CN105087439B - 一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌及其选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AM‑1及其选育方法，该选育方法包括菌株活化培养、制备接种液、含阿莫西林培养液培养、无阿莫西林培养液培养、紫外分光光度法测定、进化菌株耐药性的检测等步骤，通过耐药试验，证实选育所得菌株干酪乳杆菌AM‑1对阿莫西林具有高耐药性的特征，这一特征可确保干酪乳杆菌AM‑1制品与阿莫西林同时服用时保持较高的活力。

Description

一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌及其选育方法
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AM-1，还涉及一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1的选育方法。
【背景技术】
乳杆菌是与人类生活关系密切的益生菌之一，广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域。其中，干酪乳杆菌具有较强的耐酸、耐胆盐能力，在消化道中有较强生命力，并对其有较强的粘附能力，同时大量动物和人体实验表明，干酪乳杆菌具有较强的抑制致病菌、降血脂、提高有机体抗氧化、保护肝脏、预防糖耐受量受损和II型糖尿病、调节有机体免疫力及抗肿瘤等益生功能。
阿莫西林属于氨基糖苷类抗生素，常常作为一线药物用于治疗胃肠道中细菌引起的炎症、尿路生殖系统感染、胆道感染、中枢神经系统感染和呼吸道感染的治疗。
一般地，服用抗生素期间不建议食用益生菌制品。抗生素的出现可能会导致益生菌的活力减弱甚至死亡，影响其发挥特有的生理功效，这对日常生活过程中习惯食用益生菌制品的人群极为不利。但事实上，近年来越来越多的临床研究证据表明，同时服用益生菌和抗生素更有利于一些疾病的治疗。因此，围绕抗生素选育具有耐药特性的益生菌具有非常重要的现实意义。
本发明利用微生物在特定生长条件下的适应性进化实施干酪乳杆菌抗阿莫西林选育试验，是一种基于自然选择的选育方法，具有安全显效的特点。通过耐药实验证实所得干酪乳杆菌AM-1对阿莫西林具有高耐药性特征，该特征可确保干酪乳杆菌AM-1制品在与阿莫西林同时服用时维持较高的活力。同时，这一方法的建立可为高抗阿莫西林乳酸菌制品的研究和开发利用奠定坚实的基础。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1。
本发明的另一个目的是提供一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1的选育方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AM-1，该菌株已于2015年07月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11132。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1的MIC值为8μg/mL。
本发明还涉及一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1的选育方法，该选育方法包括下述步骤：
A、菌株活化培养
干酪乳杆菌Zhang CGMCC No.1697在液体MRS培养基中在温度37℃与有氧的条件下活化培养24h，这样传代培养3代，然后将得到的培养液在固体MRS平板上划线，在温度37℃的条件下培养48h，再随机选取三个单菌落作为出发菌株，它们在MRS培养基中在温度37℃与有氧条件下活化传代培养3代，然后冻干保藏，它们分别命名为干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3。
B、制备接种液
挑取步骤A中干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3单菌落分别于5mL生理盐水中混匀得到三种菌悬液，用LSM培养液稀释菌悬液至在波长600nm条件下OD值为0.16-0.2，得到干酪乳杆菌Zhang-1、Zhang-2和Zhang-3接种液。
C、含阿莫西林培养液培养
按照LSM培养基体积的1％接种量，把干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3接种液分别加到一组终浓度为0.125、0.25、0.5、1、4、8、16、32与64μg/mL阿莫西林的LSM培养基中，接着在温度37℃的条件下发酵培养24h，得到一组试验发酵液。
D、无阿莫西林培养液培养
采用与步骤C操作方式相同的方式，让干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3在不添加阿莫西林的LSM培养基中进行空白对照发酵，得到一组空白对照发酵液。
E、紫外分光光度法测定
在步骤C与步骤D结束后，采用紫外可见光分光光度法在波长600nm处测定所述试验发酵液OD值与所述空白对照发酵液OD值，然后对比分析确定能够抑制50％干酪乳杆菌Zhang生长的阿莫西林浓度，即阿莫西林IC50测定值。
接着，以LSM培养基体积计1％的接种量将干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3接种液转接至含有这个浓度抗生素的LSM培养基中培养，得到第一次发酵液，将第一次发酵液再按照以LSM体积计1％接种量再次接入含有这个浓度抗生素的LSM培养基中，进行第二次发酵，每日重复操作进行继代培养，使这些菌株发生适应性进化，产生突变。
F、进化菌株耐药性的检测
将出发菌株和传代过程中的干酪乳杆菌Zhang用MRS培养基活化3代后，划线于固体MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃下培养48h，挑取单菌落置于5mL浓度以重量计0.85％的NaCl溶液中，混匀，测定在波长600nm处的OD值，用这种盐水将其OD值调整至0.16-0.2，它的活菌数为3×108CFU/mL，再用MRS培养基稀释500倍后作为种子液待用，它的活菌数为6×105CFU/mL。
吸取2mL所述种子液，转接于含有0.625-64μg/mL阿莫西林的LSM培养基中，则阿莫西林浓度和菌液活菌数分别减半，每支试管中的活菌数为3×105CFU/mL；以4mL未添加阿莫西林的含有活菌数3×105CFU的接种LSM与4mL添加阿莫西林又未接种的LSM分别作为阳性对照与阴性对照，混匀后在恒温培养箱中在温度37℃下培养48h；测定三株干酪乳杆菌Zhang出发菌株的MIC值为2μg/mL，在连续继代培养1个月后，耐药性开始发生变化，3个月后达到8μg/mL，于是将这种突变株命名为高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的LSM培养基由以体积计90％IST培养基与10％MRS培养基组成。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AM-1，该菌株已于2015年07月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11132。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1的MIC值为8μg/mL。
在本发明中，MIC值是指最小抑制浓度(Minimum inhibitory concentration)，是经培养能够抑制微生物生长的最小抗生素浓度。
本发明还涉及一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1的选育方法，该选育方法包括下述步骤：
A、菌株活化培养
干酪乳杆菌Zhang CGMCC No.1697在液体MRS培养基中在温度37℃与有氧的条件下活化培养24h，这样传代培养3代，然后将得到的培养液在固体MRS平板上划线，在温度37℃的条件下培养48h，再随机选取三个单菌落作为出发菌株，它们在MRS培养基中在温度37℃与有氧条件下活化传代培养3代，然后冻干保藏，它们分别命名为干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3。
在这个步骤中，活化传代培养3代的目的是使菌种恢复活力。
在这个步骤中，所述的MRS培养基是由10克蛋白胨、10克牛肉膏、5克酵母膏、2克柠檬酸氢二铵、20克葡萄糖、1.0ml吐温80、5克三水合乙酸钠、2克三水合磷酸氢二钾、0.58克七水合硫酸镁、0.25克一水合硫酸锰、18克琼脂与1000ml蒸馏水组成，其pH 6.2-6.6。
本发明使用的液体MRS培养基是OXOID公司以商品名MRS Broth(CM0359)销售的产品。
所述的冻干保藏是微生物技术领域里常规的保藏方法。
B、制备接种液
挑取步骤A中干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3单菌落分别于5mL生理盐水中混匀得到三种菌悬液，用LSM培养液稀释菌悬液至在波长600nm条件下OD值为0.16-0.2，得到干酪乳杆菌Zhang-1、Zhang-2和Zhang-3接种液。
在本发明中，所述的LSM培养基由以体积计90％IST培养基与10％MRS培养基组成，其中：
IST培养基的组成如下：11g水解酪蛋白、3g蛋白胨、3g葡萄糖、3g氯化钠、1g可溶淀粉、2g磷酸氢二钠、1g乙酸钠、0.2g甘油磷酸镁、0.1g葡萄糖酸钙、0.001g硫酸钴、0.001g硫酸铜、0.001g硫酸锌、0.001g硫酸亚铁、0.002g氯化锰、0.001g甲萘醌、0.001g氰钴胺、0.02gL-半胱氨酸盐酸盐、0.02gL-色氨酸、0.003g维生素B6、0.003g泛酸、0.003g烟酰胺、0.0003g生物素、0.0004g硫胺、0.01g腺嘌呤、0.01g鸟嘌呤、0.01g黄嘌呤、0.01g尿嘧啶与1000ml蒸馏水；本发明使用的IST培养基为OXOID公司以商品名ISO-SENSITEST Broth(CM0473)销售的产品。
MRS培养基的组成如前面所述，在此不再赘述。
在这个步骤中，将菌悬液稀释至OD600值为0.16-0.2的目的是使活菌数约为3×108CFU/mL。
在本发明中，OD600值是使用由SHIMADZU公司以商品名UV-1700pharmaspec销售的紫外可见光分光光度计在波长为600nm条件下测定得到的光度值。
C、含阿莫西林培养液培养
按照LSM培养基体积的1％接种量，把干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3接种液分别加到一组终浓度为0.125、0.25、0.5、1、4、8、16、32与64μg/mL阿莫西林的LSM培养基中，接着在温度37℃的条件下发酵培养24h，得到一组试验发酵液。
在本发明中，使用的阿莫西林是sigma公司以商品名Amoxicillin销售的产品。
D、无阿莫西林培养液培养
采用与步骤C操作方式相同的方式，让干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3在不添加阿莫西林的LSM培养基中进行空白对照发酵，得到一组空白对照发酵液。
E、紫外分光光度法测定
在步骤C与步骤D结束后，采用紫外可见光分光光度法在波长600nm处测定所述试验发酵液OD值与所述空白对照发酵液OD值，然后对比分析确定能够抑制50％干酪乳杆菌Zhang生长的阿莫西林浓度，即阿莫西林IC50测定值。
采用紫外可见光分光光度法分别测定每个梯度发酵液在波长600nm处的OD值，将这些测定结果与不添加阿莫西林的空白对照组进行比较。通过该实验可以测到阿莫西林抑制50％干酪乳杆菌生长时的浓度，这个浓度作为初始传代时培养基中的阿莫西林的浓度。确定阿莫西林IC50测定值的具体步骤参见文献Toprak E,VeresA,Michel J,ChaitR,HartlD L,Kishony R.Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamicallysustained drug stress[J].Nature Genetics,2013,Vol.44(1):101-105。
接着，以LSM培养基体积计1％的接种量将干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3接种液转接至含有这个浓度抗生素的LSM培养基中培养，得到第一次发酵液，将第一次发酵液再按照以LSM体积计1％接种量再次接入含有这个浓度抗生素的LSM培养基中，进行第二次发酵，每日重复操作进行继代培养，使这些菌株发生适应性进化，产生突变。
在这个步骤中，所使用的紫外分光光度计为SHIMADZU公司以商品名UV-1700pharmaspec销售的产品。
F、进化菌株耐药性的检测
将出发菌株和传代过程中的干酪乳杆菌Zhang用MRS培养基活化3代后，划线于固体MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃下培养48h，挑取单菌落置于5mL浓度以重量计0.85％的NaCl溶液中，混匀，测定在波长600nm处的OD值，用这种盐水将其OD值调整至0.16-0.2，它的活菌数为3×108CFU/mL，再用MRS培养基稀释500倍后作为种子液待用，它的活菌数为6×105CFU/mL。
吸取2mL所述种子液，转接于含有0.625-64μg/mL阿莫西林的LSM培养基中，则阿莫西林浓度和菌液活菌数分别减半，每支试管中的活菌数为3×105CFU/mL；以4mL未添加阿莫西林的含有活菌数3×105CFU的接种LSM与4mL添加阿莫西林又未接种的LSM分别作为阳性对照与阴性对照，混匀后在恒温培养箱中在温度37℃下培养48h；测定三株干酪乳杆菌Zhang出发菌株的MIC值为2μg/mL，在连续继代培养1个月后，耐药性开始发生变化，3个月后达到8μg/mL，于是将这种突变株命名为干酪乳杆菌AM-1。
乳酸菌耐药性是由最小抑制浓度(MIC)衡量的，MIC是经培养能够抑制微生物生长的最小抗生素浓度。本发明采用稀释法中的宏量肉汤稀释法(Macrodilution)测定MIC(最小抑制浓度)，具体地，经过培养后，将不同浓度梯度的试管振荡均匀，通过肉眼观察，并与对照组比较，无可见干酪乳杆菌生长所对应的最小阿莫西林浓度。
在传代培养基中的阿莫西林浓度在传代过程中保持恒定。
[有益效果]
本发明是基于自然选择方法对干酪乳杆菌抗阿莫西林特性进行选育，通过耐药试验，证实选育所得菌株干酪乳杆菌AM-1对阿莫西林具有高耐药性的特征，这一特征可确保干酪乳杆菌AM-1制品与阿莫西林同时服用时保持较高的活力。
本发明的高抗阿莫西林干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AM-1，该菌株已于2015年07月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11132。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：高抗阿莫西林干酪乳杆菌AM-1的选育
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化培养
干酪乳杆菌Zhang CGMCC No.1697在液体MRS培养基中在温度37℃与有氧的条件下活化培养24h，这样传代培养3代，然后将得到的培养液在固体MRS平板上划线，在温度37℃的条件下培养48h，再随机选取三个单菌落作为出发菌株，它们在MRS培养基中在温度37℃与有氧条件下活化传代培养3代，然后冻干保藏，它们分别命名为干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3；
B、制备接种液
挑取步骤A中干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3单菌落分别于5mL生理盐水中混匀得到三种菌悬液，用LSM培养液稀释菌悬液至在波长600nm条件下OD值为0.16-0.2，得到干酪乳杆菌Zhang-1、Zhang-2和Zhang-3接种液；
C、含阿莫西林培养液培养
按照LSM培养基体积的1％接种量，把干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3接种液分别加到一组终浓度为0.125、0.25、0.5、1、4、8、16、32与64μg/mL阿莫西林的LSM培养基中，接着在温度37℃的条件下发酵培养24h，得到一组试验发酵液；
D、无阿莫西林培养液培养
采用与步骤C操作方式相同的方式，让干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3在不添加阿莫西林的LSM培养基中进行空白对照发酵，得到一组空白对照发酵液；
E、紫外分光光度法测定
在步骤C与步骤D结束后，采用紫外可见光分光光度法在波长600nm处测定所述试验发酵液OD值与所述空白对照发酵液OD值，然后对比分析确定能够抑制50％干酪乳杆菌Zhang生长的阿莫西林浓度，即阿莫西林IC50测定值；
接着，以LSM培养基体积计1％的接种量将干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3接种液转接至含有这个浓度抗生素的LSM培养基中培养，得到第一次发酵液，将第一次发酵液再按照以LSM体积计1％接种量再次接入含有这个浓度抗生素的LSM培养基中，进行第二次发酵，每日重复操作进行继代培养，使这些菌株发生适应性进化，产生突变；
F、进化菌株耐药性的检测
将出发菌株和传代过程中的干酪乳杆菌Zhang用MRS培养基活化3代后，划线于固体MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃下培养48h，挑取单菌落置于5mL浓度以重量计0.85％的NaCl溶液中，混匀，测定在波长600nm处的OD值，用这种盐水将其OD值调整至0.18，它的活菌数为3×108CFU/mL，再用MRS培养基稀释500倍后作为种子液待用，它的活菌数为6×105CFU/mL；
吸取2mL所述种子液，转接于含有30μg/mL阿莫西林的LSM培养基中，则阿莫西林浓度和菌液活菌数分别减半，每支试管中的活菌数为3×105CFU/mL；以4mL未添加阿莫西林的含有活菌数3×105CFU的接种LSM与4mL添加阿莫西林又未接种的LSM分别作为阳性对照与阴性对照，混匀后在恒温培养箱中在温度37℃下培养48h；测定三株干酪乳杆菌Zhang出发菌株的MIC值为2μg/mL，在连续继代培养1个月后，耐药性开始发生变化，3个月后达到8μg/mL，于是将这种突变株命名为干酪乳杆菌AM-1。
同时，按照与本实施例前面所描述的同样方式进行，只是吸取2mL所述种子液，转接于分别含有20、5、10、64、40、1与0.625μg/mL阿莫西林的LSM培养基中，得到同样的结果。
实施例2：进化菌株耐药性的检测
以LSM培养基体积计1％的接种量将干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3接种液转接至含有IC50阿莫西林的LSM培养基中培养，得到第一次发酵液，将第一次发酵液再按照以LSM体积计1％接种量再次接入含有这个浓度抗生素的LSM培养基中，进行第二次发酵，每日重复操作进行继代培养，使这些菌株发生适应性进化，产生突变。在连续继代培养期间，每隔1个月对菌株耐药性，即MIC值进行检测，检测方法如下：
将出发菌株和传代过程中的干酪乳杆菌Zhang-1、干酪乳杆菌Zhang-2和干酪乳杆菌Zhang-3用MRS培养基活化3代后，在固体MRS培养基上划线，在温度37℃条件下在恒温培养箱中培养48h，用接种环挑取若干单菌落于5mL 0.85％的NaCl溶液中，充分混匀后测定在600nm条件下的OD值，用上述NaCl溶液调整OD值至0.16-0.2之间(活菌数约为3×108CFU/mL)，用MRS培养基稀释500倍后作为种子液待用(活菌数约为6×105CFU/mL)。
吸取2mL该种子液转接于含有0.625-64μg/mL阿莫西林的2mL的LSM培养基中，则抗生素的浓度和菌液的活菌数分别减半，每支试管中的活菌数为3×105CFU/mL。分别以不添加抗生素的接种后4mL LSM(活菌数为3×105CFU/mL)和不添加抗生素不接种的4mL LSM作为阳性对照和阴性对照，将试管振荡均匀后，在温度37℃条件下在恒温培养箱中培养48h。
每个月的突变菌株，在适应性进化过程中的MIC值如表1所示，试验显示，干酪乳杆菌Zhang出发菌株的MIC值为2μg/mL；在连续继代培养1个月后，耐药性开始发生变化；3个月后，MIC值达到8μg/mL，该突变株记为干酪乳杆菌AM-1。
表1：适应性进化不同时间段对应突变菌株的MIC值(μg/mL)

Claims (1)

1.一种高抗阿莫西林干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)AM-1，该菌株已于2015年07月17日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11132。
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Purification and partial characterization of a novel bacteriocin produced by Lactobacillus casei TN-2 isolated from fermented camel milk (Shubat) of Xinjiang Uygur Autonomous region, China;Xin Lü等;《Food Control》;20140930;第43卷;276-283 *
乳杆菌对抗生素耐药性的研究;郭慧玲 等;《乳酸菌与人体健康：第十届乳酸菌与健康国际研讨会》;20150527;58 *

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