CN105165616A

CN105165616A - 一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法

Info

Publication number: CN105165616A
Application number: CN201510640526.0A
Authority: CN
Inventors: 史俊; 贾君; 席刚俊; 汪善锋; 徐超; 杨鹤同
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105165616B

Abstract

本发明公开了一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，它将三叶青当年生半木质化茎段经过消毒，漂洗后，剪成带1～2个腋芽的小段接种于固体培养基中培养；待腋芽萌发后将其接种到增殖培养基上进行培养，每过50～60天转接一次，直到达到需要的种苗量，再将其接种到生根培养基上进行生根培养，50～60天后，当三叶青小苗生长出2～3条根，即可进行驯化移栽。与现有技术相比，本发明可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，增殖速度快，变异率低，种苗整齐健壮，生产成本低，运输方便，移栽成活率高等优势。

Description

一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法

技术领域

本发明属于植物的栽培技术领域，具体涉及一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法。

背景技术

三叶青，学名：三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg)，又名金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠，属鼠李目，葡萄科，崖爬藤属草质藤本。为我国特有药用植物，广泛分布于长江以南各省份,主要有浙江、江西、福建、湖南、湖北、广东、广西、贵州、重庆、四川、西藏、云南、海南和台湾等地区，常生于山坡林下的灌丛中或山谷溪边林下的岩石缝中，生长海拔300～1300m

三叶青全草均可入药，以地下块根和果实的药用效果最好。其性平、味微苦，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效，主治毒蛇咬伤、扁桃体炎、淋巴结结核、跌打损伤、小儿高热惊厥等疾病。目前临床上还应用于抗癌、抗艾滋病毒,治疗血液病、心脑血管疾病、肝炎、病毒性脑膜炎等疾病。

目前三叶青主要依赖于野生挖掘，近年来，由于过度采挖和生境破坏，致使铁三叶青野生资源已濒临灭绝，人工栽培已刻不容缓，但人工栽培存在种苗供应不足，通过组培的方法快速繁殖种苗有很大的市场价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，以解决现有技术存在的栽培效率不高的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，它包括如下步骤：

(1)选取三叶青的枝条，去除叶片后剪成5～10cm的茎段，用去污剂清洗10min后，再用流水冲洗10min；将剪切冲洗后的三叶青茎段于体积分数为75％的乙醇水溶液中浸泡30～60s，再于氯化汞水溶液中浸泡5～8min；最后用无菌水冲洗3～5次后备用；

(2)将经步骤(1)处理后的三叶青茎段剪成带1～2个腋芽的小段，接种于固体培养基中；培养40～50天后腋芽萌发，摘取芽长1～2cm的腋芽备用；

(3)将步骤(2)中所得的腋芽置于增殖继代培养基中培养50～60d；培养完成后，三叶青腋芽生长成无根小苗且在茎节处产生腋芽；

(4)将步骤(3)中所得三叶青无根小苗剪成带1个腋芽的小段(或腋芽)并移至壮苗生根培养基中培养50～60天，得到三叶青成苗；

(5)选取步骤(4)中得到的4～5cm高，有2～3条根的三叶青成苗移到温室中，驯化培养10～15天后，用水冲洗去除培养基后，将三叶青成苗移栽到铺有营养土的苗床上，并遮阴保湿；待三叶青成苗的苗高达到15cm后，即可进行大田移栽。

其中，为了繁殖出足够多的可以进行步骤(4)中操作的三叶青无根小苗，可选取步骤(3)中所得的侧芽长度大于1cm的三叶青无根小苗重新剪成带1个腋芽的小段(或腋芽)接种于新的增殖继代培养基中，重复步骤(3)中的培养过程。每转接1次，增殖系数达3～4。当繁殖出足够数量的小苗时，将所得的三叶青无根小苗进行步骤(4)中操作。

其中，对于上述步骤中是选择带腋芽的小段还是腋芽接种于新的增殖继代培养基中，重复步骤(3)中的培养过程，根据三叶青无根小苗的实际生长情况而定。若无根小苗的基部腋芽较长，则剪取腋芽，若顶部腋芽较短，则剪取带1个腋芽的小段

步骤(1)中，所述的三叶青枝条为当年生半木质化茎段。

步骤(1)中，所述的去污剂为家用洗衣粉。

步骤(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的质量分数为0.1％～0.15％。

步骤(2)中，培养条件为22～25℃，光照强度为300～1000勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的固体培养基的配方包括：6-苄氨基嘌呤0～1.0mg/L+蔗糖25～30g/L+琼脂4.5～6g/L+土豆汁60～80g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.6～5.8；其中，固体培养基的优选配方为6-苄氨基嘌呤1.0mg/L+蔗糖30g/L+MS培养基+琼脂6g/L+土豆汁60g/L+活性炭0.5g/L+pH5.8。

步骤(3)中，培养条件为25～28℃，光照强度为1000～2000勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的增殖继代培养基的配方包括：6-苄氨基嘌呤0～1.0mg/L+萘乙酸0～0.5mg/L+土豆汁60～80g/L+蔗糖25～30g/L+琼脂4.5～6g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.6～5.8；其中，增殖继代培养基的优选配方为6-苄氨基嘌呤1.0mg/L+萘乙酸0.5mg/L+土豆汁60g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.8。

步骤(4)中，培养条件为25～28℃，光照强度为1000～2000勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的壮苗生根培养基的配方包括：萘乙酸0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+香蕉汁60～80g/L+琼脂4.5～6g/L+活性炭0.5g/L+White培养基+pH5.6～5.8；其中，壮苗生根培养基的优选配方为萘乙酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+香蕉汁60g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L+White培养基+pH5.8。

步骤(5)中，温室内温度为28～33℃，光照强度为6000～8000勒克斯。

步骤(5)中，所述的营养土由泥碳土和蛭石以3：1的体积比混合而成。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，增殖速度快，变异率低，种苗整齐健壮，生产成本低，移栽成活率高等优势。

2、三叶青的茎段消毒后，剪成带1～2个腋芽的小段接种到步骤(2)中的固体培养基中，采用MS并配以适当的激素，与现有的三叶青腋芽萌发培养基相比，该方法腋芽萌发并长到1～2cm的时间缩短10～15d，并且萌芽率高达80％以上，变异率小于1％，出芽整齐。

3、步骤(3)所述的继代增殖培养基中，采用MS并配以适当生长素和细胞分裂素，与传统的继代增殖培养基相比，该方法能更好更快的促进小苗生长和分枝，增殖系数可达到3～4。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

(1)剪取三叶青的茎段，去除叶片，剪成10cm左右的小段，用家用洗衣粉清洗10min，再用流水冲洗10min，将清洗干净的枝条带入超净工作台，75％体积分数的酒精浸泡45s，再放置于氯化汞水溶液中浸泡6min；无菌水冲洗3～5次。

(2)将步骤(1)得到的三叶青的无菌茎段剪成带1～2个腋芽的小段接种于固体培养基中，在22～25℃、光照度700勒克斯左右，光照时间12h/d的条件下，培养45d左右，腋芽萌发，当芽长至1～2cm时，取腋芽备用；其中，所述的固体培养基组成为：6-苄氨基嘌呤1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+土豆汁60g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.8。

(3)将步骤(2)得到的腋芽置于增殖继代培养基中，在25～28℃、光照度1500勒克斯左右、光照时间12h/d的条件下培养50～60d，三叶青腋芽生长无根小苗并在茎节处产生侧芽，等侧芽长至1cm长时，将小苗重新剪成带1个腋芽的小段重新接种到新的增殖培养基，继续培养，每转接一次，增殖系数达3～4；黄化、白化等不良变异率低于1％，直至繁殖出所需的种苗数量，可转入壮苗生根培养。其中，所述的继代增殖培养基组成为：6-苄氨基嘌呤1.0mg/L+萘乙酸0.5mg/L+土豆汁60g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.8；此配方种苗增殖率高，增殖速度快，且变异率较低，通常低于1％。

(4)将步骤(3)得到的三叶青小苗剪成带1个腋芽的小段并转移到壮苗生根培养基中，在25～28℃、光照1500勒克斯左右、光照时间12h/d的条件下培养50～60d，当三叶青小苗长成4～5cm高，有2～3条根时，即可进行驯化移栽，其中，所述的壮苗生根培养基组成为：萘乙酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+香蕉汁60g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L+White培养基+pH5.8。

(5)将步骤(4)得到的成苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后放入温室，移置铺有营养土的苗床上，并遮阴保湿，待小苗长到15cm高时，即可进行大田移栽，移栽成活率达90％以上；其中，温室内温度为28～33℃，光照强度为6000～8000勒克斯。

实施例2：

与实施例1基本相同，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中腋芽萌发，继代增殖培养、壮苗培养三个阶段分别以表1所列培养基组合进行筛选，以优选最适培养基组合配方。表1说明如下：

①培养基配方优化主要是设计不同的基础培养基、激素浓度等对培养基进行了优化设计,本实例中均设计成固体培养基，每种配方中琼脂浓度均为6g/L,蔗糖为30g/L，培养环境为温度25℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间12h/d培养室内。②针对生产，不同的培养阶段设计了培养基配方，三叶青腋芽萌发阶段主要观察腋芽萌发的快慢、长势、颜色(翠绿为佳)等指标判断配方是否合理；继代增殖阶段主要观察小苗分枝情况(越多越好)、玻璃化程度(越低越好)，发生黄化、白化等变异的程度(越低越好)等指标判断配方是否合理；壮苗生根培养阶段，主要通关观察苗的生长势、生根情况、玻璃化程度(越低越好)、颜色等指标来判断配方的好坏。通过观察和各项指标的测定，并用“★”和“☆”的多少代表配方的好坏，★越多表示越好，☆比★要低一个等次。

表1培养基配方筛选

试验表明，腋芽萌发阶段(步骤2)18种配方组合中，基础培养基和激素组合范围为6-苄氨基嘌呤0～1.0mg/L+蔗糖25～30g/L+琼脂4.5～6g/L+土豆汁60～80g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.6～5.8；在此培养基范围内，腋芽萌发速度快，生长旺盛，是较适宜的组合配方组合，带腋芽的茎段接种培养基后40～50d，腋芽萌发，并长至1～2cm；继代增殖阶段(步骤3)32种配方组合中，基础培养基、激素及天然添加物组合范围为6-苄氨基嘌呤0～1.0mg/L+萘乙酸0～0.5mg/L+土豆汁60～80g/L+蔗糖25～30g/L+琼脂4.5～6g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.6～5.8；在此培养基范围内，苗的生长势良好、增殖速度快、玻璃化程度低，50～60d可继代转接一次，增殖系数可达3～4；壮苗阶段(步骤4)，结果表明，萘乙酸0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+香蕉汁60～80g/L+琼脂4.5～6g/L+活性炭0.5g/L+White培养基+pH5.6～5.8为优选培养基配方组合。在试验中还发现土豆对三叶青腋芽萌芽及小苗的增殖发有较好的促进作用，香蕉汁有利于三叶青小苗的壮苗生根。

Claims

1.一种高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选取三叶青的枝条，去除叶片后剪成5～10cm的茎段，用去污剂清洗10min后，再用流水冲洗10min；将剪切冲洗后的三叶青茎段于体积分数为75％体积分数的乙醇水溶液中浸泡30～60s，再于氯化汞水溶液中浸泡5～8min；最后用无菌水冲洗3～5次后备用；

(3)将步骤(2)中所得的腋芽置于增殖继代培养基中培养50～60d；培养完成后，三叶青腋芽生长成无根小苗且在茎节处产生侧芽；

(4)将步骤(3)中所得三叶青无根小苗剪成带1个腋芽的小段并移至壮苗生根培养基中培养50～60天，得到三叶青成苗；

(5)选取步骤(4)中得到的4～5cm高，有2～3条根的三叶青成苗移到温室中，驯化培养10～15天后，用水冲洗去除培养基后，将三叶青成苗移栽到铺有营养土的苗床上；待三叶青成苗的苗高达到15cm后，即可进行大田移栽。

2.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的三叶青枝条为当年生半木质化茎段。

3.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的去污剂为家用洗衣粉。

4.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的质量分数为0.1％～0.15％。

5.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养条件为22～25℃，光照强度为300～1000勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的固体培养基的配方包括：6-苄氨基嘌呤0～1.0mg/L+蔗糖25～30g/L+琼脂4.5～6g/L+土豆汁60～80g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.6～5.8。

6.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(3)中，培养条件为25～28℃，光照强度为1000～2000勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的增殖继代培养基的配方包括：6-苄氨基嘌呤0～1.0mg/L+萘乙酸0～0.5mg/L+土豆汁60～80g/L+蔗糖25～30g/L+琼脂4.5～6g/L+活性炭0.5g/L+MS培养基+pH5.6～5.8。

7.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(4)中，培养条件为25～28℃，光照强度为1000～2000勒克斯，光照时间为11～13h/d；其中，所述的壮苗生根培养基的配方包括：萘乙酸0.2～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+香蕉汁60～80g/L+琼脂4.5～6g/L+活性炭0.5g/L+White培养基+pH5.6～5.8。

8.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(5)中，温室内温度为28～33℃，光照强度为6000～8000勒克斯。

9.根据权利要求1所述的高效快速繁殖三叶青试管苗的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的营养土为由泥碳土和蛭石以3：1的体积比混合而成。