CN105051177B - 用于减少粪肥或土壤中氨气和/或甲烷排放的新型细菌和聚生体 - Google Patents

用于减少粪肥或土壤中氨气和/或甲烷排放的新型细菌和聚生体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于改善粪肥或土壤的新型细菌和微生物聚生体，其中所述细菌包含部分16S rDNA核苷酸序列，所述部分16S rDNA核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示序列或其互补序列高于85％的序列同源性。

Description

用于减少粪肥或土壤中氨气和/或甲烷排放的新型细菌和聚 生体
本发明涉及一种新型细菌，一种包含这些细菌的聚生体以及所述聚生体用于减少粪肥中氨气和/或甲烷排放的应用。
粪肥为有机物并且可以用作农业有机肥料。通过添加在土壤中被细菌捕获的有机物和营养物质(如氮)，粪肥有助于土壤的肥力。粪肥中含有无机和有机形式的氮(N)。有机氮在被矿化为铵基(NH4+)前不能用于作物生长。铵基氮N在很大程度上构建并可被植物吸收，但部分被微生物量固定化，并且硝化的细菌将NH4+转化为硝酸盐(NO3-)，所述硝酸盐通过浸出或脱氮而流失并随后流失到大气中。粪肥中的挥发性氨(NH3)是从NH4+转化而来的，并且可在应用于土地后流失到大气中。流失到大气中的氮不能用于作物生产。此外，来自畜牧业生产的氨气(NH3)排放引起了不良的环境效应。除了NH3的不良效应，粪肥还包含甲烷(CH4)。甲烷是一种温室气体，并且通常认为应当减少CH2在大气中的排放。
因此，需要一种可加入到粪肥中的产品，该产品可以通过提供增加的可用于农作物的营养物质(如氮)的量来改善粪肥的质量。
需要一种可加入到粪肥中的产品，该产品可以对作物提供改善的肥料质量。
另外，需要一种可加入到粪肥中的产品，该产品有助于减少粪肥或土壤中氨气和/或甲烷的排放。
除其他目的外，本发明的一个目的在于提供一种可被加入到粪肥中的微生物聚生体，用于改善粪肥质量。
然而，本发明的另一目的在于提供一种微生物聚生体，所述微生物聚生体可以用于处理粪肥以便减少氨气和/或甲烷的排放。
然而，本发明的另一目的在于提供一种微生物聚生体，所述微生物聚生体可用于改善粪肥以便增加对植物的氮有效性。
然而，本发明的另一目的在于提供一种可加入到土壤中的微生物聚生体，用于改善土壤肥力。
本发明的另一目的在于提供一种细菌，所述细菌构成可以实现上述目的的部分聚生体。
如果没完全采用附录中所主张的细菌或聚生体，也可实现或至少部分实现除其他目的之外的该目的。
特别地，如果不完全采用包含部分16S rDNA核苷酸序列的细菌也可实现或至少部分实现该目的，其中所述部分16S rDNA核苷酸序列具有与SEQ ID NO:1所示序列或其互补序列高于85％的序列同源性。发明人惊奇地发现了一种存在于聚生体中的新型细菌。与没有加入该聚生体的粪肥相比，聚生体中的细菌和聚生体以从粪肥中排放出较少氨气和/或甲烷的方式改进了粪肥的质量。
可以采用Hall,L.,Doerr,K.A.,Wohlfiel,S.L.,Roberts,G.D.,2003中描述的16SrDNA测序方法找到所述部分16S rDNA。用于通过16S核糖体DNA测序而鉴定分支杆菌的MicroSeq系统的评价并且将其纳入常规临床分支杆菌检验，将J.Clinic.Microbiol.4,1447-1453的全部内容以引用的方式并入本文。利用以下引物(从5'到3'方向的序列)16S500F(tggagagtttgatcctggctcag)和16S500R(taccgcggctgctggcac)对细菌悬浮液进行PCR。
如本文中所使用的序列同源性的定义为在当前序列的整个长度中完全相同并连续比对的核苷酸或氨基酸的数量除以该序列的整个长度中核苷酸或氨基酸的数量再乘以100％。例如，具有与SEQ ID No.180％同源性的序列包含：在整个长度为550个氨基酸的SEQID No.1中有440个完全相同并连续比对的核苷酸，即440/550*100％＝80％。
本发明涉及一种新发现的细菌。采用由测量PCT核糖型条带大小的Bionumerics程序(源自Applied Maths公司)所提供的非加权组平均法(Unweighted Pair Group Methodwith Arithmetic Means，UPGMA)算法确定系统树。已经发现，具有包含SEQ ID No.1的16SrDNA序列的细菌属于拟杆菌属(genus Bacteriodetes)。在一个实施方式中，本发明涉及一种细菌，其中所述细菌为拟杆菌种类(bacteriodetes sp.)。
在本发明的另一个实施方式中涉及一种细菌，其中该细菌以保藏号CBS 134116存放于CBS，(根据布达佩斯条约于2012年11月27日)存放于CBS(Centraal Bureau voorSchimmelcultures，荷兰微生物菌种保藏中心)，其中CBS 134116为拟杆菌。
在另一个实施方式中，所述细菌具有与SEQ ID NO：1所示序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94、95％、96％、97％、98％、99％、100％完全相同的序列同源性。在一个优选的实施方式中，所述细菌具有与SEQ ID NO：1所示序列至少99.7％、99.8％、99.9％、100％完全相同的序列同源性。
一方面，本发明涉及包含如上所述细菌的聚生体。所述聚生体可以进一步包含念珠菌属的酵母，优选地为博伊丁假丝酵母(Candida boidinii C.Ramírez)和/或嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica Rybárová，Stros&Kocková-Kratochvílová)，和/或可进一步包含鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus/casei)，巴氏醋杆菌/罗旺(Acetobacterpasteurianus/lovaiensus)和/或缠绕红球菌/云南(Rhodococcus facians/yunnanensis)的细菌。
所述聚生体可进一步包含其他乳酸细菌和其他乙酸细菌。
在一个实施方式中，所述聚生体包含一种或多种选自由鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、加纳乳杆菌(Lactobacillus ghanensis)、类干酪乳杆菌、狭义枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis sensu stricto)、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismorits)、摩加夫芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)和甲基营养型芽孢杆菌组成的组的细菌。在一个优选的实施方式中，所述聚生体包含所有这些细菌。
在一个实施方式中，相比于没有加入根据本发明所述聚生体的粪肥，所述聚生体改善了粪肥并降低了氨气和/或甲烷的排放。粪肥被理解为动物排泄物，并且可以呈半液体状态，例如浆料。
在一个实施方式中，相比于没有加入根据本发明所述聚生体的土壤，所述聚生体改善了土壤并且降低了氨气和/或甲烷的排放。土壤被理解为薄薄覆盖在地球表面的矿物颗粒的松散覆盖物，例如覆盖在种植农作物的农田上的土壤。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种存放于CBS的聚生体，其以保藏号CBS134115(根据布达佩斯条约于2012年11月27日)存放于CBS(Centraal Bureau voorSchimmelcultures，荷兰微生物菌种保藏中心)。
在另一个实施方式中，根据本发明所述的聚生体进一步包含糖类，优选地为单糖和/或双糖。可以认为糖类为在所述聚生体中的细菌和酵母提供了环境，所述聚生体提供了一定比例的细菌和酵母的组合，该比例细菌和酵母的组合降低粪肥中氨气和/或甲烷的产生。可以认为所述聚生体提供了粪肥中的环境，所述粪肥不利于产氨菌。
在另一个实施方式中，所述糖类来源于甘蔗或甜菜，并且优选地为甘蔗蜜。
另一方面，本发明涉及SEQ ID No：1用于检测或鉴别具有与所述核苷酸序列或与SEQ ID NO:1至少85％的序列同源性的细菌的应用。
另一方面，本发明涉及一种微生物聚生体，其包含减少粪肥中氨气和/或甲烷(NH3)排放的微生物，在以保藏号CBS 134115存放于CBS的聚生体中含有所述微生物。
在另一方面，本发明涉及根据本发明所述的细菌或根据本发明所述的聚生体在减少粪肥中氮的应用。例如，该应用可以通过将包含根据本发明所述细菌或所述聚生体的溶液喷在粪肥上进行。例如，这可以采用专利申请NL2009019(其全部内容以引用的方式并入本文)中描述的方法和产品进行。
所述粪肥优选地为动物粪肥，来自例如猪、牛、家禽或马。
另一方面，本发明涉及根据本发明所述细菌或根据本发明所述聚生体用于减少土壤中氮的应用。例如，该应用可以通过将含有根据本发明所述细菌或所述聚生体的溶液喷在土壤上进行。
另一个方面，本发明涉及一种用于减少粪肥中氨气和/或甲烷排放的方法，包含：向粪肥中加入根据本发明所述细菌或所述聚生体；以及对所述细菌或聚生体进行足够时间的孵育，以减少粪肥中氨气和/或甲烷的形成。
另一个方面，本发明涉及一种用于减少土壤中氨气和/或甲烷排放的方法，包含：向土壤中加入根据本发明所述细菌或所述聚生体；以及对所述细菌或所述聚生体进行足够时间的孵育，以减少土壤中氨气和/或甲烷的形成。
根据本发明的另一个方面是根据本发明所述粪肥作为有机肥料的应用。
根据本发明所述聚生体或所述聚生体中所述细菌有利于减少氨气的排放。可以认为更多的氮存在于以可被植物(如农作物)利用的相中。惊奇地发现，根据本发明所述聚生体或所述细菌可用于改善粪肥或土壤，并且除了实现减少氨气，还改善了根据本发明所述粪肥或土壤的施肥特性。
如上所述的本发明各方面的实施方式和优点对根据本发明的其他方面也有效。
在以下本发明的优选实施方式的示例中进一步详细说明本发明。
图1
基于新发现的拟杆菌门细菌(CBS134116)的成对相似性的聚类分析系统树图(图1A)。图上的数字表示采用基于相似性的非加权组平均法(UPGMA)的聚类而测量出的相似性的量。
示例1
养猪场粪肥中的氨气排放的测试
在两个猪畜舍中进行氨气排放的测量。在其中一个畜舍中，使用专利申请NL2009019中描述的装置处理来自猪的浆料。将以保藏号CBS134115存放于CBS的聚生体喷在畜舍1中猪所排泄的浆料上。畜舍2中的浆料未经所述聚生体处理。
每个畜舍中饲养80头猪，并进行为期12周的测量。在12周中的每一天，将包含有聚生体的组合喷在蓄舍1中。利用包含有吸收液的洗气瓶进行取样，利用标准NEN 2826(NEN2826,1999:Luchtkwaliteit.Uitworp door stationaire puntbronnen.Monsternemingen bepaling van het gehalte aan gasvormig ammoniak)测量24小时内NH3的排放。通过实施吸收法和湿化学分析来对氨气进行测定。
在饲养猪的数周的几个周期以及一年的几个月中采集样本。表1显示了氨气排放的结果。相比于蓄舍2的粪肥，经过以保藏号CBS134115存放于CBS聚生体处理的粪肥中氨气排放平均降低了35％。在几个季节(夏季，冬季和秋季)以及在猪的不同生长阶段(全部12周，以及每两周为期算作1阶段)进行测量。
在测量的设置的阶段，两个蓄舍中的动物数量、动物的年龄和重量均相似。
表1
示例2
养猪场粪肥中的甲烷排放的测试
进行如示例1中相似的设置。通过采集样本并采用根据标准NEN-EN的Lung方法，在24小时内对甲烷进行测量。
比较两个不同养猪场，有平均19％的甲烷减少量。
表2显示了一个养猪场中相比于没有加入聚生体混合物的猪舍2(对照)，粪肥中加入了聚生体混合物的猪舍1的甲烷测量的结果。
示例3
聚生体的鉴别
对以保藏号NR CBS 134115存放于CBS的聚生体的样本进行分析以鉴别其组分。通过比利时根特的BCCMTM/LMG鉴别服务进行分析。
无菌条件下，对样本进行等分取样(几滴)，并将其均匀分散在：
-LMG培养基nr.66(MRS)，并在37℃下的厌氧条件下孵育1天，
-LMG培养基nr.37(RCM)，并在℃下的厌氧条件下孵育1天，
-LMG培养基nr.13，并在28℃下的有氧条件下孵育1天，
-LMG培养基nr.185(TSA)，并在28℃下的有氧条件下孵育2天。
在不同的介质中，观察到了不同菌落类型，并且为了进一步分析对该菌落进行纯化。
将四种经过纯化的菌落(t1、t2、t6和t7)采用AFLPTM进行DNA指纹识别。AFLPTM是一种用于通过选择性扩增限制性片段进行全基因组指纹识别的基于PCR的技术(Vos等.,Nucleic Acids Research 23:4407-4414(1995))。使用引物组合E01/T11(Keygene)。
以乳酸菌类群(包含双歧杆菌)的AFLPTMDNA指纹图谱为参考的AFLPTMDNA指纹图谱的聚类分析鉴别出鼠李糖乳杆菌(t1)、干酪乳杆菌(t2)、加纳乳杆菌(Lactobacillusghanensis)(t6)和类干酪乳杆菌(t7)的培养物。应当指出的是，文献资料表明干酪乳杆菌的菌株类型属于玉米乳杆菌种类。然而，原核生物系统学方面的国际委员会的司法委员会规定不应使用玉米乳杆菌这一名称(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.58:1764-1765,(2008))。
将两个经过纯化的菌落(t3和t4)进行部分16S rDNA序列分析。按照Niemann等人的方案(J.Appl.Microbiol.82:477-484(1997))制备总DNA。使用保守性引物利用PCR对16SrDNA的基因(对应于大肠杆菌编号系统的8-1541位置)的片段进行扩增。使用96的PCRClean-up试剂盒(Macherey-Nagel公司，德国)对PCR产物进行纯化。使用XTerminatorT纯化试剂盒(Applied Biosystems公司，美国)进行测序反应。通过使用软件包BioNumerics(Applied Maths公司，比利时)进行序列组装。
在从国际核苷酸序列库EMBL收集的核糖体小亚基序列的比对中包含一致性序列后使用软件包BioNumerics(Applied Maths公司，比利时)进行系统进化分析。
以0％的空位罚分的同源性计算建立相似性矩阵；排除未知碱基。用这种方法，与几个被有效记载的芽孢杆菌属种类具有97％以上的相似性，对可能物种鉴定具有显著意义。然而，由枯草芽孢杆菌-复合物(一系列高度相关物种，目前包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、摩加夫芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌)的所有被有效记载的种类获得的高度序列相似性(99.1-100％，基于部分序列)表明培养物中的一个(t3)属于这些种类中的一个。对于其他培养物，与几个被有效记载的乳酸菌种类具有97％以上的相似性，对可能物种鉴定具有显著意义。然而，与干酪乳杆菌(99.7％)和玉米乳杆菌(99.6％)的菌株类型获得的高度序列相似度(99.6-99.7％，基于部分序列)表明该培养物(t4)属于这些种类中的一个，特别是属于干酪乳杆菌。
为了进一步分析样本，在无菌条件下进行等分取样，并且在生理水中进行系列(十倍)稀释。将0.1ml的等分样本均匀分散在：
-LMG培养基nr.185(TSA)，并在28℃下的有氧条件孵育3天。
发现了一种其他的菌落类型(t8)，经过纯化后通过如上所述的部分16S rDNA序列分析对其进行进一步的分析。用这种方法，与几个被有效记载的乳酸杆菌种类具有97％以上的相似性，对可能物种鉴定具有显著意义。然而，与类干酪乳杆菌两个亚种的菌株类型获得的高度序列相似度(99.6-99.9％，基于部分序列)表明该培养物(t8)属于这一物种。

Claims (7)

1.一种减少氨气和/或甲烷排放的微生物聚生体，其中所述微生物聚生体以保藏号CBS134115存放于CBS。
2.根据权利要求1所述的微生物聚生体，包括鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、加纳乳杆菌、类干酪乳杆菌、狭义枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、摩加夫芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌的细菌。
3.根据权利要求1或2的微生物聚生体用于减少粪肥或土壤中氨气和/或甲烷排放的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述粪肥为动物粪肥。
5.一种粪肥，包含根据权利要求1或2所述的微生物聚生体。
6.一种用于减少粪肥或土壤中氨气和/或甲烷的方法，包含以下步骤：向粪肥或土壤中加入根据权利要求1或2所述的微生物聚生体；以及对所述聚生体进行足够时间的孵育，以减少所述粪肥或土壤中氨气和/或甲烷的形成。
7.根据权利要求5所述粪肥作为有机肥料的应用。
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