CN105136944B - 一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法。完整梯烷脂是存在于厌氧氨氧化菌胞内厌氧氨氧化体膜上的一种特殊磷脂。已有研究表明以完整梯烷脂为研究对象，可为厌氧氨氧化的研究提供新思路及新的支撑信息，具有较高的生态和生理学研究意义。本方法的操作流程为：取样→冷冻干燥→加入提取液→超声提取→调整提取液组分比例→离心分液→氮吹浓缩。经高效液相串联质谱分析，证明该方法效果良好，提取纯度高。

Description

一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法

技术领域

本发明属于有机物提取技术领域，涉及一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂超声提取方法。

背景技术

厌氧氨氧化细菌可以将亚硝酸盐和氨氮转化为氮气从而缩短氨氮转化的过程，具有高效低耗的优点，因而基于此类微生物发展的厌氧氨氧化工艺成为当前颇具前景的污水脱氮工艺。为了更好地将厌氧氨氧化工艺应用于规模化生产中，对厌氧氨氧化菌的生物学研究，尤其是基于细胞内化学物质的研究就是非常必要的。

在研究中，学者们在厌氧氨氧化菌胞内的最大细胞器——厌氧氨氧化体的膜上发现了一类特殊的磷脂结构，其功能在于可以提高质膜的致密性，可保护细胞不受厌氧氨氧化菌代谢过程中产生的有毒中间产物对细胞的毒害，保证代谢的正常进行。这类特殊的磷脂结构上包含有顺式联接的环丁烷，其分子空间结构类似于“楼梯状”，因此，该磷脂被命名为梯烷脂。广义的梯烷脂是指含有“梯烷结构”的磷脂，根据梯烷磷脂是否含有极性头部，可以将梯烷脂分为完整梯烷脂和核心梯烷脂，其中由核心梯烷脂和极性头部组成的被称为完整梯烷脂，而核心梯烷脂是完整梯烷脂头部水解的产物；极性头部可分为磷酸胆碱（PC）、磷酸乙醇胺（PE）、磷酸甘油（PG），其中以磷酸胆碱作为极性头部的完整梯烷脂比例最高，可用于代表完整梯烷脂。

已有的研究表明完整梯烷脂仅存在于厌氧氨氧化菌中，因此，对完整梯烷脂进行研究和提取就具有极高的生态和生理学意义。近年来，随着高效液相色谱—电喷雾电离—质谱联用技术的发展，兴起了以微生物细胞膜脂分析的研究，使基于完整梯烷脂分析的研究成为可能并得以发展。与生物学技术相比，该方法具有无需培养、快速和普适性等特点，亦可以提供较详细的有关自厌氧氨氧化菌细胞丰度和代谢过程的信息。

由于完整梯烷脂是一种特殊的磷脂，目前对该物质的提取多是采用改良的磷脂提取方法，提取方法的基础来源于外国学者Bligh,E.G.和Dyer,W.J.于1959年报道的文献（Arapid method for total lipid extraction and purification“一种总脂质快速提取和纯化方法”.Can.J.Biochem.Physiol《加拿大生物化学与生理学杂》1959.37:911-917）。而该类方法操作复杂、周期长，提取出的完整梯烷脂纯度较低，这不利于推广和使用。

目前，将完整梯烷脂视作常规磷脂进行提取，可采用的提取方法主要分为两类，一类是物理萃取法，如利用超临界流体技术等，但此类方法成本过高；另一类是化学萃取法，如有机溶剂萃取、柱层析、酶解等方法，对于不同样品方法不同，提取效率也不同，因此萃取的稳定性不能保证。

如能研发一种操作便捷、提取物纯度高的方法对于完整梯烷脂和厌氧氨氧化工艺的研究是十分必要的。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种操作便捷、提取质量高、成本低廉的厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂超声提取方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法，包括以下步骤：

1）取样：取5-10g污泥作为样品，所述污泥为含有厌氧氨氧化细菌的含水污泥；

2）冷冻干燥：采用真空冷冻干燥技术去除步骤1）的样品中所含游离水分，即将样品置于真空度0.08～0.09Mpa、温度为-40℃的环境下16-24h；将冷冻干燥后的样品置于-20℃下备用；

为保证样品一致性和后续提取过程中的提取液中各组分的体积比不受影响，污泥样品必须经过冷冻干燥处理，以充分去除污泥样品中的水分。

3）加入提取液：将步骤2）制备的样品置于50ml玻璃离心管中，并加入15-20ml提取液，所述的提取液是体积比为2:1:0.8的甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的混合溶液；

4）超声提取：在步骤3）中的玻璃离心管外设置冰浴，运用超声波破碎仪进行超声破碎处理；所述的超声破碎处理采用间歇运行模式，即超声开启3-6s，关闭4-6s，其中，超声总时间为15-20min；

5）调整提取液组分比例：向步骤4）的玻璃离心管中补充二氯甲烷和磷酸盐缓冲液，使提取液中甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为1:1:0.9；

6）离心分液：将步骤5）的玻璃离心管在5000rpm下离心10min；将离心后的上清液转移至分液漏斗中静置分液，收集下层的有机相液体；

7）氮吹浓缩：将步骤6）收集的下层的有机相液体置于氮吹仪中,在35℃下进行浓缩，浓缩至完全干燥成固相，形成底层沉淀；将底层沉淀溶解在1mL的有机溶剂中，该有机溶剂是体积比4：1的正己烷和异丙醇；再用孔径为0.45μm的有机滤膜过滤得到完整梯烷脂母液，置于-80℃存放。

其中，步骤4）中的超声波破碎仪的运行参数设置为：超声波频率20KHz，超声能量400-450W，变幅杆直径选配5-8mm，功率密度1200-2000W/cm²；为充分利用样品，可将玻璃离心管中的下层污泥样品按步骤3）-6）重复操作4-5次。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、由完整梯烷脂所组成的厌氧氨氧化体膜具有较高的密度即致密性，且自然界中含有厌氧氨氧化菌的样品又具有较大的异质性，这极大地影响了提取梯烷脂的提取效率。只有充分地分散样品，才有利于有机溶液的萃取。超声波辅助提取是一个较好的选择，超声波的空化效应和高频振荡产生的瞬间高压分散样品和破碎细胞壁，利于细胞内容物的释放且在破碎过程中无化学反应发生，因此本方法所提取的物质生物活性相对稳定，实现了对完整梯烷脂的高质量提取。

超声波辅助提取方法与超临界流体技术和单一的有机溶剂萃取方法相比，具有低成本，提取效率高的有点。

附图说明

图1为本发明实施例的母离子扫描液相色谱图（基于母离子m/z184）；

图2为本发明实施例峰A的相对丰度质谱分析图；

图3为本发明实施例峰B的相对丰度质谱分析图；

图4为本发明实施例峰C的相对丰度质谱分析图；

图5为本发明实施例峰D的相对丰度质谱分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法，包括以下步骤：

1）取样：取5-10g污泥作为样品，所述污泥为含有厌氧氨氧化细菌的含水污泥；

2）冷冻干燥：采用真空冷冻干燥技术去除步骤1）的样品中所含游离水分，即将样品置于真空度0.08～0.09Mpa、温度为-40℃的环境下16-24h；将冷冻干燥后的样品置于-20℃下备用；

为保证样品一致性和后续提取过程中的提取液中各组分的体积比不受影响，污泥样品必须经过冷冻干燥处理，以充分去除污泥样品中的水分。

3）加入提取液：将步骤2）制备的样品置于50ml玻璃离心管中，并加入15-20ml提取液，所述的提取液是体积比为2:1:0.8的甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的混合溶液；

4）超声提取：在步骤3）中的玻璃离心管外设置冰浴，运用超声波破碎仪进行超声破碎处理；所述的超声破碎处理采用间歇运行模式，即超声开启3-6s，关闭4-6s，其中，超声总时间为15-20min；

5）调整提取液组分比例：向步骤4）的玻璃离心管中补充二氯甲烷和磷酸盐缓冲液，使提取液中甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为1:1:0.9；

6）离心分液：将步骤5）的玻璃离心管在5000rpm下离心10min；将离心后的上清液转移至分液漏斗中静置分液，收集下层的有机相液体；

7）氮吹浓缩：将步骤6）收集的下层的有机相液体置于氮吹仪中,在35℃下进行浓缩，浓缩至完全干燥成固相，形成底层沉淀；将底层沉淀溶解在1mL的有机溶剂中，该有机溶剂是体积比4：1的正己烷和异丙醇；再用孔径为0.45μm的有机滤膜过滤得到完整梯烷脂母液，置于-80℃存放。

在利用氮吹仪进行浓缩时，氮气流量可以依据实际情况调整，流量大则干燥快，流量小则干燥慢，不会对干燥后的底层沉淀成分造成影响。

其中，步骤4）中的超声波破碎仪的运行参数设置为：超声波频率20KHz，超声能量400-450W，变幅杆直径选配5-8mm，功率密度1200-2000W/cm²；为充分利用样品，可将玻璃离心管中的下层污泥样品按步骤3）-6）重复操作4-5次。

本发明的处理对象为含厌氧氨氧化菌的污泥样品（土壤样品），技术方案可概括为：取样→冷冻干燥→加入提取液→超声提取→调整提取液组分比例→离心分液→氮吹浓缩，之后可以进行组分测定。本发明利用超声波的空化效应和高频振荡产生的瞬间高压分散样品和破碎细胞壁，利于细胞内容物的释放且在破碎过程中无化学反应发生，且所提取的物质生物活性相对稳定，可实现完整梯烷脂的高质量提取。在磷脂提取过程中厌氧氨氧化菌细胞的充分破碎是提取的关键，所以超声提取这一步尤为重要。目前，关于厌氧氨氧化菌完整梯烷脂的超声提取方法国内外鲜有报道，而超声提取的具体参数更未见报道；本发明探索了完整梯烷脂超声提取过程中超声设置的具体参数，超声波破碎仪设置特征在于：超声波频率20KHz，超声能量设定为400-450W，选配直径5-8mm变幅杆，功率密度1200-2000W/cm2；超声开启时间设定为3-6s，超声关闭时间设定为4-6s。并基于此完善了一整套厌氧氨氧化菌完整梯烷脂提取方法。

实施例

按以下步骤提取厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂：

1）取样：取15ml污泥作为样品，所述污泥为含有厌氧氨氧化细菌的含水污泥；离心后去除上层水分；

2）冷冻干燥：采用真空冷冻干燥技术去除步骤1）的样品中间隙水分，即运用北京博医康公司冷冻干燥机对污泥样品进行处理，参数设置为：真空度0.08～0.09Mpa、温度-40℃；冷冻干燥24h，将冷冻干燥后的样品置于-20℃的冰箱里备用；

3）加入提取液：将步骤2）得到的干燥样品8g 置于50ml玻璃离心管中，并加入10mL甲醇、5mL二氯甲烷和4mL磷酸盐缓冲液形成提取液，其中，甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为2:1:0.8；

4）超声提取：在步骤3）中的玻璃离心管外设置冰浴，运用SCIENTZ-IID超声细胞破碎机中进行超声破碎处理；所述的超声破碎处理采用间歇运行模式，即超声开启4s，关闭5s；其中，超声总时间为15min；

超声波破碎仪的运行参数设置为：超声波频率20KHz，超声能量414W，变幅杆直径为6mm，功率密度1465W/cm²；

5）调整提取液组分比例：向步骤4）的玻璃离心管中加入5mL二氯甲烷和5mL磷酸盐缓冲液，使提取液中甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为1:1:0.9；

6）离心分液：将步骤5）的玻璃离心管在5000rpm下离心10min；将离心后的上清液转移至分液漏斗中静置分液，收集下层的有机相液体；

为充分利用样品，可将玻璃离心管中的下层污泥样品按步骤3）-6）重复操作4次，以增加可收集的有机相液体；

7）氮吹浓缩：将上述五次收集的下层的有机相液体收集于玻璃试管中，并置于MD200氮吹仪中进行浓缩，浓缩至完全干燥成固相，形成底层沉淀；将底层沉淀溶解在1mL的有机溶剂中，该有机溶剂是体积比4：1的正己烷和异丙醇；然后用孔径为0.45μm的有机滤膜过滤得到完整梯烷脂母液，置于-80℃的冰箱中存放。

运用安捷伦1200高效液相色谱串联安捷伦6410B三重四级杆质谱对所提取的完整梯烷脂母液进行测定，上样量为20ul；设置选择离子模式对m/z 184 母离子进行扫描；分析所有含母离子m/z 184物质的质谱图，鉴定完整梯烷脂，鉴定情况如下：

为对厌氧氨氧化菌完整梯烷脂提取效果进行验证，对所提取样品进行了高效液相串联质谱分析，在样品母离子扫描液相色谱图（基于母离子m/z184）中，即图1所示：样品的母离子扫描液相色谱图中出现了四个较为明显的峰。峰A、峰B、峰C的出峰时间相隔较短，峰D则与前三个峰的出峰时间相隔较长。峰A出峰时间在14.2分钟左右，峰B在15.2分钟左右出现，峰C相对丰度最高，出峰时间在17分钟左右出现，峰D在23.8分钟左右出现。

对四个色谱峰进行质谱分析：

如图2所示，峰A中含有的主要物质的质荷比m/z（质荷比为分子中质子和电荷的比值，本试验中梯烷脂加氢后带电量均为+1，因此m/z值减去1便为该梯烷脂的分子量。）为844，另外还含有少量m/z为830、842和858等物质，根据已有报道均不属于梯烷脂。

如图3所示，峰B中含量最多物质的m/z为842，m/z为750、816、829和844的物质含量次之，另外还有少量的m/z为814等物质。根据已有报道，峰B中含量较高的m/z为816的物质和m/z为814的物质属于完整梯烷脂。

如图4所示，峰C中含量较多物质的m/z为742、748和784，m/z为748、762、770、774、776、788和816的物质含量次之，另外还含有少量m/z为749的物质。根据已有报道，峰C中含量较高m/z为742、774、788、816的物质属于完整梯烷脂。

如图5所示，峰D中几乎只含有m/z 530的物质，根据已有报道，该物质为完整梯烷脂。

综上，通过对应用本发明所提取的样品进行高效液相串联质谱分析，在样品的四个分离峰中的三个峰均检测到了完整梯烷脂的存在，证明该方法效果良好，提取纯度高。

本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (1)

1.一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂超声提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）取样 ：取 15ml 污泥作为样品，所述污泥为含有厌氧氨氧化细菌的含水污泥 ；离心后去除上层水分 ；

2）冷冻干燥：采用真空冷冻干燥技术去除步骤 1）的样品中间隙水分，即运用北京博医康公司冷冻干燥机对污泥样品进行处理，参数设置为 ：真空度 0.08 ～ 0.09Mpa、温度 -40℃； 冷冻干燥 24h，将冷冻干燥后的样品置于 -20℃的冰箱里备用 ；

3）加入提取液 ：将步骤 2）得到的干燥样品 8g 置于 50ml 玻璃离心管中，并加入10mL 甲醇、5mL 二氯甲烷和 4mL 磷酸盐缓冲液形成提取液，其中，甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为 2:1:0.8 ；

4）超声提取 ：在步骤 3）中的玻璃离心管外设置冰浴，运用 SCIENTZ-IID 超声细胞破碎机中进行超声破碎处理；所述的超声破碎处理采用间歇运行模式，即超声开启 4s，关闭5s ； 其中，超声总时间为 15min； 超声波破碎仪的运行参数设置为：超声波频率 20KHz，超声能量 414W，变幅杆直径为 6mm，功率密度 1465W/cm2 ；

5）调整提取液组分比例 ：向步骤 4）的玻璃离心管中加入 5mL 二氯甲烷和5mL 磷酸盐缓冲液，使提取液中甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为 1:1:0.9 ；

6）离心分液 ：将步骤 5）的玻璃离心管在 5000rpm 下离心 10min ；将离心后的上清液转移至分液漏斗中静置分液，收集下层的有机相液体 ；为充分利用样品，可将玻璃离心管中的下层污泥样品按步骤 3）-6）重复操作 4 次，以增 加可收集的有机相液体 ；

7）氮吹浓缩：将上述五次收集的下层的有机相液体收集于玻璃试管中，并置于 MD 200氮吹仪中进行浓缩，浓缩至完全干燥成固相，形成底层沉淀 ；将底层沉淀溶解在 1mL 的有机溶剂中，该有机溶剂是体积比 4 ：1 的正己烷和异丙醇 ；然后用孔径为 0.45μm 的有机滤膜 过滤得到完整梯烷脂母液，置于 -80℃的冰箱中存放。