CN105209899B - Maldi用试样调制方法以及试样调制装置 - Google Patents

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Abstract

在导电性载玻片上粘贴生物组织切片等样品(S1)后,通过真空蒸镀,形成覆盖样品的适当的基质(Matrix)物质膜层(S2)。该膜层中的基质物质的结晶非常细,均匀性也高。接着,将形成有基质膜层的载玻片置于气化溶剂气氛中,使溶剂浸润到基质膜层中(S3)。充分浸润的溶剂气化时,样品中的测定对象物质进入基质中而再结晶化。另外,通过真空蒸镀,在其表面再次形成基质膜层(S4)。追加的基质膜层会在MALDI时吸收激光的过剩能量,抑制测定对象物质的改性等,因此在具有高空间分辨率的同时可以实现高检测灵敏度。

Description

MALDI用试样调制方法以及试样调制装置
技术领域
本发明涉及用于调制使用了基质辅助激光解吸离子化(MALDI=Matrix AssistedLaser Desorption/Ionization)法的质谱分析试样的调制方法、以及根据该方法调制试样时使用的试样调制装置,更详细的,涉及适合质谱成像(MS Imaging)的试样调制方法以及试样调制装置。
背景技术
MALDI法,是为了分析难以吸收激光的试样或蛋白质等容易受激光损伤的试样,将容易吸收激光并且容易离子化的基质物质预先混合在测定对象试样中,通过向其照射激光而使试样离子化的方法。一般,将基质物质作为溶液添加到样品中,该基质溶液吸收样品所含的测定对象物质。然后,通过干燥将溶液中的溶剂气化,形成含有测定对象物质的结晶粒。向其照射激光的话,通过测定对象物质、基质物质以及激光的相互作用,可以使测定对象物质离子化。通过使用MALDI法,可以几乎无需离解而分析大分子量的高分子化合物,并且灵敏度高,也适宜微量分析,因此近年来被广泛运用于生命科学等领域。
MALDI用的基质物质,可以根据测定对象物质的种类、特性、离子极性等而适当选择,作为代表性的物质,可举出有1,4-二苯、1,8,9-三羟基蒽、2,4,6-三羟基苯乙酮、2,5-二羟基苯甲酸、2-(4-羟基苯基偶氮)苯甲酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基吡嗪-2-羧酸、3-羟基吡啶甲酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、反式-吲哚丙烯酸、2,6-二羟基苯乙酮、5-甲氧基水杨酸、5-氯水杨酸、9-蒽羧酸、吲哚乙酸、反式-3-二甲氧基-羟基肉桂酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸、1,4-二苯基丁二烯、3,4-二羟基肉桂酸、9-氨基吖啶等。
近年来,使用MALDI质谱装置、将生物组织切片上的生物分子和代谢物等的二维分布状况直接可视化的质谱成像法受到瞩目,也开发了所使用的装置(参照非专利文献1等)。质谱成像法中,在生物组织切片等试样上,可以得到表示出具有特定质荷比的离子的强度分布的二维图像。因此被期待应用于例如,通过调查癌等病理组织的特异物质的分布状况,掌握疾病的发展状况、确认用药等的治疗效果等的医疗领域、创药领域、生命科学领域等。另外,非专利文献1中,可以质谱成像的质谱装置也能同时进行显微观察,因此被称为显微质谱装置,但是本说明书中,为了明确是以质谱成像为目的的装置,因此称为成像质谱装置。
为了得到正确反映了质谱成像法中的目标物质分布状况的质谱成像图像,要求较高的空间分辨率。决定MALDI成像质谱装置中的空间分辨率的一个很大因素,是所调制的试样中的基质物质的粒径及其均匀性。质谱成像法中的以往一般的基质添加方法,是以喷墨方式向样品阵列状射出基质溶液的方法、以喷射等向样品喷涂基质溶液的方法等。但是,此种方法中,难以提高质谱成像的空间分辨率。其原因如下。
例如使用喷射向样品喷雾基质溶液的情况下,结晶粒会从其周围较大范围内吸收测定对象物质。其结果是,样品上的测定对象物质的位置信息会受损,某种物质的存在区域分界线变得不清晰。另一方面,使用喷墨方式向样品射出添加基质溶液的情况下,由于添加的基质溶液的测定部位(点)阵列状排列,因此该测定部位间的位置信息可以保证。但是,测定部位的大小依赖于基质溶液的液量,根据可射出的最少液量极限,样品上会扩展至数十~百μm程度的直径。因此,无法再进一步大幅减小测定部位,因此空间分辨率也由自身所决定。另外,此种问题点在专利文献1中也有指出。
此外,将经常用作基质物质的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)等以喷射喷雾时,结晶形状为针状,并且该针状结晶的长度不同。因此,离子化时,会因为结晶大小不同而产生样品上的测定对象物质的位置信息混乱,难以提升空间分辨率。
对于上述问题,专利文献1中提出了,作为现有的基质物质的替代,将金属氧化物构成的内核上覆盖有聚合物的微粒附着在样品上的试样调制方法,并列出了使用该方法对鼠的小脑切片进行质谱成像的结果。但是,此种试样调制方法中,调制顺序繁琐,由于无法使用廉价的现有基质物质,因此成本不可避免的增加。此外,如果是现有的基质物质,由于可离子化的成分种类等较为熟悉,因此可以根据测定对象物质等而选择适当的基质物质,但是上述新的试样调制方法的话,由于没有充分掌握哪些成分可以检测、哪些成分不可以检测,因此还存在难以使用的问题。
另一方面,作为使用现有的基质物质而实现较高的空间分辨率的试样调制方法,已知的有非专利文献2所述的方法。该方法中,为了进行蛋白质的质谱成像,在贴有样品的载玻片表面,通过真空蒸镀法形成基质膜层,然后,将该载玻片置于甲醇等溶剂气化后的气氛中,由此促进包含测定对象物质的基质物质的再结晶化。本申请的发明人的实验中也确认了,此种试样调制方法对于提升质谱成像的空间分辨率很有效。
但是,根据本申请的发明人的实验,非专利文献2所述的试样调制方法中,存在难以提高检测灵敏度的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特开2008-232842号公报
非专利文献
非专利文献1:小河洁,另5人,“显微质谱装置的开发”,岛津评论,株式会社岛津制作所,2006年3月31日发行,第62卷,第3·4号,p.125-135
非专利文献2:Junhai Yang,另1人,“Matrix Sublimation/Recrystallizationfor Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution”,Analytical Chemistry,2011年,83,pp.5728-5734
发明内容
本发明为解决上述课题而作,其目的是提供可以实现质谱成像时的高空间分辨率、并且检测灵敏度高、成本也可控制的MALDI用试样调制方法以及试样调制装置。
为解决上述课题而作的本发明所涉及的MALDI用试样调制方法的第1方式,是用于调制使用了基质辅助激光解吸离子化法的质谱分析试样的试样调制方法,实施步骤为:
a)基质层叠步骤,在真空气氛中使基质物质气化,使该基质物质层叠在载有测定对象样品的试样基板表面,
b)溶剂导入步骤,使形成在所述试样基板上的基质膜层表面与气体状或液体状的规定溶剂接触,使该溶剂浸润到所述基质膜层中,
c)基质再层叠步骤,在真空气氛中使基质物质气化,在所述溶剂已浸润状态下、或浸润溶剂已挥发状态下的所述基质膜层表面,再次层叠基质物质。
在这里,“作为测定对象的样品”指的是,想要通过MALDI离子化而实施质谱分析的对象物,特别是想要使用利用了MALDI的成像质谱装置进行质谱成像的对象物,例如,取自生物的薄切片的生物组织切片等。此外,“试样基板”指的是,例如导电性载玻片或不锈钢等金属制的板等。
此外,作为“基质物质”,可以使用以往一般的MALDI用试样调制方法所使用的现有的各种种类的基质物质。此外,作为“溶剂”,可以使用以往一般的MALDI用试样调制方法中调制基质溶液时使用的现有的各种种类的溶剂。这些基质物质以及溶剂,可根据样品所含的测定对象物质的种类等,由用户(测定操作人员)适当选择。
本发明涉及的第1方式的MALDI用试样调制方法中,将作为测定对象的样品置于试样基板表面后,在基质层叠步骤中,通过所谓的真空蒸镀,在试样基板表面层叠基质物质而形成覆盖样品的基质膜层。接着,在溶剂导入步骤中,使形成在试样基板上的基质膜层表面与气体状或液体状的规定溶剂接触,使该溶剂浸润到基质膜层中。然后,在该溶剂干燥前或干燥后,在之前形成的基质膜层表面,通过真空蒸镀,再层叠基质物质。
另外,即使在溶剂没有干燥状态下进行基质物质真空蒸镀的情况下,将试样基板置于真空气氛中的时点,浸润到基质膜层中的溶剂会急速挥发,被从基质膜层中除去。因此,即使在溶剂干燥前开始真空蒸镀,实质上也是在溶剂已干燥的状态下,在基质膜层上蒸镀新的基质物质。
通过真空蒸镀所形成的基质膜层中的基质物质结晶非常细,并且均匀性高。在浸润到此种基质膜层的溶剂气化过程中,基质物质的结晶吸收样品中的测定对象物质,再结晶化。基质再层叠步骤中,如此,在分散有测定对象物质的微细结晶的基质膜层表面,形成较薄的基质膜层。特别是蛋白质等来自生物试样的测定对象物质容易受到激光损伤,虽然与测定对象物质混杂的基质物质具有抑制激光损伤的作用,但由于其结晶非常微细,因此较之于较大的结晶,其作用变弱。
与此相对,本发明涉及的试样调制方法所调整的试样中,表面形成有不含测定对象物质的基质膜层,因此通过MALDI离子化时,其表面的基质膜层会适当吸收激光,抑制测定对象物质的损伤。其结果是,较之于溶剂润湿后不再层叠基质物质的情况,产生的离子量增加,可帮助提升检测灵敏度。
本发明涉及的第1方式的MALDI用试样调制方法中,例如,可以在溶剂导入步骤中,在充满了气化溶剂的容器内,放置形成有基质膜层的试样基板,由此使基质膜层表面与气化溶剂接触,将该状态维持规定时间,使溶剂浸润到基质膜层中。
此外,也可以在相同的溶剂导入步骤中,用喷射等向形成在试样基板上的基质膜层表面喷雾液体状溶剂,由此使该基质膜层表面与液体状的溶剂接触,使该溶剂浸润到基质膜层中。
前者的方法如后所述,可以使用同一个装置,连续进行基质层叠步骤以及基质再层叠步骤的处理,这一点很好。另一方面,该方法中溶剂浸润到基质膜层中需要时间,因此溶剂导入步骤处理需要花费时间。与此相对,后者的方法可以在短时间内向基质膜层表面供给更多的溶剂,因此可以用更短的时间使溶剂浸润到基质膜层中。
特别是作为溶剂导入步骤使用了前者方法的本发明涉及的MALDI用试样调制装置,具备有:
a)可密闭的容器,
b)将该容器内维持真空气氛的真空排气部,
c)将载有作为测定对象的样品的试样基板保持在所述容器内的试样保持部,
d)与该试样保持部所保持的试样基板的样品放置面相对配置,在所述容器内将基质物质加热并蒸镀在所述试样基板上的蒸镀源,
e)在所述真空排气部没有进行真空排气的状态下,向所述容器内导入气化溶剂的气化溶剂供给部,
可以在所述容器内通过所述试样保持部保持住试样基板的状态下,依次实施所述基质层叠步骤、所述溶剂导入步骤以及所述基质再层叠步骤。
本发明涉及的MALDI用试样调制装置中,实施基质层叠步骤、溶剂导入步骤以及基质再层叠步骤的各项作业也可以由用户手工操作进行,或者根据控制部预先设定好的程序,控制各部自动进行。
本发明涉及的MALDI用试样调制装置中,将载有样品的试样基板设置在通过真空排气部进行了真空排气的容器内部的话,可以无需在中途从该容器中取出试样基板而调制MALDI用试样。特别是如果上述各步骤的处理为自动进行的结构的话,测定操作人员无需在中途进行任何操作,因此省力的同时,也不会因为测定操作人员的技术、经验等而产生试样质量差异。
此外,为解决上述课题而作的本发明涉及的MALDI用试样调制方法的第2方式,是用于调制使用了基质辅助激光解吸离子化法的质谱分析试样的试样调制方法,实施的步骤是:
a)基质层叠步骤,在真空气氛中使基质物质气化,使该基质物质层叠在载有作为测定对象的样品的试样基板表面,
b)溶液导入步骤,向形成在所述试样基板上的基质膜层表面,喷雾浓度低于基质涂布法所使用的基质溶液的基质溶液,使该溶液浸润到基质膜层中。
在这里,溶液导入步骤所使用的基质溶液的浓度,低于一般的基质涂布法所使用的基质溶液的浓度。一般基质涂布法中使用的是基质的饱和溶液,但上述第2方式中,优选使用饱和溶液的1/2~1/5左右浓度的基质溶液。
该第2方式的MALDI用试样调制方法中,溶液导入步骤中将低浓度的基质溶液喷雾到试样基板上的基质膜层表面的话,该溶液浸润到基质膜层中,主要是溶液中的溶剂到达样品,在气化过程中,该基质膜层中的基质物质结晶吸收样品中的测定对象物质,再结晶化。另一方面,低浓度的基质溶液中所含的基质物质不会进入结晶较细的基质膜层中,因此残留在其表面附近。其结果是,与第1方式的试样调制方法相同,可以调制出在分散有测定对象物质的非常细的结晶基质膜层表面覆盖了较薄的基质膜状态的试样。由此,可以达成与第1方式的试样调制方法大致相同的作用·效果。
根据本发明涉及的MALDI用试样调制方法,在进行质谱成像时,可以调制出同时实现高空间分辨率和高检测灵敏度的试样。此外,本发明涉及的MALDI用试样调制方法中,用作基质物质的不是特殊物质,可以使用以往那样一般的试样调制方法中使用的各种基质物质。因此,容易获取且成本可控的同时,对于每种基质物质,都已掌握哪些成分可以检测或者哪些成分不可检测,因此对用户而言也具有便利性高的优点。
此外,根据本发明涉及的MALDI用试样调制装置,可以通过同一个装置调制MALDI用试样,省力的同时,可以稳定的调制出检测再现性高的试样。
附图说明
图1是显示本发明的第1实施例的MALDI用试样调制方法中的处理顺序流程图。
图2是显示本发明的第2实施例的MALDI用试样调制方法中的处理顺序流程图。
图3是显示本发明的第3实施例的MALDI用试样调制方法中的处理顺序流程图。
图4是本发明涉及的MALDI用试样调制方法所调制出的试样的截面概念图。
图5是用于实施第1实施例的MALDI用试样调制方法的试样调制装置的概略构成图。
图6是用于确认本发明效果的第1实验所使用的测定对象样品内的分析范围照片。
图7是第1实验中的分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱。
图8是第1实验中的分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱。
图9是第1实验中通过成像质谱装置得到的质谱成像图像的比较图。
图10是第1实验中m/z848.400~848.800范围的质谱放大图。
图11是显示图10所示的质荷比范围附近的质谱成像图像的图。
图12是显示第2实验中仅进行蒸镀的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图13是显示第2实验中蒸镀后仅喷射涂布溶剂的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图14是显示第2实验中蒸镀后喷射涂布低浓度基质溶液的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图15是显示第2实验中蒸镀后仅通过雾化器涂布溶剂的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图16是显示第2实验中蒸镀后通过雾化器涂布低浓度基质溶液的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图17是第2实验中的结果汇总图。
符号说明
1…导电性载玻片
2…试样
3,5…基质膜层
4…共晶区域
10…基座
11…真空室
12…第1阀门
13…真空泵
14…第2阀门
15…气化溶剂生成部
16…真空计
17…泄漏阀
18…试样台
18a…支持杆
18b…支持板
18c…开口
19…蒸镀源
20…基质物质
21…遮挡器
21a…支轴
21b…挡板
30…控制部
31…加热控制部
32…真空控制部
33…气体供给控制部
34…遮挡器驱动控制部
具体实施方式
以下说明本发明涉及的MALDI用试样调制方法的几个实施例。其中,调制通过成像质谱装置测定来自生物的组织切片的情况下的试样。
[第1实施例]
图1是显示本发明的第1实施例的MALDI用试样调制方法中的处理顺序的流程图,图4是调制出的试样的截面概念图。
首先,操作人员将测定对象之组织切片等薄膜状样品2放置在相当于本发明中的试样基板的导电性载玻片1上(步骤S1)。另外,除了导电性载玻片以外,作为试样基板,也可以使用不锈钢等的金属制的板。
接着,通过真空蒸镀法形成规定基质物质的膜层,覆盖住被置于该导电性载玻片1上的样品2整体(步骤S2)。作为基质物质,可以直接使用以往的MALDI用试样调制方法中一般使用的物质,例如DHB、CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)、9-AA(9-氨基吖啶)、或者除此以外的上述的各种物质。通过真空蒸镀,在样品2上形成非常细且致密结晶的基质膜层3(参照图4(a))。该基质膜层3的适当厚度为约0.5~1.5[μm]左右。
接着,将形成有基质膜层3的导电性载玻片1置于气化溶剂气氛中,将该状态保持规定时间。由此,如图4(b)所示,该溶剂从与气化溶剂接触的基质膜层3的表面慢慢浸润到基质膜层3中(步骤S3)。作为溶剂,可以使用以往的MALDI用试样调制方法中调制基质溶液时所使用的溶剂,例如甲醇等。
润湿基质膜层3中的溶剂到达样品2后气化的话,该样品中的测定对象物质(例如蛋白质、投入的药剂等)被吸入基质物质,再结晶化而形成共晶。图4(c)中,该共晶区域以符号4表示。在经过了此种溶剂润湿、形成了共晶区域4的基质膜层3的表面,通过真空蒸镀法,再次形成基质物质的膜层(步骤S4)。其结果是,如图4(d)所示,形成有共晶区域4的基质膜层3的表面被基质膜层5覆盖。该基质膜层5的恰当厚度为约0.5~1.5[μm]左右。由此,完成了MALDI用试样(步骤S5)。
步骤S2、S4中的基质膜层3、5的形成,典型的可以使用使基质物质加热气化、在对象物上成膜的真空蒸镀装置进行。此外,步骤S3中的对于基质膜层3的溶剂润湿,例如可以如下进行。即,在装有规定量溶剂的密闭容器内部,设置形成有基质膜层3的导电性载玻片1,架设在疏水性树脂构成的支持体上。疏水性的支持体,是为了不使溶剂渗入而直接与导电性载玻片1接触。一般溶剂具有挥发性,但使用例如水等比较难挥发的溶剂时,也可以适当加热溶剂或施加超声波振动而促进气化。由此,密闭容器内充满气化溶剂,通过将该气氛维持规定时间,可以使溶剂润湿到基质膜层3中。
另外,使用真空蒸镀装置形成基质膜层5时,之前工序中润湿到基质膜层3中的溶剂不一定要干燥。这是因为,步骤S4中为了进行真空蒸镀而将导电性载玻片1置于真空气氛中的话,基质膜层3中的溶剂会因此在极短时间内气化而被除去。
将如此调制出的试样通过成像质谱装置进行质谱分析,分析时,该试样具有以下特征。
如上所述,通过真空蒸镀形成的基质膜层3、5中的基质物质结晶非常细且均匀性高。此外,也没有出现喷射喷雾法向样品表面涂布DHB等时产生针状结晶的问题。为了离子化而向试样照射微小直径的激光时,存在于该照射部位的结晶会飞散,但由于结晶自身微细,因此不会出现该照射部位的周围飞散,因此,可以在保持样品2上的位置信息的状态下,测定对象物质被离子化。因此,随着激光的照射直径减小,可以提升相应的空间分辨率。
此外,特别是来自蛋白质等生物的物质,激光能量较大的话容易因此产生改性等损伤,这是因信号累积而重复照射多次激光时目标物质的离子发生量减少的一个原因。与此相对,如上调制的试样中,测定对象物质所分散的共晶区域4被基质膜层5覆盖,因此被激光照射时基质膜层5中的物质粒子会适当吸收激光,缓和给予到测定对象物质的能量。因此,测定对象物质难以产生改性等,较之于没有基质膜层5的情况,可以增加离子的发生量。其结果是,可以为质谱分析提供更大量的离子,实现较高的检测灵敏度。
[第2实施例]
图2显示的是本发明的第2实施例的MALDI用试样调制方法中的处理顺序流程图。与上述第1实施例的不同仅是步骤S3变更为步骤S13,除此以外的各步骤与第1实施例相同。
该第2实施例的MALDI用试样调制方法中,在形成于导电性载玻片1上的基质膜层3的表面,通过喷枪等的喷射,直接喷雾溶剂。由此,在基质膜层3的表面附着溶剂的微细液滴,该溶剂浸润到基质膜层3中(步骤S13)。
第1实施例的试样调制方法中,为了使基质膜层3充分润湿,需要花费例如数小时左右的时间,与此相对,该第2实施例的试样调制方法中,可以大大缩短相应的时间。但是,由操作人员自身进行溶剂喷雾的话,容易因操作人员的技术等而造成试样差异。
[第3实施例]
图3显示的是本发明的第3实施例的MALDI用试样调制方法中的处理顺序流程图。步骤S1、S2与上述第1实施例的试样调制方法完全相同,步骤S3以后的工序不同。
该第3实施例的MALDI用试样调制方法中,在导电性载玻片1上形成基质膜层3后,在该基质膜层3的表面,通过喷枪等的喷射,直接喷雾低浓度的基质溶液(步骤S23),之后使该溶液干燥,除去溶剂(步骤S24)。在这里,“低浓度”指的是,浓度低于以往一般的基质涂布法所使用的基质溶液的浓度,具体的,浓度为基质溶液饱和浓度的1/2~1/5左右较为适当。
涂布在真空蒸镀所形成的基质膜层3表面的基质溶液中的基质物质,是以基质膜层3中的微小且均匀性高的结晶为核而生长的,因此即使基质溶液自身的涂布均匀性不太良好,也容易生成均匀性高的结晶。因此,所涂布的基质溶液产生的基质物质结晶也微小且均匀性高。此外,基质溶液中的溶剂浸润到基质膜层3中,到达样品2,该样品中的测定对象物质与基质物质形成共晶,形成覆盖其的基质溶液中的基质物质的结晶膜层。因此,可以制成与图4(d)所示的第1、第2实施例的试样调制方法所调制的试样具有类似截面结构的试样。由此,该第3实施例的试样调制方法调制的试样,具有与第1、第2实施例的试样调制方法所调制的试样同样的效果和优点。
接着,说明用于上述第1实施例的试样调制方法的试样调制装置的一个实施例。图5是该实施例的试样调制装置的概略构成图。
该试样调制装置具备有基座10和可开关的真空室11,通过该基座10和真空室11,其内部构成为可以维持真空气氛的成膜室。基座10上,分别通过第1阀门12安装有真空泵13,通过第2阀门14安装有气化溶剂生成部15,还安装有用于测量成膜室内的真空度的真空计16和用于降低成膜室内的真空度的泄漏阀17。成膜室内设置有:放置导电性载玻片(或金属制板等)1的试样台18、装填有基质物质20的蒸镀源19、遮挡器21。
蒸镀源19,是通过在真空气氛下的成膜室内加热基质物质20而使其成粒子状向空间飞散。蒸镀源19有船型、篮型、坩埚型、线型等种类,可以根据使用的基质物质的形态、量、使蒸镀粒子飞散的方向等适当选择,图5的例中,使用的是船型。试样台18由水平配置的近中央处形成有开口18c的支持板18b、以及保持该支持板18b的支持杆18a构成。开口18c设置在蒸镀源19的基质物质20的正上方,导电性载玻片1置于支持板18b上,使得所粘贴的样品2向着下方、即与基质物质20相对。遮挡器21由支轴21a和挡板21b构成,通过以支轴21a为中心使挡板21b在规定角度范围内转动,将向着蒸镀源19上方、即向着导电性载玻片1前进的基质物质粒子遮蔽或使其通过。
该试样调制装置中的用于控制试样调制的控制部30包含有:加热控制部31、真空控制部32、气体供给控制部33、遮挡器驱动控制部34等的功能块。该控制部30可以通过含有例如CPU、ROM、RAM、计时器等的微型计算机等具体实现,例如在以CPU为中心实施根据存储在ROM中的控制程序、控制用参数进行的演算处理的过程中,进行上述功能块的控制操作。
对应图1中的各步骤,说明本实施例的试样调制装置自动调制试样时的操作。
操作人员将样品2置于导电性载玻片1上,如图5所示,置于试样台18的支持板18b上。此外,蒸镀源19上放置DHB等适当的基质物质,关闭真空室11,通过未图示的操作部下达开始指令。受到该指令,控制部30中,真空控制部32关闭第2阀门14以及泄漏阀17,启动真空泵13,通过第1阀门12将成膜室内真空排气。真空排气开始后,真空控制部32通过真空计16监控成膜室内的气压,当该实测气压达到了预先设定的目标气压的话,切换真空泵13的操作,使得实测气压维持在目标气压附近。
实测气压达到目标气压的话,加热控制部31如图5所示,在遮挡器21关闭的状态(挡板21b位于蒸镀源19上方的状态)下,开始蒸镀源19的加热。加热温度的控制可以通过调整流向蒸镀船的加热电流而进行。加热温度达到了预先设定的目标温度(基质物质20的升华温度,例如DHB为约130℃)的话,调整加热电流,使得加热温度维持在近乎一定。
加热温度达到目标温度后经过规定时间的话,遮挡器驱动控制部34打开遮挡器21。由此,从基质物质20升华的粒子到达导电性载玻片1,蒸镀开始。例如在经过了规定时间的蒸镀、层叠在导电性载玻片1上的基质膜层厚度达到规定厚度的话,遮挡器21被关闭,蒸镀源19的加热停止。另外,优选并非根据蒸镀时间判断蒸镀停止的时点,而是通过例如本申请人在专利申请2012-159296号(参照日本专利特开213-137294号公报)中提出的方法,监控基质膜层的厚度,根据该监控结果判断蒸镀停止的时点。
经过了从蒸镀停止到蒸镀源19的温度充分下降的时间后,真空控制部32停止真空泵13的同时关闭第1阀门12。另一方面,气体供给控制部33打开第2阀门14,向成膜室内供给气化溶剂生成部15中生成的气化溶剂。气化溶剂生成部15通过将溶剂适当加热或者向储存的溶剂施加超声波振动,生成气化溶剂。由此,成膜室内充满了气化溶剂,形成了基质膜层的导电性载玻片1被置于气化溶剂气氛中。通过维持规定时间(通常为数小时左右)的此种状态,溶剂浸润到基质膜层中。
经过了预先设定的规定时间的话,气体供给控制部33关闭第2阀门14,停止向成膜室供给气化溶剂。与此同时,真空控制部32再次启动真空泵13,同时打开第1阀门12,对成膜室内进行真空排气。然后,与第1次形成基质膜层时相同,当成膜室内的气压达到目标气压后开始蒸镀源19的加热,该加热温度达到目标温度、经过了规定时间后,打开遮挡器21,实施蒸镀。
然后,当判断为该第2次的基质膜层厚度达到了预先设定的规定厚度后,关闭遮挡器21,停止蒸镀源19的加热以及真空排气,所有工序结束。
当然,从如上所述的最初的真空排气时点到所有工序结束为止的一系列操作,除了全部自动进行以外,部分或所有作业和操作也可以由操作人员手工进行。具体而言,各阀门12、14、17等的开关、真空泵13的启动·停止、蒸镀源19的加热·停止、加热电流的调整、遮挡器21的开关等的部分或全部操作也可以由操作人员分别指示进行。虽然此种作业费事,但由于无需将粘贴了样品2的导电性载玻片1装入成膜室后再次取出即可进行试样调制,因此较之于在成膜室外侧进行基质膜层的溶剂浸润的情况,可以大幅减轻操作人员的负担。
接着,说明用于确认本发明涉及的MALDI用试样调制方法效果的实验方法以及结果。
[第1实验的方法以及结果]
该实验中,作为测定对象的样品为鼠小脑的10[μm]切片。图6是显示该样品内的分析范围的照片。此外,基质物质为DHB,使用的分析装置为岛津制作所制造的成像质谱装置,MALDI离子源的照射激光直径为5[μm],样品上的激光光斑的间距为10[μm],分析范围内的分析点数为250×250,质荷比范围为m/z400~1200。此外,试样调制方法尝试了上述第3实施例的方法(以下的说明以及图中称为“蒸镀+喷涂法”)、无喷射仅蒸镀的以往的方法(以下的说明以及图中称为“蒸镀法”)、以往的喷射喷雾法(以下的说明以及图中称为“喷涂法”)等三个。另外,蒸镀+喷涂法中的蒸镀时间为3分钟,蒸镀法中的蒸镀时间为12分钟。
图7是所有分析点(250×250点)中得到的质谱的平均质谱。此外,图8是仅显示了蒸镀+喷涂法以及蒸镀法的质谱图。从这些图可知,检测到的峰值数,喷涂法最多,蒸镀+喷涂法次之,蒸镀法最少。此外可知,仅蒸镀法的话检测到的峰值数较少,但通过与低浓度溶剂喷射组合,检测到的峰值数增加。
图9是显示通过成像质谱装置得到的具有特定质荷比的物质的二维分布的质谱成像图像比较图。喷涂法的情况下,m/z769.56下只能得到非常不清晰的图像,m/z760.58下变为无法反映样品上组织边界的图像。即,喷涂法下检测到的峰值数虽然较多,但质谱成像图像非常不清晰,不适于成像质谱分析。与此相对,蒸镀法以及蒸镀+喷涂法中,可以得到比喷涂法清晰得多的图像。
图10是m/z848.400~848.800的较窄质荷比范围的质谱。要注意,图10(a)的纵轴(信号强度轴)的刻度是图10(b)的10倍。例如观察m/z848.648的峰值强度,蒸镀+喷涂法是蒸镀法的约4倍。即,蒸镀+喷涂法显示出比蒸镀法高的灵敏度。图11是该质荷比范围附近的质谱成像图像。如上所述,由于蒸镀+喷涂法的信号检测灵敏度高于蒸镀法,因此质谱成像图像上该物质存在的像素强度值大,从其结果可以确认,可以清晰显示出该物质所存在的部位。
从以上结果可以确认,本发明的一个方法之蒸镀+喷涂法特别适合成像质谱分析,较之于单纯的蒸镀法,优点是检测到的峰值数多(即可以得到更多的成分信息),可以得到清晰的质谱成像图像,特别是由于灵敏度高,量少成分也可以得到清晰的质谱成像图像。
[第2实验的方法以及结果]
该第2实验中,作为测定对象的样品,使用了正常的老鼠肝脏的10[μm]切片。此外,该实验中,基质物质为CHCA,使用的分析装置为岛津制作所制造的成像质谱装置,MALDI离子源的照射激光直径为20[μm],样品上的激光光斑的间距为25[μm],分析范围内的分析点数为70×52,质荷比范围为m/z100~670。此外,对于置于导电性样品玻璃上的样品表面的基质物质蒸镀,使用岛津制作所株式会社制造的蒸镀装置,蒸镀条件为气压:10[Pa],蒸镀源温度:240℃,蒸镀时间:约4分钟。此时的气压,作为一般的蒸镀条件是非常低的真空度。另外,蒸镀时间实际上并非以时间来决定蒸镀停止的时点,而是以蒸镀膜层表面出现2条干涉条纹的时点停止蒸镀。其结果是,蒸镀时间为约4分钟。基质膜层的厚度为约0.6[μm]。
试样调制方法,除了第1实验中的“蒸镀法”,还尝试了以下4种方法。
(1)蒸镀基质物质后,用喷枪只喷射喷雾溶剂(75%乙醇,25%水)(以下称为“蒸镀+溶剂喷涂法”)。
(2)蒸镀基质物质后,用喷枪喷射喷雾低浓度基质溶液(上述溶剂中溶解10[mg/mL]浓度的CHCA)(以下称为“蒸镀+低浓度溶液喷涂法”)。
(3)蒸镀基质物质后,用雾化器只喷雾溶剂(75%乙醇,25%水)(以下称为“蒸镀+溶剂雾化器法”)。
(4)蒸镀基质物质后,用雾化器喷雾与(2)同样的低浓度基质溶液(以下称为“蒸镀+低浓度溶液雾化器法”)。
但是(3)、(4)中,雾化器喷雾重复进行10秒×10次(间隔10秒以上),以此实施间歇性的喷雾。如此使用雾化器的话,较之于喷枪喷雾,喷雾出的溶液液滴变得非常微细。
图12是显示实施了蒸镀法的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图13是显示实施了蒸镀+溶剂喷涂法的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图14是实施了蒸镀+低浓度溶液喷涂法的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图15是显示实施了蒸镀+溶剂雾化器法的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图16是显示实施了蒸镀+低浓度溶液雾化器法的情况下,涂布基质后的样品表面的显微观察图像(a)、分析范围内的所有分析点得到的质谱的平均质谱(b)、以及代表性的质谱成像图像(c)的图。
图12~图16中,(b)都是所有分析点(70×52点)中得到的质谱的平均质谱。此外,图12~图15中,(c)都是亚精胺(Spermidine)、精胺(Spermine)以及基质之CHCA(Adduction)等三个物质的质谱成像图像。
从这些图可知,在不进行溶剂或低浓度溶液喷雾的蒸镀法中,整体的检测灵敏度非常低,在质谱成像图像上,也几乎无法观测到通常推测分布在整个样品内的亚精胺、精胺。与此相对,特别是低浓度溶液喷射或使用雾化器喷雾的话,整体的检测灵敏度提升,检测到的峰值数也增加。此外可以确认,质谱成像图像上,相当于亚精胺、精胺的像素强度值变大,因此可以清晰显示出这些物质的存在部位。另外,使用了雾化器的溶剂喷雾中,检测灵敏度提升到了与低浓度溶液喷雾相同的程度,但使用了喷射的溶剂喷雾中,无法确认检测灵敏度的提升。可以推测,这不是因为喷枪和雾化器的喷雾方法的差异,而是喷雾出的液滴大小的影响较大。
图17是图12(b)~图16(b)所示质谱中显示出的亚精胺、精胺以及CHCA对应峰值的峰值面积、对于来自基质的峰值的强度比、与仅蒸镀情况下的强度比的实验结果汇总图。观察图17(b)可以确认,无论是溶剂喷雾还是低浓度溶液喷雾,通过使用雾化器进行喷雾,亚精胺、精胺的峰值强度比增大。这些物质是水溶性的聚胺类,对于这些水溶性的物质,可以得出结论,即使不喷雾基质溶液,只要喷雾与水混合的有机溶剂,就可以得到充分大的检测灵敏度改善效果。
此外,如上所述,即使喷射喷雾低浓度溶液,也可以提升聚胺类等物质的检测灵敏度,观察图17(c)很明显,来自基质的峰值强度的增大也很显著。因此,无论使用溶剂还是低浓度溶液,较为理想的不是大液滴,而是进行微细液滴的喷雾。
此外,第1实验中,在充分高的真空度(10-3[Pa]程度的气压)下进行蒸镀,与此相对,在该第2实验中,基质物质蒸镀时的真空度非常低。由此可知,只要适当控制基质膜层厚度的话,即使在低真空条件下实施基质物质蒸镀,也可以得到良好的分析结果。
另外,上述实施例均只是本发明的一例,在本发明主旨范围内的适当变形、追加、修正也包含于本申请的权利要求范围内。

Claims (5)

1.一种MALDI用试样调制方法,其是调制用于使用了基质辅助激光解吸离子化法的质谱分析的试样的试样调制方法,其特征在于,实施如下步骤:
a)基质层叠步骤,在真空气氛中使基质物质气化,使该基质物质层叠在载有作为测定对象的样品的试样基板表面;
b)溶剂导入步骤,使形成在所述试样基板上的基质膜层表面与气体状或液体状的规定溶剂接触,使该溶剂浸润到所述基质膜层中;
c)基质再层叠步骤,在真空气氛中使基质物质气化,再次使基质物质层叠在所述溶剂已浸润的状态的、或浸润溶剂已挥发的状态的所述基质膜层表面。
2.根据权利要求1所述的MALDI用试样调制方法,其特征在于,
所述溶剂导入步骤中,在充满了气化溶剂的容器内,将形成有基质膜层的试样基板放置规定时间,由此使该溶剂浸润到基质膜层中。
3.根据权利要求1所述的MALDI用试样调制方法,其特征在于,
所述溶剂导入步骤中,向形成在试样基板上的基质膜层表面喷雾溶剂,由此使该溶剂浸润到基质膜层中。
4.一种MALDI用试样调制装置,是用于权利要求2所述的MALDI用试样调制方法的试样调制装置,其特征在于,具备有:
a)可密闭的容器;
b)维持该容器内真空气氛的真空排气部;
c)将载有作为测定对象的样品的试样基板保持在所述容器内的试样保持部;
d)与该试样保持部所保持的试样基板的样品放置面相对配置,在所述容器内将基质物质加热并蒸镀在所述试样基板上的蒸镀源;
e)在所述真空排气部没有进行真空排气的状态下,向所述容器内导入气化溶剂的气化溶剂供给部,
所述MALDI用试样调制装置能够在所述容器内通过所述试样保持部保持住试样基板的状态下,依次实施所述基质层叠步骤、所述溶剂导入步骤以及所述基质再层叠步骤。
5.一种MALDI用试样调制方法,是调制用于使用了基质辅助激光解吸离子化法的质谱分析的试样的试样调制方法,其特征在于,实施如下步骤:
a)基质层叠步骤,在真空气氛中使基质物质气化,使该基质物质层叠在载有作为测定对象的样品的试样基板表面;
b)溶液导入步骤,向形成在所述试样基板上的基质膜层表面,喷雾为不饱和溶液的基质溶液,使该溶液浸润到基质膜层中。
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