CN105102458B - 作为自分泌运动因子抑制剂的二氢吡啶并嘧啶化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了式I的化合物，或其药学上可接受的盐。本发明化合物是自分泌运动因子抑制剂，其可用于与骨关节炎相关的疼痛的治疗。
Description
本发明涉及二氢吡啶并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐及其治疗用途。本发明的化合物是自分泌运动因子(autotaxin)抑制剂。
自分泌运动因子是一种被报道为细胞外溶血磷脂酸(LPA)的主要来源的酶，所述LPA通过其同源受体之一LPA1上调疼痛相关蛋白。LPA是影响许多生物和生物化学过程的细胞内脂质介质。自分泌运动因子介导的LPA生物合成的靶向抑制可提供预防疼痛的新型机制。需要抑制自分泌运动因子的化合物。
与骨关节炎(OA)相关的疼痛据报道是导致OA患者的下肢残疾的主要症状。超过两千万美国人已被确诊患有OA，其为最常见的关节病。期望用于患有OA相关疼痛的患者的治疗选择。
美国专利7,524,852 ('852)公开了某些取代的双环嘧啶衍生物作为抗炎剂。
PCT/US2011/048477中公开了具有自分泌运动因子活性的某些吲哚化合物。
本发明提供作为自分泌运动因子抑制剂的新型化合物。本发明提供抑制自分泌运动因子介导的LPA产生的某些新型化合物。期望自分泌运动因子抑制剂化合物为自分泌运动因子介导的病症，诸如与OA相关的疼痛提供治疗。
本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐：
其中
A选自
L是键或C1-C3 烷基；且
B选自H，
。
优选的是，B选自
。
进一步优选本发明的化合物，其中B是
。
在本发明的一个优选方面，A选自
。
优选的是，A选自
。
优选的是，A是
。
在另一个实施方案中，A是
。
本发明的一个优选方面是L选自键和CH2。优选的是，L是键。优选的是，L是CH2。
本发明提供了式II的化合物或其药学上可接受的盐
。
本发明提供了式III的化合物或其药学上可接受的盐
。
应当理解，本发明化合物可作为互变异构形式存在。当存在互变异构形式时，本发明考虑到了各形式和其混合物。
本发明还提供治疗患者的OA相关疼痛的方法，其包括向需要此类治疗的患者施用有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗中。
本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗OA相关疼痛。甚至此外，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗OA相关疼痛的药物的用途。
本发明进一步提供包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种其它治疗剂。本发明还涵盖用于合成式I的化合物的新型中间体和方法。
术语“药学上可接受的盐”是指被认为对于临床和/或兽医用途可接受的本发明的化合物的盐。药学上可接受的盐和它们的常用制备方法是本领域中众所周知的。参见例如P. Stahl, 等人, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection andUse,(VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge,等人, "Pharmaceutical Salts," Journalof Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, 1977年1月。
如本文所使用的术语“治疗(“treating”或“treat”或“treatment”)是指限制、减慢、停止或逆转现有症状、状况或病症的进展或严重度。症状、状况或病症可呈现为“急性”或“慢性”事件。在急性事件中，化合物在症状、状况或病症开始时施用且当事件消失时停用。慢性事件在与该症状或事件相关的病症或状况的过程中治疗，其中慢性治疗不依赖于该症状或事件的特定表现。本发明考虑到急性和慢性治疗两者。
本发明的化合物抑制自分泌运动因子且可用于治疗与自分泌运动因子的增加相关的疾病或状况。本发明的化合物抑制自分泌运动因子介导的LPA的产生且可用于治疗伴随LPA的增加的疾病或状况。当与其它LPA脂质介质相比时，本发明的化合物抑制自分泌运动因子介导的LPA生物合成。本发明的化合物可用于治疗与LPA的增加相关的疾病或状况。
如本文所使用的“患者”是指需要治疗的动物。一个优选实施方案是作为哺乳动物、优选作为人的患者。另一个优选实施方案是作为伴侣动物、诸如狗、猫或家禽的患者。
如本文所使用的术语“有效量”是指在单剂量或多剂量施用于患者后在被诊断或治疗的患者中提供期望作用的本发明的化合物或其药学上可接受的盐的量或剂量。应当理解的是，由医师鉴于相关情况，包括待治疗的状况、所选施用途径、施用的实际活性剂、个体患者的年龄、重量和反应以及患者症状的严重度和其它相关情况决定实际施用的活性剂的量。
本发明的化合物优选配制成通过使得化合物可生物利用的任何途径施用的药物组合物。最优选地，此类组合物用于口服施用。此类药物组合物及其制备方法是本领域中众所周知的。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(D.B. Troy, 编辑, 第21版, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。
通常，式I的化合物可以从式IV的化合物制备。更具体地，在方案A中，式IV的化合物在O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐和碱(诸如二异丙基乙胺)存在的情况下与式VII的化合物偶联以提供式I的化合物。合适的溶剂包括二甲亚砜。
或者在方案A中，式I的化合物可以从式V的化合物制备。更具体地，式IV的化合物在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和碱(诸如N,N-二甲基-4-吡啶胺)存在的情况下与式VIII的化合物(其中Pc是基团B的合适前体)偶联以提供式V的化合物。合适的溶剂包括二氯甲烷。式V的化合物(其中Pc是基团B的合适前体)在如实施例和制备例中所述条件下反应以提供式I的化合物。熟练的药用化学家将选择适于转化为基团B的Pc值。式VIII的化合物(其中Pc是基团B的合适前体)可以如实施例和制备例中所述制备。
方案A
如方案B中所示，式IV的化合物可以从式VI的化合物(其中Pg是胺保护基)制备。更具体地，式VI的化合物(其中Pg是叔丁氧基羰基)与酸(诸如盐酸)在溶剂(诸如四氢呋喃)中反应以提供式IV的化合物。
方案B
在方案C中，式VI的化合物(其中Pg是叔丁氧基羰基)可以从式IX的化合物制备。更具体地，N-叔丁氧基羰基-4-哌啶酮相继与(CH3)2NCH(OCH3)2在溶剂(诸如二甲基甲酰胺)中反应，且然后与式IX的化合物、碱(诸如碳酸钾)在共溶剂(诸如乙醇)中反应以提供式VI的化合物(其中Pg是叔丁氧基羰基)。式IX的化合物可已通过使2,3-二氢-1H-茚-2-胺盐酸盐和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐与碱(诸如二异丙基乙胺)在溶剂(如乙腈)中反应制备。
方案C
制备例和实施例
以下“制备例和实施例”进一步说明本发明且代表本发明的化合物的典型合成。应当理解的是，通过说明而非限制的方式记载“制备例和实施例”，且本领域普通技术人员可作出各种修改。试剂和起始物质通常是本领域普通技术人员可得的。其它可通过与已知的结构类似化合物的合成类似的有机和杂环化学的标准技术和以下“制备例和实施例”描述的程序(包括任何新型程序)来制备。
除非作出相反的指示，本文说明的化合物使用ACDLABS或Symyx Draw 3.2命名和编号。
制备例1
1-茚满-2-基胍盐酸盐的合成。
将2,3-二氢-1H-茚-2-胺盐酸盐(197 g; 1.08当量; 1.16摩尔)、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(158 g; 1.00当量; 1.08摩尔)和二异丙基乙基胺(400 g; 2.87当量; 3.09摩尔;539.74 mL)于乙腈(2 L)中的溶液在62℃下搅拌2小时，在此期间白色固体沉淀。将混合物冷却至25℃，然后过滤且用300 mL乙腈和300 mL甲基叔丁基醚洗涤。将产物在空气中在25℃干燥1小时以提供作为白色固体的标题化合物(200g, 87%)。MS(m/z): 176(M + 1)。
制备例2
2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯的合成。
将1,1-二甲氧基-N,N-二甲基-甲胺(224 g; 2.15当量; 1.88摩尔; 250.98 mL)和N-叔丁氧基羰基-4-哌啶酮(250 g; 1.44当量; 1.25摩尔)于二甲基甲酰胺(1.2 L)中的溶液在109℃在N2下搅拌4小时。将混合物冷却至25℃，且然后添加乙醇(700 mL; 12.02摩尔; 553.91 g)。将1-茚满-2-基胍盐酸盐(185 g; 1.00当量; 873.90 mmol)和碳酸钾(475g; 3.44摩尔)在25℃一次性添加至混合物中以形成白色悬浮液。将混合物在80-90℃搅拌24小时，然后冷却至25℃且将混合物倒入5 L冰/水中以获得黄色悬浮液。用乙酸乙酯(3 x3 L)萃取且用10%氯化锂溶液(3 L)、水(3 L)和饱和氯化钠溶液(3 L)洗涤有机层。经无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩以得到约300 ml红色溶液。通过硅胶塞(10cm高，5cm直径)过滤溶液，且然后浓缩至干燥以得到作为红色凝胶的标题化合物(320g, 100%)。MS(m/z): 367(M+ 1)。
制备例3
N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺的合成
将盐酸(900 mL; 5M，于水中; 5.17当量; 4.50摩尔; 1.08 kg)逐份添加至2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-甲酸叔丁酯(319 g; 1.00当量;870.48 mmol)于四氢呋喃(1.5 L)中的溶液。一旦添加完成，将该溶液在50℃搅拌1小时。将混合物冷却至25℃，且然后添加3 L甲基叔丁基醚和1 L水。使溶液在20℃静置16小时。分离各相且用二氯甲烷(2 L)萃取水相。弃去有机萃取物且使用4M氢氧化钠将水相调节至pH10。用乙酸乙酯(3 x 3 L)萃取且用饱和氯化钠(2 L)洗涤合并的有机萃取物。经无水硫酸钠干燥，过滤且浓缩至干燥以得到红色凝胶。在50℃将物质再溶解于乙酸乙酯(300 mL)和石油醚(200 mL)中且允许其经24小时沉淀。过滤和干燥以提供标题化合物(85 g, 37%)。MS(m/z): 267(M + 1)。
制备例4
1-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔基)吡唑-4-甲酸乙酯的合成。
将1H-吡唑-4-甲酸乙酯(700.7 mg, 5 mmol)置于50mL圆底烧瓶中，且溶解于二甲基甲酰胺(11mL)中。将反应混合物冷却至0℃。经20分钟逐份添加氢化钠(180.0 mg, 4.5mmol)。搅拌反应混合物20分钟，且然后添加3-溴丙-1-炔基(三甲基)硅烷(0.92 mL, 6.5mmol)，且再搅拌30分钟。用水(20mL)淬灭反应混合物，且用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，以乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.75 g, 60%)。LCMS(m/z):251.0(M+1)。
制备例5
1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯的合成。
将1-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔基)吡唑-4-甲酸乙酯(0.751 g, 3.00 mmol)置于微波瓶中，且溶解于二甲基甲酰胺(12.00mL)和水(18mL)中。添加五水合硫酸铜(II)(149.79 mg, 0.6 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(1.19 g, 6.00 mmol)和二甲基甲酰胺(2 mL)。使反应混合物脱气三次。添加叠氮基三甲基硅烷(1.60 mL, 12.00 mmol)，且在90℃加热15小时。将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，以甲醇/乙腈纯化残余物，以得到标题化合物(0.5g, 75%)。LCMS(m/z): 222.0(M+1)。
制备例6
1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸的合成。
将1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯(2.1 g, 7.16 mmol)置于100mL圆底烧瓶中，且溶解于四氢呋喃(30mL)和水(15mL)中。添加氢氧化锂(1.50 g, 35.79 mmol)，并在55℃加热18小时。用5N盐酸将反应混合物稀释至pH 1-2。在减压下移除溶剂。添加乙醇且滤出固体。在减压下浓缩滤液，以得到标题化合物(3.01 g,105%)。LCMS(m/z):194.0(M+1)。
实施例1
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-基]甲酮的合成。
实施例1的化合物的替代化学名称为[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][1-(1H-1,2,3-三唑-4基甲基)-1H-吡唑-4-基]甲酮。
将1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸(2.28 g 5.70 mmol)置于100mL圆底烧瓶中，且溶解于二甲亚砜(28.5 mL)中。添加二异丙基乙基胺(6.8 mL, 39.2 mmol)和O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(3.5 g, 11.00 mmol)，且搅拌10分钟。添加N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(1.52 g, 5.70 mmol)，且搅拌该反应混合物90分钟。使用水(40mL)淬灭反应，且用10%甲醇/乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过反相层析纯化残余物，且用甲醇/乙酸乙酯/己烷结晶，以得到标题化合物(0.45 g, 18%)。LCMS(m/z):442.2(M+1)。
制备例7
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-(1H-吡唑-4-基)甲酮的合成。
将4-吡唑甲酸(700.7 mg, 5 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(2.00 g, 7.51 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.16g, 11.26 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(45.9 mg, 0.3 mmol)置于250mL圆底烧瓶中，且溶解于二氯甲烷(60mL)中。在25℃搅拌该反应混合物18小时。用饱和碳酸氢钠(50mL)淬灭该反应，且用二氯甲烷萃取两次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。使残余物从甲醇/乙酸乙酯再结晶，以得到标题化合物(0.98 g, 28%)。LCMS(m/z): 361.2(M+1)。
制备例8
1H-咪唑-4-基-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将1H-咪唑-4-甲酸(1.26 g, 11.21 mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(1.14 g,7.45 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(1.82 g, 6.83 mmol)、三乙胺(2.84 mL, 20.36 mmol和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.43 g,7.45 mmol)置于圆底烧瓶中。添加二甲基甲酰胺(22mL)，且在25℃搅拌过夜。用水淬灭该反应，且用9:1 二氯甲烷/甲醇萃取。用水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，使用甲醇/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(1.2g，49%)。LCMS(m/z)：361.2(M+1)。
制备例9
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-(1H-吡咯-3-基)甲酮的合成。
将N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(1.08 g, 4.05 mmol)、1H-吡咯-3-甲酸(500.00 mg, 4.50 mmol)置于圆底烧瓶中。添加二甲基甲酰胺(15 mL)和二异丙基乙胺(3.14 mL, 18.00 mmol; 3.14)。冷却至0℃，且逐滴添加1-丙基膦酸环酐(3.45 mL, 5.85 mmol)。在0℃搅拌，且容许升温至室温，且在25℃搅拌18小时。倒入冰水中，且搅拌15分钟。过滤固体，用水洗涤，且在真空烘箱中在40℃干燥固体，以得到标题化合物(1.62g，31%)。LCMS(m/z)：360.2(M+1)。
制备例10
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-(1-丙-2-炔基吡咯-3-基)甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-(1H-吡咯-3-基)甲酮(500 mg, 1.39 mmol)和二甲基甲酰胺(3 mL)置于圆底烧瓶中，且冷却至℃。添加双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠(1.81 mL, 1.81 mmol)，且搅拌40分钟。添加3-溴丙-1-炔基(三甲基)硅烷(216.50 µL, 1.53 mmol)。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.55g，25%)。LCMS(m/z)：398.0(M+1)。
制备例11
1-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔基)三唑-4-甲酸甲酯的合成。
将1H-三唑-5-甲酸甲酯(400.00 mg, 3.15 mmol)和二甲基甲酰胺(6.84 mL)置于圆底烧瓶中。将混合物冷却至0℃。经20分钟逐份添加氢化钠(120.00 mg, 3.0 mmol)，且然后搅拌20分钟。添加3-溴丙-1-炔基(三甲基)硅烷(578.83 µL, 4.09 mmol)。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.25g，33%)。LCMS(m/z)：238.0(M+1)。
制备例12
1-[(5-三甲基甲硅烷基-1H-三唑-4-基)甲基]三唑-4-甲酸甲酯的合成。
将1-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔基)三唑-4-甲酸甲酯(240 mg, 1.01 mmol)置于微波反应容器中，且添加二甲基甲酰胺(6 mL)和水(6 mL)。添加五水合硫酸铜(II)(50.50mg, 0.202 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(400.67 mg, 2.02 mmol)。使该系统脱气，鼓入氮气且鼓泡三次。添加叠氮基三甲基硅烷(540.00 µL, 4.04 mmol)，且在90℃加热18小时。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/乙腈纯化残余物，以得到标题化合物(0.28g，39%)。LCMS(m/z)：281.0(M+1)。
制备例13
1-(1H-三唑-4-基甲基)三唑-4-甲酸的合成。
将1-[(5-三甲基甲硅烷基-1H-三唑-4-基)甲基]三唑-4-甲酸甲酯(0.28 g, 1.00mmol)、四氢呋喃(5.00 mL)、氢氧化锂(209.55 mg, 4.99 mmol)和水(2.38 mL)置于圆底烧瓶中，且在55℃加热3小时。用1N盐酸使该反应混合物酸化，且在减压下浓缩至干燥，以得到作为白色固体的标题化合物(0.47g，>100%)。LCMS(m/z): 234.0(M+40)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) ppm: 5.75(s, 1H), 7.94(bs, 1H), 8.67(s, 1H), 15.33(bs, 1H)。
制备例14
3-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔氧基)苯甲酸甲酯的合成。
将3-羟基苯甲酸甲酯(502.10 mg, 3.3 mmol)和二甲基甲酰胺(7.00 mL)置于圆底烧瓶中。将混合物冷却至0℃。逐份添加氢化钠(171.58 mg, 4.29 mmol)，且搅拌15分钟。添加3-溴丙-1-炔基(三甲基)硅烷(700.34 µL, 4.95 mmol)，且搅拌18小时。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.24g，28%)。LCMS(m/z)：263.0(M+1)。
制备例15
3-[(5-三甲基甲硅烷基-1H-三唑-4-基)甲氧基]苯甲酸甲酯的合成。
将3-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔氧基)苯甲酸甲酯(234 mg, 0.89 mmol)置于圆底烧瓶中，且添加二甲基甲酰胺(5.6 mL)和水(5 mL)。添加五水合硫酸铜(II)(44 mg,0.18 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(353 mg, 1.78 mmol)。使该系统脱气，鼓入氮气且鼓泡三次。添加叠氮基三甲基硅烷(0.475 mL, 3.57 mmol)，且在90℃加热18小时。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/乙腈纯化残余物，以得到标题化合物(0.27g，55%)。LCMS(m/z)：306.0(M+1)。
制备例16
3-(1H-三唑-4-基甲氧基)苯甲酸的合成。
将3-[(4-三甲基甲硅烷基-1H-三唑-5-基)甲氧基]苯甲酸甲酯(0.15 g, 0.49mmol)、四氢呋喃(2 mL)、氢氧化锂(206 mg, 4.91 mmol)和水(1 mL)置于圆底烧瓶中，且在55℃加热3小时。用1N盐酸使该反应混合物酸化，且在减压下浓缩至干燥，以得到作为白色固体的标题化合物(0.14g，70%)。LCMS(m/z)：220.0(M+40)。
制备例17
3-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)苯甲酸甲酯的合成。
将3-溴苯甲酸甲酯(1.88 g, 8.73 mmol)、三乙胺(10.00 mL, 71.74 mmol)、(三甲基甲硅烷基)乙炔(1.48 mL, 10.49 mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(0.146 g, 0.205mmol)和碘化亚铜(I) (23 mg, 0.121 mmol)置于圆底烧瓶中。在90℃加热该反应混合物18小时。将该反应混合物脱气，且添加更多的(三甲基甲硅烷基)乙炔(1.48 mL, 10.49mmol)、3-溴苯甲酸甲酯(1.88 g, 8.73 mmol)和碘化亚铜(I)(23 mg, 0.121 mmol)，且在90℃加热该混合物18小时。用75mL 1N盐酸淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(1.4g，69%)。LCMS(m/z)：233.0(M+1)。
制备例18
3-乙炔基苯甲酸的合成。
将3-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)苯甲酸甲酯(0.399 g, 1.55 mmol)和四氢呋喃(3.68 mL)置于圆底烧瓶中。添加氢氧化锂(0.162 g, 3.86 mmol)和水(3.68 mL)，且在50℃加热。用1.3mL 5N盐酸淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩，以得到标题化合物(0.26g，>100%)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) ppm: 4.39(s, 3H), 7.50(m, 2H), 7.70(m, 1H), 7.94(m, 1H) 13.22(s, 1H)。
制备例19
(3-乙炔基苯基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将3-乙炔基苯甲酸(259 mg, 1.78 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(430 mg, 1.78 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(464 mg, 2.42 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(9.86 mg, 0.080 mmol)置于圆底烧瓶中，且溶解于二氯甲烷(13mL)中。在25℃搅拌该反应混合物1小时。在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.64g，91%)。LCMS(m/z)：395.2(M+1)。
实施例2
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[1-(3-甲基咪唑-4-基)吡唑-4-基]甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-(1H-吡唑-4-基)甲酮(0.142 g, 0.40 mmol)、5-溴-1-甲基-咪唑(89 mg, 0.55 mmol)、碳酸铯(257 mg,0.79 mmol)、(1R,2R)-二氨基甲基环己烷(16 mg, 0.12 mmol)和碘化亚铜(I)(7.50 mg,0.039 mmol)置于微波反应容器中。添加甲苯(2 mL)和二甲基甲酰胺(2 mL)。密封该容器，且吹洗三次，且在110℃加热48小时。使该反应冷却至室温，且用水(2mL)淬灭。用乙酸乙酯萃取三次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.078g，0.42%)。LCMS(m/z)：441.2(M+1)。
实施例3
[1-(3-咪唑-1-基丙基)吡唑-4-基]-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-(1H-吡唑-4-基)甲酮(180 mg, 0.50 mmol)、碳酸铯(507 mg, 1.56 mmol)和碘化钠(12.5 mg, 0.083mmol)置于圆底烧瓶中。添加二甲基甲酰胺(2.5mL)，且搅拌20分钟。添加溶解于2mL二甲基甲酰胺中的1-(3-溴丙基)咪唑氢溴酸盐(150.00 mg, 0.56 mmol)。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.073g，28%)。LCMS(m/z)：469.0(M+1)。
实施例4
[1-(2-咪唑-1-基乙基)咪唑-4-基]-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将1H-咪唑-4-基-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(200 mg, 0.55mmol)和碳酸铯(506 mg, 1.55 mmol)置于圆底烧瓶中。添加二甲基甲酰胺(2.5mL)，且搅拌20分钟。添加(2-溴乙基)-1H-咪唑-1-鎓溴化物(156 mg, 0.61mmol)，且搅拌20分钟。用水淬灭该反应，且用9:1二氯甲烷/甲醇萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.058g，23%)。LCMS(m/z)：455.2(M+1)。
实施例5
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[1-(1H-三唑-4-基甲基)吡咯-3-基]甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-(1-丙-2-炔基吡咯-3-基)甲酮(140 mg, 0.35 mmol)置于微波反应容器中，且添加二甲基甲酰胺(3mL)和水(4mL)。添加五水合硫酸铜(II)(35 mg, 0.141 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(279 mg, 1.41mmol)。使该系统脱气，鼓入氮气且鼓泡三次。添加叠氮基三甲基硅烷(0.188 mL, 1.41mmol)，且在90℃加热过夜。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.083g，53%)。LCMS(m/z)：441.2(M+1)。
实施例6
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[1-(1H-三唑-4-基甲基)三唑-4-基]甲酮的合成。
将1-(1H-三唑-4-基甲基)三唑-4-甲酸(97 mg, 375 mmol)和二甲亚砜(2 mL)置于圆底烧瓶中。添加o-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(240 mg, 0.725mmol)和二异丙基乙胺(450 µL, 2.58 mmol)，且搅拌15分钟。添加N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(0.100 g, 0.375 mmol)，且在25℃搅拌18小时。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.014g，8.4%)。LCMS(m/z)：443.2(M+1)。
实施例7
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[3-(1H-三唑-5-基)苯基]甲酮的合成。
将(3-乙炔基苯基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(243 mg, 0.616 mmol)置于微波反应容器中，且添加二甲基甲酰胺(1.2 mL)和水(3.7 mL)。添加五水合硫酸铜(II)(31 mg, 0.123 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(244 mg, 1.23mmol)。使该系统脱气，鼓入氮气且鼓泡三次。添加叠氮基三甲基硅烷(0.33 mL, 2.46mmol)，且在90℃加热2小时。用水淬灭该反应，且用9:1 乙酸乙酯/甲醇萃取三次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析(使用甲醇/乙酸乙酯/己烷)和然后反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.27g，33.0%)。LCMS(m/z)：438.2(M+1)。
制备例20
1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸的合成。
将1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯(2.1 g, 7.16 mmol)置于100mL圆底烧瓶中，且溶解于四氢呋喃(30 mL)和水(15 mL)。添加氢氧化锂(1.50 g, 35.79 mmol)，且在55℃加热18小时。用5N盐酸将该反应混合物稀释至pH 1-2。在减压下移除溶剂。添加乙醇且滤出固体。在减压下浓缩滤液，以得到标题化合物(3.01g，>100%)。LCMS(m/z)：194.0(M+1)。
制备例21
1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸乙酯的合成。
将1-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔基)吡唑-4-甲酸乙酯(0.751 g, 3.00 mmol)置于微波瓶中，且溶解于二甲基甲酰胺(12.00 mL)和水(18 mL)中。添加五水合硫酸铜(II)(150 mg, 0.6 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(1.19 g, 6.00 mmol)和二甲基甲酰胺(2 mL)。将该反应混合物脱气三次。添加叠氮基三甲基硅烷(1.60 mL, 12.00 mmol)，且在90℃加热15小时。将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，用甲醇/乙腈纯化残余物，以得到标题化合物(0.5g，75%)。LCMS(m/z)：222.0(M+1)。
制备例22
1-(3-三甲基甲硅烷基丙-2-炔基)吡唑-4-甲酸乙酯的合成。
将1H-吡唑-4-甲酸乙酯(700.7 mg, 5 mmol)置于50mL圆底烧瓶中，且溶解于二甲基甲酰胺(11mL)中。使该反应混合物冷却至0℃。经20分钟逐份添加氢化钠(180 mg, 4.5mmol)。搅拌该反应混合物20分钟，且然后添加3-溴丙-1-炔基(三甲基)硅烷(0.92 mL, 6.5mmol)，且再搅拌30分钟。用水(20mL)淬灭该反应混合物，且用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，以乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.75g，60%)。LCMS(m/z)：251.0(M+1)。
实施例8
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-基]甲酮的合成。
实施例8的化合物的替代化学名称为[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][1-(1H-1,2,3-三唑-4基甲基)-1H-吡唑-4-基]甲酮。
将1-(1H-三唑-4-基甲基)吡唑-4-甲酸(2.28 g 5.70 mmol)置于100mL圆底烧瓶中，且溶解于二甲亚砜(28.5mL)中。添加二异丙基乙胺(6.8 mL, 39.2 mmol)、O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(3.5 g, 11.00 mmol)，且搅拌10分钟。添加N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(1.52 g, 5.70 mmol)，且搅拌该反应混合物90分钟。用水(40mL)淬灭该反应，且用10%甲醇/乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过反相层析纯化残余物，且用甲醇/乙酸乙酯/己烷结晶，以得到标题化合物(0.45g，18%)。LCMS(m/z)：442.2(M+1)。
制备例23
(4-溴-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(2.66 g, 10 mmol)、4-溴吡啶-2-甲酸(2.24 g, 11.0 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.88 g, 15.0 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(61 mg, 0.50 mmol)置于100mL圆底烧瓶中。溶解于二氯甲烷(40mL)中，且在室温下搅拌18小时。浓缩且通过快速硅胶层析，用乙腈/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(2.9g，64%)。LCMS(m/z)：452.0(M+2)。
制备例24
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[4-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-2-吡啶基]甲酮的合成。
将(4-溴-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(2.9 g, 6.44 mmol)、三甲基甲硅烷基-乙炔(1.1 mL, 7.73 mmol)、三乙胺(16mL, 116 mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(219 mg, 0.31 mmol)和碘化亚铜(I)(32 mg,0.2 mmol)置于50mL圆底烧瓶中。溶解于二甲基甲酰胺(32mL)中，且将该反应混合物脱气三次。在65℃加热该反应混合物18小时。将混合物冷却至室温，用水稀释，且用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，以乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(1.3g，43%)。LCMS(m/z)：468.2(M+1)。
制备例25
(4-乙炔基-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[4-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-2-吡啶基]甲酮(1.3 g, 2.78 mmol)置于50mL圆底烧瓶中。溶解于四氢呋喃(18mL)中，且使该反应混合物冷却至0℃。添加1N 氟化四丁基铵(3.06 mL; 3.06mmol)，且搅拌30分钟。用水(40mL)淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，以甲醇/乙酸乙酯纯化残余物，以得到标题化合物(0.89g，81%)。LCMS(m/z)：396.0(M+1)。
实施例9
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[4-(1H-三唑-5-基)-2-吡啶基]甲酮的合成。
实施例9的化合物的替代化学名称为[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][4-(1H-1,2,3-三唑-5基)吡啶-2-基]甲酮。
将(4-乙炔基-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(2.3 g, 4.92 mmol)置于微波瓶中，且溶解于二甲基甲酰胺(29mL)和水(29mL)中。添加五水合硫酸铜(II)(246 mg, 1 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(1.9 g, 9.8mmol)和二甲基甲酰胺(15 mL)。将该反应混合物脱气三次。经20分钟逐滴添加叠氮基三甲基硅烷(2.3 mL, 20 mmol)。在90℃加热15小时。将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.47g，22%)。LCMS(m/z)：439.0(M+1)。
制备例26
(6-氯哒嗪-3-基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
搅拌6-氯哒嗪-3-甲酸(1.93 g; 1.20当量; 12.17 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(2.70 g; 1.00当量; 10.14 mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.14 g; 1.10当量; 11.16 mmol)于二氯甲烷(25 mL)中的悬浮液30分钟。在减压下浓缩该反应混合物，且通过柱层析(0至5%甲醇/二氯甲烷)纯化残余物，以提供标题化合物(3.70g；90%)。MS(m/z)：407(M+1)。
制备例27
2-氰基-2-[6-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-羰基]哒嗪-3-基]乙酸叔丁酯的合成。
在室温将氰基乙酸叔丁酯(0.27 mL; 1.52当量; 1.83 mmol)添加至氢化钠(0.12g; 2.50当量; 3.00 mmol)于1,4-二烷(6.5 mL)中的搅拌悬浮液中。1小时后，添加(6-氯哒嗪-3-基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(0.49 g;1.00当量; 1.20 mmol)，且在100℃加热所得反应混合物16小时。使该反应混合物冷却至室温，分配于乙酸乙酯和0.5 M 盐酸之间，且分离各层。经无水硫酸钠干燥有机层，过滤，且在减压下浓缩得到标题化合物(0.61g；99%)。MS(m/z)：512(M+H)。
制备例28
2-[6-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-羰基]哒嗪-3-基]乙腈的合成。
将对甲苯磺酸单水合物(0.025 g; 0.11当量; 0.13 mmol)添加至2-氰基-2-[6-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-羰基]哒嗪-3-基]乙酸叔丁酯(0.61 g; 1.00当量; 1.19 mmol)于甲苯(8 mL)中的搅拌溶液中，且加热至回流，持续3小时，然后冷却至室温，且过滤。将固体残余物溶解于二氯甲烷(30mL)中，且用饱和碳酸氢钠洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，且浓缩。通过柱层析(50至75%丙酮/己烷)纯化残余物，以得到标题化合物(0.255g；52%)。MS(m/z)：412(M+H)。
实施例10
[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][6-(1H-四唑-5-基甲基)哒嗪-3-基]甲酮的合成。
将叠氮基三甲基硅烷(0.81 mL; 10当量; 6.08 mmol)和二丁基氧化锡(0.042 g;0.28当量; 0.17 mmol)添加至2-[6-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-羰基]哒嗪-3-基]乙腈(0.25 g; 1.00当量; 0.61 mmol)于甲苯(6 mL)中的搅拌悬浮液，且在110℃加热所得反应混合物16小时，然后冷却至室温，且在减压下浓缩。通过反相柱层析纯化所得残余物，以得到标题化合物(0.074g；27%)：MS(m/z)：455(M+H)。
制备例29
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[6-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)哒嗪-3-基]甲酮的合成。
在140℃照射装有(6-氯哒嗪-3-基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(0.505 g; 1.00当量; 1.24 mmol)、碘化亚铜(I)(0.014 g; 0.06当量; 0.073 mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(0.043 g; 0.05当量; 0.061 mmol)和三甲基甲硅烷基乙炔(0.69 mL; 3.94当量; 4.90 mmol)于二甲基甲酰胺(0.9 mL)和三乙胺(10mL)中的悬浮液的微波小瓶30分钟。将该反应混合物分配于乙酸乙酯和0.1 N 盐酸之间，且分离。搅拌有机层与SiliCycle (SiliaMetS硫醇) 30分钟，过滤且浓缩。将残余物溶解于50%丙酮/己烷中，且用硅胶栓纯化。在减压下浓缩滤液，以得到标题化合物(0.44g；76%)：MS(m/z)：469(M+H)。
制备例30
[6-(2,2-二甲氧基乙基)哒嗪-3-基]-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
制备例30的化合物的替代化学名称为(6-乙炔基哒嗪-3-基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮。
搅拌[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[6-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)哒嗪-3-基]甲酮(0.50 g; 1.00当量; 1.07 mmol)和碳酸钾(0.42 g;2.8当量; 3.01 mmol)于甲醇(10 mL)中的悬浮液15分钟。过滤反应物，且在减压下浓缩。将残余物分配于水和二氯甲烷之间，且分离各层，然后用二氯甲烷(150mL)进一步萃取水层。经无水硫酸钠干燥合并的有机萃取物，过滤，且在减压下浓缩。通过柱层析(50%丙酮/己烷)纯化所得残余物，以得到标题化合物(0.082g；16%)：MS(m/z)：397(M+H)。
实施例11
[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][6-(1H-1,2,3-三唑-5-基)哒嗪-3-基]甲酮的合成。
将(6-乙炔基哒嗪-3-基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(0.082 g; 1.00当量; 0.21 mmol)、五水合硫酸铜(II)(0.005 g; 0.1当量;0.020 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(0.012 g; 0.3当量; 0.061 mmol)于二甲基甲酰胺(1 mL)和水(1 mL)中的搅拌溶液脱气且回填(2x)。添加叠氮基三甲基硅烷(0.05 mL; 1.8当量;0.375 mmol)，且在90℃加热所得反应混合物1小时。将该反应混合物冷却至环境温度，分配于0.1N盐酸和乙酸乙酯之间，且分离。进一步用乙酸乙酯(2×50mL)萃取水层。用盐水(2×50mL)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤，且在减压下浓缩。通过反相柱层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.031g；35%)。MS(m/z)：440(M+H)。
制备例31
(5-溴-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
搅拌5-溴烟碱酸(0.91 g; 1.20当量; 4.51 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(1.00 g; 1.00当量; 3.75 mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.791 g; 1.1当量; 4.13 mmol)于二氯甲烷(9 mL)中的悬浮液三十分钟，然后在减压下浓缩该反应混合物。通过柱层析(0至5%甲醇/二氯甲烷)纯化粗制残余物，以得到作为白色固体的标题化合物(1.145g；68%)。MS(m/z)：450,452(M,M+2H)。
制备例32
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[5-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-3-吡啶基]甲酮的合成。
在120℃，照射含有(5-溴-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(1.47 g; 1.00当量; 2.45 mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(0.086 g; 0.05当量; 0.12 mmol)、碘化亚铜(I)(0.024 g; 0.05当量; 0.12 mmol)、三乙胺(1.42 mL; 4.15当量; 10.16 mmol)、(三甲基甲硅烷基)乙炔(2.42 mL; 7.0当量; 17.1mmol)和二甲基甲酰胺(2.45 mL)的20mL微波小瓶50分钟。在乙酸乙酯(75mL)中稀释该反应混合物，且添加SiliaMetS硫醇(1.381g)，然后在环境温度下搅拌该反应混合物16小时。过滤该混合物，且然后用氯化锂溶液(5%，2x)和盐水洗涤有机物。经无水硫酸钠干燥有机物，过滤并浓缩。通过柱层析(30%丙酮/己烷)纯化残余物，以得到作为橙棕色泡沫的标题化合物(0.852g；74%)。MS(m/z)：468(M+H)。
制备例33
(5-乙炔基-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
在环境温度下搅拌[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[5-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-3-吡啶基]甲酮(0.852 g; 1.00当量; 1.82 mmol)和碳酸钾(0.76 g; 3.0当量; 5.47 mmol)于甲醇(5 mL)和二氯甲烷(10 mL)中的溶液15分钟，然后在减压下浓缩该反应混合物。将残余物溶解于乙酸乙酯中，且用水洗涤。经无水硫酸钠干燥有机萃取物，过滤且浓缩以得到作为固体的标题化合物(0.753g；>95%)。该材料无需进一步纯化即可用于下一步骤中。MS(m/z)：396(M+H)。
实施例12
[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][5-(1H-1,2,3-三唑-5-基)吡啶-3-基]甲酮的合成。
将包含(5-乙炔基-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(0.72 g; 1.00当量; 1.82 mmol)、五水合硫酸铜(II)(0.023 g; 0.05当量; 0.091 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(0.072 g; 0.2当量; 0.36 mmol)于二甲基甲酰胺(1.8 mL)和水(1.8 mL)中的溶液脱气和回填(氮气)两次。添加叠氮基三甲基硅烷(0.36mL; 1.5当量; 2.73 mmol)，且将该反应混合物加热至90℃，持续2小时。使该反应混合物冷却至室温，且用乙酸乙酯和50%饱和氯化钠稀释。用3:1 氯仿:异丙醇萃取水层。经无水硫酸钠干燥合并的有机层，过滤且浓缩。将残余物与甲醇和乙酸乙酯一起研磨，以得到作为灰白色固体的标题化合物(0.173g；22%)。MS(m/z)：439(M+H)。
制备例34
1H-咪唑-4-基-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
在室温搅拌N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(1.00 g; 1.00当量; 3.75 mmol)、1H-咪唑-4-甲酸(0.46 g; 1.10当量; 4.10 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.79 g; 1.10当量; 4.12 mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(0.63 g; 1.10当量; 4.11 mmol)和三乙胺(1.6 mL; 3.1当量; 11.48 mmol)于二甲基甲酰胺(12.5 mL)中的混合物过夜。将该溶液分配于乙酸乙酯和5%氯化锂溶液之间，且分离各层，然后进一步用乙酸乙酯萃取水层。经无水硫酸钠干燥合并的有机萃取物，过滤且在减压下浓缩。通过柱层析(0至20%甲醇/二氯甲烷)纯化粗制残余物，以得到作为灰白色固体的标题化合物(0.842g；62%)。MS(m/z)：361(M+H)。
实施例13
[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][1-(1H-1,2,3-三唑-5-基甲基)-1H-咪唑-4-基]甲酮的合成。
经5分钟将氢化钠(0.22 g; 2.00当量; 5.55 mmol)逐份添加至1H-咪唑-4-基-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(1.00 g; 1.00当量;2.77 mmol)于四氢呋喃(10 mL)中的0℃溶液，且搅拌15分钟。使该混合物升温至环境温度，且添加炔丙基溴(0.46 mL; 1.5当量; 4.16 mmol)。在环境温度下搅拌该混合物16小时。添加甲醇(1mL)，且浓缩该混合物。通过柱层析(0至5%甲醇/二氯甲烷)纯化残余物，以得到作为N-炔丙系异构体(0.697g，63%)和N-丙二烯系异构体(0.123g，11%)的混合物的中间体N-烷基咪唑。
合并这些产物，且添加至五水合硫酸铜(II)(0.024 g; 0.05当量; 0.096 mmol)于二甲基甲酰胺(16.4 mL)和水(4 mL)中的溶液中。将该系统脱气，且用氮气回填3次，然后添加L-抗坏血酸钠盐(0.090 mg; 0.23当量; 0.45 mmol)。添加叠氮基三甲基硅烷(0.40mL; 1.50当量; 3.00 mmol)，且在90℃加热该反应混合物16小时。将该混合物分配于水和3:1 氯仿:异丙醇之间，且分离。进一步用3:1 氯仿:异丙醇萃取水层3次。经无水硫酸钠干燥合并的有机物，过滤且在真空中浓缩。通过反相层析纯化产物，以得到作为白色固体的标题化合物(0.035g；5%)。MS(m/z)：442(M+H)。
制备例35
(4-溴-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(2.66 g, 10 mmol)、4-溴吡啶-2-甲酸(2.24 g, 11.00 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.88 g, 15.00 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(61.08 mg, 0.500 mmol)置于100mL圆底烧瓶中。溶解于二氯甲烷(40.0mL)中，且在室温搅拌18小时。浓缩且通过快速硅胶层析，以乙腈/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(2.9g，64%)。LCMS(m/z)：452.0(M+2)。
制备例36
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[4-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-2-吡啶基]甲酮的合成。
将(4-溴-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(2.9 g, 6.44 mmol)、三甲基甲硅烷基-乙炔(1.1 mL, 7.73 mmol)、三乙胺(16mL, 115.5 mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(219.15 mg, 0.31 mmol)和碘化亚铜(I)(32mg, 0.2 mmol)置于50mL圆底烧瓶中。溶解于二甲基甲酰胺(32mL)中，且将该反应混合物脱气三次。在65℃加热该反应混合物18小时。将混合物冷却至室温，用水稀释，且用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，用乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(1.3g，43%)。LCMS(m/z)：468.2(M+1)。
制备例37
(4-乙炔基-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[4-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-2-吡啶基]甲酮(1.3 g, 2.78 mmol)置于50mL圆底烧瓶中。溶解于四氢呋喃(18 mL; 15.89)中，且使该反应混合物冷却至0℃。添加1M 氟化四丁基铵(3.06 mL;3.06 mmol)，且搅拌30分钟。用水(40mL)淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过快速硅胶层析，用甲醇/乙酸乙酯纯化残余物，以得到标题化合物(0.89g，81%)。LCMS(m/z)：396.0(M+1)。
实施例14
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[4-(1H-三唑-5-基)-2-吡啶基]甲酮的合成。
实施例14的化合物的替代化学名称为[2-(2,3-二氢-1H-茚-2-基氨基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基][4-(1H-1,2,3-三唑-5基)吡啶-2-基]甲酮。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[4-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-2-吡啶基]甲酮(2.3 g, 4.92 mmol)置于微波瓶中，且溶解于二甲基甲酰胺(29mL)和水(29mL)中。添加五水合硫酸铜(II)(246 mg, 1.0 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(1.9 g, 9.8 mmol)和二甲基甲酰胺(15 mL)。将该反应混合物脱气三次。经20分钟逐滴添加叠氮基三甲基硅烷(2.3 mL, 20 mmol)。在90℃加热该混合物15小时。将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯萃取三次，且弃去水相。合并有机层，且用盐水洗涤一次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.47g，22%)。LCMS(m/z)：439.0(M+1)。
制备例38
6-咪唑-1-基吡啶-3-甲酸的合成。
将6-咪唑-1-基吡啶-3-甲酸甲酯(535 mg, 2.50 mmol)、四氢呋喃(12mL)、氢氧化钠(780 mg, 3.75 mmol)和甲醇(10 mL)置于圆底烧瓶中，且在50℃加热3小时。用1N盐酸使该反应混合物酸化，且在减压下浓缩直至干燥。悬浮于甲醇/二氯甲烷中，过滤，且浓缩得到作为白色固体的标题化合物(0.47g，68%)。LCMS(m/z)：190.0(M+1)。
实施例15
(6-咪唑-1-基-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将6-咪唑-1-基吡啶-3-甲酸(125 mg, 0.66 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(160 mg, 0.60 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(173 mg, 0.90 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(3.7 mg, 0.03 mmol)置于圆底烧瓶中，且溶解于二氯甲烷(5mL)中。在25℃搅拌该反应混合物18小时。在减压下浓缩至干燥。通过反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.049g，19%)。LCMS(m/z)：438.0(M+1)。
实施例16
[4-(1H-咪唑-4-基)苯基]-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将4-(1H-咪唑-4-基)苯甲酸(124 mg, 0.66 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(160 mg, 0.60 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(173 mg, 0.90 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(3.7 mg, 0.03 mmol)置于圆底烧瓶中，且溶解于二氯甲烷(5mL)中。在25℃搅拌该反应混合物18小时。在减压下浓缩至干燥。通过反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.106g，40%)。LCMS(m/z)：437.2(M+1)。
制备例39
(6-溴-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将6-溴吡啶-3-甲酸(224 mg, 1.10 mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(266 mg, 1.00 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(288 mg, 1.50 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(6.1 mg, 0.05 mmol)置于圆底烧瓶中，且溶解于二氯甲烷(4mL)中。在25℃搅拌该反应混合物18小时。在减压下浓缩。通过正相层析，用乙腈/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.25g，55%)。LCMS(m/z)：452.2(M+1)。
制备例40
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[6-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-3-吡啶基]甲酮的合成。
将二甲基甲酰胺(1.44 mL)中的(6-溴-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(260 mg, 0.57 mmol)、三乙胺(1.44 mL,10.36mmol)、(三甲基甲硅烷基)乙炔(0.098 mL, 0.69 mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(9.8mg, 0.014 mmol)和碘化亚铜(I)(1.4 mg, 0.008 mmol)置于圆底烧瓶中，且在65℃加热。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/乙腈纯化残余物，以得到标题化合物(0.17g，63%)。LCMS(m/z)：468.2(M+1)。
制备例41
(6-乙炔基-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[6-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-3-吡啶基]甲酮(170 mg, 0.36 mmol)置于圆底烧瓶中。添加四氢呋喃(1mL)，且冷却至0℃。添加1M氟化四正丁基铵(0.40 mL, 0.40 mmol)，且搅拌30分钟。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.087g，61%)。LCMS(m/z)：396.2(M+1)。
实施例17
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[6-(1H-三唑-4-基)-3-吡啶基]甲酮的合成。
将(6-乙炔基-3-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(87 mg, 0.22 mmol)置于微波反应容器中，且添加二甲基甲酰胺(1.7mL)和水(1.3mL)。添加五水合硫酸铜(II)(11 mg, 0.044 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(87 mg, 0.44mmol)。使该系统脱气，鼓入氮气且鼓泡三次。添加叠氮基三甲基硅烷(0.117 mL, 0.88mmol)，且在90℃加热2小时。用水淬灭该反应，且用9:1 乙酸乙酯/甲醇萃取三次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.043g，44%)。LCMS(m/z)：439.2(M+1)。
制备例42
(5-溴-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将5-溴吡啶-2-甲酸(224 mg, 1.10mmol)、N-茚满-2-基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(266 mg, 1.0 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(288mg, 1.50 mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(6.1 mg, 0.050 mmol)置于圆底烧瓶中，且溶解于二氯甲烷(4mL)中。在25℃搅拌该反应混合物18小时。在减压下浓缩。通过正相层析，用乙腈/二氯甲烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.34g，75%)。LCMS(m/z)：452.2(M+1)。
制备例43
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[5-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-2-吡啶基]甲酮的合成。
将二甲基甲酰胺(2 mL)中的(5-溴-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(0.34 g, 0.75 mmol)、三乙胺(1.89 mL, 13.54mmol)、(三甲基甲硅烷基)乙炔(0.128 mL, 0.91 mmol)、双(三苯基膦)氯化钯(II)(13 mg,0.018 mmol)和碘化亚铜(I)(1.9 mg, 0.010 mmol)置于圆底烧瓶中，且在90℃加热。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.25g，71%)。LCMS(m/z)：468.2(M+1)。
制备例44
(5-乙炔基-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮的合成。
将[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[5-(2-三甲基甲硅烷基乙炔基)-2-吡啶基]甲酮(300 mg, 642 mmol)置于圆底烧瓶中。添加四氢呋喃(1.5mL)，且冷却至0℃。添加1M氟化四正丁基铵(0.71 mL, 0.71 mmol)，且搅拌30分钟。用水淬灭该反应，且用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤一次，且经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析，用甲醇/乙酸乙酯/己烷纯化残余物，以得到标题化合物(0.18g，71%)。LCMS(m/z)：396.2(M+1)。
实施例18
[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]-[5-(1H-三唑-4-基)-2-吡啶基]甲酮的合成。
将(5-乙炔基-2-吡啶基)-[2-(茚满-2-基氨基)-7,8-二氢-5H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-6-基]甲酮(162 mg, 0.41 mmol)置于微波反应容器中，且添加二甲基甲酰胺(0.7mL)和水(2.4mL)。添加五水合硫酸铜(II)(20 mg, 0.082 mmol)和L-抗坏血酸钠盐(162 mg,0.82 mmol)。使该系统脱气，鼓入氮气且鼓泡三次。添加叠氮基三甲基硅烷(0.218 mL,1.64 mmol)，且在90℃加热2小时。用水淬灭该反应，且用9:1 乙酸乙酯/甲醇萃取三次。经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓缩。通过正相层析(用甲醇/乙酸乙酯/己烷)和然后反相层析纯化残余物，以得到标题化合物(0.014g，8.0%)。LCMS(m/z)：439.2(M+1)。
通过胆碱释放测量的自分泌运动因子的抑制
该测定的目的是使用胆碱释放测定检测自分泌运动因子抑制。
测试化合物(100% DMSO中的10 mM储液)在100% DMSO中连续稀释，导致在半区96孔板(Corning 3992)中产生10个浓度的100X抑制剂。在100% DMSO中的这10个孔各自在圆底96孔板(Fisher 12565502)中在测定缓冲液中以1:33.33稀释，产生在含有3% DMSO的孔中产生3X浓度。该测定缓冲液是50 mM Tris pH8.0、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.01% TRITONTM X-100(Sigma T9284)和0.01%脂肪酸游离牛血清白蛋白(Sigma A8806)。然后将各3X测试化合物的20μl等分试样一式一份(in singlicate)添加至黑色平底96孔板(Corning 3991)。然后将3X重组人自分泌运动因子(Echelon, E-4000)(转染至293E细胞中且通过镍螯合物和尺寸排阻色谱法纯化的具有C端His标签的全长人自分泌运动因子)的每孔20μl等分试样添加至除了无酶对照孔以外的各孔中。将每孔20μl的测定缓冲液等分试样添加至无酶对照孔中。将含有胆碱氧化酶(Sigma C5896)、辣根过氧化物酶(Sigma P8125)、amplex ultrared (Invitrogen A36006)和自分泌运动因子底物溶血磷脂酰胆碱(LPC)16:0 (Avanti Polar Lipids 855675P)的3X混合物(cocktail)的20μl等分试样添加至各孔中，同时避光。胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、amplex ultrared和LPC 16:0在孔中的最终浓度分别为0.4单位/ml、4单位/ml、40 μM和30 μM。然后将该板用铝箔封条密封且在LablineImperial III孵育器中在37℃孵育1小时。在该孵育过程中，LPC被自分泌运动因子裂解，导致产生溶血磷脂酸(LPA)16:0和胆碱。释放的胆碱被胆碱氧化酶氧化，导致产生甜菜碱和过氧化氢。过氧化氢与辣根过氧化物和amplex ultrared反应以形成荧光分子试卤灵(resorufin)。用SpectraMax Gemini EM荧光计使用SoftMax Pro 4.8软件在 530-590 nm的激发-发射波长测量板上的试卤灵。使用4参数曲线拟合计算IC50。本文的实施例1的化合物基本如上所述测试。IC50显示于表1。例举的化合物具有小于30nM的IC50。
表1：自分泌运动因子的抑制：胆碱释放测定
| 测试化合物 | IC50(nM) |
| 实施例1 | <1.70 nM(n=5) |
| 实施例9 | <1.70 nM(n-5) |
表1中数据说明，使用体外胆碱释放测定，实施例1的化合物抑制自分泌运动因子。
在人血浆存在的情况下的LPA的自分泌运动因子介导的抑制
以下测定意欲测量LPA的自分泌运动因子介导的抑制。当其用于测试已被鉴定为自分泌运动因子抑制剂的化合物时，该测定是可用于鉴定自分泌运动因子-介导的LPA抑制剂化合物的工具。通过自分泌运动因子的LPA生物合成据信对LPA1介导的神经性疼痛的LPA的来源。Makoto Inoue,等人, “Autotaxin, a synthetic enzyme of lysophosphatidic acid(LPA), mediates the induction of nerve-injured neuropathic pain”,Molecular Pain, 2008, 4:6。该测定的结果支持自分泌运动因子介导的LPA生物合成的抑制。
将收集在肝素钠(Lampire Biologicals)中的来自健康人女性供体的血浆单元合并、等分且储存在-80℃。在测定当天，将血浆等分试样解冻且在离心机中在4℃以3000 RPM旋转10分钟以去除碎片。将90μl血浆等分试样添加至96孔圆底聚丙烯板的各孔中。将含有10% DMSO/测定缓冲液(50 mM Tris pH8.0、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2)的10X测试化合物的10μl等分试样添加至除了不含测试化合物的对照孔以外的各孔中。这一式一份地产生10个1X测试化合物浓度，最终浓度为1% DMSO/90%血浆。将无测试化合物的10% DMSO于测定缓冲液中的10μl等分试样添加至0小时(n=8)和3小时无测试化合物对照(n=8)孔中。将500 mM乙二胺四乙酸(EDTA)的10μl等分试样添加至各0小时无测试化合物对照孔中以螯合内源性自分泌运动因子。将0小时无测试化合物对照孔的整个内容物转移至新的96孔圆底聚丙烯板中且冷冻在-80℃。然后将含有血浆+/-测试化合物(减去0小时无抑制剂对照孔)的板在Robbins Scientific™ 400型杂交孵育器中在37℃孵育3小时，同时以14,000 RPM摇动。在该3小时孵育过程中，血浆中存在的卵磷脂胆固醇酰基转移酶裂解磷脂酰胆碱，产生自分泌运动因子底物溶血磷脂酰胆碱(LPC)的更高血浆水平。通过内源性自分泌运动因子裂解该提高的内源性LPC水平，产生内源性溶血磷脂酸(LPA)的更高血浆浓度(Nakamura等人, Clinical Biochemistry 40(2007), 274-277)。自分泌运动因子抑制剂可抑制LPA在3小时孵育中的这种提高。在3小时孵育后，将10μl 500 mM EDTA添加至所有其余孔(含有测试化合物的孔和3小时无测试化合物对照孔)中以螯合内源性自分泌运动因子。然后将这些孔的整个内容物添加至先前已储存在-80℃的含有0小时无测试化合物对照血浆(没有解冻该0小时血浆)的板中。然后将该板用铝箔封条再覆盖且放回-80℃，直至取出用于质谱分析。在取出当天，将该板在冰上解冻且将来自各孔的25μl血浆转移至2ml TrueTaper™正方形96深孔板(Analytical Sales and Products #968820)中。将含有LPA内标(50 ng/ml D5氘LPA 16:0和50 ng/ml D5氘LPA 18:0)的提取缓冲液(50%甲醇、49.9%乙腈、0.1% 乙酸)的400μl等分试样添加至各孔中，且通过质谱分析测定各样品中的总LPA。根据下式计算LPA的抑制百分比：
100 -(3小时血浆 + 测试化合物– 0小时血浆无测试化合物对照) /(3小时血浆无测试化合物对照 – 0小时血浆无测试化合物对照) X 100。
使用4参数曲线拟合计算IC50值。结果表示为算数平均值+/-标准偏差；n=x。使用本发明的化合物的该测定的结果可以显示剂量依赖性且统计显著的LPA抑制。该测定的结果可以支持测试化合物抑制自分泌运动因子介导的LPA生物合成。
使用4参数曲线拟合计算IC50值。使用本发明的化合物的该测定的结果显示剂量依赖性的自分泌运动因子介导的LPA抑制。
表2：人血浆中的LPA的自分泌运动因子介导的抑制
| 测试化合物 | IC50(nM) |
| 实施例1 | 5.4(n=5)(范围4.3至7.1) |
| 实施例9 | 7.0(n=5)(范围6.1-9.3) |
表2中的数据证实，在人血浆存在的情况下，实施例1的化合物是自分泌运动因子介导的LPA的抑制剂。
Claims (15)
1.下式化合物，或其药学上可接受的盐：
其中
A选自
L是键或C1-C3亚烷基；且
B选自
。
2.如权利要求1所要求保护的化合物或其盐，其中L选自键或CH2。
3.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中B选自
。
4.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中A选自
。
5.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中A选自
。
6.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中B是
。
7.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中A是
。
8.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中L是CH2。
9.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中A是
。
10.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其盐，其中L是键。
11.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物为式II的化合物：
。
12.如权利要求1-2中任一项所要求保护的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物为式III的化合物：
。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.根据权利要求1-12中任一项的化合物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗自分泌运动因子介导的病症的药物的用途。
15.根据权利要求1-12中任一项的化合物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗骨关节炎相关疼痛的药物的用途。
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