室产物有效成分含量÷中试产物有效成分含量。它们的实际使用剂量是:人参茎叶醇提取物(含总皂苷42.2%)88mg/kg/d,川芎醇提取物(含总酚酸30.1%)74mg/kg/d。
分为以下几组:
①假手术组给溶媒
②模型组给溶媒
③人参茎叶醇提取物(T)组:人参茎叶醇提取物88mg/kg/d;
④川芎醇提取物(C)组:川芎醇提取物74mg/kg/d;
⑤人参茎叶醇提取物﹢川芎醇提取物(TC)组③+④
从手术后次日连续灌胃给药21天,因吴茱萸醇提取物需0.02%羧甲基纤维素钠溶解,故假手术组及模型组给予等体积的0.02%的羧甲基纤维素钠溶液。
1.3.3观察指标
1.3.3.1左室肥厚指数(左室重/体重,LVHI)和左室重/右室重(LVW/RVW)之比(见第二部分1.3.4)。
1.3.3.2心房利钠因子mRNA(ANFmRNA)表达
(1)主要试剂与溶液
DEPC,trizol液,氯仿,异丙醇,无水乙醇,RNA纯化试剂盒,逆转录反应体系试剂盒(TaKaRa生物工程公司),GREENPCRMasterMix试剂盒,MilliQA水,目的基因和内参基因前后引物混合液。
(2)RNA提取
①匀浆:取左室心肌组织约50~100mg,加入500ultrizol液,充分匀浆;
②卒取:上述匀浆中加入氯仿0.5ml,快速摇匀,离心12000g/min,4℃,15min,取上清液;
③沉淀:在上清液中加入等体积异丙醇,离心12000g/min,4℃,15min,弃去上清液;
④清洗:加入75%的乙醇500μl,离心12000g/min,4℃,5min,小心弃去乙醇;
⑤空干:滤纸上倒置数分钟;
⑥溶解:DEPC水100μl溶解得到粗提RNA。
(3)RNA纯化
①在粗提RNA的EP管内加入纯化试剂盒中RP350μl,同时加入75%乙醇250μl;
②上柱:将以上混合液吸入RNA纯化柱离心10000g/min,1min;
③冲洗:75%乙醇500ul加入柱内进行离心10000g/分,1min,重复1次。
④洗脱及收集纯化RNA液:把纯化柱移入新的EP管内,加入DEPC水100μl洗脱,离心,1min,10000g/min。盛于EP管内的100μl水溶液即纯化的RNA液待测样品。
(4)测定样品中RNA的纯度及浓度
自收集的RNA母液中取5μl加DEPC水495μl稀释(100倍)后,采用HD---2000紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度,重复3次,A260/A280比值在1.6-2.0范围内表示纯度较理想,并根据A260的值计算出RNA样品母液的浓度(RNA样品母液的浓度(μg/ml)=A260×40×稀释倍数),配制50ng/μl的RNA样品液体。
(5)逆转录
用50ng/ulRNA样品液体稀释40ul;混合体系组成如表11。
表9逆转录混合体系组成
反应总体积为40μl。
将逆转录体系EP管放入BIORADicycler仪器中进行逆转录,在控制面板上设置RT循环参数。见表12。
RT循环参数:
37℃15min
85℃5sec
表10扩增反应体系的组成
反应总体积为15μl。
1.3.3.3形态学与细胞直径测量
为进一步证实药物的作用,取假手术组、模型组和经组织病理学评价可能为合理配方组动物的左室标本,行HE染色、光镜观察心肌组织结构。(为节约原材料和时间,其余5组不作此项检查)。
①取心肌组织块,经10%多聚甲醛固定后,常规石蜡包埋切片,二甲苯脱蜡,过程如下:二甲苯5min→二甲苯5min→100%乙醇2min→95%乙醇lmin→80%乙醇lmin→75%乙醇lmin→蒸馏水洗2min;
②苏木素染色5min,自来水冲洗;
③)盐酸乙醇分化30秒,反复提插数次;④自来水浸泡15min;
⑤)置伊红液2min;
⑥)常规脱水,透明,封片:95%乙醇lmin→95%乙醇1min→100%乙醇lmin→100%乙醇lmin→二甲苯石碳酸(3:1)lmin→二甲苯lmin→二甲苯lmin→中性树脂封固;
⑦)光学显微镜观察。
1.3.4统计学处理
所有数据以mean±SD(x±s)表示,全部数据采用SPSS13.0软件进行ANOVA统计学处理,以P<0.05认为有差异,P<0.01认为有显著性差异。
2结果
2.1各给药方案对模型大鼠LVHI和LVW/RVW的影响
给药21天后可见,模型组的LVHI和LVW/RVW两指标均较假手术组显著升高(P﹤0.01);而人参茎叶醇提取物单用组的该两项指标较模型组有显著的降低(P﹤0.01);川芎醇提取物单独给药21天可降低造模所致LVHI的升高(P﹤0.05),对LVW/RVW也有降低的趋势;TC组较人参茎叶单用组还有进一步增效的趋势,应结合其他指标进一步判断(表11,图13和图14)。
表11各组大鼠给药后LVHI和LVW/RVW的影响
*P<0.05,**P<0.01vsSham;#P<0.05,##P<0.01vsModel
2.2各给药方案对模型大鼠ANFmRNA表达的影响
由表12和图15可见,在手术后21天,模型组心肌ANFmRNA表达为假手术组的7倍以上(P﹤0.01);与模型组比较,人参茎叶提取物组心肌ANFmRNA表达水平显著降低(P﹤0.01),川芎提取物两组ANFmRNA表达也呈下降趋势。
表12各给药方案对模型大鼠ANFmRNA表达的影响
2.3各给药方案对模型大鼠心肌细胞形态学及细胞直径的影响
见表13和图16,图17见,给药结束后,取各组大鼠左室心肌进行HE染色,并在光镜下观察和测量细胞直径,形态观察结果表明,模型组心肌细胞直径较假手术组明显变粗,而人参茎叶提取物单用组和二药混合给药组的心肌细胞直径得到模型改善。通过测量细胞直径的具体数据表明,模型组心肌细胞直径较假手术组在统计学上非常显著的增大(p﹤0.01);人参皂苷单用组和二药混合给药组心肌细胞直径却显著低于模型组(P﹤0.01),其中,两药全剂量混合给药的效果还明显优于人参茎叶提取物单用(P﹤0.05)。
表13各给药方案对模型大鼠心肌细胞直径的影响
*P﹤0.05,**P﹤0.01vsSham(假手术组),#P﹤0.05,##P﹤0.01vs模型组
3结果分析
本次实验目的在于观察中试提取产物的抗心肌肥厚效应,其给药量基本以采用实验室产物进行药理实验时的给药量(见第二部分)为依据,即按下式计算:中试产物给药量=实验室产物给药量×实验室产物有效成分含量÷中试产物有效成分含量,做了一定的微调。为了便于对二药效果的分析,本次实验还在原来只使用LVHI和LVW/RVW两评价指标的基础上增加了另外两项:ANFmRNA表达(心肌肥厚的标志)和心肌细胞直径的测量。同时,本次实验也以由上式推算出来的各提取物抗心肌肥厚的“最小有效量”(或接近此量的剂量)为“基本给药单位”,结果表明,在单用给药组中,人参茎叶醇提取物(含总皂苷42.2%)88mg/kg组抗心肌肥厚作用最显著、确切,其对四个评价指标均有显著的改善(p<0.05或p<0.01);其次为川芎醇提取物(含总酚酸30.1%)74mg/kg组,该组的两个评价指标有统计学显著降低;从而认为,该结果进一步证实人参茎叶醇提取物在配方中作为“主药”的地位。这与采用实验室产物实验的结果十分吻合,说明重复性较好。此次实验使用人参茎叶醇提取物(含总皂苷74.5%)50mg/kg也取得肯定而确切的抗心肌肥厚的疗效。如以纯的人参茎叶总皂苷计算,两次实验的纯皂苷量均约为37mg/kg,这应视为配方中的“核心”部分。
结论:在本项目条件下,抗心肌肥厚的配方:人参茎叶醇提取物(含总皂苷42.2%)88mg/kg/d+川芎醇提取物(含总酚酸30.1%)74mg/kg/d可以有效的治疗心肌肥厚。其中,人参茎叶醇提取物(含总皂苷42.2%)88mg/kg(相当于纯皂苷37mg)为配方的核心成分。
实施例1一种抗心肌肥厚的胶囊剂制备方法
(1)从人参茎叶中提取总皂苷:取人参茎叶粗粉,加入70%乙醇76℃下热回流提取两次,所述70%乙醇的用量按照1kg人参茎叶粗粉加入10L70%乙醇的比例加入,每次4小时,粗滤,将得到的提取液进行合并、浓缩,回收乙醇,得浸膏,然后将浓缩得到浸膏用6倍水溶解,离心,取清液,调整其密度在25℃时为1.08,再经D101大孔树脂吸附后,分别经9倍柱体积的水、9倍柱体积的30%乙醇、10倍柱体积的70%乙醇和5倍柱体积的95%乙醇依次梯度洗脱,最后收集70%乙醇洗脱液,于旋转蒸发器中浓缩至稠膏,回收乙醇,70~80℃烘干,即得人参茎叶提取物。
(2)从川芎中提取总酚酸:取川芎粗粉,加入80%乙醇75℃下热回流提取3次,所述80%乙醇的用量按照1kg川芎粗粉加入8L80%乙醇的比例加入,每次3小时,第一次回流前浸泡13小时,趁热减压过滤,回收乙醇至无醇味,得川芎粗醇提取物;每千克粗提取物用500ml水充分溶解,上D101大孔树脂柱子,以15倍柱体积的蒸馏水流动洗脱,流速2ml/min,直至无茚三酮阳性反应和molish阳性反应;再以8倍柱体积的50%乙醇流动洗脱,流速2~3ml/min,将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并收集为Ⅰ段,第5个柱体积为Ⅱ段,将两段合并,最后以95%乙醇连续回流,充分溶解,趁热抽滤,清除残余的多糖杂质,减压浓缩,真空干燥,即得川芎提取物。
(3)将步骤(1)和(2)得到的提取物按照以下重量份的成分比例进行混合:人参茎叶提取物78份和川芎提取物84份,得混合物。
(4)干燥:70℃,真空度-0.07MPa减压干燥6小时,粉碎,过65目筛。
(5)混合:将干膏粉加入淀粉混合均匀。
(6)制粒:95%乙醇湿法制粒,过24目筛。
(7)整粒:湿颗粒60℃干燥4h,用24目筛整粒。
(8)总混:颗粒在V型混合机中混合。
(9)胶囊填充:颗粒用0号胶囊灌装,装量0.4g/粒。胶囊壳应符合《中国药典》2010年版二部第1204页项下的要求。
(10)内包装:将检验合格的胶囊用口服固体药用高密度聚乙烯瓶包装,每瓶装32粒,口服固体药用高密度聚乙烯瓶应符合YBB00122002的规定。
(11)外包装、检验、入库。
实施例2一种抗心肌肥厚的颗粒剂的制备方法
(1)从人参茎叶中提取总皂苷:取人参茎叶粗粉,加入70%乙醇76℃下热回流提取两次,所述70%乙醇的用量按照1kg人参茎叶粗粉加入10L70%乙醇的比例加入,每次4小时,粗滤,将得到的提取液进行合并、浓缩,回收乙醇,得浸膏,然后将浓缩得到浸膏用7倍水溶解,离心,取清液,调整其密度在25℃时为1.09,再经D101大孔树脂吸附后,分别经9倍柱体积的水、9倍柱体积的30%乙醇、10倍柱体积的70%乙醇和5倍柱体积的95%乙醇依次梯度洗脱,最后收集70%乙醇洗脱液,于旋转蒸发器中浓缩至稠膏,回收乙醇,75℃烘干,即得人参茎叶提取物。
(2)从川芎中提取总酚酸:取川芎粗粉,加入80%乙醇75℃下热回流提取3次,所述80%乙醇的用量按照1kg川芎粗粉加入8L80%乙醇的比例加入,每次3小时,第一次回流前浸泡15小时,趁热减压过滤,回收乙醇至无醇味,得川芎粗醇提取物;每千克粗提取物用500ml水充分溶解,上D101大孔树脂柱子,以15倍柱体积的蒸馏水流动洗脱,流速3ml/min,直至无茚三酮阳性反应和molish阳性反应;再以8倍柱体积的50%乙醇流动洗脱,流速3ml/min,将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并收集为Ⅰ段,第5个柱体积为Ⅱ段,将两段合并,最后以95%乙醇连续回流,充分溶解,趁热抽滤,清除残余的多糖杂质,减压浓缩,真空干燥,即得川芎提取物。
(3)将步骤(1)和(2)得到的提取物按照以下重量份的成分比例进行混合:人参茎叶提取物88份和川芎提取物74份,得混合物。
(4)干燥:70℃,真空度-0.07MPa减压干燥6小时,过65目筛。
(5)粉碎,混合:加入适量可溶性淀粉,制粒。
(6)分装:袋装,10g/袋。
(7)外包装、检验、入库。
实施例3一种抗心肌肥厚的丸剂的制备方法
(1)从人参茎叶中提取总皂苷:取人参茎叶粗粉,加入70%乙醇76℃下热回流提取两次,所述70%乙醇的用量按照1kg人参茎叶粗粉加入10L70%乙醇的比例加入,每次4小时,粗滤,将得到的提取液进行合并、浓缩,回收乙醇,得浸膏,然后将浓缩得到浸膏用8倍水溶解,离心,取清液,调整其密度在25℃时为1.1,再经D101大孔树脂吸附后,分别经9倍柱体积的水、9倍柱体积的30%乙醇、10倍柱体积的70%乙醇和5倍柱体积的95%乙醇依次梯度洗脱,最后收集70%乙醇洗脱液,于旋转蒸发器中浓缩至稠膏,回收乙醇,80℃烘干,即得人参茎叶提取物。
(2)从川芎中提取总酚酸:取川芎粗粉,加入80%乙醇75℃下热回流提取3次,所述80%乙醇的用量按照1kg川芎粗粉加入8L80%乙醇的比例加入,每次3小时,第一次回流前浸泡13~17小时,趁热减压过滤,回收乙醇至无醇味,得川芎粗醇提取物;每千克粗提取物用500ml水充分溶解,上D101大孔树脂柱子,以15倍柱体积的蒸馏水流动洗脱,流速2ml/min,直至无茚三酮阳性反应和molish阳性反应;再以8倍柱体积的50%乙醇流动洗脱,流速2ml/min,将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并收集为Ⅰ段,第5个柱体积为Ⅱ段,将两段合并,最后以95%乙醇连续回流,充分溶解,趁热抽滤,清除残余的多糖杂质,减压浓缩,真空干燥,即得川芎提取物。
(3)将步骤(1)~(2)得到的提取物按照以下重量份的成分比例进行混合:人参茎叶提取物95份和川芎提取物72份,得混合物。
(4)将上述混合物添加甘露醇、乳糖进行混合,混合后物料倒入离心喷雾造粒机中,喷入95%乙醇溶液,制备得到丸子。
(5)将所得的丸子物进行干燥,筛分,得到所需粒径范围内的丸子。
(6)分装:袋装,10g/袋。
(7)外包装、检验、入库。
实施例4一种抗心肌肥厚的片剂的制备方法
(1)从人参茎叶中提取总皂苷:取人参茎叶粗粉,加入70%乙醇76℃下热回流提取两次,所述70%乙醇的用量按照1kg人参茎叶粗粉加入10L70%乙醇的比例加入,每次4小时,粗滤,将得到的提取液进行合并、浓缩,回收乙醇,得浸膏,然后将浓缩得到浸膏用7倍水溶解,离心,取清液,调整其密度在25℃时为1.1,再经D101大孔树脂吸附后,分别经9倍柱体积的水、9倍柱体积的30%乙醇、10倍柱体积的70%乙醇和5倍柱体积的95%乙醇依次梯度洗脱,最后收集70%乙醇洗脱液,于旋转蒸发器中浓缩至稠膏,回收乙醇,75℃烘干,即得人参茎叶提取物。
(2)从川芎中提取总酚酸:取川芎粗粉,加入80%乙醇75℃下热回流提取3次,所述80%乙醇的用量按照1kg川芎粗粉加入8L80%乙醇的比例加入,每次3小时,第一次回流前浸泡17小时,趁热减压过滤,回收乙醇至无醇味,得川芎粗醇提取物;每千克粗提取物用500ml水充分溶解,上D101大孔树脂柱子,以15倍柱体积的蒸馏水流动洗脱,流速2ml/min,直至无茚三酮阳性反应和molish阳性反应;再以8倍柱体积的50%乙醇流动洗脱,流速3ml/min,将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并收集为Ⅰ段,第5个柱体积为Ⅱ段,将两段合并,最后以95%乙醇连续回流,充分溶解,趁热抽滤,清除残余的多糖杂质,减压浓缩,真空干燥,即得川芎提取物。
(3)将步骤(1)~(2)得到的提取物按照以下重量份的成分比例进行混合:人参茎叶提取物90份和川芎提取物80份,得混合物。
(4)干燥:75℃,喷雾干燥6小时,过60目筛。
(5)粉碎,制片:加入适量硬脂酸镁,混匀,压制成片。
(6)包薄膜衣,即得。
Claims (9)
1.一种抗心肌肥厚的中药制剂,其特征在于,由以下重量份的成分组成:人参茎叶提取物78~98份和川芎提取物64~84份。
2.根据权利要求1所述的抗心肌肥厚的中药制剂,其特征在于,由以下重量份的成分组成:人参茎叶提取物88份和川芎提取物74份。
3.根据权利要求1或2所述的抗心肌肥厚的药物组合物,其特征在于,所述的人参茎叶提取物中含总皂苷38~50%,所述的川芎提取物中含总酚酸30.0~37%。
4.根据权利要求1或2所述的抗心肌肥厚的中药制剂,其特征在于,所述的人参茎叶提取物和川芎提取物均采用醇提法进行提取。
5.根据权利要求1所述的抗心肌肥厚的中药制剂,其特征在于,所述中药制剂其大鼠用的给药量为人参茎叶醇提取物78~98mg/kg/d和川芎醇提取物64~84mg/kg/d。
6.根据权利要求2所述的抗心肌肥厚的中药制剂,其特征在于,所述中药制剂其大鼠用的给药量为人参茎叶醇提取物88mg/kg/d和川芎醇提取物74mg/kg/d。
7.根据权利要求1~6任一项所述的抗心肌肥厚的中药制剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:分别从人参茎叶中提取总皂苷得到人参茎叶提取物,从川芎中提取总酚酸得到川芎提取物,然后将人参茎叶提取物、川芎提取物按照权利要求1所述的比例进行混合均匀,最后制成不同的剂型。
8.根据权利要求7所述的抗心肌肥厚的中药制剂的制备方法,其特征在于,所述的从人参茎叶中提取总皂苷的具体方法为:取人参茎叶粗粉,加入70%乙醇76℃下热回流提取两次,所述70%乙醇的用量按照1kg人参茎叶粗粉加入10L70%乙醇的比例加入,每次4小时,粗滤,将得到的提取液进行合并、浓缩,回收乙醇,得浸膏,然后将浓缩得到浸膏用6~8倍水溶解,离心,取上清液,调整其密度在25℃时为1.08~1.1,再经D101大孔树脂吸附后,分别经9倍柱体积的水、9倍柱体积的30%乙醇、10倍柱体积的70%乙醇和5倍柱体积的95%乙醇依次梯度洗脱,最后收集70%乙醇洗脱液,于旋转蒸发器中浓缩至稠膏,回收乙醇,70~80℃烘干,即得。
9.根据权利要求7所述的抗心肌肥厚的中药制剂的制备方法,其特征在于,所述的从川芎中提取总酚酸的具体方法为:取川芎粗粉,加入80%乙醇75℃下热回流提取3次,所述80%乙醇的用量按照1kg川芎粗粉加入8L80%乙醇的比例加入,每次3小时,第一次回流前浸泡13~17小时,趁热减压过滤,回收乙醇至无醇味,得川芎粗醇提取物;每千克粗提取物用500ml水充分溶解,上D101大孔树脂柱子,以15倍柱体积的蒸馏水流动洗脱,流速2~3ml/min,直至无茚三酮阳性反应和molish阳性反应;再以8倍柱体积的50%乙醇流动洗脱,流速2~3ml/min,将50%乙醇洗脱层前4个柱体积合并收集为Ⅰ段,第5个柱体积为Ⅱ段,将两段合并,最后以95%乙醇连续回流,充分溶解,趁热抽滤,清除残余的多糖杂质,减压浓缩,真空干燥,即得。
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URMILA ASWAR等: "Amelioration of cardiac hypertrophy induced by abdominal aortic banding in ferulic acid treated rats", 《BIOMEDICINE & AGING PATHOLOGY》 * |
吕昕瞳等: "人参总皂苷对血管紧张素II所致乳大鼠心肌细胞肥大的抑制作用", 《中国药理学与毒理学杂志》 * |
李文兰等: "大孔吸附树脂对川芎中阿魏酸及总酚酸的分离纯化", 《中国新药杂志》 * |
郭自强等: "川芎嗪对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大的影响", 《北京中医药大学学报》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN105213448B (zh) | 2019-05-24 |
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