CN105158307A - 一种微量组织样本氟离子提纯与碱性收集装置及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于微量组织样本氟离子快速前处理与碱性收集与富集装置，包含样本反应部分、冷凝部分和末端碱性吸附部分，其中，样本反应部分包括：组织样本氟离子微量加热管及与之相配套使用的油浴锅；冷凝部分包括：微量冷凝器；末端碱性吸附部分包括：碱性吸附柱、其中的碱性吸附材料及接收管。本发明可实现微量组织样本氟离子的快速前处理与纯化，并具有分离纯化效率高、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。

Description

一种微量组织样本氟离子提纯与碱性收集装置及其应用

技术领域

本发明涉及一种动物组织样本所含氟离子提纯及收集的装置，尤其适用于微量组织样本的氟离子提纯及收集。

背景技术

地氟病对人体健康危害严重，它是一种以侵犯牙齿和骨骼为主的全身性慢性中毒，主要临床表现是氟斑牙和氟骨症，其中对骨骼及其它软组织的损害尤为严重，主要表现为腰、腿及全身关节麻木、疼痛、关节变形等症状，严重的地氟病患者出现腰弯背驼、功能障碍乃至瘫痪、丧失劳动能力，生活不能自理，给家庭和社会带来较大的影响(中华人民共和国卫生部，2000)。高氟暴露引起的地氟病依然是我国许多地区严重的公共卫生问题之一。据2011年卫生统计年鉴统计结果，燃煤污染型地方性氟中毒病区分布于13个省(市)的188个县(市、区)，受威胁人口约3582万。饮水型地方性氟中毒病区分布于28个省(区、市)的1137个县(市、区)，受威胁人口约8728万。饮茶型地方性氟中毒病区分布于7个省(区)的316个县(市、区)，受威胁人口约3100万(中华人民共和国卫生部，中国卫生统计年鉴，2012)。我国现有20多个省市仍属于高氟地区，总地氟病病区人口约为1.18亿，除上海和海南省外，其他各省、区均有病区分布(中华人民共和国卫生部，2012)。

人体(或其它动物)氟离子的内暴露途径，可科学地评估氟暴露危害，衡量一个地区人群摄氟量水平和地方性氟中毒监测和防治效果。因此，对其内蓄积水平研究成为环境、食品与环境管理部门的科研热点。然而，组织样本中氟的测定与其它化合物有着截然不同的特点，相比工业产品或环境样本而言，一般情况下，能够获得组织样本的量十分有限，且组织样本为固体形式，积累氟存在于复杂基质内，为非游离态氟。如何对微量组织样本中的氟在复杂的基质下完成氟离子的分离、纯化与收集是影响氟内暴露准确定量分析结果的关键性技术。

通常情况下，氟离子分离与纯化方法必须考虑其所处的介质背景，此外，还必须考虑将用何种检测仪器对其进行检测。目前，氟离子的测定通常采用：离子选择电极法、离子色谱法(吴景芝，2012；吴伟杰，2005；赵怀颖，2011)和分光光度法(张玉明，2002；邓恢祥，1994；何良汉，2007)。在现有氟离子检测方法中，由于检测原理不同，要求的纯化精度也不相同。电极法操作比较简便，电极敏感膜为LaF3单晶，为避免其它离子的干扰，电极法对溶液PH有较严格的要求；离子色谱法和分光光度法则适用于多种无机阴离子和有机酸的同时分析，具有简单、快速和高灵敏度、高选择性、检测限低等优点(陈静，2009；林国剑，2004；胡培勤，2007)，但二者均要求严格地去除干扰离子，如氯离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、碳酸根离子等。由此可见，现有氟的检测方法均要求避免其它干扰离子，氟离子前处理方法必须能够保证在测定前对氟离子进行纯化与富集。

针对组织样本中氟离子的提取分离过程就是尽量使氟离子与其它成份分离开，从而在检测过程中避免背景或其它杂质的干扰。待测氟离子组分中通常含有与该组分结构相似的杂质，将待测组分与杂质分离的过程，称为“净化”。在生物样本的氟离子提取过程中，净化过程是样本前处理的技术难点，也是关系到检测结果的真实性及检测方法可靠性的重要步骤。

目前氟的前处理常用方法有碱熔灰化法、酸解浸取法、酸解扩散法、碱熔蒸馏法、氧瓶燃烧法、高温燃烧水解法等(赵怀颖，2011)。

碱熔灰化法一般要求样本量在5.0克以上，加入硝酸溶液和氢氧化钠于600℃进行灰化，随后再进行蒸馏。将灰化后的样本加入硫酸，并加入数粒沸石，使蒸馏瓶中溶液的温度上升至190℃，然后将馏出管口置于碱液上方进行收集(吴景芝，2012)，但此方法具有一定的缺陷，馏出管口与碱液液面的位置并无明确说法，如果二者相差太远，则蒸出的HF容易挥发至空气中，如果二者太近，又会使管口与液面接触，从而产能产生倒吸；而且进行吸收的碱液的量容易过多，使原本含量较少的氟离子进一步稀释，导致氟离子含量低于检测仪器的检出限。高温燃烧水解法操作简便，吸收液成分简单，但必须适应于燃烧测定的基质样本，该方法缺陷在于无法避免将燃烧后的其它多种灰烬一起带入水蒸气并进入样品中(赵怀颖，2011)。使用酸解浸取法、酸解扩散法处理样品，能将样品中酸溶性和水溶性的氟转化为可测定态的氟，但如何针对微量成份进行富集并不清楚。

分析现有几种前处理方法，高温燃烧法无法去除组织样本中其它离子的干扰，碱性灰化法无法适用于组织样本燃烧，否则容易产生水分喷溅，在碱化法蒸馏时不易使用碱液直接吸收蒸出的HF。以上前处理技术均具有一定的缺陷，它们通常容易造成待测样本的损失，造成回收率的误差较大，同时增加了实验步骤，导致实验成本增加；且对样品量有要求，不能满足微量组织样本的氟含量分析。

目前，尚未发现针对微量组织样本(液态最少0.5ml，固态最少量0.15g)而设计的氟离子提纯与收集的装置。

参考文献

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发明内容

本发明提供了一种简单易行的微量组织样本氟离子提纯与收集装置。

本发明所提供的组织样本氟离子提纯与碱性收集装置包含样本反应部分、冷凝部分和末端碱性吸附部分。发明装置的整体示意图见附图1，其中，1为样本反应部分，包括：组织样本氟离子微量加热管；2为冷凝部分，包括：微量冷凝器2；3为末端碱性吸附部分，包括：碱性吸附柱、吸附柱内的碱性吸附材料及接收管。

其中，本申请要求保护的装置还附加的包括样品加热部分，所述样品加热部分包括油浴锅7，其中油浴锅与组织样本氟离子微量加热管相配套使用。组织样本氟离子微量加热管示意图见附图2，加热管从上到下依次由三部分组成：第一内磨砂管口1-1、第一固定部分1-2及直管加热部分1-3。优选的，第一内磨砂管口管径为19mm，长度为16mm；第一固定部分为凸出椭圆形鼓泡，长度为25mm；直管加热部分中直管直径为12mm，长度为70mm。微量加热管用于将微量含氟组织样本、一定比例稀释后的硫酸置于其中。添加顺序为微量含氟组织样本、去离子水、硫酸，加后立即密封，待整套微量设备连接好后再放于油浴锅中加热。

微量冷凝器，本发明中的冷凝器采用微型直管冷凝的方式。微量冷凝器示意图见附图3，微量冷凝器从左至右依次为：具有第一外磨砂接口的第二固定部分2-1、冷凝直管2-2及具有第二外磨砂接口的延长细导向管部分2-3。冷凝器第二固定部分的第一外磨砂接口尺寸与微量加热管的第一内磨砂管口配对，保证连接后不漏气，冷凝器第二固定部分尺寸也与微量加热管第一固定部分相同，第一外磨砂接口和第二固定部分总高度为50mm；冷凝直管为反向U形，直径7mm，两边竖向直管高度为17mm，横向直管长度为48mm，弯管部分为半径4mm圆弧；延长细导向管部分的第二外磨砂管口尺寸与碱性接受柱的第二内磨砂管口配对，延长细导向管部分中的第二外磨砂管口及其第三固定部分尺寸的总高度为50mm，延长细导向管部分中包含有延长导向细管2-4，直径为5mm，长度为54mm，保证延长导向细管的末端管口正好位于吸附柱柱口处，保证冷凝管中HF气体直接进入吸附柱内，减少仪器内壁停留量。冷凝器的材料可以选用玻璃或有机玻璃类高分子聚合物等。

末端碱性吸附部分示意图见附图4，碱性吸附柱从上到下依次为：第二内磨砂管口3-1、第四固定部分3-2、吸附材料装填柱3-3及接收管3-4、碱性吸附材料3-5。碱性吸附柱第二内磨砂管口尺寸与微量冷凝器的第二外磨砂管口配对，保证连接后不漏气，第二内磨砂管口直径为19mm，第二内磨砂管口下方第四固定部分尺寸也与微量冷凝器的第三固定部分相同，第二内磨砂管口和第四固定部分总高度为50mm；吸附材料装填柱为直径7mm长40mm的玻璃直柱，后自然缩口为直径4mm长度15mm的尾管；接收管为独立的直管，直径为16mm，高度为100mm，材料可选为玻璃、塑料等，此处研究为便捷操作，直接使用15ml离心管，尺寸正好符合设计要求，也可另行定制。碱性吸附柱及配套设备保证由冷凝器出来的HF气体与碱性吸附材料中的碱性溶液发生反应，生成NaF从而将HF固定；接收管用以接受加热过程中的馏出液及加热后吸附柱的淋洗液。

碱性吸附材料制备，包括吸附材料的选择与碱性处理。此部分碱性吸附材料要求既不能与HF反应，也不能与NaOH反应，并能够起到吸附碱性溶液的作用。传统的硅胶、离子树脂、聚丙烯酰胺、硅藻土等因其中含有二氧化硅或其它离子成份，均不能做为碱性吸附材料。本发明中优选的附着材料为脱脂棉，为天然无机化合物，不与NaOH反应，且有一定的NaOH溶液保留量，符合材料选择要求。使用时将其填充至碱性吸附柱内，填充高度为15mm左右，然后进行碱性处理：使用0.6MNaOH溶液淋洗，每次淋洗1ml，共淋洗三次，自然淋洗不进行吹洗，最后整体仪器进行连接时再滴加少许NaOH液封脱脂棉表层；此处需注意碱性吸附柱的装填和碱性处理与样本进行加热蒸馏处理的时间不要超过2小时，超过时需对装填的脱脂棉再进行一次碱性处理。

本发明中为了使微量组织样本中的氟离子从中挥发出，主要结合加热装置的使用，本申请中使用的方法为：称量0.15g左右的组织样本于组织样本氟离子微量加热管，缓缓加入700ul去离子水；碱性吸附柱内放入10mm高的脱脂棉，以0.6M的NaOH溶液进行淋洗，淋洗3次，每次淋洗液量为1.0ml，最后连接装置时加入0.5ml淋洗液(0.6M的NaOH溶液)进行液封。向已经加入组织样品及去离子水的组织样本氟离子微量加热管内加入300ul2∶1硫酸，迅速与冷凝部分和末端碱性吸附部分连接固定。将组织样本氟离子微量加热管放入油浴锅内，固定好整套装置，打开油浴锅，初始加热温度为90℃，当温度升至90℃后加热5分钟，然后设定为110℃加热5分钟，最终温度设为150℃，加热20分钟，接收管中的馏出液体积不发生变化时停止加热，时间为40分钟左右。在加热条件下促进组织样本中的氟离子与浓硫酸形成的HF气体(沸点19.5℃)进行挥发，使组织样本中HF从组织样本中挥发出，然后依序经过本发明的冷凝部分和末端碱性吸附部分，在碱性吸附柱内与脱脂棉中保留的碱液反应，形成NaF从而固定氟离子。加热过程中，加热管内蒸出的水蒸汽会带出碱性吸附材料中固定的一部分含F^-碱液，进入接收管内，另一部分固定的F^-在加热过后用碱液淋洗进入接收管内，使用碱液为0.06MNaOH溶液，淋洗两次，每次淋洗量为200μl。

采用以上方案，本发明通过加热技术与碱性吸附材料的应用，可实现微量组织样本氟离子的快速纯化与富集。在微量组织样本此类生物样本的前处理过程中，可以克服传统的碱性灰化、加酸搅拌等实验操作步骤的繁琐问题，及高温280℃左右将HF蒸出却因微量样本无法适用于检测方法的问题，避免待测样本的损失，减少溶剂的消耗，使得样本前处理过程变得简单有效。

本发明可达到如下目的：1)实现微量组织样本(1.5-1g)中氟离子的分离纯化；2)通过加入浓硫酸使组织样本中的氟离子从组织样本中挥发出来，实现去除杂质对检测体系干扰；2)复杂环境中背景中多种干扰物质的去除；3)复杂环境中生物大分子蛋白的去除；4)减少传统方法中高温蒸发(280度)使用大量水份进入了接收器；5)通过温度控制避免大量硫酸根离子被蒸发出；6)通过碱性木质素改性实现HF的富集与浓缩，避免传统碱液面吸收法的溶液倒吸或HF挥发损失的问题。

一般组织样本的氟含量测定前处理方法一般有碱性灰化法、碱熔蒸馏法、氧氮燃烧及高温燃烧水解法，这些方法均需较大量的组织样本，且实验装置复杂成本高，高温操作，存在操作复杂及安全的问题。用本发明的微量组织样本氟离子提纯与碱性收集装置进行动物组织样本氟含量测定，可以减少组织样本的采样量，在采样方面减少经费使用，同时该装置结构简单，温度要求不高，操作简单，纯化过程中损失量少，具有分离纯化效率高、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。

附图说明

图1为本发明微量组织样本氟离子前处理与碱性收集柱整体示意图，其中0为油浴锅，1为微量加热管，2位微量冷凝器，3为碱性吸附柱及接收管；

图2为本发明的组织样本氟离子微量加热管示意图，其中1-1为内磨砂管口，1-2位固定部分，1-3位直管加热部分。

图3为本发明的微量冷凝器示意图，其中2-1为外磨砂接口和固定部分(附图3中2-1)，2-2为冷凝直管，2-3为具有第二外磨砂接口的延长细导向管部分，2-4为延长导向细管。

图4为本发明的末端碱性吸附部分，其中包括3-1为内磨砂管口，3-2为固定部分，3-3为吸附材料装填柱部分，3-4为接收管，3-5为碱性吸附材料。

图5大鼠肌肉加标拟合曲线

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例：用于微量小牛组织样本生物样本氟离子酸化加热前处理与碱性收集柱法

1、前处理

填料：

向吸附材料装填柱内填充脱脂棉花，柱内棉花层高15mm左右，以1ml0.6MNaOH溶液淋洗，淋洗三次，最后滴加几滴0.6MNaOH溶液，液封棉花层表面，与微量冷凝器连接，并用皮筋扎牢。如图1所示。

加热：

使用千分之一的分析天平，准确量取0.15g组织样品，加入微量加热管中。组织样品最先加，随后移取700ul去离子水，最后加入300ulH₂SO₄(2∶1)，以酸解组织样品，将组织样品中F^-释放出来，以HF形式存在于溶液中。加入硫酸后迅速与微量冷凝器、碱性吸附柱连接起来，闭合整个反应装置(如图1所示)。各部分除了磨砂口连接密封外，用橡皮筋固定各个部分，防止滑动。将预先加入100ul淋洗液(0.06mol/LNaOH)的15ml离心管作为接收管使用，置碱性吸附柱下方接受馏出液。

将微量加热管放入油浴锅内加热。

油浴锅加热温度从90℃-110℃-150℃梯度升温，初始加热温度为90℃，当温度升至90℃后加热5分钟，然后设定为110℃加热5分钟，最终温度设为为150℃，加热20分钟，接收管中的馏出液体积不发生变化时停止加热，时间为40分钟左右。油浴高温蒸馏出的水蒸气将HF气体(沸点为19.54℃)带出进入碱性吸附柱，被碱性吸附柱内填充的碱性脱脂棉吸收，F^-以不挥发性盐NaF形式存在，继续蒸馏出的水蒸气淋洗脱脂棉，将部分含NaF的淋洗进入接收管内，接收管内原本添加的少量0.06mol/LNaOH溶液保证接受液保持碱性，使得F^-一直以不挥发盐形式存在，防止F^-损失。

2、检测

当碱性吸附柱下方不再有馏出液时，停止加热，冷却5分钟左右，取下碱性吸附柱，用200μl0.06MNaOH溶液淋洗碱性吸附柱，淋洗两次，保证碱性脱脂棉中吸附的NaF完全进入接收管内。用约30ul6.53％的H₂SO₄溶液调pH至中性，个别样品用0.65％H₂SO₄溶液微调，加去离子水至1.5ml刻度线。

向1.5ml接受液内准确加入1.5ml总离子强度调整液(TISAB溶液：量取500ml水于1000ml烧杯中，加入57ml冰乙酸，58g氯化钠和4.0gEDTA，搅拌溶解。置烧杯于冷水浴中，用氢氧化钠溶液(240g/L)调节pH为5.-5.5之间，用水稀释至1000ml，摇匀)，插入PF-2-01氟离子选择电极及甘汞参比电极进行电位测定。

主要仪器：SartriusBS124S分析天平；离子计，上海仪电科学仪器PXS-270；氟离子选择电极，上海仪电科学仪器PF-2-01；震荡机，其林贝尔仪器制造GL-901；移液枪，eppendorf公司制造(1mL)、ppetman公司制造(100uL)

氟离子选择电极分析条件：仪器操作温度为25℃，测定时使用的参比电极中饱和氯化钾溶液充足，距离加液口2-3mm，电极测量前用去离子水冲洗擦干。

3、结果

使用微量动物组织氟离子前处理与碱性收集柱法对加标组织样进行测定，分别进行标线及加标回收测定，验证微量动物组织氟离子前处理与碱性收集柱法的准确度及精确度。

准确量取5份0.15g大鼠肌肉组织样品，用以加标进行标线的测定拟合，具体溶液加入量见表1。

表1标线样品及各药剂加入量

对加标标线测定数据进行线性拟合，拟合结果见图5。

对预先加标0.5ug的组织样品进行加标回收测定，数据见表2。

表2加标回收试验结果

微量组织样本氟离子提纯与碱性收集装置的加标样本测定结果见图6及表2，其中图6为标线测定结果拟合曲线，从图中可知曲线拟合R2为0.9885，拟合效果较好。在对7份加标微量组织样本进行测定，根据拟合曲线计算方法的检出浓度。7份加标微量样本的回收率在94.45-109.12％，平均回收率为102.68％，RSD为4.97％，在生物样本检测数据误差允许范围内。说明本专利装置可实现微量组织样本的提纯和收集，极大的减少提纯过程中的氟离子损失量，可实现高的回收率，平行结果好。

本发明虽由前述实施例来描述，但因不同的动物组织本底值不同可能具有不同的回收率，不同生物样本中含有脂类也会有所不同，因此，可以不脱离本发明的精神下通过简单试验做一些变化而有针对性地去除干扰物，这些可能的变化内容也属于本发明。前述实验过程为本发明一个较合理的使用方法，仅为本发明可以具体实施的方式之一，但并不以此为限。

Claims (5)

1.一种组织样本氟离子提纯与碱性收集装置，其特征在于所述装置包含样本反应部分、冷凝部分和末端碱性吸附部分；其中，样本反应部分包括：组织样本氟离子微量加热管；冷凝部分包括：微量冷凝器；末端碱性吸附部分包括：碱性吸附柱和其中的碱性吸附材料及接收管。

2.如权利要求1所述的组织样本氟离子提纯与碱性收集装置，其中，所述碱性吸附材料为经过前处理和碱性处理的脱脂棉，所述前处理和碱性处理为：以1m10.6MNaOH溶液淋洗，淋洗三次，最后滴加几滴0.6MNaOH溶液，液封脱脂棉表层。

3.如权利要求1或2所述的组织样本氟离子提纯与碱性收集装置，还包括样品加热部分，所述样品加热部分包括油浴锅，其中油浴锅与组织样本氟离子微量加热管配套使用。

4.一种利用权利要求1-3之一所述的组织样本氟离子提纯与碱性收集装置进行氟离子提纯与碱性收集方法，所述方法为：

(1)称量组织样本于组织样本氟离子微量加热管中，缓缓加入去离子水；碱性吸附柱内放入脱脂棉，以NaOH溶液进行淋洗，最后连接装置时加入淋洗液进行液封；

(2)向已经加入组织样品及去离子水的组织样本氟离子微量加热管内加入硫酸，迅速与冷凝部分和末端碱性吸附部分连接固定；将组织样本氟离子微量加热管放入油浴锅内，固定好整套装置，加热；在加热条件下促进组织样本中的氟离子与浓硫酸形成的HF气体进行挥发，使组织样本中HF从组织样本中挥发出，然后依序经过冷凝部分和末端碱性吸附部分，在碱性吸附柱内与碱性吸附材料中的碱液反应形成NaF从而固定氟离子；

(3)加热过程中，加热管内蒸出的水蒸汽会带出碱性吸附材料中固定的一部分含F^-碱液，进入接收管内，另一部分固定的F^-在加热过后用碱液淋洗进入接收管内，最后用NaOH溶液淋洗两次。

5.如权利要求4所述的氟离子提纯与碱性收集方法，其中步骤(2)中的加热具体为：油浴锅加热温度从90℃-110℃-150℃梯度升温，初始加热温度为90℃，当温度升至90℃后加热5分钟，然后设定为110℃加热5分钟，最终温度设为为150℃，加热20分钟，接收管中的馏出液体积不发生变化时停止加热，时间为40分钟左右。