CN105136950A - 一种猕猴桃茎黄酮类hplc指纹图谱建立及其指纹图谱 - Google Patents
一种猕猴桃茎黄酮类hplc指纹图谱建立及其指纹图谱 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立及其指纹图谱，指纹图谱建立包括：供试品溶液的制备，对照品溶液的制备；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm；分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，柱温为35℃，注入液相色谱仪，测定。本发明将猕猴桃枝条、叶、花药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异；供试品制作简便，色谱条件容易实现；稳定性和重现性都比较好；适于对猕猴桃枝条、叶、花药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。
Description
技术领域
本发明属于食品药品管理领域，尤其涉及一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立及其指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱特指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体特征的图谱或图像。中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的质量控制手段，目前，已被众多国际性医药机构所承认，已成为中成药、天然药物质量控制最有效的方法之一。美国食品药品管理局在1996年制定的《FDA关于植物制品的指南》中，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品提供相应的指纹图谱。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。中国国家药品监督管理部门于2000年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准。中药指纹图谱经过了数十年的研究，使用了包括紫外、红外、气相、高效液相、薄层、核磁共振、扫描电子显微镜、计算机图像分析、电泳技术、同功酶分析法、分子生物学技术、聚类分析技术等许多现代分析测试手段，为中药的物质鉴定和成分分析积累了大量的数据。但从中药全面质量控制的角度看，还远未达到有效地反映和控制中药的整体质量的目的。高效液相色谱(HPLC)指纹图谱在国际上容易获得认可，包括美国、英国、法国、加拿大、德国、日本和印度在内的许多国家更愿意接受HPLC指纹图谱。因此，为中药材建立相应的HPLC指纹图谱，是现阶段控制中药内在质量的有效手段。四川是猕猴桃最大的主产区之一，其根，藤梨根，作为解毒抗癌药材在《江西草药》、《湖南药物志》、《浙江民间常用草药》、《福建民间草药》、《闽东本草》、《陕西中草药》中都有记载，报道根中先后分离出糖类、三萜、黄酮等化合物；另具调查，由于根资源有限，目前中药材市场购进的藤梨根90％以茎充根。从猕猴桃栽培看，每年入冬有大量修枝，茎叶、疏花废弃；因此建立枝条、叶、花有效成分指纹图谱，是既解决质量评价方式单一，不足以系统、完整地表明药材的整体质量，亟需探索更先进、更有效的质量控制手段问题；又能使猕猴桃资源充分利用。
目前猕猴桃枝条、叶、花黄酮类指纹图谱未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立及其指纹图谱，旨在得到的猕猴桃枝条、叶、花、药材标准指纹图谱，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足。
本发明是这样实现的，一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法，所述的猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法采用高效液相色谱法，具体的步骤如下：
步骤一，供试品溶液的制备，采用粉碎的阴干猕猴桃茎叶、花蕾、美味根，加入甲醇，过滤和清洗，取续滤液作为供试品溶液；
步骤二，对照品溶液的制备，精密称取芦丁对照品和槲皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml各含0.12mg的混合溶液，摇匀，即得；
步骤三，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm；
步骤四，分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，柱温为35℃，注入液相色谱仪，测定，即得，以芦丁和槲皮苷分别计算出总黄酮含量，最终结果以平均值计。
进一步，所述供试品溶液的制备方法具体包括：将阴干猕猴桃茎叶、花蕾、美味根，粉碎为40目，分别称取药材粉各4.0克,加40ml甲醇，称定重量，加热回流提取60min,放冷，用甲醇补齐重量，过滤，将容器和滤渣用甲醇分别清洗若干次，将滤液和清洗液合并，用旋转蒸发仪蒸干，再用3ml甲醇溶解并清洗容器，合并后过0.45um孔径微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
进一步，所述梯度洗脱以如下体积浓度配置进行：
0分钟时，流动相A为5％的乙腈溶液，流动相B为95％的0.2％磷酸水溶液；
15分钟时，流动相A为10％的乙腈溶液，流动相B为90％的0.2％磷酸水溶液；
40分钟时，流动相A为20％的乙腈溶液，流动相B为80％的0.2％磷酸水溶液；
45分钟时，流动相A为90％的乙腈溶液，流动相B为10％的0.2％磷酸水溶液；
55分钟时，流动相A为90％的乙腈溶液，流动相B为10％的0.2％磷酸水溶液；
56分钟时，流动相A为5％的乙腈溶液，流动相B为95％的0.2％磷酸水溶液；
68分钟时，流动相A为5％的乙腈溶液，流动相B为95％的0.2％磷酸水溶液。
本发明的另一目的在于提供一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱，猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱的建立，具体包括如下：
步骤一，供试品溶液的制备，采用粉碎的阴干猕猴桃茎叶、花蕾、美味根，加入甲醇，过滤和清洗，取续滤液作为供试品溶液；
步骤二，对照品溶液的制备，精密称取芦丁对照品和槲皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml各含0.12mg的混合溶液，摇匀，即得；
步骤三，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm；
步骤四，分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，柱温为35℃，注入液相色谱仪，测定，即得，以芦丁和槲皮苷分别计算出总黄酮含量，最终结果以平均值计；
确定了17个共有特征峰；
1号峰，平均保留时间RT为6.6min，RSD为2％，峰面积为113，RSD为0.57％；
2号峰，平均保留时间RT为8.8min，RSD为9％，峰面积为825，RSD为4.17％；
3号峰，平均保留时间RT为11.3min，RSD为1％，峰面积为157，RSD为0.79％；
4号峰，平均保留时间RT为16.1min，RSD为1％，峰面积为354，RSD为1.79％；
5号峰，平均保留时间RT为17.1min，RSD为3％，峰面积为320，RSD为1.62％；
6号峰，平均保留时间RT为21.5min，RSD为0％，峰面积为1515，RSD为7.66％；
7号峰，平均保留时间RT为24.3min，RSD为6％，峰面积为530，RSD为2.68％；
8号峰，平均保留时间RT为26.0min，RSD为5％，峰面积为579，RSD为2.92％；
9号峰，平均保留时间RT为29.0min，RSD为5％，峰面积为231，RSD为1.17％；
10号峰，平均保留时间RT为30.2min，RSD为4％，峰面积为831，RSD为4.20％；
11号峰，平均保留时间RT为31.1min，RSD为4％，峰面积为1044，RSD为5.28％；
12号峰，平均保留时间RT为32.2min，RSD为1％，峰面积为201，RSD为1.02％；
13号峰，平均保留时间RT为34.0min，RSD为1％，峰面积为54.83，RSD为0.27％；
14号峰，平均保留时间RT为35.0min，RSD为0％，峰面积为171，RSD为0.86％；
15号峰，平均保留时间RT为36.9min，RSD为5％，峰面积为1640，RSD为8.29％；
16号峰，平均保留时间RT为43.0min，RSD为5％，峰面积为304，RSD为1.53％；
17号峰，平均保留时间RT为43.7min，RSD为4％，峰面积为831，RSD为4.20％。
本发明具有如下优点：
猕猴桃根(藤梨根，软枣猕猴桃根)用作败毒抗癌、清热消肿药材，在我国已有上千年历史，但随着野生资源的枯竭出现药材断层，中药材市场常用猕猴桃枝条冒充根，鱼目混杂，质量难以保证。本项目指纹图谱研究，可将不同品种、不同部位(枝条、花、根)与软枣猕猴桃根进行比较，通过比较其共有峰，证明枝条是根的延伸部位，具有同源同质属性，而花与枝条、根之间细微差异也能凸显；通过猕猴桃黄酮类指纹图谱建立，可以区分供替代藤梨根作药材的猕猴桃枝条与其它植物根的差别，为猕猴桃枝条替代藤梨根药材质量标准的制定奠定基础。
另外本发明的供试品制作简便，色谱条件容易实现；方法的稳定性和重现性较好；适于对猕猴桃枝条、叶、花药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。
附图说明
图1是本发明实施例提供的猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法流程图；
图2是本发明实施例提供的枝条中黄酮类具十七个共峰示意图；
图3是本发明实施例提供的软枣猕猴桃根与8个品种枝条提取的黄酮类指纹图谱相似度示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
参阅图1：
本发明是这样实现的，一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法将猕猴桃枝条、叶、花药材作为一个整体对待，得到猕猴桃枝条、叶药材的指纹图谱，通过比较其共有峰找出不同药材之间的细微差异。
进一步，所述的猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法的具体步骤为：
S101、供试品溶液的制备：将药材阴干，分别取猕猴桃茎叶、花蕾、美味根药材粉末,加甲醇，精密称定，加热回流提取60min,放冷，用甲醇补齐重量，过滤，将容器和滤渣用甲醇分别清洗若干次，将滤液和清洗液合并，用旋转蒸发仪蒸干，再用甲醇溶解并清洗容器，合并后过0.45um孔径微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；
S102、高效液相色谱分析，流动相为甲醇-0.2％醋酸水溶液，梯度洗脱得到猕猴桃枝条、叶药材的指纹图谱。
进一步，高效液相色谱分析，色谱分离柱为Kromasil100-5C18，250×4.6mm，5μm；流动相为甲醇-0.2％醋酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序为：0min→15min→40min→45min→50min→55min→56min→69min，甲醇5％→10％→20％→90％→90％→5％→5％；
流速为1.0mL/min，检测波长为UV-254nm，230nm，296nm，DAD全波长；
进样量为10μL，柱温为35℃。
本发明实施例的猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法具体包括如下：
步骤一、供试品溶液的制备：将阴干猕猴桃茎叶、花蕾、美味根，粉碎为40目，分别称取药材粉各4.0克,加40ml甲醇，称定重量，加热回流提取60min,放冷，用甲醇补齐重量，过滤，将容器和滤渣用甲醇分别清洗若干次，将滤液和清洗液合并，用旋转蒸发仪蒸干，再用3ml甲醇溶解并清洗容器，合并后过0.45um孔径微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品和槲皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml各含0.12mg的混合溶液，摇匀，即得。
步骤二、色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil100-5C18，250×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm
洗脱程序为：0min→15min→40min→45min→55min→56min→68min，乙腈5％→10％→20％→90％→90％→5％→5％。
步骤三，测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，柱温为35℃。注入液相色谱仪，测定，即得。以芦丁和槲皮苷分别计算出总黄酮含量，最终结果以平均值计。
按照本发明提供的方法，对7批猕猴桃枝条、叶、花药材建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了17个共有特征峰。如图2所示特征峰的保留时间分别为：6.6min、8.8min、11.3min、16.1min、17.1min、21.5min、24.3min、26.0min、29.0min、30.2min、31.14min、32.21min、34.01min、35.00min、36.95min、43.05min、43.4min，这些共有特征峰构成了猕猴桃茎叶药材的指纹特征，可作为猕猴桃茎叶药材的标准指纹图谱。保留时间见表1。图3是本发明实施例提供的软枣猕猴桃根与8个品种枝条提取的黄酮类指纹图谱相似度示意图，表明相似度极高。
表1
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述的猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法采用高效液相色谱法，具体的步骤如下：
步骤一，供试品溶液的制备，采用粉碎的阴干猕猴桃茎叶、花蕾、美味根，加入甲醇，过滤和清洗，取续滤液作为供试品溶液；
步骤二，对照品溶液的制备，称取芦丁对照品和槲皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml各含0.12mg的混合溶液，摇匀，即得；
步骤三，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm；
步骤四，分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，柱温为35℃，注入液相色谱仪，测定，即得，以芦丁和槲皮苷分别计算出总黄酮含量，最终结果以平均值计。
2.如权利要求1所述的猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法具体包括：将阴干猕猴桃茎叶、花蕾、美味根，粉碎为40目，分别称取药材粉各4.0克,加40ml甲醇，称定重量，加热回流提取60min,放冷，用甲醇补齐重量，过滤，将容器和滤渣用甲醇分别清洗若干次，将滤液和清洗液合并，用旋转蒸发仪蒸干，再用3ml甲醇溶解并清洗容器，合并后过0.45um孔径微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
3.如权利要求1所述的猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱以如下体积浓度配置进行：
0分钟时，流动相A为5％的乙腈溶液，流动相B为95％的0.2％磷酸水溶液；
15分钟时，流动相A为10％的乙腈溶液，流动相B为90％的0.2％磷酸水溶液；
40分钟时，流动相A为20％的乙腈溶液，流动相B为80％的0.2％磷酸水溶液；
45分钟时，流动相A为90％的乙腈溶液，流动相B为10％的0.2％磷酸水溶液；
55分钟时，流动相A为90％的乙腈溶液，流动相B为10％的0.2％磷酸水溶液；
56分钟时，流动相A为5％的乙腈溶液，流动相B为95％的0.2％磷酸水溶液；
68分钟时，流动相A为5％的乙腈溶液，流动相B为95％的0.2％磷酸水溶液。
4.一种猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱，其特征在于，猕猴桃茎黄酮类HPLC指纹图谱的建立，具体包括如下：
步骤一，供试品溶液的制备，采用粉碎的阴干猕猴桃茎叶、花蕾、美味根，加入甲醇，过滤和清洗，取续滤液作为供试品溶液；
步骤二，对照品溶液的制备，精密称取芦丁对照品和槲皮苷对照品，加50％甲醇制成每1ml各含0.12mg的混合溶液，摇匀，即得；
步骤三，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm；
步骤四，分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，柱温为35℃，注入液相色谱仪，测定，即得，以芦丁和槲皮苷分别计算出总黄酮含量，最终结果以平均值计；
确定了17个共有特征峰；
1号峰，平均保留时间RT为6.62min，峰面积为113，RSD为0.57％；
2号峰，平均保留时间RT为8.89min，峰面积为825，RSD为4.17％；
3号峰，平均保留时间RT为11.31min，峰面积为157，RSD为0.79％；
4号峰，平均保留时间RT为16.11min，峰面积为354，RSD为1.79％；
5号峰，平均保留时间RT为17.13min，峰面积为320，RSD为1.62％；
6号峰，平均保留时间RT为21.50min，峰面积为1515，RSD为7.66％；
7号峰，平均保留时间RT为24.36min，峰面积为530，RSD为2.68％；
8号峰，平均保留时间RT为26.05min，峰面积为579，RSD为2.92％；
9号峰，平均保留时间RT为29.05min峰面积为231，RSD为1.17％；
10号峰，平均保留时间RT为30.24min，峰面积为831，RSD为4.20％；
11号峰，平均保留时间RT为31.14min，峰面积为1044，RSD为5.28％；
12号峰，平均保留时间RT为32.21min，峰面积为201，RSD为1.02％；
13号峰，平均保留时间RT为34.01min，峰面积为54.83，RSD为0.27％；
14号峰，平均保留时间RT为35.00min，峰面积为171，RSD为0.86％；
15号峰，平均保留时间RT为36.95min，峰面积为1640，RSD为8.29％；
16号峰，平均保留时间RT为43.05min，峰面积为304，RSD为1.53％；
17号峰，平均保留时间RT为43.74min，峰面积为831，RSD为4.20％。
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