CN105165606B - 一种黑木相思人工种子制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑木相思人工种子制备方法，包括外植体处理、诱导培养、增殖培养、人工种子制作和人工种子贮藏的步骤，其中诱导培养使用的诱导培养基为MS+0.3‑0.7mg/L 6‑BA+0.08‑0.12mg/L IBA+25‑35g/L蔗糖+琼脂，增殖培养使用的增殖培养基为MS+0.5‑0.7mg/L 6‑BA+0.15‑0.25mg/L NAA+25‑35g/L蔗糖+琼脂，最终制作的人工种子盛入无菌大培养皿并密封后，于4℃条件下黑暗保存。本发明的方法不受季节限制，具有更好的营养供应和抗病能力，并且方便贮藏和运输，人工种子栽培出的幼苗成活率近100％，且无表型变异。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是一种黑木相思人工种子制备方法。
背景技术
黑木相思(A.melanoxylon)原产地为澳大利亚南部，为相思类最高大乔木之一，最高可达35m，胸径1～1.5m，由于种源差异较大，也有些仅高10～20m，胸径0.5m。黑木相思因其木纹美丽、材质好，在家具及贴面板材上具有很高的应用价值。且木材的声学性能优异，常作为优质小提琴背板。黑木相思的心材呈棕色至黑棕色，间有红色条纹，木纹整齐且有斑点状、雨点状、鸟眼状、提琴状的美丽图案。黑木相思耐寒、耐旱、耐瘠、具固氮根瘤，改土性能好，适合在我国的福建南部、广东、广西南部、海南等地生长。黑木相思属强阳性树种，喜光、耐干旱、耐瘠薄、寿命长，能耐-6℃低温。浅根型，侧根发达，在土层30cm以上的酸性土壤上生长良好。有固氮根瘤，枯落物丰富，改土性能好，是荒山、“四旁”、园林、公路的优良绿化树种，对氟化氢、二氧化硫、氯气抗性强，也可作污染区的绿化树种，还是良好的蜜源植物和绿肥资源。
目前国内黑木的采种园少，国内生产的种子数量完全不能满足市场需要，因此种子的主要来源是澳大利亚进口，一般都是澳大利亚没有改良的原生种，原生种子苗由于不经过改良对国内气候的适应性差，且分化严重。林业上一般采取无性系苗造林，可以解决上述问题。获得无性苗的方法，通常利用优树为材料进行扦插繁或组织培养技术，但目前黑木的组培技术有待进一步优化，组培苗在国内也相当的少价格也较高。扦插繁殖技术由于存在部位效应，需要采取顶部枝条。但是，优树一般树体高大且都是成年树，不易采到顶部枝条，同时，由于树体老化，扦插也不易成活。
农业生产中使用的天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。种皮通常在种子的外层起保护作用；胚乳含有大量的营养物质，是种苗萌发生长不可缺少的营养来源；胚由胚芽、胚轴、胚根和子叶构成，将来发成植株。随着农业生物技术的发展，通过组织培养技术，可把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有于叶、根、茎分生组织的结构。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。所谓人工种子，就是将组织培养产生的体细胞胚和性细胞胚包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜，形成一种类似于种子的结构。
目前，人工种子的制备已经在多种植物，尤其是天然种子稀缺的植物的制备中获得成功，从而为这些植物的繁殖提供大量种子。由于黑木相思在这方面还缺乏相关研究，因此目前还没有黑木相思人工种子的报道。
发明内容
本发明提供一种黑木相思人工种子制备方法，不受季节限制，幼苗成活率近100％。
一种黑木相思人工种子制备方法，包括如下步骤：
(1)外植体处理：将采回的黑木相思枝条剪去叶片，用1-3％洗衣粉溶液浸泡清洗3-7分钟，再用自来水冲洗干净；在超净工作台上用70-75％的乙醇震荡漂洗10-50秒，用无菌水冲洗1-3次后，用0.08-0.12％的升汞溶液消毒5-10分钟，用无菌水冲洗3-7次，吸干水；
(2)诱导培养：截取带1～2个腋芽茎段接种于诱导培养基上，上述诱导培养基为MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.08-0.12mg/L IBA+25-35g/L蔗糖+琼脂，进行暗培养6-8天后转到光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出不定芽；
(3)增殖培养：将上述诱导培养产生的不定芽转到增殖培养基上，上述增殖培养基为MS+0.5-0.7mg/L 6-BA+0.15-0.25mg/L NAA+25-35g/L蔗糖+琼脂，光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出丛生芽；任选地，在上述增殖培养条件下，每25～30天继代培养一次，上述继代培养使用上述增殖培养基；
(4)人工种子制作：将1/2MS+0.3-0.5mg/L IBA+3.0～5.0％海藻酸钠+1.0～3.0％壳聚糖溶液注入试管，将上述步骤(3)中增殖得到的丛生芽移进上述试管中的溶液内部，用2.0～3.0％CaCl2溶液注入上述试管内壁，凝固5～10min，用清水冲洗出上述试管内的固化凝胶即得人工种子；
(5)人工种子贮藏：将上述(4)制作的人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm-M膜密封后，于4℃条件下黑暗保存。
作为本发明的优选方案，上述步骤(1)的外植体处理具体为：将采回的黑木相思枝条剪去叶片，用2％洗衣粉溶液浸泡清洗5分钟，再用自来水冲洗干净；在超净工作台上用75％的乙醇震荡漂洗30秒，用无菌水冲洗1次后，用0.1％的升汞溶液消毒7分钟，用无菌水冲洗5次，吸干水。
作为本发明的优选方案，上述步骤(2)的诱导培养具体为：截取带1～2个腋芽茎段接种于诱导培养基上，上述诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+琼脂，进行暗培养7天后转到光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出不定芽。
作为本发明的优选方案，上述步骤(3)的增殖培养具体为：将上述诱导培养产生的不定芽转到增殖培养基上，上述增殖培养基为MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+琼脂，光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出丛生芽；任选地，在上述增殖培养条件下，每25～30天继代培养一次，上述继代培养使用上述增殖培养基。
作为本发明的优选方案，上述步骤(4)的人工种子制作具体为：将1/2MS+0.4mg/LIBA+4.0％海藻酸钠+2.0％壳聚糖溶液注入试管，将上述步骤(3)中增殖得到的丛生芽移进上述试管中的溶液内部，用2.5％CaCl2溶液注入上述试管内壁，凝固5～10min，用清水冲洗出上述试管内的固化凝胶即得人工种子。
作为本发明的优选方案，上述步骤(3)中进行30代上述继代培养。
本发明的方法使黑木相思幼苗生产除了不受季节限制外，还具有更好的营养供应和抗病能力和方便贮藏和运输的特点，通过本发明的方法得到的黑木相思人工种子栽培出的黑木相思幼苗成活率近100％，且无表型变异。研究发现，黑木相思在步骤(3)的增殖培养基中继代30代，未发现有变异苗出现，说明只要培养基以及激素浓度配合使用恰当，可以高继代培养。
附图说明
图1为本发明实施例1中诱导培养产生出不定芽的图；
图2为本发明实施例1中增殖培养产生出丛生芽的图；
图3为本发明实施例1中最终得到的人工种子的图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，这些实施例仅是示例性的，不应当理解为对本发明保护范围的限制。
实施例中，除了乙醇的百分含量按照体积/体积百分含量(v/v％)计以外，其它溶液的百分含量均按照质量/体积百分含量(w/v％)计。
实施例中，MS是指组织培养中常用的MS基本培养基，1/2MS是指1/2MS基本培养基，6-BA是指6-苄氨基腺嘌呤，IBA是指吲哚丁酸，NAA是指萘乙酸。
实施例1
本实施例的黑木相思人工种子制备方法，包括如下步骤：
(1)外植体处理：将采回的黑木相思枝条剪去叶片，用2％洗衣粉溶液浸泡清洗5分钟，再用自来水冲洗干净；在超净工作台上用75％的乙醇震荡漂洗30秒，用无菌水冲洗1次后，用0.1％的升汞溶液消毒7分钟，用无菌水冲洗5次，吸干水。
(2)诱导培养：截取带1～2个腋芽茎段接种于诱导培养基上，上述诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+琼脂，进行暗培养7天后转到光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出不定芽。图1示出了诱导培养产生出的不定芽。
(3)增殖培养：将上述诱导培养产生的不定芽转到增殖培养基上，上述增殖培养基为MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+琼脂，光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出丛生芽；在上述增殖培养条件下，每25～30天继代培养一次，上述继代培养使用上述增殖培养基。图2示出了增殖培养产生出的丛生芽。
(4)人工种子制作：将1/2MS+0.4mg/L IBA+4.0％海藻酸钠+2.0％壳聚糖溶液注入试管，将上述步骤(3)中增殖得到的丛生芽移进上述试管中的溶液内部，用2.5％CaCl2溶液注入上述试管内壁，凝固5～10min，用清水冲洗出上述试管内的固化凝胶即得人工种子。图3示出了最终得到的人工种子。
(5)人工种子贮藏：将上述(4)制作的人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm-M膜密封后，于4℃条件下黑暗保存。
本实施例的方法能够使黑木相思幼苗生产不受季节限制，还具有更好的营养供应和抗病能力和方便贮藏和运输的特点，通过本实施例的方法得到的黑木相思人工种子栽培出的黑木相思幼苗成活率100％，且无表型变异。在步骤(3)的增殖培养基中继代30代，未发现有变异苗出现，说明可以高继代培养。
实施例2
本实施例的黑木相思人工种子制备方法，包括如下步骤：
(1)外植体处理：将采回的黑木相思枝条剪去叶片，用1％洗衣粉溶液浸泡清洗7分钟，再用自来水冲洗干净；在超净工作台上用70％的乙醇震荡漂洗50秒，用无菌水冲洗3次后，用0.08％的升汞溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗7次，吸干水。
(2)诱导培养：截取带1～2个腋芽茎段接种于诱导培养基上，上述诱导培养基为MS+0.3mg/L 6-BA+0.08mg/L IBA+25g/L蔗糖+琼脂，进行暗培养8天后转到光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出不定芽。
(3)增殖培养：将上述诱导培养产生的不定芽转到增殖培养基上，上述增殖培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+25g/L蔗糖+琼脂，光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出丛生芽；在上述增殖培养条件下，每25～30天继代培养一次，上述继代培养使用上述增殖培养基。
(4)人工种子制作：将1/2MS+0.3mg/L IBA+3.0％海藻酸钠+1.0％壳聚糖溶液注入试管，将上述步骤(3)中增殖得到的丛生芽移进上述试管中的溶液内部，用2.0％CaCl2溶液注入上述试管内壁，凝固5～10min，用清水冲洗出上述试管内的固化凝胶即得人工种子。
(5)人工种子贮藏：将上述(4)制作的人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm-M膜密封后，于4℃条件下黑暗保存。
本实施例的方法能够使黑木相思幼苗生产不受季节限制，还具有更好的营养供应和抗病能力和方便贮藏和运输的特点，通过本实施例的方法得到的黑木相思人工种子栽培出的黑木相思幼苗成活率99％，且无表型变异。在步骤(3)的增殖培养基中继代30代，未发现有变异苗出现，说明可以高继代培养。
实施例3
本实施例的黑木相思人工种子制备方法，包括如下步骤：
(1)外植体处理：将采回的黑木相思枝条剪去叶片，用3％洗衣粉溶液浸泡清洗3分钟，再用自来水冲洗干净；在超净工作台上用75％的乙醇震荡漂洗10秒，用无菌水冲洗2次后，用0.12％的升汞溶液消毒5分钟，用无菌水冲洗3次，吸干水。
(2)诱导培养：截取带1～2个腋芽茎段接种于诱导培养基上，上述诱导培养基为MS+0.7mg/L 6-BA+0.12mg/L IBA+35g/L蔗糖+琼脂，进行暗培养6天后转到光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出不定芽。
(3)增殖培养：将上述诱导培养产生的不定芽转到增殖培养基上，上述增殖培养基为MS+0.7mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+35g/L蔗糖+琼脂，光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出丛生芽；在上述增殖培养条件下，每25～30天继代培养一次，上述继代培养使用上述增殖培养基。
(4)人工种子制作：将1/2MS+0.5mg/L IBA+5.0％海藻酸钠+3.0％壳聚糖溶液注入试管，将上述步骤(3)中增殖得到的丛生芽移进上述试管中的溶液内部，用3.0％CaCl2溶液注入上述试管内壁，凝固5～10min，用清水冲洗出上述试管内的固化凝胶即得人工种子。
(5)人工种子贮藏：将上述(4)制作的人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm-M膜密封后，于4℃条件下黑暗保存。
本实施例的方法能够使黑木相思幼苗生产不受季节限制，还具有更好的营养供应和抗病能力和方便贮藏和运输的特点，通过本实施例的方法得到的黑木相思人工种子栽培出的黑木相思幼苗成活率98％，且无表型变异。在步骤(3)的增殖培养基中继代30代，未发现有变异苗出现，说明可以高继代培养。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种黑木相思人工种子制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)外植体处理：将采回的黑木相思枝条剪去叶片，用1-3％洗衣粉溶液浸泡清洗3-7分钟，再用自来水冲洗干净；在超净工作台上用70-75％的乙醇震荡漂洗10-50秒，用无菌水冲洗1-3次后，用0.08-0.12％的升汞溶液消毒5-10分钟，用无菌水冲洗3-7次，吸干水；
(2)诱导培养：截取带1～2个腋芽茎段接种于诱导培养基上，所述诱导培养基为MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.08-0.12mg/L IBA+25-35g/L蔗糖+琼脂，进行暗培养6-8天后转到光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出不定芽；
(3)增殖培养：将所述诱导培养产生的不定芽转到增殖培养基上，所述增殖培养基为MS+0.5-0.7mg/L 6-BA+0.15-0.25mg/L NAA+25-35g/L蔗糖+琼脂，光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出丛生芽；在所述增殖培养条件下，每25～30天继代培养一次，所述继代培养使用所述增殖培养基，进行30代所述继代培养；
(4)人工种子制作：将1/2MS+0.3-0.5mg/L IBA+3.0～5.0％海藻酸钠+1.0～3.0％壳聚糖溶液注入试管，将所述步骤(3)中增殖得到的丛生芽移进所述试管中的溶液内部，用2.0～3.0％CaCl2溶液注入所述试管内壁，凝固5～10min，用清水冲洗出所述试管内的固化凝胶即得人工种子；
(5)人工种子贮藏：将所述步骤(4)制作的人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm-M膜密封后，于4℃条件下黑暗保存。
2.根据权利要求1所述的黑木相思人工种子制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的外植体处理具体为：将采回的黑木相思枝条剪去叶片，用2％洗衣粉溶液浸泡清洗5分钟，再用自来水冲洗干净；在超净工作台上用75％的乙醇震荡漂洗30秒，用无菌水冲洗1次后，用0.1％的升汞溶液消毒7分钟，用无菌水冲洗5次，吸干水。
3.根据权利要求1所述的黑木相思人工种子制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的诱导培养具体为：截取带1～2个腋芽茎段接种于诱导培养基上，所述诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+琼脂，进行暗培养7天后转到光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出不定芽。
4.根据权利要求1所述的黑木相思人工种子制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的增殖培养具体为：将所述诱导培养产生的不定芽转到增殖培养基上，所述增殖培养基为MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+琼脂，光照下培养，每天12小时灯光，光照强度1500～2000Lux，25℃～28℃，培养25～30天诱导产生出丛生芽；在所述增殖培养条件下，每25～30天继代培养一次，所述继代培养使用所述增殖培养基。
5.根据权利要求1所述的黑木相思人工种子制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的人工种子制作具体为：将1/2MS+0.4mg/L IBA+4.0％海藻酸钠+2.0％壳聚糖溶液注入试管，将所述步骤(3)中增殖得到的丛生芽移进所述试管中的溶液内部，用2.5％CaCl2溶液注入所述试管内壁，凝固5～10min，用清水冲洗出所述试管内的固化凝胶即得人工种子。
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