CN105189729B - 用于组织处理以及由其制备细胞悬液的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供适用于生产活组织的可移植细胞悬液的方法和至少部分自动化设备以及由其产生的组合物，所述悬液适用于促进上皮相关手术中的组织再生。人的组织再生是极其有限的，并且构成了对受损器官功能修复的主要挑战。创伤治疗是需要组织再生的典型领域。哺乳动物组织的创伤(撕裂或开口)可导致组织破坏和创伤面处微血管系统的凝固。

Description

用于组织处理以及由其制备细胞悬液的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年3月14日提交的美国临时申请号 61/783,422和于2013年4月13日提交的澳大利亚申请号2013205148 的权益和优先权，所述申请的全部内容以引用的方式特此并入。
发明领域
本发明涉及一种至少部分自动化设备，以及其用于制备细胞悬 液，具体地为包含适用于组织再生的活上皮细胞的悬液的用途。
背景
人的组织再生是极其有限的，并且构成了对受损器官功能修复的 主要挑战。创伤治疗是需要组织再生的典型领域。哺乳动物组织的创 伤(撕裂或开口)可导致组织破坏和创伤面处微血管系统的凝固。所述 组织的修复代表对损伤的有序、受控的细胞应答。所有软组织创伤， 不论大小，均以类似方式愈合。组织的生长和修复机制为生物学系统， 其中细胞增殖和血管生成在氧梯度的存在下发生。在组织修复期间发 生的连续的形态和结构改变已经很详细地表征，并且在一些情况下经 过量化。参见Hunt,T.K.等人，“Coagulationand macrophage stimulation of angiogenesis and wound healing”，The surgicalwound，第1-18页， F.Dineen&G.Hildrick-Smith编(Lea&Febiger，Philadelphia:1981)。
各种器官如皮肤或心脏中的组织再生依赖于结缔组织恢复血液 供应并且使得残余的器官特异性细胞如角化细胞或肌肉细胞能够重 建器官完整性。因此，间充质细胞(例如，成纤维细胞，或另外，血 管系统的内皮细胞)的相关功能是分泌增强愈合过程的因子，例如， 促进新血管形成(血管生成)的因子或通过增殖和迁移角化细胞来促 进上皮再形成的因子。
创伤的细胞形态由三个不同区组成。中心无血管创伤空间是缺氧 的、酸中毒且高压的，并且具有高乳酸盐水平。邻近创伤空间(wound spate)的是局部缺血的梯度区，其由正在分裂的成纤维细胞构成。前 导区后面是通过成熟成纤维细胞和众多新形成的毛细血管(即新血管 形成)表征的活性胶原合成的区域。虽然新血管生长(血管生成)对创伤 组织的愈合是必要的，但是血管生成剂通常不能满足对提供组织修复 的额外生物合成效果的期待已久的需求。除了急性创伤(例如，由外 伤引起的灼伤或撕裂)之外，人工形成的创伤(例如，在移植体供区 (donor site)、美容适应症、整形手术或表皮治疗中)、慢性创伤(例如， 静脉或糖尿病性溃疡)以及其他适应症如疤痕重塑、无毛皮肤缺损损 伤、色素沉着问题、白癜风、白斑病以及美容再生手术也需要快速且 有效的治疗。尽管需要更快速的创伤愈合(例如，严重烧伤、手术切 口、撕裂以及其他外伤)，但是迄今为止，在使用药理学试剂加速创 伤愈合方面仅取得有限的成功。
常规创伤治疗的主要目标是实现创伤闭合。开放性皮肤创伤代表 一种主要的创伤类别。这种类别包括急性手术和外伤，例如慢性溃疡、 烧伤，以及慢性创伤如神经病性溃疡、压疮、动脉和静脉(郁积)或混 合动静脉溃疡，以及糖尿病性溃疡。开放性皮肤创伤通常通过包括六 个主要组成部分的过程愈合：i)炎症、ii)成纤维细胞增殖、iii)血管增 殖、iv)结缔组织合成、v)上皮形成，以及vi)创伤收缩。当这些组成 部分，不管个别地还是作为整体，不正确地起作用时，创伤愈合不良。 众多因素可能影响创伤愈合，包括营养不良、感染、药理学试剂(例 如，细胞毒性药物和皮质类固醇)、糖尿病和年龄大。参见CurrentSurgical Diagnosis&Treatment(Way；Appleton&Lange)中的Hunt等 人，第86-98页(1988)。
不易愈合的皮肤创伤可引起受试者相当大的身体、情感和社交痛 苦以及高昂的财务费用。参见，例如，Richey等人，Annals of Plastic Surgery 23(2):159-65(1989)。事实上，不能恰当愈合的创伤最终可能 需要积极的外科手术治疗，如自体皮肤移植(其中移植皮肤片)或培养 真皮移植。例如，培养上皮自体移植(CEA)手术从患者获取皮肤细胞， 以在实验室中使新的皮肤细胞生长成片。使用新片作为移植物。然而， 这些移植物的获取速率不尽如人意。参见，例如Sood等人，Journal of Burn Care Research 31(4):559-68(2010)。较新的移植手术为了更多的 支撑，将CEA与基质结合起来。例如，目前可用作培养或工程化真 皮的是具有其中掺入成纤维细胞的不同基质的产品，如
Figure BDA0000840551800000031
和
Figure BDA0000840551800000032
然而，这些产品在较大创伤中不能有效地诱导上皮 形成。掺入表皮细胞和成纤维细胞的培养/工程化的皮肤可作为
Figure BDA0000840551800000033
(NOVARTIS Pharma)和
Figure BDA0000840551800000034
(Bristol-Myers Squibb) 获得。然而，在培养的表皮层与真皮层之间的亲和力，以及在临床效 果获得不足方面仍存在问题。
存在对于改善的创伤愈合，并且更广泛地，组织再生技术的需要。 本发明提供一种适用于施用在各种受区上的自体细胞悬液，其可在不 考虑创伤的类型或组织，或患者群体的性质的情况下使用。还提供了 用于制备所述悬液的自动化设备及其使用。
发明概述
在一个方面，提供了一种用于细胞收获和移植的自动化系统。所 述系统包括：
用于处理组织的一次性匣子，其包括组织处理室、位于其中的破 碎器以及通过破碎器与组织处理室分开的细胞收集室，其中在将组织 处理室中的组织机械和/或化学地解离并且使解离组织通过破碎器之 后，将细胞悬液收集在细胞收集室中；
任选地，一次性施用装置，其直接或间接地与细胞收集室可移除 地流体连通并且能够从其中接收细胞悬液；以及
用于容纳匣子和施用装置并且用于提供动力以向组织供应机械 力和/或化学试剂的可重复使用的控制台，控制台包括致动机构，其 用于致动破碎构件，以便在放置于组织处理室中的组织上施加机械 力，从而将组织机械解离。
在一些实施方案中，匣子在使用前被密封在无菌包装中。破碎器 可为网格、筛、格栅、叶片、或其任何组合。在一些设计中，匣子还 包括可移除地放置在或铰接到组织处理室上用于接合致动机构的盖 子，其中盖子具有用于密封组织处理室的密封件。例如，密封件在面 向组织处理室的第一侧上可具有工作表面，其中当破碎构件被致动并 且放置在密封件的面向破碎构件的第二侧上时，工作表面与放置在组 织处理室中的组织接触。匣子还可包括锁定机构，其用于在盖子一放 置在组织处理室上即固定所述盖子，以使当系统在使用中时，盖子保 持被放置。
在各种实施方案中，匣子还包括用于提供酶溶液的第一封包和用 于提供缓冲溶液的第二封包，这两个封包均与组织处理室流体连通， 其中酶溶液破坏组织中的胞外基质，从而将组织化学解离，并且其中 缓冲溶液洗涤解离组织并且将细胞悬浮在细胞悬液中。例如，第一封 包可具有通过可破裂密封件分开的第一容器和第二容器，第一容器含 有无菌水，并且第二容器含有冻干酶粉，其中当密封件破裂时，冻干 酶粉遇到无菌水并且溶解于其中。所述第一容器或第二容器可为囊 袋、小瓶或注射器。为了将试剂递送至组织，控制台还可包括用于分 别驱动酶溶液和缓冲溶液离开第一封包和第二封包，进入组织处理室 的第一施压机构和第二施压机构。在一些实施方案中，第一封包还收 集使用后的废弃酶溶液，并且第二封包还收集使用后的废弃缓冲溶 液。所有废料也可收集在一个封包中。第一封包可与第一泵流体连通， 以用于泵送酶溶液和废弃酶溶液。第二封包也可与第二泵流体连通， 以用于泵送缓冲溶液和废弃缓冲溶液。在一些实施方案中，匣子还包 括泵，其用于从细胞收集室中抽取细胞悬液，并且随后在填充后，将 细胞悬液泵送到施用装置中，第三泵与细胞收集室和施用装置流体连 通。第一泵、第二泵和第三泵中的两个或所有可以是同一个泵。第一 泵、第二泵或第三泵可为蠕动泵、注射泵、或其他类型的泵，并且可 为一次性的或可重新使用的。在一些实施方案中，匣子还包括用于收 集废弃酶溶液的第一注射器和用于收集废弃缓冲溶液的第二注射器， 这两个注射器均与细胞收集室流体连通。匣子还可包括第三注射器， 其用于从细胞收集室中抽取细胞悬液，并且随后在填充后，将细胞悬 液泵送到施用装置中，第三注射器与细胞收集室和施用装置流体连 通。在某些实施方案中，匣子还包括用于酶溶液和缓冲溶液的受控计 量的流体检测器。作为囊袋的替代，匣子可包括分别用于提供酶溶液、 无菌水和冻干酶粉的三个容器。
在某些实施方案中，少量酶溶液可在孵育期间泵入和泵出腔室 (例如，以固定的间隔或频率)，以帮助搅拌酶溶液并加快组织处理/ 破碎。
在各种实施方案中，匣子还可包括至少一个用于提供外源试剂的 供应容器。供应容器可为用于提供缓冲溶液的同一个封包(例如，缓 冲溶液可包括外源试剂，或者在从封包中释放缓冲溶液之后被外源试 剂的溶液代替)。外源试剂可为例如，热激蛋白或其片段、透明质酸、 富含血小板的血浆、生长因子、脂肪干细胞、或前述的任何组合。
在某些实施方案中，匣子还包括位于破碎器与细胞收集室之间、 用于过滤经过处理的组织以移除大的聚集体的过滤器。过滤器可以可 选地或另外地位于细胞收集室与施用装置之间，用于过滤细胞悬液以 移除大的聚集体。
在一些实施方案中，匣子还包括用于在流体移动期间平衡压力的 机构，其可为抗微生物过滤器或孔型弯曲通道。
在希望或需要时，匣子的与生物材料接触的一个或多个部件可移 除地组装在其中，以使所述部件可从匣子中移除用于生物危害性处 置，从而允许回收利用匣子的其余部分。
施用装置可为系统的一部分或为独立设备。在运送至用于细胞移 植的无菌场所之前，施用装置的外表面可密封在无菌包装中。在一些 实施方案中，施用装置能够将其中的细胞悬液分配、喷涂或滴落到受 区(recipient site)或支撑件上。施用装置可为加压或弹簧加载的。施用 装置可具有用于细胞悬液的轴向施用的枢转头部。作为施用装置的替代或除其之外，系统可包括用于接收细胞悬液的支撑件或基底，其中 支撑件在接收细胞悬液之后用于移植或培养。支撑件可为基质、支架、 敷料、或其任何组合；支撑件可为固体、半固体、多孔或片段化的。
在各种实施方案中，破碎构件可为控制台的一部分(例如，连接 至致动机构)，或匣子的一部分(例如，位于组织处理室中且例如连接 至盖子)。破碎构件可为研杵或研磨机。在一些实施方案中，在使用 研杵的情况中，研杵可上下循环和/或旋转来促进组织处理。研杵还 可具有一个或多个翅片。
在一些实施方案中，控制台还包括以下中的一个或多个：用于将 匣子抽吸到控制台中和从控制台中喷射出的机构；防止匣子在处理期 间移除的联锁装置；用以控制处理时间、所需悬液体积以及组织处理 的启动的操作员界面；显示组织处理状态的显示板；以及当充满时用 于喷射施用装置的喷射机构。
在各种实施方案中，系统可包括用于指导控制台中的处理器或计 算机芯片以控制自动化过程的定制控制软件。系统也可连接至用于收 集和处理数据的外部计算机。
除了控制台之外，匣子还可具有用于提供能量(例如，热量)的机 构，以便向组织供应机械力和/或化学试剂。
在另一方面，用于细胞收获和移植的系统可包括：
用于处理组织的匣子，其包括组织处理室、位于其中的破碎器， 以及通过破碎器与组织处理室分开的细胞收集室，其中在将放置在组 织处理室中的组织机械和/或化学地解离并且使解离组织通过破碎器 之后，将细胞悬液收集在细胞收集室中；以及
用于容纳匣子并且用于提供动力以向组织供应机械力和/或化学 试剂的可编程控制台，其中控制台包括用于控制控制台以供应机械力 和/或化学试剂的处理器。
在某些实施方案中，在放置在匣子中之前，组织可为至少部分处 理的组织样品。例如，至少部分处理的组织样品已经经受用酶孵育, 以便破坏组织中的胞外基质，从而将组织化学解离。
在各种实施方案中，匣子还可包括用于提供包含化学试剂的溶液 的容器，其中化学试剂能够破坏组织中的胞外基质。相应地，控制台 还包括施压机构，其用于驱动溶液离开容器且进入组织处理室，从而 将其中的组织化学解离。
在一些实施方案中，匣子在使用之前可被密封在无菌包装中。匣 子还可包括可移除地放置在或铰接到组织处理室上用于接合致动机 构的盖子，其中盖子具有用于密封组织处理室的密封件。在一个实施 方案中，密封件在面向组织处理室的第一侧上具有工作表面，其中当 破碎构件被致动并且放置在密封件的面向破碎构件的第二侧上时，工 作表面与放置在组织处理室中的组织接触。在一些实施方案中，匣子 还包括锁定机构，其用于在盖子一放置在组织处理室上即固定盖子， 以使当系统在使用中时，盖子保持被放置。
在一些实施方案中，匣子还包括用于提供外源试剂的至少一个供 应容器，所述外源试剂可为热激蛋白或其片段、透明质酸、富含血小 板的血浆、生长因子、脂肪干细胞、或前述的任何组合。
在某些实施方案中，控制台还包括破碎构件以及用于其的致动机 构，其中当致动时，破碎构件与组织处理室接合并且在放置于其中的 组织上施加机械力，从而将组织机械解离。在一些实施方案中，匣子 还包括位于组织处理室中的破碎构件。破碎构件可为研棒或研磨机， 并且破碎器(在匣子中)可为网格、筛、格栅、叶片、或其任何组合。
作为破碎构件和致动机构的替代或除其之外，控制台还可包括用 于驱动放置在组织处理室中的磁体的移动的磁源，其中磁体的移动在 放置于其中的组织上施加机械力，从而将组织机械解离。
系统任选地还包括一次性施用装置，其直接或间接地与细胞收集 室可移除地流体连通并且能够从其中接收细胞悬液。施用装置能够将 其中的细胞悬液分配、喷涂或滴落到受区或支撑件上。作为施用装置 的替代或除其之外，系统可包括用于接收细胞悬液的支撑件，其中支 撑件在接收细胞悬液之后用于移植或培养。支撑件可为基质、支架、 敷料、或其任何组合，支撑件可为固体、半固体、多孔或片段化的。
系统还可包括位于破碎器与细胞收集室之间、用于过滤经过处理 的组织以移除大的聚集体的过滤器。过滤器也可位于细胞收集室后 面，用于过滤细胞悬液以移除大的聚集体。
在一些实施方案中，匣子的与生物材料接触的一个或多个部件可 以可移除地安装在其中，以使所述部件可从匣子中移除用于生物危害 性处置，从而允许回收利用匣子的其余部分。
在各种实施方案中，系统可包括用于指导控制台中的处理器或计 算机芯片以控制自动化过程的定制控制软件。系统也可连接至用于收 集和处理数据的外部计算机。
除了控制台之外，匣子还可具有用于提供动力(例如，热量)的机 构，以便向组织供应机械力和/或化学试剂。
还提供了使用本文描述的系统进行细胞收获和移植的方法。所述 方法可包括：
将组织放置在组织处理室中；
指导控制台以致动破碎构件；以及
撷取其中具有细胞悬液的施用装置。
在一些实施方案中，所述方法包括：
将组织放置在组织处理室中；
指导控制台中的处理器，以便向组织供应机械力和/或化学试剂； 以及
撷取细胞悬液。
在各种实施方案中，在以上细胞收获和移植的方法中，组织已经 经受用酶孵育，以便破坏组织中的胞外基质，从而将组织化学解离。
由以下描述，本发明的其他方面和优点将对本领域技术人员变得 显而易见。
详述
本领域技术人员将了解，本文所述的本发明适于进行除明确描述 的那些以外的变化和修改。应理解，本发明包括所有所述变化和修改。 本发明也包括说明书中个别或共同提及或指示的所有步骤、特征、组 合物和化合物以及步骤或特征的任何和所有组合或步骤或特征中的 任何两个或更多个。
本发明在范围上不受限于本文所述的具体实施方案，所述实施方 案仅意图用于例示性目的。功能等效的产物、组合物和在适当时的方 法明确在如本文所述的本发明的范围内。
贯穿本说明书和以下的权利要求书，除非上下文另有要求，否则 词语“包含(comprise)”或如“包含(comprises)”或“包括(comprising)”的 变型将理解为暗示包括所陈述的整体或整体的组，但不排除任何其他 整体或整体的组。
鉴于上文，本发明提供一种适用于生产活组织的细胞悬液的独特 方法和设备，所述细胞悬液适用于施用至处于上皮相关手术中的患 者。在应用该方法和/或在使用该设备时，从患者收获供体组织(例如， 皮肤上皮，如无毛上皮、呼吸道上皮、血管上皮、角膜上皮和腺上皮) 并使其经受组织解离手段，并且收集适用于施用回同一患者的受区的 细胞。在一些实施方案中，如此收集的细胞在施用至受区之前可在体 外培养和扩增。也可将细胞接种至支架或基质，细胞可在其中生长和 /或增殖为人造组织或器官。
细胞可以在溶液中的细胞悬液(在本文中与“细胞悬浮液(cellularsuspension)”互换使用)的形式存在，所述悬液适于立即分散(例如，在 不进行细胞的体外培养的情况下在收获和/或过滤之后立即)在受区 上。细胞悬液可单独分散(在收获之后或在体外培养之后立即)至受 区，或与一种或多种另外因子(如热激蛋白、透明质酸、富含血小板 的血浆、生长因子、和/或脂肪干细胞)结合分散以促进，例如，创伤 愈合、皮肤表面重修(skin re-surfacing)、或其他上皮治疗。细胞悬液 可通过喷涂、滴落或任何其他施用方法分散。细胞悬液也可直接注射 到组织中。
本发明的方面包括用于细胞收获和移植的系统，其可包括：用于 处理组织的匣子，其包括组织处理室、位于其中的破碎器，以及通过 破碎器与组织处理室分开的细胞收集室，其中在将放置在组织处理室 中的组织机械和/或化学地解离并且使解离组织通过破碎器之后，将 细胞悬液收集在细胞收集室中；以及用于容纳匣子并且用于提供动力 以向组织供应机械力和/或化学试剂的可编程控制台，其中控制台包 括用于控制控制台以供应机械力和/或化学试剂的处理器。
在一些实施方案中，本发明的系统可为ReCell Next Generation (NG)产品系统。该系统可包括可重复使用的控制台、一次性匣子(在 本文中与“盒子”互换使用)以及任选地一次性施用装置。施用装置在 使用前可驻留于匣子中。具有施用装置的匣子可为一次性无菌包装 的。匣子承载组织处理室以及治疗和处理皮肤样品所需的材料(流体 和或固体)。匣子和施用装置为无源设备，其受到控制台的机械作用 (在匣子插入其中之后)，以实现所需的机械组织加工和流体移动。所 有动力源和控制可位于控制台中。
在一些实施方案中，处理的基本功能是1)通过浸泡在加热的酶中 预处理皮肤样品，2)用缓冲液漂洗所述皮肤样品，3)在浸没在另外的 缓冲溶液中的同时机械研磨所述皮肤样品以解离所需细胞，4)将细胞 悬浮在缓冲液中，接着5)将产品悬液传送至施用装置，以使施用装置 可由操作员手动使用来将细胞悬液施用至患者的准备的创面床上。
组织处理可通过多种方法或方法的组合完成。在本文所述的实施 方案中，研磨过程涉及在向构件应用部分旋转运动的同时，通过特定 设计的构件(“研棒表面”)在皮肤样品上施加压缩和/或旋转力。流体处 理过程涉及在将酶溶液引入处理室之前使用无菌水自动重构酶粉末， 然后将酶移除至废料容器，随后在该过程的剩余部分期间将缓冲液或 其他溶液一次或多次引入腔室中。最后，将产品流体，即皮肤细胞的 悬液泵送至施用装置或其他容器或基质，以用于引入创伤。
下文是本发明的一个可能实施方案
Figure BDA0000840551800000111
NG的描述。该系统 经过设计、研发和制造，以便向用户提供一种用于处理大于手动 ReCell试剂盒(图1，下文详细描述)的范围的改进的新型、自动化、 安全、有效、可预测、可靠且易于使用的设备。
自动化系统的一些优点包括：
●处理时间最小化
●消除手动处理步骤，用户交互最小化并且提供自动化处理
●在处理结束时，向用户提供在外部保持无菌的容器或施用装置 中的细胞悬液
●改进施用装置和喷嘴应用以用于更直观的使用
●使用户对悬液一致性有信心
下文描述本发明的另外特征。然而，应当理解的是，这些实施例 仅出于例示本发明的目的而包括在内。不应以任何方式理解为对如上 所述的本发明的宽泛描述的限制。
提出以下描述以便为本领域普通技术人员提供本文所要求的组 合物和/或方法如何制备和评价的示例性描述，并且旨在纯粹是对本 发明的举例说明且不旨在限制本发明人所认定的发明范围。以下实施 例的各种方面的修改和变型将对本领域技术人员显而易见并且包括 在本发明的范围内。例如，虽然结合皮肤相关手术描述了一些实施例， 但是在完全在本领域普通技术人员的水平内的轻微修改的情况下，所 述实施例也可应用于非皮肤上皮组织(如呼吸道上皮、血管上皮、腺 上皮、角膜上皮等)。
下文是该系统以及其中各种部件的一些示例性设计。
1.综述
ReCell NG系统是用于治疗多种皮肤或其他上皮相关病症的自体 细胞收获和移植系统，其通过将所收获细胞的液体悬液施用至治疗区 域来实现。这种细胞悬液由患者自身的皮肤或其他上皮组织在自动化 自体过程中制备。
该过程采用酶和/或机械作用从组织样品中解离细胞，并且将它 们放入在缓冲溶液中的悬液中。
该系统包括一次性匣子或盒子(图2A-3B，示出两种不同的设计)； 可重新使用的控制台(图4A-6B，示出两种不同的设计)，盒子插入所 述控制台中；以及任选地，一次性施用装置(图7-9)，其容纳在盒子 中备用。
盒子可以无菌提供，并且含有处理材料和容纳组织样品的腔室。 所述盒子被密封，以防止微生物穿透。施用装置在处理期间在容纳在 盒子中的同时用细胞悬液填充，并且接着在将盒子从控制台中移除之 后被移除进行使用。控制台提供一些或所有的动力和控制。除了控制 台之外，匣子也可具有用于提供动力(例如，热量)的机构，以便向组 织供应机械力和/或化学试剂。
施用装置能够将其中的细胞悬液分配、喷涂或滴落到受区或支撑 件上。例如，施用装置可将细胞悬液流体喷涂或滴落到治疗区域上， 或允许施用在已经就位的接触层敷料下方，取决于医师的选择。作为 施用装置的替代或除其之外，该系统可包括用于接收细胞悬液的支撑 件，其中支撑件在接收细胞悬液之后用于移植或培养。支撑件可为基 质、支架、敷料、或其任何组合；支撑件可为固体、半固体、多孔或 片段化的。
2.人工ReCell
ReCell NG系统是先前研发的ReCell人工过程的至少部分自动化 型式。
人工过程采用ReCell试剂盒(图1)，其与无菌和未灭菌部件一起 输送。ReCell试剂盒含有无菌水、冻干酶(粉末)和复合乳酸钠缓冲液 (“缓冲液”)各自的一个小瓶。通过在酶瓶中引入10ml无菌水将酶重 构。然后将酶溶液放置在试剂盒的加热孔中以使溶液达到37摄氏度。 接着将皮肤样品在加热的酶中放置一段时间，以破坏胞外基质并且减 少表皮与真皮层之间的附接。将缓冲液从其小瓶中取出并且放置于 ReCell处理单元中的漂洗孔内。将产生细胞悬液所需量的缓冲液抽取 到5ml注射器中。细胞悬液体积量的增加允许治疗更大的表面区域。 皮肤样品可为通过使用植皮刀或其他类似的标准设备获得的刃厚(split-thickness)活检(包括表皮、真皮-表皮接合处以及一些真皮)。可 使用1-4平方厘米的活检产生例如1-4ml的细胞悬液。细胞悬液可根 据需要稀释或浓缩以增加或减少其体积。
一旦皮肤样品已经完成在酶中的处理，就通过浸入漂洗孔中将其 在缓冲液中漂洗。然后表皮侧朝上将样品呈放在试剂盒“托盘”上。使 用手术刀将表皮和接合处细胞层手动刮除，以将细胞收集在缓冲溶液 的小池中。在刮研时，用数滴缓冲溶液将样品润湿，以将解聚的细胞 携带到悬液中。使用正确的缓冲溶液总量，以便产生所需的细胞悬液 体积。
手动倾斜托盘以使细胞悬液移动到角落中，使用注射器从所述角 落中抽取所述悬液。将细胞悬液抽吸若干次，以漂洗托盘并且收集最 大数量的细胞。然后将细胞悬液从注射器分配到位于ReCell处理单 元的第三孔中的细胞粗滤篮(例如，40、80、100或200微米大的网格， 或根据所需过滤应用的任何其他大小)中。移除粗滤器，接着用新的 无菌注射器从孔中抽吸并抽取经过过滤的细胞悬液。然后将喷雾头装 配至该注射器，由此形成用于将细胞悬液喷雾或滴落到治疗区域上的 施用装置。可选地，使用钝针将悬液引入敷料下方。
3.RECELL NG系统
ReCell NG自动化过程包括三个子系统：流体操纵(任选)、组织 处理和施用。
流体操纵和组织处理系统具有将组织样品和流体封闭在盒子内 且接触所述组织样品和流体的部件。这些部件形成密封系统。控制台 的磁性和/或机械部件在密封系统的部件上施加力，从而在不机械打 破系统密封的情况下导致在密封系统内的移动。这实现了组织样品的 机械加工和流体移动，同时维持微生物屏障。
系统被密封，以防止微生物。组织处理室可用系统内的“弯曲通 道”出口或抗微生物过滤器通气，以允许空气离开和进入，而不将微 生物携带到系统中。由于流体移动通过系统，调节体积和压力变化是 必要的。
组织样品的基本机械加工可使用破碎构件获得。在各种实施方案 中，破碎构件可为控制台的一部分(例如，连接至致动机构)，或匣子 的一部分(例如，位于组织处理室中且例如连接至盖子)。破碎构件可 为研棒或研磨机。
在一个示例性系统中，机械加工通过往复式-旋转构件实现，所 述构件即“研棒”(图13-14)，其通过挠性密封件向组织样品施加线性和 扭转力以及反复撞击。(研棒的致动部分(“研棒致动器汽缸”)是控制台 的一部分，并且不接触组织样品。通过安装在挠性密封件(“研棒表面”) 内部的部件加工组织样品，力从控制台中的致动构件传送通过所述挠 性密封件。在组织位于粗糙的金属网或任何合适的组织破碎器(例如， 具有孔、叶片、格栅、筛等)上时抵靠所述组织施加这些力，这有助 于将力集中，并且允许液体和细胞穿过其中滴落。研棒表面可具有也 有助于集中力的多个径向隆脊，在研棒旋转时模仿在当前ReCell试剂盒中使用的手术刀的动作。隆脊的数量、它们的形状和运动、实现 解聚所需的力和时间可调整和优化。也可使用其他破碎构件，如研磨 机。
代替研棒运动或与其结合，可通过剧烈搅拌放置在缓冲液(例如， 复合乳酸钠缓冲液)浴中的组织样品来实现机械加工。例如，可将组 织样品与盒子中的无菌磁搅拌器一起放置在缓冲液浴中。控制台可提 供磁力以驱动磁搅拌器的移动(例如，旋转)，从而物理破坏细胞角质 层并且解离细胞。
在运送至用于细胞移植的无菌场所之前，施用装置的外表面可密 封在无菌包装中。例如，施用装置可容纳在盒子中的隔室中，所述隔 室用剥离膜或任何其他无菌包装密封，以使施用装置的外部被保持在 微生物屏障内。施用装置可为系统的一部分或为独立设备。施用装置 可为加压或弹簧加载的。施用装置可具有用于细胞悬液的轴向施用的 枢转头部。在处理期间，可从流体操纵系统通过密封通道用细胞悬液 填充施用装置，以使细胞悬液在无菌场所中由医师喷涂在治疗区域上 之前不暴露。
作为施用装置的替代或除其之外，系统可包括用于接收细胞悬液 的支撑件，其中支撑件在接收细胞悬液之后用于移植或培养。支撑件 可为基质、支架、敷料、或其任何组合，支撑件可为固体、半固体、 多孔或片段化的。
4.流体操纵系统
流体操纵系统是任选的。例如，如果组织样品在放置在盒子中之 前已经经过部分处理(例如，用酶如胰蛋白酶溶液孵育，并且洗涤且 放置在缓冲液中)，那么可消除流体操纵系统。示例性流体操纵系统 在图15A-15C中示出。图15A为其操作的示意图。图15B和15C为 在匣子中操纵流体的示例性硬件。这包括以下项目，除非另作说明， 其为盒子的部分。
在各种实施方案中，匣子包括用于提供酶溶液的第一封包和用于 提供缓冲溶液的第二封包，这两个封包均与组织处理室流体连通，其 中酶溶液破坏组织中的胞外基质，从而将组织化学解离，并且其中缓 冲溶液洗涤解离组织并且将细胞悬浮在细胞悬液中。例如，第一封包 可具有通过可破裂密封件分开的第一容器和第二容器，第一容器含有 无菌水，并且第二容器含有冻干酶粉，其中当密封件破裂时，冻干酶 粉遇到无菌水并溶解于其中。所述第一容器或第二容器可为囊袋、小 瓶或注射器。为了将试剂递送至组织，控制台还可包括分别驱动酶溶 液和缓冲溶液离开第一封包和第二封包，进入组织处理室的第一施压 机构和第二施压机构。在一些实施方案中，第一封包还收集使用后的 废弃酶溶液，并且第二封包还收集使用后的废弃缓冲溶液。第一封包 可与第一泵流体连通，以用于泵送酶溶液和废弃酶溶液。第二封包也 可与第二泵流体连通，以用于泵送缓冲溶液和废弃缓冲溶液。在一些 实施方案中，匣子还包括泵，其用于从细胞收集室中抽取细胞悬液， 并且随后在填充后，将细胞悬液泵送到施用装置中，第三泵与细胞收 集室和施用装置流体连通。第一泵、第二泵和第三泵中的两个或所有 可以是同一个泵。第一泵、第二泵或第三泵可为蠕动泵、注射泵、或 其他类型的泵，并且可为一次性的或可重新使用的。在一些实施方案 中，匣子还包括用于收集废弃酶溶液的第一注射器和用于收集废弃缓 冲溶液的第二注射器，这两个注射器均与细胞收集室流体连通。匣子 还可包括第三注射器，其用于从细胞收集室中抽取细胞悬液，并且随 后在填充后，将细胞悬液泵送到施用装置中，第三注射器与细胞收集 室和施用装置流体连通。在某些实施方案中，匣子还包括用于酶溶液 和缓冲溶液的受控计量的流体检测器。作为囊袋的替代，匣子可包括 分别用于提供酶溶液、无菌水和冻干酶粉的三个容器。
示例性流体操纵系统包括：
●容纳流体和酶粉末的两个密封封包(用于将组织化学解离，其 可包括，例如，用酶消化，所述酶如胰蛋白酶、分散酶、胶原酶、胰 蛋白酶-EDTA、嗜热菌蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白 酶、木瓜蛋白酶以及胰酶)。封包1具有由密封件分开的两个腔室。第一腔室容纳无菌水，并且第二腔室容纳冻干酶粉。封包2容纳乳酸 钠缓冲液，或用以补足细胞悬液的其他溶液。可选地，可使用三个容 器来分别提供酶溶液、无菌水和冻干酶粉。水和酶可储存在通过管或 其他装置连接的独立容器中。
●两个辊(或其他合适的施压机构，如压力板)(控制台的部分)， 其用于驱动流体离开封包。
●将两个封包连接至组织处理室的两个流体通道。
●组织处理室(也是组织处理系统的部分)。
●组织处理室下面的细胞收集室。
●公用流体通道，其包括与泵和流体/空气检测器对接的管，用 于计量和移动单独流体。
●用以填充施用装置的流体通道。
●一组夹紧阀(或其他阀，如旋转阀、活塞阀、滑动闸门阀；控 制台的部分)，其在处理循环需要时升高和降落来关闭或打开每个流 体通道。
●施用装置(任选的)，其保持为流体操纵系统的完整部分，直到 在无菌场所中由医师从盒子中移除进行使用。
●在各种实施方案中，匣子还可包括用于提供外源试剂的至少一 个供应容器。例如，外源试剂可为热激蛋白或其片段、透明质酸、富 含血小板的血浆、生长因子、脂肪干细胞、或前述的任何组合。
在希望或需要时，匣子或流体操纵系统的与生物材料接触的一个 或多个部件可移除地组装在其中，以使所述部件可从匣子中移除用于 生物危害性处置，从而允许回收利用匣子的其余部分。
在需要泵的情况下，泵可为蠕动泵、注射泵、或其他类型的泵， 并且可为一次性的或可重新使用的。泵可为控制台的一部分并且是可 重新使用的，或者可为盒子的一部分并且是一次性的。例如，蠕动泵 发动机和致动器可结合到耐用控制台中，并且与一定长度的管对接。 蠕动泵发动机可具有以旋转或线性构型附接至其的辊。这些辊可接触 管，从而挤压管使其闭塞，并且沿着管通道驱动流体。
一次性泵(例如，蠕动泵)作为完全包封在该系统的可消耗盒子部 分内的完整、简单、廉价的泵可为有利的。一次性泵可通过简单的物 理接口配接至发动机，所述发动机为耐用控制台的一部分。示例性一 次性泵为购自Quantex Arc Ltd(London,UK)的Quantex泵。
5.流体操纵过程
这是任选的，取决于组织样品在放置于盒子中之前是否已经经过 处理或部分处理。如果组织样品在进入盒子中之前已经经过至少部分 处理，那么可省略流体操纵。在一个实施例中，部分处理包括在将组 织样品放入盒子中之前，用酶如胰蛋白酶溶液孵育组织样品，洗涤并 将其放置在缓冲液中。
在需要流体操纵的情况下，一将盒子插入控制台中，即关闭所有 阀门。第一辊(“酶辊”)向前推动，从而用酶粉包压缩无菌水并破坏密 封件。这将两个腔室接合成一个。
第一辊停止，以给予酶用以溶解在水中的延迟期，辊可在暂停之 前具有设定百分比的推进，或通过压力开关进行控制。
第一阀门打开(在“酶进料管”上)。然后第一辊继续推进，从而破 坏在组合的无菌水/酶封包与通向组织处理室的“酶进料管”之间的第 二密封件。
第一辊恢复推进以使酶溶液移动出封包。蠕动泵(或任何其他泵) 使溶液移动到组合的组织处理室和细胞收集室，以填充所述组合腔室 并且覆盖组织。第一阀门关闭。当组织样品浸泡在酶溶液中时，进行 可变的/可设定的延迟。(注意：可使用组织处理室壁中的传感器和线 圈，或通过从控制台向上延伸的热销维持温度。在此期间，研棒可上 下循环以帮助搅拌酶溶液和促进组织处理。这可允许较短的浸泡期。 也可使用用以移动所采用流体的其他手段，如旋转添加或未添加翅片 的研棒，并且将少量溶液泵入和泵出腔室。)
第一阀门再次打开，并且蠕动泵(或任何其他泵)通过酶排放管将 酶溶液抽出组合的组织处理和细胞收集室，并且将其储存在封包 #1(现在是空的酶囊袋)中作为废料储存。第一阀门关闭。第二阀门打 开(在“缓冲液进料管”上)。第二辊(“缓冲液辊”)部分推进，打破密封件。 蠕动泵(或任何其他泵)既计量体积，又通过缓冲液进料管泵送缓冲溶 液以漂洗组织处理室中的组织样品。(缓冲液可通过多个端口进入， 以用于表面覆盖。)泵入充足的缓冲液以完全填充组织处理/细胞收集 室组合。然后阀门关闭。
第一阀门再次打开。蠕动泵(或任何其他泵)将所有漂洗缓冲液从 处理室中抽出，并且抽入封包#1中作为废料储存。
细胞收集室的体积可针对组织样品大小和待用缓冲液体积进行 调整。
然后开始解聚过程(参见以下组织处理部分)。第二阀门打开，第 二辊继续推进，并且蠕动泵(或其他任何泵)在研棒移动期间将缓冲溶 液移动到腔室中一次或多次，以用数滴缓冲溶液反复泼洒组织样品， 以与研棒的移动相协调的方式暂停在其间。阀门在各等份之间关闭。 (注意：缓冲液封包可被设计具有分级宽度，以增加小体积应用的体 积精确度。辊可用流量控制表控制。
在这一过程中，缓冲液拾取正从组织样品中释放的细胞，并且因 此形成的细胞悬液通过重力排放到细胞收集室中，通过安装在细胞收 集室中的100微米过滤器(或40、80、150或200微米大小的网格， 或取决于所需过滤应用的任何其他大小)。(参见关于组织处理的部分 和关于组织处理和细胞收集室组件的图10-12。)在研棒循环结束时， 向腔室中添加另外的缓冲液以漂洗所述腔室，收集所有解聚细胞，并 且补足所需的细胞悬液体积。这可多次发生，以便完全捕获所有细胞 并实现所需体积。然后第二阀门关闭并且保持关闭。
在组织处理完成后，阀门打开(在“细胞收集管”上)。泵将细胞悬 液从收集室(通过过滤器)中抽出并且抽入施用装置中。然后泵逆转， 将细胞悬液突然泵送回到组织处理/细胞收集室中，以将细胞从腔室 和研棒表面冲掉，并且进一步活化细胞。这可重复。在此过程之后， 悬液保留在施用装置中。然后阀门关闭。
可从缓冲液封包中抽取另外的缓冲液，并且将其泵送至腔室(如 上所述)以漂洗所述腔室，收集另外的解聚细胞，并且补足所需的细 胞悬液体积。这可多次发生，以便完全捕获所有细胞并实现所需体积。 将此另外的悬液泵送至施用装置，然后泵逆转，并且将细胞悬液突然 泵送回到组织处理/细胞收集室中，以将细胞从腔室和研棒表面冲掉， 并且进一步活化细胞。
6.组织处理系统
组织处理系统为在图2A-3B(两个不同的匣子设计，#1和#2)、图 4A-6B(两个不同的控制台设计，#1和#2)，以及图10-12(组织处理和 细胞收集室)中示出的匣子和控制台的元件的组合。
组织处理室：由工程树脂(或任何其他合适的材料)与底部开口上 方的钢网(或任何其他合适的破碎器)(“组织处理网”)构成的容器，由 强的肋结构支撑或沿周边支撑。腔室的顶部用盖子(“腔室盖”)关闭。 此腔室中的一个组合端口或两个独立端口允许泵入酶溶液和缓冲溶 液。(缓冲液可通过一个或两个或多个端口进入，以用于表面覆盖。)
腔室盖：可移除地放置在或铰接到组织处理室上的盖子可用于密 封其顶部开口，例如，通过卡口配件。一旦关闭，盖子就可通过锁定 机构锁定在适当位置，以使盖子在处理过程中保持关闭，并且在第一 次使用之后不可再次打开或重新使用。盖子的主体包括柔性弹性体 (例如，聚氨酯)密封件，其具有紧固在盖子的腔室侧上的凸起的研棒 表面(球形凸面)以及顶部的花键凹槽。当盖子紧固至腔室时，O-环密 封件或其他地方(或可选地，抗微生物过滤器)处的弯曲通道出口允许 空气通过，但是针对微生物侵入进行密封。盖子还可为基本刚性的， 其形式为具有o-环或方形密封件或其他密封装置的垂直轴。
组织处理网：具有凹球形形状的不锈钢网，覆盖组织处理室底部 的开口，将所述组织处理室与下面的细胞收集室分开。当组织样品放 置在处理室中时，其位于组织处理网上。也可使用任何合适的组织破 碎器(例如，具有孔的片材、叶片、格栅、筛等)。
细胞收集室：组织处理室下方的腔室，安装有过滤器(例如，100 微米、200微米、或更大或更小)，以使从组织处理室中排放的细胞悬 液在进入细胞收集室底部之前从其中通过，以移除或收集大的聚集体 或组织碎片。在某些实施方案中，匣子还包括位于破碎器与细胞收集 室之间、用于过滤经过处理的组织以移除大的聚集体的过滤器。过滤 器可以可选或另外地位于细胞收集室与施用装置之间，用于过滤细胞 悬液，以移除大的聚集体。(注意：细胞收集室的体积可为可变的， 以允许使用各种小体积的缓冲溶液，同时维持在组织处理结束时用缓 冲液覆盖组织样品。)
致动机构(控制台部件)：允许力穿过盖子至组织样品的构件。致 动机构将具有允许与腔室盖配合以允许解聚的楔片。当枢转臂处于收 缩位置(图5B上图、图6B上图和图13)时，圆柱形破碎构件(控制台 部件)被牵拉远离盖子，以使其不干扰正在移动进出控制台的盒子； 当枢转臂就位(图5B下图、图6B下图和图14)时，破碎构件的底部 放置在盖子内的密封件或膜上。例如，密封件在面向组织处理室的第 一侧上可具有工作表面，其中在破碎构件被致动并且放置在密封件的 面向破碎构件的第二侧上时，工作表面与放置在组织处理室中的组织 接触。可选地，破碎构件可为匣子的一部分(例如，连接至腔室盖或 组织处理室)，以使在与致动机构配合时，破碎构件可受到致动机构 的作用，以向组织施加力。
致动机构可以通过弧线以振荡形式旋转。这允许向组织样品施加 扭矩。
致动机构上的弹簧加载的或机械、磁性或其他力允许直接或通过 膜向组织样品施加稳定的力。
致动机构的周期性升起和降落允许对组织样品撞击或施加不同 的力。
所有上述所施加的力直接(当破碎构件为匣子的一部分时)或通 过盒子的腔室盖顶部上的密封件(不破坏密封件)传递至组织样品，因 此组织样品周围的微生物屏障在整个过程中得以保持。
上述腔室盖和致动机构模块的可选或另外设计是在组织处理室 中提供磁搅拌器，并且通过由控制台提供的磁力驱动磁搅拌器。在足 够剧烈的搅拌时，磁搅拌器将组织样品分解成细胞的羽状物，所述羽 状物可接着被过滤并收集于细胞收集室中。
7.组织处理
此过程力图使用金属网的所添加的加工元件以及来自研棒的撞 击在一定程度上模仿手动ReCell试剂盒中手术刀在托盘表面上的刮 研动作。这些另外的加工元件力图提供足够的作用以解离所需细胞， 而不考虑样品的取向。
在上述缓冲液漂洗之后，致动机构向盖子移动以与带楔片的腔室 盖表面配合，并且对组织样品施加力(直接地或至研棒表面)。(参见图 14。)
可应用以规定频率周期性升高和降落和/或旋转致动机构的机构 在组织样品上提供研棒表面的周期性撞击或可变的力。
安装在致动机构上的连杆提供使研棒致动器旋转的能力。由于研 棒表面上的多个脊，在此弧线上的振荡运动可扫掠脊，以覆盖整个样 品表面。
以上过程继续规定的循环数。在完成时，Dennis的一些残余物将 卡在网格中。所需细胞将悬浮于细胞收集室中的缓冲液中。
可选地或与以上致动机构相结合，控制台可提供磁力，所述磁力 驱动先前放置在组织处理室中的磁搅拌器的移动。磁搅拌器的移动可 将组织样品分解成细胞的羽状物。
8.施用装置
施用装置的设计在图7-9中示出。
施用装置含有弹簧加载的注射器，其中弹簧被定向以抵抗注射器 的填充。
施用装置上的操作阀门被定位和设置成允许填充施用装置注射 器，但是阻止流体离开施用装置上的喷雾嘴。
可选地，施用装置可包括隔膜，或例如硅橡胶。这种隔膜将被定 位邻近匣子中的相配隔膜。当将匣子插入控制台中时，其与固定的凸 起部相配合。这迫使弹簧加载式针头穿过两个隔膜，打开从匣子管道 至施用装置的流体通道，从而允许所述施用装置被填充。当将匣子从 控制台移除时，弹簧加载式针头收缩，从而将两个隔膜重新密封并且 确保无菌。
弹簧压缩在流体处于施用装置中时以及在其随后排空至治疗表 面上时维持所述流体上的压力。
在施用装置填充之后，将盒子从控制台移除，并且将盒子运载至 无菌场所，巡回护士打开在匣子中的仍然无菌的施用装置腔室，并且 将其呈送给擦洗中的护士或医师，所述护士或医师无菌地将其撷取用 于施用至患者。
医师将施用装置喷嘴对准治疗区域，并且部分或全部打开操作阀 门，以实现从滴注至喷雾的所需流动强度。(操作阀门可为任何合适 的阀门。)施用装置可具有用于细胞悬液的轴向施用的枢转头部。
作为施用装置的替代或除其之外，系统可包括用于接收细胞悬液 的支撑件，其中撑件在接收细胞悬液之后用于移植或培养。支撑件可 为基质、支架、敷料、或其任何组合，支撑件可为固体、半固体、多 孔或片段化的。
9.控制台
控制台内部布置在图5A-6B中示出为两种不同的设计(控制台设 计#1和#2)。
系统的一些或所有有源的、通电的机械部件和电气部件驻留在控 制台中。(所有盒子部件可为无源的，由通电的控制台部件机械驱动， 除了可放置在盒子中的加热盘管和传感器可能例外。)控制台可具有 基于盒子中的无源签名设备识别盒子是正品(genuine)且先前未使用 的设备或装置(验证，例如，通过条形码或ID芯片)。可选地，匣子 也可具有有源部件，如用于提供动力(例如，热量)的机构，以便向组 织供应机械力和/或化学试剂。
在一些实施方案中，控制台还包括以下中的一个或多个：用于将 匣子抽吸到控制台中和从控制台中喷射出的机构；防止匣子在处理期 间移除的联锁装置；用以控制处理时间、所需悬液体积以及组织处理 的启动的操作员界面；显示组织处理状态的显示板；以及当充满时用 于喷射施用装置的喷射机构。
在各种实施方案中，系统可包括用于指导控制台中的处理器或计 算机芯片以控制自动化过程的定制控制软件。系统也可连接至用于收 集和处理数据的外部计算机。
机械系统：主要机械系统在上文描述，并且总结如下：
●流体封包辊：这些辊骑跨在由步进电动机驱动的导螺杆上，每 个辊一个电动机。
●泵：与匣子中的管对接用于流体移动。
●致动机构：用于向破碎构件提供力和振荡的机构，以及其旋转 连杆。
●阀门致动：控制开关所有管的阀门将通过螺线管致动。
还包括控制电子设备以实现以下：
■ReCell NG仪器内部子系统的操作可通过电子系统监测和控 制，所述电子系统包括与各种致动器、传感器以及用户界面部件对接 的一个或多个微控制器。
■用于微控制器的另外资源可包括闪速存储器，具有备用电池的 实时时钟，以及对外部计算机的串行接口。用于微控制器的指令包含 在加载到闪速存储器中的固件程序中，这允许更新/升级的容易安装。
■致动器，如发动机，通过微型计算机经由数字输出(DO)电路 打开或关闭。可选地，发动机的供电(以及因此速度)可使用由定时器 和计数器控制的数字输出进行改变，这是被称为脉冲宽度调制(PWM) 的技术。
■传感器可用于测量或指示重要的物理参数，如辊机构的位置、 辊施加的力，或内部温度。传感器输出通过微控制器使用模数转换器 (ADC)或数字输入(DI)电路读取。
●用户界面(例如，背光彩色LCD触摸屏、固定触摸屏、简易按 钮或旋钮或LED等)包括数据输入的装置、用于向显示器输出各种数 据的装置、指示器或音频发生器。这些类型的设备可作为包括用以操 作更复杂的部件(例如，触摸开关或显示器)的电路的模块来购买并且 通常通过内部总线与微控制器通信。
■在微型计算机上执行的程序定期扫描各种输入，如用户界面切 换、位置传感器或温度传感器，并且接着确定适当的输出动作，如打 开或关闭发动机或加热器。下文将对软件进行详细讨论。
操作员界面：示例性操作员界面可为控制面板。界面还可为触摸 屏。可包括以下功能：
●能够从3米距离和最小45°角在视觉上确定关键参数进度(条 或其他定性视觉指示器以及倒计时时钟)
●处理完成和悬液准备就绪指示器
●错误或误差指示器
●AC电源指示器：在插入时亮起且电源可用，而不考虑控制台 开启还是关断。
●通/断开关
●状态指示
●电源开/关
●处理和运行状态
●待机
●错误/误差
●用户界面在不同照明条件下应为可读的，包括在典型的手术室 中遇到的照明条件
●精确至一分钟内的倒计时定时器
●处理完成和错误/误差的听觉和视觉指示器
●具有听觉反馈的用于用户输入的按钮、按键或触摸板
●为用户提供指令或提示
●允许用户输入所需的悬液体积
●允许用户输入处理水平
●仪器应提供匣子正确放置的积极反馈。
●仪器必须确保在整个手术中匣子保持正确放置，检测匣子是否 被碰出或移出操作位置，并且提供故障状况通知
●匣子应与控制台的接口自动对准
●匣子应仅在一个取向上与控制台配合
●细胞处理不必对操作员可见
●休止-仪器应自动关闭：
●在120分钟的休止(无按钮按压、盒插入等)之后，在开启之后 且在循环开始之前
●在循环结束时，在盒子移除之后90分钟
●关机前15分钟的视觉和听觉预先通知
●提供覆盖选项
●如果盒子在循环结束时没有移除，不要关断，而是以2分钟的 间隔提供视觉和听觉提示信号
●警告：
●匣子包未正确放置
●研钵处温度过高
●处理中的内部错误
●电源故障
在各种实施方案中，系统可包括用于指导控制台中的处理器或计 算机芯片以控制自动化过程的定制控制软件。系统也可连接至用于收 集和处理数据的外部计算机。
软件：
●软件可以C/C++或其他编程语言来编写。可利用实时操作系统 或可执行为定时和资源管理提供支持。一些功能可使用可编程硬件解 决方案如FPGA或组合硬件/软件设备如“芯片上可编程系统”实现。
●处理架构可由处理和定时需求、功耗约束等确定，也可利用多 处理器设计来划分功能(例如，用于显示器、触摸屏、电池监测、可 消耗接口的单独处理器)。
●用于每个处理器的开发工具(例如，交叉编译器、JTAG调试接 口)可在仪器中使用。开源工具如Git、CVS、Bugzilla等可用于软件 配置管理和缺陷跟踪。
●可包括用以执行仪器接口和调试功能的支持软件。
●包括以下功能：
●监测和可消耗接口的控制：
○热控制
○流体控制，包括泵送、定位、囊袋辊定位、阀门致动以及必要 传感器(空气、压力、位置等)
○解聚控制(研棒定位和移动的控制，必要传感器等)
○耗材检测(防止不存在或不恰当放置的耗材)
○耗材验证(确保正品的盒子，并且防止重新使用)
●用户界面
○细胞处理工作流程
○硬件接口：图形显示、音频输出、离散状态指示器和操作员输 入
●电源
○监测AC电源状态
○DC电源状态和控制
○电池状态的监测
○电池充电的控制
○控制系统电子设备，以实现操作的节能模式
●仪器自检，如通过风险分析和控制所确定(独立的监测处理器 或看门狗定时器、POST等)。
○启动自检
○在处理中自我监测以维持基本性能
●用于日期/时间的实时时钟的监测和控制
●通过有线接口(USB2.0、RS-232)与外部计算机双工通信
●将仪器操作记录在事件日志中
●将检测到的警告、错误等记录在服务日志中
●仪器操作配置(例如，语言选择)
●通过有线通信端口(USB、RS232、JTAG等)实现的调试/软件 升级机制
电源：
●电子系统可通过电池或将为各种电路所需要的能够将AC线 路电压转换为若干DC电平的通用电源供电。电源是通用的意味着其 可接受大多数国家所使用的输入线路电压和频率的范围。将使用独立 电源线，以便适应不同国家的不同壁装电源插座配置。
●电源线将插入输入模块，所述输入模块包括电源开关和线路滤 波器，其衰减不期望的所实施的线路频率，以便满足电磁兼容性(EMC) 规定。断路器将被包括来保护仪器免受由某些故障状况引起的损坏。
●电力供应必须遵守应用于医疗电气设备的安全规定，如 IEC60601-1和其他相关国家变型(例如，UL、CSA、EN)。电力供应 中的各种信号将由微型计算机监测，以确保仪器的可靠操作。
10.系统背景
ReCell NG可用于解聚来自患者的刃厚皮肤样品的细胞，并且收 集这些细胞以用于再引入患者的准备的创面床。
适应症：
●在医院环境中：
○烧伤、烫伤和创伤性损伤
○供区
○用于改善肌理和肤色的较大疤痕修整
●在诊室环境中：
○色素沉着障碍，如白癜风
○表皮缺陷，如痤疮疤痕、毛痣以及皮肤癌疤痕
○用于急性创伤的愈合的预防用途
○通过激光切除、磨皮术或深度化学去皮进行表面重修
○慢性创伤(腿溃疡/愈合困难)
可设计两种仪器：
●诊室控制台：
○能够并行处理两个或更多个样品，一个皮肤样品使用一个耗材
○应仅接受小的(例如，4ml)匣子，并且因此将受限于少量(例如， 4ml)的细胞悬液(CS)
●手术室(OR)控制台：
○能够并行处理两个或更多个样品，一个皮肤样品使用一个耗材
○能够生产最多至16ml的CS
○应接受小的或大的匣子，但是小匣子将受限于少量(例如，4ml) 的CS
可设计两种可消耗匣子：
●小(例如，4ml)匣子预期用于诊室，并且应递送最多至4ml的 细胞悬液
●大(例如，16ml)匣子预期用于OR，并且应递送最多至16ml 的细胞悬液
11.示例性工作流程分析
存在两个独立的工作流程：一个用于OR(图16)，并且一个用于 诊室(图17)。简而言之，工作流程可包括以下步骤：
●将皮肤样品(未处理或部分处理的(例如，在酶溶液中孵育的)) 装载到匣子中
●将匣子插入仪器中
●设定所需悬液体积、处理水平
●按压启动
●细胞悬液在20分钟内(用标准处理)传送至施用装置，而无需 另外的操作员动作
RECELL NG手术室程序：
●在一种所提出的场景(图16)中，ReCell NG控制台位于手术室 (OR)中，在桌子、台面或手推车上，在无菌场所以外。打开控制台， 以升温和自检。也可将仍处于其无菌包装(在制造过程中辐射灭菌)中 的盒子预热。
●使用无菌技术将盒子引入无菌场所中。擦洗中的护士或技术人 员通过移除盖子打开解聚腔室，并且将组织样品(刚从患者处获得)放 入孔中，接着更换盖子。保留盖子，从而在整个处理和处置中维持密 封。组织样品不以任何特定方式定向。
●擦洗护士将盒子传递给巡回护士，巡回护士将盒子带回控制 台，并且将盒子插入控制台上的狭槽中，直到其置于控制台中，被吸 入控制台中或以其他方式锁定到适当的位置。巡回护士使用控制台操 作员界面，以指示所需的处理时间和悬液体积，并且启动处理循环。
●系统在不需要来自操作员的进一步输入的情况下自动重构酶 (如果皮肤样品在放入盒子中之前已经经过部分处理，例如，如果皮 肤样品已经在酶溶液中孵育，那么酶可能不是必需的)、处理组织、 产生并过滤悬液，并且装载施用装置。在细胞处理期间，进度显示器 持续更新并且显示处理状态以及剩余时间，直到处理完成，当处理循 环完成(大约30分钟)时，通知音和灯光通知用户细胞悬液准备就绪 并且处于施用装置中。
●接着巡回护士将盒子从控制台中移除，将其带到无菌场所，并 且使用无菌技术打开施用装置隔室，并且将无菌施用装置呈送给擦洗 护士或医师。
●然后医师将细胞悬液施用至治疗区域上。
ReCell NG的示例性过程步骤：
●将台面单元设在无菌场所之外。
●打开台面单元。设备执行自动自检并启动加热器。如果自检的 结果是可接受的，那么仪器提示输入，包括所需的悬液体积。
●将无菌匣子引入无菌场所中
●外科医师获取插入匣子中的皮肤样品(刮取的活检)
●巡回护士或技术人员将匣子插入控制台中，设定悬液体积，并 且按压“运行”。
●仪器处理组织(假定过程)
●将酶溶解于无菌水中；等待或搅拌以混合(任选的)
●将酶溶液泵送到研钵中，以浸没皮肤样品(任选的)
●当酶溶液的温度达到22℃或更高时，启动定时器
●加热至37℃
●在指定时间之后，关闭加热器，并且将酶溶液排放至废料。
●用缓冲溶液漂洗皮肤样品；将漂洗溶液排放至废料。
●添加少量的缓冲液以收集细胞，处理皮肤样品以移除和收集细 胞
●过滤细胞，并且产生用于治疗区域大小的适当体积的悬液。
●将悬液转移到递送装置中。
●信号完成
●将匣子从控制台中移除，并且巡回护士或技术人员打开施用装 置隔室。外科护士将递送容器(其外表面保持无菌)从匣子的仍无菌的 内部移除，并且递给外科医师。
●外科医师将悬液喷涂、滴落或输注到治疗区域上。
12.数据
系统，在内部或外部，可包括足以维护操作日志的数据存储单元。 例如，控制台可含有用于记录活动的设备，以用于报告、故障排除和 持续改进。控制台还可提供有记录自检、准备就绪模式、输入参数、 匣子插入时间、启动事件时间以及用于控制台的具有最大输出大小的 至少四个程序的温度/时间数据的能力。另外，还可包括具有例如1 秒的精度的时间戳数据，以及访问或显示日志的装置。
13.处理参数(细胞悬液)
可获得各种皮肤或其他上皮组织用于处理。组织样品可具有装入 组织处理室中的最大尺寸(例如，约4cm x 4cm)，并且可如所需一样 小(例如，1.0cm2)。推荐厚度范围为约0.006-0.008”(0.15-0.20mm)， 并且可以更薄或更厚(例如，0.1”(2.54mm))。以下是适于通过本发明 的系统处理的若干示例性大小：
●标准时间：至多4cm2，0.006-0.008”厚
●中等时间：至多16cm2，0.010-0.012”厚
●长时间：至多16cm2，至多0.10”厚
样品可能呈非矩形的不规则形状，并且可能较厚。
示例性流体递送：
●重构酶：10±0.2ml(例如，避免起泡，来自容器的酶溶液的恢 复等。)
●在消化后用缓冲液漂洗皮肤样品：10±1.0ml(从皮肤样品移除 酶且使所述酶失活)
●产生细胞悬液：由用户根据表1选择体积，公差±0.2ml。推 荐的皮肤样品大小和待使用来开始的缓冲液的体积在表1中示出。
表1
所需细胞悬液体积(CSV) 活检面积[BA](cm<sup>2</sup>) 用于制备悬液的缓冲液
1.0 1 1.5
1.5 2 2.0
2.0 4 2.5
2.5 4 3.0
3.0 4 3.5
3.5 4 4.0
4.0 4 4.5
5.0 9 5.5
6.0 9 6.5
7.0 9 7.5
8.0 9 8.5
9.0 16 9.5
10.0 16 10.5
11.0 16 11.5
12.0 16 12.5
13.0 16 13.5
14.0 16 14.5
15.0 16 15.5
16.0 16 16.5
在孵育期间，设备可将温度维持在最低35℃且最高42℃。(烧伤 手术室中的环境温度可高达42℃。)在孵育之后，不需要升高的温度， 并且可允许腔室移至环境温度。(注意，由于用于烧伤手术的OR温 度常大于37℃，所以环境可大于37℃，无需冷却至环境以下。)
处理定时：对于标准处理，整个处理可在20分钟之内完成。时 间可根据样品的大小和厚度而改变。
所得细胞悬液(CS)包括各种存活且具功能性的皮肤细胞，包括已 分化的、正在分化的和未分化的细胞。一些细胞能够分裂。一些能够 提供正常功能。可包括角化细胞、朗格汉斯细胞、成纤维细胞和黑素 细胞。在一些实施方案中，对于至多320cm2的最大治疗面积，可使 用4ml的CS，并且对于至多1280cm2的最大治疗面积，可使用16ml 的CS。
细胞解聚过程的输出可使用100μm或其他大小的过滤器过滤以 移除较大颗粒。将所得细胞悬液(CS)流体转移至施用装置。输出的体 积可由操作员设定。
来自该过程的废料应根据用于使用区域的生物材料的指导和实 践包含在用于处置的耗材内。耗费的匣子和所使用的施用装置，或其 中的任何部件可作为生物废料处理。
14.环境要求
ReCell NG系统在以下操作条件下应根据其限定说明书进行操 作：
温度：10℃-42℃
相对湿度：5％-95％，无冷凝
大气压力：从海平面以下1500ft至海平面以上6500ft
(15.51psiA-11.56psiA或106.9kPa-79.7kPa)
ReCell NG系统在暴露于以下运输条件后应根据其限定说明书进 行操作：
温度控制台：-20℃-60℃
匣子：-4℃-30℃
相对湿度：最高至95％，无冷凝
大气压力：从海平面以下1500ft至海平面以上19000ft
(15.51psiA-7.04psiA或106.9kPa-48.5kPa)
ReCell NG系统在暴露于以下存储条件下之后应根据其限定说明 书进行操作：
温度控制台：-20℃-60℃匣子：2℃-30℃
相对湿度：最高至95％，无冷凝
大气压力：从海平面以下1500ft至海平面以上19000ft
(15.51psiA-7.04psiA或106.9kPa-48.5kPa)
ReCell NG系统在暴露于用于运载容器的随机振动测试的ASTM D 4728标准测试方法之后，应根据其限定说明书进行操作。
本发明的所描述方法和设备的各种修改和变型将对于本领域技 术人员显而易见，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定优 选实施方案描述了本发明，但应理解的是，要求保护的本发明不应不 适当地局限于所述特定实施方案。实际上，相关领域技术人员可明显 看出的对用于执行本发明的所描述方式的各种修改旨在处于权利要 求的范围内。

Claims (32)

1.一种用于细胞收获和移植的系统，其包括：
用于处理组织的匣子，所述匣子包括组织处理室、位于其中的破碎器，铰接到组织处理室上的盖子，以及通过所述破碎器与所述组织处理室分开的细胞收集室，其中所述盖子具有用于密封所述组织处理室的挠性密封件；
用于细胞移植的施用装置，其与细胞收集室可移除地流体连通；以及
用于可移除地容纳所述匣子和所述施用装置的可编程控制台，其中所述控制台包括破碎构件及其致动机构，以及处理器，所述处理器用于控制致动机构从而向组织处理室内的组织通过盖子的密封件施加压缩和/旋转力，从而机械解离组织，
其中在将放置在所述组织处理室中的所述组织机械解离并且使所解离组织通过所述破碎器之后，将细胞悬液收集在所述细胞收集室中，并接收到施用装置。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述匣子还包括用于提供包含化学试剂的溶液的容器，其中所述化学试剂能够破坏所述组织中的胞外基质。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述控制台还包括施压机构，其用于驱动所述溶液离开所述容器并且进入所述组织处理室，从而将其中的所述组织化学解离。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述匣子还包括用于提供酶溶液的第一封包和用于提供缓冲溶液的第二封包，这两个封包均与所述组织处理室流体连通，其中所述酶溶液破坏所述组织中的胞外基质，从而将所述组织化学解离，并且其中所述缓冲溶液洗涤所述解离组织并且将细胞悬浮于所述细胞悬液中。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述第一封包具有通过可破裂密封件分开的第一容器和第二容器，所述第一容器含有无菌水，并且所述第二容器含有冻干酶粉，其中当所述密封件破裂时，所述冻干酶粉遇到所述无菌水并溶解于其中。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述第一容器或所述第二容器为囊袋、小瓶或注射器。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子在使用前被密封在无菌包装中。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，所述盖子可移除地放置在或铰接到所述组织处理室上用于接合所述致动机构。
9.根据权利要求8所述的系统，其中在面向所述组织处理室的第一侧上具有工作表面，其中当所述破碎构件被致动并且放置在所述密封件的面向所述破碎构件的第二侧上时，所述工作表面与放置在所述组织处理室中的所述组织接触。
10.根据权利要求8所述的系统，其中所述匣子还包括用于在所述盖子一放置在所述组织处理室上即固定所述盖子的锁定机构，以使所述系统在使用过程中时，所述盖子保持被放置。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子还包括用于提供外源试剂的至少一个供应容器。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述外源试剂为热激蛋白或其片段、透明质酸、富含血小板的血浆、生长因子、脂肪干细胞、或前述的任何组合。
13.根据权利要求1所述的系统，其中破碎构件为往复式-旋转构件。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子还包括位于所述组织处理室中的破碎构件。
15.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子还包括用于在流体移动期间平衡压力的机构。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述机构为抗微生物过滤器或孔型弯曲通道。
17.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，所述施用装置是一次性的。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述施用装置能够将其中的所述细胞悬液分配、喷涂或滴落到受区或支架上。
19.根据权利要求17所述的系统，其中在运送至用于细胞移植的无菌场所之前，所述施用装置的外表面密封在无菌包装中。
20.根据权利要求17所述的系统，其中所述施用装置是加压或弹簧加载的。
21.根据权利要求17所述的系统，其中所述施用装置具有用于所述细胞悬液的轴向施用的枢转头部。
22.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子还包括位于所述破碎器与所述细胞收集室之间、用于过滤所处理的组织以去除大的聚集体的所述过滤器。
23.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子还包括位于所述细胞收集室后面、用于过滤所述细胞悬液以移除大的聚集体的所述过滤器。
24.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子的与生物材料接触的一个或多个部件可移除地安装在其中，以使所述部件可从所述匣子中移除用于生物危害性处置，从而允许回收利用所述匣子的其余部分。
25.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其还包括用于指导所述处理器的定制控制软件。
26.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其连接至用于收集和处理数据的外部计算机。
27.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述匣子还包括用于提供动力以向所述组织供应机械力和/或化学试剂的机构。
28.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其还包括用于接收所述细胞悬液的支撑件，其中所述支撑件在接收所述细胞悬液之后用于移植或培养。
29.根据权利要求28所述的系统，其中所述支撑件为基质、支架、敷料或其任何组合。
30.根据权利要求28所述的系统，其中所述支撑件为固体、半固体、多孔或片段化的。
31.一种使用根据权利要求1-6中任一项所述的系统进行细胞收获和移植的非治疗性方法，其包括：
将所述组织放置在所述组织处理室中；
指导所述控制台以致动所述破碎构件；以及
撷取其中具有所述细胞悬液的所述施用装置。
32.一种使用根据权利要求1-6中任一项所述的系统进行细胞收获和移植的非治疗性方法，其包括：
将所述组织放置在所述组织处理室中；
指导所述控制台中的所述处理器，以便向所述组织供应所述机械力和/或化学试剂；以及
撷取细胞悬液。
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