CN105061626B - 车前子多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种车前子多糖的提取方法，包括以下步骤：1)车前子水提；2)将水提液浓缩，醇沉，得到沉淀；3)将沉淀依次用无水乙醇、丙酮分别洗涤，复溶于蒸馏水，加入蛋白酶酶解，得到酶解液；4)将酶解液经分子量为80000～200000的透析袋进行第一次透析24～72h，取保留液经分子量为1500000～2000000的透析袋进行第二次透析24～72h，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心得到沉淀；5)将步骤4)所述的沉淀依次用无水乙醇、丙酮分别洗涤，复溶于蒸馏水，加入活性炭脱色，过滤，喷雾干燥，即为车前子多糖。制得的车前子多糖具有显著的免疫增强作用。
Description
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体涉及车前子多糖的提取方法。
背景技术
车前子为车前科植物Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressaWilld.的干燥成熟种子，具有利水、清热、明目、祛痰的功效，用于小便不通，淋浊带下，尿血，暑湿泻痢，咳嗽多痰。研究表明车前子多糖是由木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸等组成的杂多糖，该多糖是一种部分发酵性膳食纤维，其分子量为几千到上百万不等。众所周知，采用不同的提取方法，所得到的车前子多糖的成分不同，最终带来的功效也不同。目前常规的车前子多糖的提取工艺包括以下步骤：1)将车前子破碎用6～12倍重量的80～95％乙醇回流2～3次，每次回流2～3h，除去脂溶性杂质；2)将残渣加6～12倍重量的蒸馏水回流提取2～3次，每次回流提取2～3h，滤液浓缩至药材0.2～1.0体积，加入80～95％乙醇沉淀，离心得沉淀；3)沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤；4)洗涤后的沉淀用0.5～2倍重量的蒸馏水溶解，以分子量大小为3×103～1.2×104的透析袋透析24～72h；5)将透析液浓缩，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤，洗涤后的沉淀用蒸馏水溶解，采用弱酸弱碱性阴、阳离子交换树脂串联法脱去色素和蛋白质，减压浓缩洗脱液，即得车前子多糖。经验证，该多糖不仅具有整肠通便、降低血脂、调节血糖的功效，还具有良好的免疫促进作用。然而，本申请人在上述提取方法的基础上加以改进，提取的车前子多糖的免疫促进作用明显提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种车前子多糖的提取方法，该方法提取的车前子多糖具有较强的免疫促进作用。
本发明提供的技术方案是车前子多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)车前子破碎，加入其20～30倍重量的水，回流提取2～3次，每次提取1～3h，过滤，收集滤液备用；
2)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；
3)将步骤2)所述的沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，加入蛋白酶酶解1～3h，灭酶，得到酶解液；
4)将酶解液经分子量为80000～200000的透析袋进行第一次透析24～72h，取保留液经分子量为1500000～2000000的透析袋进行第二次透析24～72h，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心得到沉淀；
5)将步骤4)所述的沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，加入活性炭脱色，过滤，喷雾干燥，即为车前子多糖。
上述步骤2)中，加入90～95v％的乙醇至混合液中醇含量为80～85v％。
上述步骤3)中，所述蛋白酶的加入量为洗涤后的沉淀重量的1～2％。蛋白酶可以将提取物中的大分子蛋白质酶解为多肽和氨基酸。
步骤4)中，酶解液先经截留分子量为80000～200000的透析袋进行第一次透析，小分子色素、多肽和氨基酸和蛋白酶将透过透析袋滤除，大大提高保留液的纯度；而将第一次透析得到的保留液经截留分子量为1500000～2000000的透析袋进行第二次透析，分子量低于1500000～2000000这个范围内的物质将滤出得到透析液。
本发明提取的车前子多糖分子量上限为1500000～2000000，下限为80000～200000，其免疫促进作用远远超出普通车前子多糖。同时，本发明提取的车前子多糖纯度很高，经HPLC检测，纯度高达99.2％以上，颜色为白色。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1)车前子破碎，加入其20倍重量的水，回流提取2次，每次提取1h，过滤，收集滤液备用；
2)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，加入90v％的乙醇至混合液中醇含量为80v％，离心得沉淀；
3)将步骤2)所述的沉淀依次用2倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2倍蒸馏水溶解，并加入经洗涤后的沉淀重量1％的蛋白酶酶解1h，灭酶，得到酶解液；
4)将酶解液以分子量为80000的透析袋进行第一次透析24h，取保留液以分子量为1500000的透析袋进行第二次透析24h，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心得到沉淀；
5)将步骤4)所述的沉淀依次用2倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2倍蒸馏水溶解，加入活性炭脱色，过滤，喷雾干燥，即为车前子多糖。经苯酚-硫酸法检测，纯度高达99.2％，颜色为白色。
实施例2
1)车前子破碎，加入其30倍重量的水，回流提取3次，每次提取3h，过滤，收集滤液备用；
2)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.3的浸膏，加入95v％的乙醇至混合液中醇含量为85v％，离心得沉淀；
3)将步骤2)所述的沉淀依次用4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用4倍蒸馏水溶解，并加入经洗涤后的沉淀重量2％的蛋白酶酶解3h，灭酶，得到酶解液；
4)将酶解液以分子量为200000的透析袋进行第一次透析72h，取保留液以分子量为2000000的透析袋进行第二次透析72h，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心得到沉淀；
5)将步骤4)所述的沉淀依次用4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用4倍蒸馏水溶解，加入活性炭脱色，过滤，喷雾干燥，即为车前子多糖。经苯酚-硫酸法检测，纯度高达99.23％，颜色为白色。
实施例3
1)车前子破碎，加入其25倍重量的水，回流提取2次，每次提取2h，过滤，收集滤液备用；
2)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.2的浸膏，加入95v％的乙醇至混合液中醇含量为85v％，离心得沉淀；
3)将步骤2)所述的沉淀依次用3倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用3倍蒸馏水溶解，并加入经洗涤后的沉淀重量1.5％的蛋白酶酶解2h，灭酶，得到酶解液；
4)将酶解液以分子量为100000的透析袋进行第一次透析48h，取保留液以分子量为1800000的透析袋进行第二次透析48h，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心得到沉淀；
5)将步骤4)所述的沉淀依次用3倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用3倍蒸馏水溶解，加入活性炭脱色，过滤，喷雾干燥，即为车前子多糖。经苯酚-硫酸法检测，纯度高达99.31％以上，颜色为白色。
为验证本发明的车前子多糖具有较强的免疫促进作用，现进行以下动物实验。
1、车前子多糖对小鼠单核巨噬细胞吞噬活性的影响
体重(20±2)g清洁级昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组10只。空白对照组组、高剂量组、中剂量组、低剂量组和阳性对照组。空白对照组给予生理盐水；高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予实施例1制得的车前子多糖，其剂量见下表1；阳性对照组给予背景技术所述方法制得的车前子多糖，其剂量见下表1。除空白对照组，其他各组均以灌胃方式给药，连续给药7d。末次给药24h后，经小鼠尾静脉注入4倍1％明胶稀释的印度墨汁0.1ml/10g，分别于2min和6min眼眶后取血20μl，并将其加入到0.1％碳酸钠溶液2ml中，摇匀，以0.1％碳酸钠溶液做空白对照，在分光光度计600nm波长处侧光密度值，OD1表示2min的光密度值，OD2表示6min的光密度值。根据公式计算廓清指数K，K值经体重及肝脾重量换算后，得吞噬指数α。试验结果见表1。
表1
注：各组与阳性对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。与空白对照组比较，△p＜0.05，△△p＜0.01。
由上表可知，阳性对照组与空白组相比，廓清指数和吞噬指数均明显降低，且有显著差异，说明阳性对照组的车前子多糖具有免疫增强作用。高剂量组、中剂量组和低剂量组与阳性对照组相比，廓清指数和吞噬指数也明显降低，且有极显著差异，这说明本发明的车前子多糖比常规提取的车前子多糖具有更强的免疫促进作用。
2、车前子多糖对小鼠溶血素抗体生成(比色法)的影响
取体重(20±2)g清洁级昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组10只。空白对照组组、高剂量组、中剂量组、低剂量组和阳性对照组。空白对照组给予生理盐水；高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予实施例1制得的车前子多糖，其剂量见下表2；阳性对照组给予背景技术所述方法制得的车前子多糖，其剂量见下表2。除空白组外，各组每日腹腔注射给药一次，连续14天。除空白组外，各组每只小鼠给药8次后腹腔注射绵羊红细胞悬液0.2ml/只(约4亿个细胞)进行免疫，用生理盐水将血清按1:300比例稀释，将稀释后的小鼠血清1.0ml，绵羊红细胞0.5ml，加入试管中，再加入经生理盐水1:10稀释的豚鼠血清1.0ml，空白对照组以等体积生理盐水代替血清，将试管置于37℃水浴下10min，去除试管置于冰水浴中，以终止反应，冷却后离心。将离心后上清液1.0ml，都氏液3.0ml加入试管中，混匀后静置10min，在540nm处测定吸收度值。另在试管中加入0.25ml绵羊红细胞和都氏液3.75ml，测定绵羊红细胞半数溶血时的吸收度值。
表2
| 组别 | 剂量(mg/100g) | HC50(％) |
| 空白对照组 | 1ml | 251.62±9.67 |
| 阳性对照组 | 150 | 761.61±83.15△△ |
| 高剂量组 | 150 | 431.39±63.89* |
| 中剂量组 | 100 | 481.37±72.16* |
| 低剂量组 | 50 | 569.13±56.31** |
注：各组与阳性对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。与空白对照组比较，△p＜0.05，△△p＜0.01。
由上表可知，阳性对照组与空白组相比，具有极显著差异，表明常规提取的车前子多糖对绵羊红细胞所致溶血素生成具有一定抑制作用。高剂量组、中剂量组和低剂量组与阳性对照组相比，也具有显著性差异，这也表明本发明的车前子多糖比常规车前子多糖对绵羊红细胞所致溶血素生成具有更强的抑制作用，也就是说本发明的车前子多糖具有极强的免疫增强作用。
Claims (3)
1.车前子多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)车前子破碎，加入其20～30倍重量的水，回流提取2～3次，每次提取1～3h，过滤，收集滤液备用；
2)将滤液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；
3)将步骤2)所述的沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，加入蛋白酶酶解1～3h，灭酶，得到酶解液；
4)将酶解液经分子量为80000～200000的透析袋进行第一次透析24～72h，取保留液经分子量为1500000～2000000的透析袋进行第二次透析24～72h，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心得到沉淀；
5)将步骤4)所述的沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，加入活性炭脱色，过滤，喷雾干燥，即为车前子多糖。
2.根据权利要求1所述的车前子多糖的提取方法，其特征在于：步骤2)中，加入90～95v％的乙醇至混合液中醇含量为80～85v％。
3.根据权利要求1所述的车前子多糖的提取方法，其特征在于：步骤3)中，所述蛋白酶的加入量为沉淀重量的1～2％。
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