CN105175639A

CN105175639A - 一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法

Info

Publication number: CN105175639A
Application number: CN201510729314.XA
Authority: CN
Inventors: 陈涛; 高宝娇; 史楠
Original assignee: North University of China
Current assignee: North University of China
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明属于功能高分子与蛋白质工程技术领域，提供了一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法，通过甲基丙烯酰氯与羟基之间快速的酯化反应，使在聚乙烯醇微球表面形成大量的可聚合的双键；利用在水溶液中过硫酸铵/亚硫酸氢钠氧化还原引发体系作用下，使微球表面的双键与水溶液中对苯乙烯磺酸钠之间发生聚合反应，简捷地实现单体对苯乙烯磺酸钠在微球表面发生接枝聚合，快捷地制得了接枝吸附微球CPVA-<i>g</i>-PSSS。该吸附微球可以简便、高效的分离提取胰蛋白酶，对于胰蛋白酶的分离提取具有积极的参考价值。

Description

一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法

技术领域

本发明属于功能高分子与蛋白质工程技术领域，具体涉及一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法。

背景技术

胰蛋白酶是存在于动物胰脏中的一类蛋白水解酶，是一种碱性蛋白质。其属于肽链内切酶，对肽链中的精氨酸、赖氨酸的肽键处具有选择性的水解作用，能够把各类蛋白质水解为多肽或氨基酸。胰蛋白酶不仅在食品、医药、工业上有着重要及广泛的应用，还在蛋白质的测序及序列分析上有着广阔的应用。

胰蛋白酶由动物胰脏中提取，然后再进行分离纯化。在蛋白质的各种分离纯化技术中，吸附法具有简便、高效与低成本的优点。由于碱性蛋白质在一般的pH条件下，其大分子链携带正电荷，故分离碱性蛋白质常用的吸附材料为阳离子交换树脂。阳离子交换树脂虽然对碱性蛋白质可产生吸附作用，但在水介质中只能发生一定程度的溶胀，对蛋白质大分子链的吸附不但传质阻力大，而且吸附容量受限。

对于水介质中蛋白质的吸附而言，具有聚电解质接枝刷结构的固体微粒是最适合的固体材料[WangS-Y,ChenK-M,KayitmazerAB,LiL,GuoX-H.ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces,107(2013)251–256]。在水介质中，聚电解质接枝刷可以充分地伸展开来，从而可与蛋白质大分子链保持充分接触，凭借主-客体之间的强静电相互作用力，对蛋白质发生高效的吸附作用，而且还能维持蛋白质的构象，保持蛋白质的功能[WittemannA,BallauffM.AnalyticalChemistry,76(2004)2813–2819]。

发明内容

针对上述现状，本发明的目的在于提供一种新型的、具有接枝刷结构的固体吸附微球的制备方法，使其制备的吸附微球具有良好的吸附胰蛋白酶的特性，同时还能够维持其构象，保持其功能。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是，提供一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法，通过甲基丙烯酰氯与羟基之间快速的酯化反应，使在聚乙烯醇微球表面形成大量的可聚合的双键；利用在水溶液中过硫酸铵/亚硫酸氢钠氧化还原引发体系作用下，使微球表面的双键与水溶液中对苯乙烯磺酸钠之间发生聚合反应，简捷地实现单体对苯乙烯磺酸钠在微球表面发生接枝聚合，快捷地制得了接枝吸附微球CPVA-g-PSSS。

一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法，具体步骤如下：

步骤一，将含有4%～9%的交联聚乙烯醇微球浸泡在无水丙酮溶液中12h，使微球充分的溶胀，然后再加入5%～10%的甲基丙烯酰氯以及一定量的缚酸剂无水碳酸钠，在30℃～45℃条件下反应6h～12h。制得表面键合有大量可聚合双键的改性微球。

步骤二，在装有搅拌器、冷凝管及温度计的四口烧瓶中，加入含量为0.5%～2%的改性微球MAO-CPVA，在蒸馏水中浸泡溶胀12h；然后加入10%～20%的对苯乙烯磺酸钠SSS，通N₂气30min以排除空气；升温至25℃～40℃后，再加入0.05%～0.1%的亚硫酸氢钠和0.1%～0.2%的过硫酸铵，搅拌并在N₂保护条件下使对苯乙烯磺酸钠SSS发生接枝聚合反应8h～14h。反应结束后，过滤、蒸馏水冲洗，然后真空干燥至恒重，得到接枝吸附微球CPVA-g-PSSS。

本发明的有益效果是：所制备的具有接枝刷结构的固体吸附微粒，吸附微球CPVA-g-PSSS上充分伸展开的阴离子聚电解质接枝刷可与胰蛋白酶分子保持充分的接触，凭借两者之间的强静电相互作用力，对胰蛋白酶产生高效的吸附作用，同时还能够维持胰蛋白酶的构象，保持其功能。本发明的研究结果为胰蛋白酶的分离纯化提供了新的方法，在胰蛋白酶的分离与纯化领域具有积极的参考价值。

附图说明

图1是改性微球MAO-CPVA化学反应过程；

图2是接枝微球CPVA-g-PSSS化学反应过程。

具体实施方式

如图1、2所示，以具体实施例对制备方法进行说明。

实施例1

将2g交联微球CPVA置于40mL的丙酮中，浸泡12h，使微球充分溶胀，加入2mL的甲基丙烯酰氯MAC及少量缚酸剂碳酸钠，恒温于40℃，使MAC的酰氯基团与CPVA微球表面的羟基发生酯化反应，8h后结束反应，制得表面键合有甲基丙烯酰基的改性微球MAO-CPVA。

在装有搅拌器、冷凝管及温度计的四口烧瓶中，加入65mL蒸馏水和0.5g改性微球MAO-CPVA浸泡溶胀12h；然后加入9.8g对苯乙烯磺酸钠SSS，通N₂气30min以排除空气；升温至35℃后，再加入0.049g亚硫酸氢钠和0.098g过硫酸铵，搅拌并在N₂保护条件下使SSS发生接枝聚合反应10h后结束反应；过滤收集产物微球，然后用蒸馏水反复洗涤，真空干燥至恒重，即制备得到接枝吸附微球CPVA-g-PSSS，接枝度为17mg/g。

实施例2

将4g交联微球CPVA置于60mL的丙酮中，浸泡12h，使微球充分溶胀，加入5mL的甲基丙烯酰氯MAC及少量缚酸剂碳酸钠，恒温于35℃，使MAC的酰氯基团与CPVA微球表面的羟基发生酯化反应，10h后结束反应，制得表面键合有甲基丙烯酰基的改性微球MAO-CPVA。

在装有搅拌器、冷凝管及温度计的四口烧瓶中，加入80mL蒸馏水和2g改性微球MAO-CPVA浸泡溶胀12h；然后加入18g对苯乙烯磺酸钠SSS，通N₂气30min以排除空气；升温至30℃后，再加入0.09g亚硫酸氢钠和0.17g过硫酸铵，搅拌并在N₂保护条件下使SSS发生接枝聚合反应14h后结束反应；过滤收集产物微球，然后用蒸馏水反复洗涤，真空干燥至恒重，即制备得到接枝吸附微球CPVA-g-PSSS，接枝度为15.5mg/g。

实施例3

将3g交联微球CPVA置于55mL的丙酮中，浸泡12h，使微球充分溶胀，加入5mL的甲基丙烯酰氯MAC及少量缚酸剂碳酸钠，恒温于30℃，使MAC的酰氯基团与CPVA微球表面的羟基发生酯化反应，12h后结束反应，制得表面键合有甲基丙烯酰基的改性微球MAO-CPVA。

在装有搅拌器、冷凝管及温度计的四口烧瓶中，加入80mL蒸馏水和1g改性微球MAO-CPVA浸泡溶胀12h；然后加入15g对苯乙烯磺酸钠SSS，通N₂气30min以排除空气；升温至40℃后，再加入0.055g亚硫酸氢钠和0.12g过硫酸铵，搅拌并在N₂保护条件下使SSS发生接枝聚合反应8h后结束反应；过滤收集产物微球，然后用蒸馏水反复洗涤，真空干燥至恒重，即制备得到接枝吸附微球CPVA-g-PSSS，接枝度为16mg/g。

将20mL浓度不同的胰蛋白酶磷酸盐缓冲液分别置于若干个50mL的具塞锥形瓶中，加入准确称取的质量为0.05g的功能接枝微球CPVA-g-PSSS，于25℃恒温振荡6.5h后，离心分离，测定上清液中胰蛋白酶的浓度，计算得接枝微球CPVA-g-PSSS对胰蛋白酶的饱和吸附量为66mg/g。

经过对吸附性能的测试可明确利用本发明所提供的制备方法所制备的接枝微球CPVA-g-PSSS吸附效率高，为胰蛋白酶的分离纯化提供了新的方法，在胰蛋白酶的分离与纯化领域具有积极的参考价值，同时也可类比本领域内其他蛋白酶的吸附微粒的制备。以上虽然已参照典型实施例描述了本申请，但应当理解，所用的术语是说明和示例性、而非限制性的术语。由于本申请能够以多种形式具体实施而不脱离发明的精神和实在，所以应当理解，上述实施例不限于任何前述的细节，而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释，因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和调整都应为随附权利要求所涵盖。

Claims

1.一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法，其步骤如下：

步骤一，使交联聚乙烯醇微球在无水丙酮中浸泡数小时，使其充分溶胀后，使其与甲基丙烯酰氯及定量的缚酸剂发生酯化反应，从而形成表面含有大量可聚合双键的改性微球MAO-CPVA；

步骤二，将改性微球MAO-CPVA浸泡在装有蒸馏水的四口瓶中数小时，再加入对苯乙烯磺酸钠，然后通氮气以排除空气；将亚硫酸氢钠、过硫酸铵分别加入到上述体系中，在一定温度下进行接枝聚合反应数小时，过滤后用蒸馏水冲洗，然后烘干至恒重，得到具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球CPVA-g-PSSS。

2.根据权利要求1所述一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法，其特征在于：步骤一中所述交联聚乙烯醇微球的含量为4~9%，交联聚乙烯醇溶胀时间为12h；所述甲基丙烯酰氯的含量为5~10%；所述缚酸剂选用无水碳酸钠；所述酯化反应温度为30~45℃，反应时间为6~12h。

3.根据权利要求1所述一种具有接枝刷的胰蛋白酶吸附微球的制备方法，其特征在于：步骤二中所述改性微球MAO-CPVA的含量为0.5~2%，对苯乙烯磺酸钠的含量为10~20%；所述反应温度为25~40℃，反应时间为8~14h；所述体系中亚硫酸氢钠含量为0.05~0.1%，过硫酸铵含量为0.1~0.2%。