CN105176924B - 一种软骨再生干细胞制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种软骨再生干细胞制剂及其应用，步骤包括：血清分离，分离脂肪干细胞，培养脂肪干细胞，软骨再生干细胞制剂的准备和注射治疗。自体血清培养基培养的脂肪干细胞，提高了该干细胞生长，可获得有效性关节治疗制剂；为促进脂肪干细胞转变成软骨，添加适量生长因子(TGF‑beta,thrombospondin‑2,BMP‑2,BMP‑7)，做成高效干细胞混合制剂；本发明使用了把干细胞混合制剂直接注射到关节腔这种安全方式。

Description

一种软骨再生干细胞制剂及其应用

技术领域

本发明涉及干细胞治疗领域，特别是涉及一种软骨再生干细胞制剂及其应用。

背景技术

干细胞不仅具有自我复制能力，还能分化成其它多种细胞，是一种多潜能细胞。由于干细胞的此种特性，最近数年来利用干细胞的治疗制剂及再生医学领域受到了高度关注。一般干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞涉及伦理问题，并且存在引发癌变的潜在风险。近年来，成体干细胞的分化机理研究和治疗方法及治疗后效果的体系研究正积极展开，骨髓中提取的干细胞和脐带血干细胞在疑难病中的临床治疗效果就是有力地证明了干细胞的重要性。

脂肪干细胞作为成体干细胞的一种，它可分化成脂肪、骨骼、软骨肌肉、心脏、血管和神经等多种细胞及组织，由于脂肪干细胞的分离提取容易，单位体积中含有的干细胞数量多，所以目前以广泛应用于疑难症的研究和提高脂肪干细胞分化成软骨细胞效率的研究居多，有研究表明，添加适量的TGF-beta，thrombospondin-2，BMP-2，BMP-7等生长因子更能提高软骨的分化能力。近些年来，整形美容及再生医学领域也对其进行着广泛的研究和应用，由此可见，脂肪干细胞的市场应用前景极其广泛。

人的关节由关节头和关节窝组成，两个骨骼间形成的关节腔内有起润滑作用的润滑液3-3.5ml。关节是人体组织中承受体重负荷最大的组织，是最容易磨损的部位，关节软骨是一层软骨组织，由软骨细胞和丰富的细胞外基质组成，软骨细胞占软骨总体积的10％，在细胞外基质的合成和分泌中起重要的作用。关节软骨组织没有血管、神经及淋巴组织，如果受损就不会再生，关节损伤严重就会引发退行性关节炎等关节疾病，给日常生活和工作带来极大的不便，软骨损伤严重时只能用新的人工组织代替原有组织，到目前为止，这是唯一的代替不可再生关节的治疗方法，但该方法半永久性的给患者带来极大的经济负担。

虽然利用自体软骨细胞移植的软骨组织再生在近些年的临床中得到应用，但受软骨损伤部位和年龄等的限制，且若软骨大范围受损时不宜使用该法。因此为了克服以上问题，更有预测性的，更加安全的治疗方法就是利用自体干细胞的软骨再生治疗术。脂肪干细胞有可分化成各种细胞的特性，为使其成为适合治疗制剂，如何对其进行有效培养和分化能力最大化也在不断的研发中。

当前脂肪干细胞的关节软骨再生治疗中需要解决以下几个问题：1.通过脂肪干细胞的有效培养增加细胞的数量；2.避免使用牛血清带来的病毒，细菌感染的可能性，免疫反应和感染等副作用；3.寻找使脂肪干细胞向软骨细胞分化最大化的方法。

中国专利CN103087992A公开了一种用于软骨损伤修复的改良脂肪干细胞，通过基因转导技术诱导脂肪干细胞表达骨形态发生蛋白(BMP-4)或转化生长因子(TGF-β3)，这种性能增强的干细胞具有很好的增殖能力和软骨修复能力，是一种很好的用于软骨损伤修复的工具，BMP-4和TGF-β3对干细胞有调节和营养作用，此发明通过病毒载体转导的方法让干细胞充分的表达这些营养因子，这些改良的脂肪干细胞和软骨细胞共培养在成软骨诱导培养基中向软骨细胞分化的能力比普通的脂肪干细胞高，产生更多的II型胶原，形成的软骨球更大更致密，同时，移植的干细胞在体内存活周期延长，延长了生长因子和营养因子对损伤部位的修复作用，促进软骨的生长和伤口的较快愈合。但是，此方法通过病毒载体转导的方式改良干细胞，其实这是一种转基因技术，在没有得到时间证明的情况下，无法预知是否对人体造成损伤，而且干细胞培养会出现癌变，若转导基因，会大大提高癌变几率。

发明内容

为了解决软骨损伤治疗成本高，治疗效果差的问题，我们提出了一种软骨再生干细胞制剂及其应用，采用本发明可以达到降低治疗成本，治疗效果好，治愈能力强，无副作用的目的。

本发明是通过以下技术方案实现的：

为实现上述目的，本发明提供一种软骨再生干细胞制剂及其应用，步骤如下：

(1)血清分离：从患者身上采集50ml血液，在常温中放置1-3小时进行凝固；之后以1000-3000rpm，4℃离心5-20分钟，收集血清；血清用灭菌的0.2μm网过滤，分装后在-20℃条件下长期保存；血清使用前在50-60℃水浴中进行灭活处理20-40分钟。

(2)分离脂肪干细胞：利用一般吸脂术从患者的大腿和/或腹部提取20-30ml脂肪；提取的脂肪组织利用磷酸盐缓冲液PBS(phosphate buffer sulfate)和裂解缓冲液(lysisbuffer)洗涤3-4次以清除红血球；洗涤完毕后在1.5mg/ml胶原酶(collagenase type I)37℃条件下处理0.5-2小时，搅拌反应后1000-2000rpm离心5-20分钟，分离提取出脂肪干细胞；利用100μm细胞筛过滤，过滤液1000-2000rpm离心5-20分钟，分离提取高纯度的脂肪干细胞。

(3)培养脂肪干细胞：分离出的高纯度脂肪干细胞在0.5-2g/L葡萄糖(glucose)，0.5-2％青霉素(penicillin)或链霉素(streptomycin)，含有5-20％血清的DMEM培养基在37℃，5％CO₂浓度条件下培养，24小时后更换培养基清除未附着的细胞并每3天更换一次培养基。

(4)软骨再生干细胞制剂的准备：培养出的脂肪干细胞通过胰酶-EDTA(trypsin-EDTA)处理，用1000-2000rpm离心10分钟，离心完毕后用PBS溶液洗涤3-4次；提取1.0×10⁸个脂肪干细胞；用台盼蓝(trypan blue)染色确认细胞的成活率；在这些细胞中添加4-10ng/ml的细胞生长因子TGF-beta，50-200ug/ml的血小板反应蛋白2(thrombospondin-2)，90-400ng/ml的重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，90-400ng/ml的人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)后再追加1％透明质酸(hyaluronic acid)1-2ml制成自体干细胞混合制剂。

(5)注射治疗：制成的软骨再生干细胞制剂用24-26gaze的针头缓慢注射进关节腔内，剂量为1-3ml。

优选地，上述步骤(3)中血清为自体血清(AS)或胎牛血清(FBS)。异种血清可能带来感染和免疫反应，因此，利用自体血清为治疗载体更为常用，对有多分化能力的脂肪干细胞的培养数量和治疗效果达到最优化。

本发明的有益效果在于：

1、自体血清培养基培养的脂肪干细胞，提高了该干细胞生长，可获得有效性关节治疗制剂。

2、为促进脂肪干细胞转变成软骨，添加适量生长因子(TGF-beta,thrombospondin-2,BMP-2,BMP-7)，做成高效干细胞混合制剂。

3、把干细胞混合制剂直接注射到关节腔这种安全方式。

附图说明

图1：10％的自体血清(AS)和对比血清10％胎牛血清(FBS)中脂肪干细胞的培养及形态确认在显微镜下的结果。

图2A,2B：通过FACS分析，从10％自体血清(AS)和对比血清10％胎牛血清(FBS)中培养出的脂肪干细胞的表现型确认结果。

图3：利用免疫学染色法，确认10％自体血清(AS)和10％对比血清-胎牛血清(FBS)中培养细胞的表现型的结果。

图4A：10％自体血清(AS)和10％对比血清胎牛血清(FBS)中测出的单位时间内脂肪干细胞的数量图。

图4B：利用WST-8分析法体现10％自体血清和(AS)10％对比血清牛血清(FBS)时表现脂肪干细胞增殖的图。

图5：利用Oil red O染色法确认使用10％自体血清和(AS)10％的对比血清牛血清(FBS)时分化成脂肪的分化能力。

图6A：关节内结构。

图6B：关节内注入关节治疗剂—干细胞混合制剂。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一种软骨再生干细胞制剂及其应用，步骤如下：

(1)血清分离：从患者身上采集50ml血液，在常温中放置2小时进行凝固；之后以1800rpm，4℃离心10分钟，收集血清；血清用灭菌的0.2μm网过滤，分装后在-20℃条件下长期保存；血清使用前在56℃水浴中进行灭活处理30分钟。

(2)分离脂肪干细胞：利用一般吸脂术从患者的大腿和/或腹部提取25ml脂肪；提取的脂肪组织利用磷酸盐缓冲液PBS(phosphate buffer sulfate)和裂解缓冲液(lysisbuffer)洗涤3次以清除红血球；洗涤完毕后在1.5mg/ml胶原酶(collagenase type I)37℃条件下处理1小时，搅拌反应后1500rpm离心10分钟，分离提取出脂肪干细胞；利用100μm细胞筛过滤，过滤液1500rpm离心10分钟，分离提取高纯度的脂肪干细胞。

(3)培养脂肪干细胞：分离出的高纯度脂肪干细胞在1g/L葡萄糖(glucose)，1％青霉素(penicillin)或链霉素(streptomycin)，含有10％血清的DMEM培养基在37℃，5％CO₂浓度条件下培养，24小时后更换培养基清除未附着的细胞并每3天更换一次培养基。

(4)细胞培养检测：为确认脂肪干细胞在10％自体血清(AS)和10％胎牛血清(FBS)条件下的培养，在原代培养(PC)和继代培养第3代(passage3；P3)中利用显微镜观察细胞的形态。其结果10％自体血清(AS)和胎牛血清(FBS))条件下肉眼确认了脂肪干细胞形态的一致(图1).。这个结果揭示利用培养脂肪干细胞中使用自体血清是可能的。

(5)FACS分析：细胞表现型分析以含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM为对照，添加有10％自体血清(AS)的DMEM中使用了第3代(P3)的脂肪干细胞。添加0.25％的Trpsin-EDTA(Gibco-BRL)在37℃条件下存放5分钟，1200rpm离心10分钟，获得的细胞利用FACS分析机进行分析。此时使用的抗体是PE-，PE-cy5或FITC-conjugated抗体的CD13(IgG1,PE)，CD29(IgG1，PE-cy5)，CD31(IgG1，PE)，CD34(IgG1，FITC)，CD44(IgG1，FITC)--(BD pharmingen)。细胞用PBS洗涤，再稀释加入荧光标记，在4℃避光环境中进行20分钟的染色。有荧光标记的细胞用1％paraformaldehyde固定后使用FACS分析机进行分析。

为确认自体血清(AS)和胎牛血清(FBS)中脂肪干细胞的表现特性，使用了FACS，FACS结果使用胎牛血清(FBS)和自体血清(AS)培养的所有脂肪干细胞中发现了带有间充质干细胞特性的CD13，CD29，CD44。未发现造血母细胞特性的CD34和内皮细胞特性的CD31(图2)。并且确认到CD13，CD29，CD4在10％自体血清(AS)里的表现更高于胎牛血清中(图2)。这些结果提示使用自体血清(AS)培养脂肪干细胞能更有效能维持和提高干细胞的特性。

(6)免疫学染色：培养3-4天的细胞在含有4％paraformaldehyde的PBS溶液中进行10分钟的处理固定，并把固定液用PBS做了3次洗涤(每次5分钟)。为细胞的标记使用了PE-，PE-cy5或FITC-conjugated抗体CD13(IgG1，PE)，CD29(IgG1，PE-cy5)，CD31(IgG1，PE)，CD34(IgG1，FITC)，CD44(IgG1，FITC)(BD pharmingen)。再用PBS洗涤细胞3次，PBS中溶解4’,6’-diamindino-2-phenylindole(DAPI；Molecular Probes)成10ng/ml浓度进行了最后的洗涤，使其显现细胞核的荧光像对比颜色并在显微镜下检测到了免疫荧光颜色带阳性的细胞。

使用免疫学染色法确认到，利用10％自体血清(AS)和10％胎牛血清(FBS)培养的脂肪干细胞中的干细胞代表因子CD44。其结果在FACS分析中也得到了一致确认CD44(图3)。这些结果表明使用自体血清(AS)培养脂肪干细胞时同样持有干细胞特性。

(7)细胞增殖分析：为分析细胞增殖采用了hemocytometry和WST-8(DojindoLaboratory)方法，这两种方法中使用了第3代(P3)脂肪干细胞。Hemocytometry方法是把脂肪干细胞在6孔板的各孔里各添加5×104个的细胞进行24小时培养。后利用0.25％trypsin-EDTA(Gibco-BRL)分离细胞再利用hemocytometer和trypan blue测定了细胞数。WST-8分析是96-well plate的各孔里各添加1×103个细胞培养48-72小时后利用650nm和450nm波长的Biotek EL-312e microplate reader酶标仪(Biotek Instruments，Winooski，VT)中经过测定。其中测定的各群体的平均值和标准偏差是4个孔中得出的值，用relative proliferation(％)表示。

为10％自体血清(AS)和胎牛血清(FBS)中确认脂肪干细胞的倍增时间，分别在12小时，22小时，44小时，66小时利用血球计数板测定了细胞数。结果确认细胞增殖最活跃的生长期(log phage)中10％自体血清(AS)的脂肪干细胞doubling time为15小时，10％胎牛血清(FBS)的脂肪干细胞doubling time为20小时(图4A)。即确认到10％自体血清(AS)中的脂肪干细胞的增殖比10％胎牛血清(FBS)快。利用WST-8分析法，分别10％自体血清(AS)和10％胎牛血清(FBS)中的脂肪干细胞增殖再确认结果表明，从48小时-72小时内使用10％自体血清(AS)的脂肪干细胞的增殖速度远高于胎牛血清(FBS)(图4B)。这些结果提示使用10％自体血清(AS)培养脂肪干细胞的效果远高于10％胎牛血清(FBS)。

(8)确认自体血清中培养的脂肪干细胞的分化：通过oil red O染色法评价了自体血清中培养的脂肪干细胞的分化和转化成脂肪的能力。把脂肪干细胞1×104/cm²添加到multiple-well plate，含有10％自体血清(AS)和胎牛血清(FBS)的DMEM培养液里进行了24小时的培养(Day 0)。后利用adipogenesis differentiation medium(StemProAdipogenesis Differentiation Kit,Gibco invitrogen)更换了培养基3天(Day1-3)。第4天为确认脂肪干细胞的脂肪分化进行了oil red O染色。培养的细胞用10％formaldehyde在常温中固定5分钟后利用60％isopropanol洗涤，再把固定的细胞用2％oil red O溶液在常温中进行10分钟的染色确认了细胞内的脂肪积蓄。为清除过度染色利用70％的酒精和蒸馏水进行了洗涤。

10％胎牛血清(FBS)中培养的脂肪干细胞一般能够分化成脂肪，肌肉，骨骼(软骨)，神经。为确认利用自体血清(AS)培养脂肪干细胞时的分化能力做以下实验。用10％自体血清(AS)和10％胎牛血清(FBS)条件下培养的脂肪干细胞通过oil red O染色法进行了分析(图5)。其结果两者都确认了培养的脂肪干细胞转化成脂肪。结果提示利用10％自体血清(AS)培养的脂肪干细胞维持分化能力并分化成其它组织(如肌肉，骨骼，神经等)。

(9)软骨再生干细胞制剂的准备：培养出的脂肪干细胞通过胰酶-EDTA(trypsin-EDTA)处理，用1500rpm离心10分钟，离心完毕后用PBS溶液洗涤3次；提取1.0×10⁸个脂肪干细胞；用台盼蓝(trypan blue)染色确认细胞的成活率；在这些细胞中添加6ng/ml的细胞生长因子TGF-beta，100ug/ml的血小板反应蛋白2(thrombospondin-2)，200ng/ml的重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，200ng/ml的人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)后再追加1％透明质酸(hyaluronic acid)1.5ml制成自体干细胞混合制剂。

(10)注射治疗：制成的软骨再生干细胞制剂用25gaze的针头缓慢注射进关节腔内，剂量为2ml(图6A,B)。

Claims (1)

1.一种软骨再生干细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)血清分离：从患者身上采集50ml血液，在常温中放置1-3小时进行凝固；之后以1000-3000rpm，4℃离心5-20分钟，收集血清；血清用灭菌的0.2μm网过滤，分装后在-20℃条件下长期保存；血清使用前在50-60℃水浴中进行灭活处理20-40分钟；

(2)分离脂肪干细胞：利用一般吸脂术从患者的大腿和/或腹部提取20-30ml脂肪；提取的脂肪组织利用磷酸盐缓冲液PBS和裂解缓冲液洗涤3-4次以清除红血球；洗涤完毕后在1.5mg/ml胶原酶37℃条件下处理0.5-2小时，搅拌反应后1000-2000rpm离心5-20分钟，分离提取出脂肪干细胞；利用100μm细胞筛过滤，过滤液1000-2000rpm离心5-20分钟，分离提取高纯度的脂肪干细胞；

(3)培养脂肪干细胞：分离出的高纯度脂肪干细胞在0.5-2g/L葡萄糖，0.5-2％青霉素或链霉素，含有5-20％血清的DMEM培养基在37℃，5％CO2浓度条件下培养，24小时后更换培养基清除未附着的细胞并每3天更换一次培养基；

(4)软骨再生干细胞制剂的准备：培养出的脂肪干细胞通过胰酶-EDTA处理，用1000-2000rpm离心10分钟，离心完毕后用PBS溶液洗涤3-4次；提取1.0×10⁸个脂肪干细胞；用台盼蓝染色确认细胞的成活率；在这些细胞中添加4-10ng/ml的细胞生长因子TGF-beta，50-200ug/ml的血小板反应蛋白2，90-400ng/ml的重组人骨形态发生蛋白-2，90-400ng/ml的人骨形态发生蛋白-7后再追加1％透明质酸1-2ml制成自体干细胞混合制剂；

所述步骤(3)中血清为自体血清。