CN101121118B - 改性大孔聚乙烯醇树脂及分离和纯化中草药多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及改性大孔聚乙烯醇分离树脂及分离和纯化中草药多糖的方法。聚乙烯醇树脂微球在碱性条件下和环氧氯丙烷反应，然后在碱性条件下再与三甲胺、三乙胺或二乙烯三胺反应，水洗净，干燥。粗多糖(甘草多糖、黄芪多糖、灵芝多糖、香菇多糖和人参多糖等)水溶液直接经过改性大孔聚乙烯醇分离树脂分离柱分离和纯化，可以只经一步就可除去其中的主要杂质-蛋白和色素85％以上，分离液经干燥可得到纯度大于80％的多糖产品。

Description

改性大孔聚乙烯醇树脂及分离和纯化中草药多糖的方法

技术领域

本发明涉及分离树脂的制备和中草药有效成分的提取领域，具体是改性大孔聚乙烯醇树脂及分离和纯化中草药多糖的方法。本发明涉及的树脂可以简单、有效地去除中草药中粗多糖中的蛋白、色素等，从而对粗多糖达到分离和纯化的目的。

背景技术

多糖(polysaccharide)又称为多聚糖，分子量一般在数万到数百万，广泛存在于动物细胞膜，植物和微生物细胞壁中，是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物。到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被提取出来，其中从中草药中获得的水溶性多糖最为重要，已发现有100多种中草药中的多糖类化合物具有免疫促进作用，如甘草多糖、香菇多糖、枸杞多糖、灵芝多糖、黄芪多糖等。中草药多糖具有很强的生理活性，药理研究与临床应用表明，中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝等多种功能，受到越来越多的重视。已经有不少多糖类药物应用于临床，也有很多多糖类保健品的出现。

由于中草药多糖较高的生理活性，很好的治疗和保健功能，因此，中草药多糖的提取受到了更多地重视。

中草药多糖的常规提取方法有煎煮法、水蒸馏法、溶剂浸提法等，其提取时间长，影响提出率。随着现代科学的发展，超临界萃取、超声、微波、超滤、凝胶电泳分离、真空冷冻干燥提取分离等新技术，已经应用到中药及其天然植物研究生产领域中。这些新技术的应用使多糖的提取更为简便和快捷，提高了提出率，缩短了提取时间，节约了溶剂。

以上这些提取和分离方法大都需要经过水提、醇沉、脱蛋白、脱色、脱盐等复杂步骤，而且都需要用到大量的有机溶剂如石油醚、氯仿、乙醇、丙酮等，整个过程耗时较长，资源和能源耗费较大，而且会产生污染，环境不友好。这些大大限制了中草药多糖的生产和应用。

甘草(Glycyrrhiza uralcnsis Fisch)是豆科甘草属的多年生草本植物，使传统常用中药，味甘、性平，归心、肺、脾、胃经。它具有清热解毒，健脾补气，润肺止咳，调和药性之功效。其有效成分主要为甘草多糖、三萜皂苷类化合物(甘草酸、甘草次酸)和甘草黄酮等。其中的甘草多糖(Glycyrrhize polysaccharide)经药理研究表明具有免疫调节作用，能抑制变态反应，并具有较强的抗肿瘤作用和抗病毒作用，而且无细胞毒性，是一种较好的生物活性多糖。

灵芝(Ganoderma lucidum)为多孔菌科真菌灵芝的子实体，在我国作为药物已有2000多年的历史。灵芝的有效成分非常丰富，目前已知的有多糖、麦角字醇、三萜类、蛋白质、氨基酸、多肽、等十大类，150多种。灵芝多糖(Ganoderma lucidumpolysaccharides，GLP)是由肽多糖、葡聚糖、杂多糖等多糖均一体组成的混合物，是灵芝中的最主要的生理活性成分。目前分离到的灵芝多糖达200种之多，大部分为β型葡聚糖，分子量从数千到数万不等，不溶于高浓度乙醇，可在热水中溶解。灵芝多糖的药理活性主要取决于多糖中的糖苷键和立体结构，其中以β-(1→3)、(1→6)连接或β-(1→4)、(1→6)的糖苷键活性较高。

现代药理和临床研究证明，GLP具有广泛的药理活性，具有提高机体免疫力、抗肿瘤、消除机体内自由基、抗辐射、提高肝脏解毒功能等作用，能使人体产生抗体及干扰素，可治疗高血压、高血脂、糖尿病、乙型肝炎等多种现代医学中的疑难病症。

发明内容

本发明的目的是提供一种改性大孔聚乙烯醇树脂及分离和纯化中草药多糖的方法。用本发明的树脂，同时成功地对中草药粗多糖进行了分离和纯化，可得到纯度较高的多糖产品，纯度大于80％。不使用到其它的有机溶剂，环境友好。操作过程简单，资源及能源耗费少。

本发明提供的改性大孔聚乙烯醇树脂，平均粒度20-120目，它是将聚乙烯醇(醋酸乙烯酯与异氰尿酸三烯丙酯的共聚物；交联度为30％，醇解度90％)微球树脂进行改性制备的，聚乙烯醇微球树脂(天津欧瑞生物科技有限公司生产)首先在碱性条件下和环氧氯丙烷反应，带上活性功能基团环氧基，然后在碱性条件下和三甲胺、三乙胺或二乙烯三胺等反应，从而带上阴离子功能基团，再经蒸馏水洗净即可。具体制备方法包括的步骤：

1)40-50℃下，在1-3M的NaOH溶液中，20-120目的聚乙烯醇树脂微球(交联度为30％，醇解度90％)和1-4倍体积的环氧氯丙烷反应3-5h，用水洗净，抽干，得到活化的微球，环氧基团含量为80-200μmol/g。

2)在1-3M的NaOH溶液中，活化的聚乙烯醇微球和1-4倍体积的三甲胺或三乙胺(聚乙烯醇微球与试剂体积比)等反应10h，反应温度40-50℃，水洗净得到球形、多孔状聚乙烯醇树脂微球，备用。

本发明提供的改性大孔聚乙烯醇分离树脂分离和纯化中草药粗多糖的方法包括的步骤：

1)取中草药粗多糖用水配成0.1-10mg/ml的溶液，过滤除去少量不溶性沉淀得粗多糖清夜；

2)将改性聚乙烯醇树脂装入分离柱中，将1)的清液以1-5床体积/小时的流速过分离柱，接收分离液，分别检测接收液和上样液中的多糖、蛋白和色素。

3)分离液经冷冻干燥，得到白色多糖粉末。

所述的中草药粗多糖重量与树脂的体积是0.5～4∶20。

所述的树脂柱径和柱高比为1∶5～20。

本发明所涉及的多糖为普通中草药粗多糖：甘草多糖、黄芪多糖、灵芝多糖、香菇多糖和人参多糖等，粗多糖纯度可在10-50％之间不等。粗多糖用蒸馏水作为溶剂直接溶解，浓度宜在0.1-10mg/ml，在2-5mg/ml为佳。粗多糖溶液经过滤或离心除去少量不溶性沉淀后直接上树脂分离柱分离。

粗多糖溶液上样量依树脂种类和粗多糖溶液浓度而定，可在分离树脂床体积的0.1-5倍之间，上样量少可得到纯度较高的多糖产品，但一次处理的粗多糖样品较少，产量不高，上样量多则可以得到更多的多糖，但纯度有所降低。上样量在分离树脂床体积的0.5-2倍为佳。分离纯化过程中的流速可在1-5BV/h，1-2BV/h时效果较好。

粗多糖水溶液经树脂分离柱分离后，其中的主要杂质-蛋白和色素可以一次性地吸附在树脂上而除去，流出液主要为纯化后的多糖样品。流出溶液可经减压蒸馏、冷冻干燥或喷雾干燥得到纯度较高的多糖产品。

样品中多糖的含量可用高效液相色谱法或苯酚-硫酸比色法测定，其中的蛋白用考马斯亮蓝染色法、凯氏定氮法等测定，色素的去除率用在最大波长的光吸收法测定。

纯化多糖后的分离树脂可以再生而重复使用，再生方法包括：30-80％的乙醇浸泡、淋洗，水洗，0.5-5％的酸(HCl)浸泡、淋洗，水洗，0.5-5％的碱(NaOH)浸泡、淋洗，水洗。

本发明的优异性在于：

1.本发明所涉及的多糖的分离和纯化中利用树脂一步除去蛋白和色素，相比现有工艺，过程简单，资源及能源耗费少，

2.现有技术多采用乙醇沉淀多糖，耗费了大量的乙醇，对环境并不友好；本发明的纯化工艺只涉及到水和树脂，没有用到其它的有机溶剂，环境友好。

3.本发明所涉及的分离树脂可以经洗脱蛋白和色素再生后重复利用，有利于产品的可持续生产。

具体实施方式

实施例1.改性大孔聚乙烯醇分离树脂的制备

平均粒度60目的聚乙烯醇微球40g(醋酸乙烯酯与异氰尿酸三烯丙酯的共聚物；交联度为30％，醇解度90％，天津欧瑞生物科技有限公司生产)，加入2M的NaOH溶液80ml、环氧氯丙烷160ml和DMSO(二甲基亚砜)100ml，40℃下振荡反应3h后，用蒸馏水充分洗净，抽干，得到活化的微球，环氧值为120μmol/g(氯化镁-盐酸滴定法测定)。活化的PVA树脂中加入2M的NaOH溶液200ml和三甲胺200ml，40℃下振荡反应10h，然后用蒸馏水充分洗净。即得到聚乙烯醇分离微球树脂，微球的交换量为100μmol/g(酸碱滴定法测定)。

实施例2.改性大孔聚乙烯醇分离树脂对粗甘草多糖的分离和纯化

取由实施例1制备的树脂20ml装入分离柱中，分离柱直径15mm，树脂高度为150mm。取粗甘草多糖粗(纯度10.26％，蛋白含量6.58mg)用蒸馏水配成4mg/ml浓度的溶液，过滤除去少量不溶性沉淀得粗甘草多糖清液，此清液以1BV/h(BV：床体积)的流速过分离柱，接收流出液，分别检测流出液和上样液中的多糖、蛋白和色素。流出液经冷冻干燥，得到白色多糖粉末9.8mg，纯度87.59％(苯酚-硫酸比色法测定)，收率8.17％，一次性蛋白去除率98.4％(考马斯亮蓝染色法测定)，色素去除率98.2％(色素的去除率用在最大波长的光吸收法测定，最大波长：373nm)。

实施例3.改性大孔聚乙烯醇分离树脂对粗灵芝多糖的分离和纯化

取由实施例1制备的树脂按实施例2的方法装分离柱。取粗灵芝多糖(纯度15.4％，蛋白含量0.474mg)用蒸馏水配成4mg/ml浓度的溶液，过滤除去少量不溶性沉淀得粗甘草多糖清液，此清液以1BV/h的流速过分离柱，接收流出液，分别检测流出液和上样液中的多糖、蛋白和色素。分离液经冷冻干燥，得到白色多糖粉末10.5mg，纯度91.39％，收率8.75％，一次性蛋白去除率88.23％，色素去除率92.41％。(检测方法同上)

实施例4.分离树脂的再生

实施例2或3中分离过多糖的聚乙烯醇分离树脂20ml用40ml 50％的乙醇浸泡5h，再用40ml蒸馏水充分洗涤至中性，然后树脂用40ml 2％的HCl浸泡5h后再冲洗，用蒸馏水充分淋洗至中性，最后用40ml 2％的NaOH溶液浸泡5h，再冲洗40ml，用蒸馏水充分淋洗至中性，取样测交换量为98μmol/g(酸碱滴定法测定)，接近使用前水平。

Claims (6)

1.一种改性大孔聚乙烯醇分离树脂分离和纯化中草药粗多糖的方法，该改性大孔聚乙烯醇分离树脂的制备方法是：将平均粒度20-120目的聚乙烯醇树脂微球在碱性条件下和环氧氯丙烷反应，带上活性功能基团环氧基，然后在碱性条件下与三甲胺或三乙胺反应，水洗净，干燥；其特征在于使用该改性大孔聚乙烯醇分离树脂分离和纯化中草药粗多糖包括下述的步骤：

1)取中草药粗多糖用水配成0.1-10mg/ml的溶液，过滤除去少量不溶性沉淀得粗多糖清液；

2)将改性大孔聚乙烯醇分离树脂装入分离柱中，将步骤1)的清液通过分离柱，接收分离液，分别检测分离液和上样液中的多糖、蛋白和色素；

3)分离液经冷冻干燥，得到白色多糖粉末。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的中草药粗多糖是甘草多糖、黄芪多糖、灵芝多糖、香菇多糖或人参多糖，粗多糖用蒸馏水作为溶剂直接溶解，浓度宜在0.1-10mg/ml。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的中草药粗多糖的重量与改性大孔聚乙烯醇分离树脂的体积比是0.5～2∶20mg/ml。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的改性大孔聚乙烯醇分离树脂柱径和柱高比为1∶5～20。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分离纯化过程中的流速为1-5BV/h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于一次处理样品为1-15倍树脂床体积。